KR20140060426A - 갈색거저리 유충을 포함하는 염증성 질환 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 갈색거저리(Tenebrio molitor) 유충을 포함하는 염증성 질환 치료용 조성물에 관한 것으로, 갈색거저리 유충을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 사료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 갈색거저리 유충은 염증 관련 인자들인 NO, iNOS, TNF-α, IL-6, IL-1ß, NF-κB 의 발현을 억제하여 항염증활성을 보이고, 대식세포에 대한 독성이 없으므로, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 사료용 조성물의 제조에 이용할 수 있다.

Description

갈색거저리 유충을 포함하는 염증성 질환 치료용 조성물{Composition for treating inflammatory disease comprising Tenebrio molitor larvae}

본 발명은 갈색거저리(Tenebrio molitor) 유충을 포함하는 염증성 질환 치료용 조성물에 관한 것으로, 갈색거저리 유충을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 사료용 조성물에 관한 것이다.

항산화(antioxidation)란 체내에서 일어나는 여러 산화작용을 방지하는 것을 말한다. 산화작용은 체내에 존재하는 여러 종류의 불포화 지방산이 산소에 의해 산화되면 과산화 지질이라고 하는 물질이 생성되고 이것이 증가하면 노화 현상이 촉진되는 현상을 말한다. 인간의 질병 및 노화는 체내 대사과정 중 발생하는 O₂ ^-(superoxide), NO(nitric oxide), NO₂(nitrogen dioxide), OH(hydroxyl), ROO(proxyl), RO(alkoxyl), HO2(hydroperoxyl) 라디칼(radical) 등의 산화반응에 기인하며 생체 내에서는 이런 유해한 라디칼인 유리기로부터 생체를 방어하기 위한 수단으로써 수퍼옥사이드 디스무타제(SOD, superoxide dismutase), 카탈라제(CAT;catalase), 글루타치온 퍼옥시다제(GSHpx; glutathione peroxidase) 등의 항산화 효소나 비타민 E, 글루타치온 등의 항산화 물질이 존재하여 유리기를 제거함으로써 생체를 산화적 손상으로부터 보호한다(Tiidus PM. et al, Sports Med, 20, pp12-13, 1995).

그러나 이러한 항산화 방어계가 유리기 생성을 조절할 수 없을 정도로 저하될 때 조직의 산화적 스트레스와 손상이 촉진되며 체내에서 생성된 과잉의 유리기와 지질 과산화물은 단백질의 산화, DNA 손상과 같은 산화적 스트레스에 의한 상해를 증가시킨다(Kumar CT, et al, Mol. Cell Biochem., 111, pp109-115, 1992). 그러므로 이러한 산화적 스트레스의 감소를 위해 많은 합성 또는 천연 항산화 물질이 개발되어 왔으나 합성 항산화제의 경우 안전성에 문제가 있어(Branen, A.L, J. Am. Oil. Chem. Soc., 55, 123-126, 1975; Ito, N., et al, J. Natl. Cancer Inst., 70, pp343-349, 1983), 최근에는 각종생약과 식용식물 추출물 등에서 보다 안전하며 항산화 효과가 뛰어난 천연 항산화제를 개발하기 위한 노력을 하고 있다(Lim, D.K., et al, Korean J. Food Sci. Technol., 28, pp83-89, 1996; Kim, H.K., et al, Korean J. Food Sci. Technol., 27, pp80-85, 1995; Cha, J.Y, J. Korean Soc, Food Nutr., 28, pp1131-1136, 1999; Kim, M.H., et al, Korean J. Food Sci. Technol., 31, pp273-279, 1999).

염증(inflammation)은 병원체의 침입 또는 손상된 조직 제거를 개시하기 위해 상처부위에 대해 나타나는 지역적인 반응이다. 염증의 긍정적인 역할에도 불구하고 인간질병을 위한 가장 일반적인 발병 메커니즘의 하나가 되었다. 활성화된 백혈구(monocytes) 및 대식세포에 의한 산화질소(NO)의 생성이 강력한 염증 반응을 개시하고, 세균 병원체에 대한 초기 면역 반응에서 가장 중요한 부분이 된다(Bogdan C., Nat. Immunol., 2, pp907-916, 2001).

염증반응의 결과로서, iNOS(inducible nitric oxide synthase)에 의해 생성된 NO의 상기 생리학적인 농도(Supraphysiological concentrations)가 다양한 염증 질환의 병리생물학에 있어서 역할을 하고 있다고 믿어지고 있다(Clancy R.M. et al., Arthritis. Rheum., 41, pp1141-1151, 1998). 염증반응의 유도물질들중에서 LPS(lipopolysaccharide)는 백혈구와 같은 면역세포와 상호 작용을 하며, 단핵세포의 식세포들에 있어서 iNOS 이소형태의 활성화에 의한 NO 농도의 증대에 의한 염증 반응에 있어서 중요한 역할을 하고 있다(MacMicking J. et al., Annu. Rev. Immunol., 15, pp323-350, 1997).

최근 곤충의 용도에 대한 관심이 높아지면서, 곤충의 활용 범위도 농업에서 생명과학, 의학 등으로 넓고 다양해지고 있다. 최근엔 장수풍뎅이, 사슴벌레, 왕귀뚜라미, 반딧불이 등이 자연생태학습용과 애완용으로 인기다. 이밖에 화문매개용, 유용물질을 추출해 식품 또는 약재로 개발하는 분야, 사료로 개발해 가축의 단백질 공급원으로 활용하는 분야, 축산분뇨 및 음식물 쓰레기를 정화하는 환경정화 분야, 곤충 축제 등의 지역행사 소재로 광범위하게 이용되고 있다.

갈색거저리(Tenebrio molitor)는 딱정벌레목 거저리과의 곤충으로, 갈색쌀거저리라고도 한다. 몸길이는 약 15mm정도이며, 몸 빛깔이 구룡충(구룡거저리)과 비슷해 어두운 갈색이며 광택이 난다. 머리에 점들이 있으나 촘촘히 나 있지 않으며, 촉각(더듬이)의 끝마디는 길이와 나비가 같다. 앞가슴등판은 정사각형이고, 뒷가두리의 새로홈은 뚜렷하며, 복판은 나비가 넓은 오각형이다. 딱지날개는 갈색으로 8줄의 새로홈이 있고 간실은 볼록하며 작은 점들이 촘촘히 있다. 성충은 주로 곡류 속에 알을 낳는데, 알은 매우 작아 눈으로 쉽게 찾을 수 없으며 12주일 후 부화한다. 갈색거저리의 유충은 밀웜(mealworm)이라 하고, 유충기간은 약 10주이나 인공 사육할 때에는 약 2주 정도이며, 변태기간이 비교적 짧아 곤충을 쉽게 체험할 수 있고 곡식을 먹이로 하는 매우 청결한 곤충이다. 유충은 번데기가 되기까지 먹이와 온도에 따라 920번 탈피한다. 번데기가 되고 23주가 지나면 성충으로 우화하며 처음으로 우화할 때에는 연한 갈색이나 점차 검게 변한다. 성충은 야행성으로 낮에는 구멍 속에 숨어 지내다가 밤에 활동한다. 주로 인가 근처의 곡식부대 속에서 유충으로 월동하다가 봄에 번데기와 성충으로 변태한다. 곡식의 해충으로 유명하며 최근 동물원에서 새나 고슴도치와 같은 작은 동물의 먹이로 많이 기르고 있으며, 한국을 비롯하여 전 세계에 분포한다.

현재 갈색거저리를 이용한 특허로는 갈색거저리를 함유하는 사료(공개특허 10-2011-0054692), 갈색거저리 유충에서 분리한 항진균 단백질(대한민국 등록특허 10-0230959) 등이 있고, 밝혀진 용도는 아직 많지 않다.

이에 본 발명인은 갈색거저리의 용도를 탐색하던 중, 항산화 활성 및 항염증 활성이 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 갈색거저리 유충을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 갈색거저리 유충을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 갈색거저리 유충을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 사료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 갈색거저리 유충을 유효성분으로 포함하는 항산화 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 갈색거저리 유충을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 갈색거저리 유충을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 갈색거저리 유충을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 사료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 갈색거저리 유충을 유효성분으로 포함하는 항산화 식품 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 갈색거저리 유충의 새로운 용도를 제공하는데 그 특징이 있다. 갈색거저리 유충을 분말화하여 항염증 활성을 검사해 본 결과, 아래와 같이 유효한 데이터가 나왔다.

갈색거저리 유충 현탁액을 넣은 실험군은 염증으로 인해 증가되는 NO(nitric oxide)의 양이 양성대조군(LPS, lipopolysaccharide)보다 유의적으로 적고(실험예 1 및 [도 1] 참조), 염증반응에서 증가되는 iNOS, TNF-α, IL-6들의 유전자 발현율 (실험예 2 및 [도 2] 참조) 및 TNF-α, IL-1ß 의 분비량(실험예 3 및 [도 3])을 양성대조군(LPS)과 비교해봤을 때, 현저히 감소시켰다. 또한 염증관련 신호전달 체계에서 중요한 역할을 하는 전사인자인 NF-kB (nuclear factor keppa B)를 핵으로 이동하는 것을 막아줌으로써 뚜렷한 항염증 효과가 있음을 확인할 수 있고(실험예 4 및 [도 4] 참조), 대식세포에 대한 독성 검사를 MTS assay로 한 결과, 세포 생장률이 대조군과 비슷한 수준을 보임으로서, 독성이 없는 것을 확인하였다(실험예 5 및 [도 5] 참조). 상기 실험 결과는 갈색거저리 유충을 멸균한 그룹과 멸균하지 않은 그룹 간에 차이가 없었으므로, 갈색거저리 유충을 가공하는 공정에서 따로 멸균 공정이 필요하지는 않은 것으로 판단된다.

NO는 신경전달, 혈관의 이관 및 세포 매개성 면역반응에 관여하는 물질로서, NOS(nitric oxide synthase)에 의해 L-arginine으로부터 생성된다(Nathan and Xie, 1994; Alderton et al., 2001). 특히 대식세포가 LPS(lipopolysaccaride)에 의해 자극되면 iNOS(inducible nitric oxide synthase)가 발현되고, 상기 iNOS에 의해서 많은 양의 NO가 생성된다. 또한 IL-6 및 TNF-α로 대표되는 염증성 cytokine은 염증 반응을 매개하는 물질로 특히 초기 염증 반응에 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. 주로 단핵구나 대식세포에서 분비되는 IL-6는 B세포가 형질세포로 분화되는 마지막 단계를 활성화시키고, 항체의 분비를 촉진한다. 또한 IL-6는 염증병소에서 증가하는 것으로 알려져 있다. TNF-α는 LPS 반응의 주요 매개체로 내재면역반응의 중요한 역할을 담당한다. 대식세포나 비만세포에서 분비되는 TNF-α는 암세포에 세포독성을 나타내며, 만성염증반응과 관련되어 있다. NF-kB는 염증유발 반응에서 유전자의 전사를 촉진하는 인자이다. 활성 NF-kB는 Rel 그룹의 소단위체로 존재하며, 이런 heterodimer 는 보통 비활성세포에서 억제 kB (IkBs)와 결합하여 비활성 복합체로서 세포질에 격리되어 있다. 대식세포에서 NF-kB는 외부의 lipopolysaccharide, IL-1ß, TNF-α와 같은 세포 밖 신호에 의해 활성화 되고, 일산화질소(NO)와 프로스타글란딘과 같은 염증 매개물을 생성하는 염증 유전자를 조절한다. NF-kB 의 억제는 염증 질환과 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA)에 유용하다 (고두진, 약학석사학위논문, 충북대학교대학원, 2012).

따라서 본 발명은 갈색거저리 유충을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 갈색거저리 유충은 분말 또는 현탁액의 형태로 사용할 수 있고, 현탁액의 용매는 탄소수 1 내지 6개의 유기용매일 수 있다. 상기 유기용매는 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 갈색거저리 유충 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 갈색거저리 유충 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 갈색거저리 유충 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 당 약 0.01 내지 1,000mg, 가장 바람직하게는 0.1 내지 100mg일 수 있다. 그러나 상기 갈색거저리 유충 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 갈색거저리 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염를 염증성 질환의 예방 또는 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한, 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명의 약학적 조성물이 적용될 수 있는 염증성 질환은 NO, iNOS, TNF-α, IL-6, IL-1ß, NF-κB 등과 같이 일련의 염증 반응을 일으키는 다양한 자극 요인들로 인하여 유발된 염증을 동반하는 질환을 말한다. 상기 염증성 질환에는 부종 등과 같은 일반적인 염증 증상을 포함하여 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(neuropathic joint disease; 또는 'charcot joint'이라고도 함), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 척추측만증(scoliosis), 혈색소증, 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열(familial Mediterranean fever), 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia) 등을 포함하며, 이에 제한되지는 않는다. 또한 급만성 습진, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 박탈 피부염, 일광 피부염, 건선 등 염증성 피부질환도 포함된다.

NO의 생산 및 성상세포에 의한 염증 사이토카인들을 통한 염증 진행은 다발성 경화증(MS, multiple sclerosis/ Nygardas P.T. et al., Mol. Immunol., 38, pp921-929, 2002), 알츠하이머 병(AD, Alzheimer's disease/ Morimoto K. et al., Exp. Neurol., 177, pp95-104, 2002), 및 뇌허혈 (Stanimirovic D and Satoh K., Brain Pathology, 10, pp113-126, 2000) 등을 포함하는 다양한 신경염증 질환의 발전에 중요한 역할을 한다.

또한, NO는 혈중산소가 감소된 상태에서 뉴런의 사멸을 유도할 수 있으며, 그 결과로 인한 뇌 염증은 뇌졸중(stroke), 신경의 퇴행성(neurodegeneration) 및 뇌의 노화와 같은 하이폭시아와 연관된 병리에 있어 중요하다(Mander P.et al., J. Neurosci. Res., 79, pp208-215, 2005).

NO는 또한 간염, 위염 및 류머티스 관절염을 포함하는 많은 염증 질환의 병태생리학적 과정에 영향을 준다. 백혈구 및 대식세포와 같은 증가된 염증 세포의 iNOS에 의한 NO 생산은 다양한 염증 질환의 주요한 원인이 된다.

만성적인 또는 과도한 염증 반응에 의해 발생한 NO의 많은 양은 염증 질환의 발병에서 역할을 한다. 간 손상이 내독소혈증(endotoxemia), 간염(hepatitis), 출혈성 쇼크(hemorrhagic shock) 및 허혈성 재관류(ischemic reperfusion)를 포함한 다양한 손상으로부터 유래되어지는 동안, iNOS 발현 및 NO 생산은 방어 메카니즘으로서 손상을 조절하기 위해 증가되고, 이로 인해 간염의 발전 및 좀더 심각한 간 질환이 유발된다(Li J and Billiar TR, Am. J. Physiol., 276, ppG1069-G1073, 1999).

대식세포에 의한 NO 생산은 또한 알콜성 간 질환(alcoholic liver disease)과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.(Hunt NC and Goldin RD, J. Hepatol., 14, pp146 150, 1992) 또한 iNOS의 활성증가 및 NO의 축적은 헬리코박터 파일로리 연관 위 질환의 발명을 초래한다(Rieder G et al., Int. J. Med. Microbiol., 293, p403-412, 2003). 헬리코박터 파일로리균은 만성 위염을 유발하며, 또한 세균 감염에 의한 높은 수준은 NO 생산이 점막의 손상 및 DNA의 돌연변이 유발로 인하여 궤양(peptic ulcer) 및 위암(gastric carcinoma)의 발전에 중요한 역할을 하고 있다.(Akiko S. et al., Basel. Karger., pp136-146, 2001; Rieder G. et al., Int. J. Med. Microbiol., 293, pp403-412, 2003).

NO는 또한 류머티즘 관절염(rheumatoid arthritis)(Ma Y. and Pope R.M., Curr. Pharm. Design 11, pp 569-580, 2005), 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis)(Libby P. et al., Circulation. 105, pp1135-1143, 2002) 및 자기 면역 질환(autoimmune diseases)(Bo L. et al., Ann. Neurol. 36, pp778-786, 1994; Brosnan C.F. et al., Neurology. 45, ppS16-21, 1996)과 같은 다른 염증 진행의 발병 및 경과에 연관되어 있다고 널리 알려져 있다.

본 발명은 갈색거저리 유충을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 뿐만 아니라, 갈색거저리 유충은 항산화 활성을 보인다. LPS로 산화적 스트레스를 준 세포의 NO와 자유 라디컬들을 감소시켜주는 것을 확인할 수 있다(실시예 1 및 실시예 6 참조). 따라서 본 발명은 갈색거저리 유충을 유효성분으로 포함하는 항산화 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 식품 조성물로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 등이 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 본 발명의 항염증 활성 또는 항산화 활성이 있는 갈색거저리 유충은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 갈색거저리 유충 외에 함유할 수 있는 다른 성분으로 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 이당류, 예를 들어, 말토오스, 슈크로스 등의 다당류, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상의 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 갈색거저리 유충은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 대추씨 정유는 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 갈색거저리 유충은 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명은 갈색거저리 유충을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 사료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 사료용 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛형태 및 사일레지(silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 여러 가지 발효 미생물 균 또는 효소들을 첨가함으로써 제조될 수 있고, 상기 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 갈색거저리 유충을 혼합하여 염증성 질환 예방 및 개선용으로 제조될 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛기로 제형화하여 제조될 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 본 발명이 갈색거저리 유충과 혼합하여, 젖산 발효시켜서 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 갈색거저리 유충은 염증 관련 인자들인 NO, iNOS, TNF-α, IL-6, IL-1ß, NF-κB 의 발현을 억제하여 항염증활성을 보이고, 대식세포에 대한 독성이 없으며, 산화적 스트레스로 인해 발생하는 NO 및 자유 라디컬을 소거하는 항산화 활성을 보이는 바, 항염증 기능을 가진 약학적 조성물, 식품 조성물, 사료용 조성물 및 항산화 식품 조성물의 제조에 효과적이다.

도 1의 A는 비멸균 그룹의 NO 소거능을 나타낸 것이다. (10, 100, 500, 1000 은 갈색거저리 유충 현탁액의 농도(ug/mL))
도 1의 B는 멸균 그룹의 NO 소거능을 나타낸 것이다. (10, 100, 500, 1000 은 갈색거저리 유충 현탁액의 농도(ug/mL))
도 2의 A는 TNF-α유전자 발현 수준을 real time PCR로 확인한 결과이다.
도 2의 B는 IL-6 유전자 발현 수준을 real time PCR로 확인한 결과이다.
도 2의 C는 iNOS 유전자 발현 수준을 real time PCR로 확인한 결과이다.
도 3의 A는 TNF-α 발현량을 측정한 결과이다.
도 3의 B는 IL-1ß 발현량을 측정한 결과이다.
도 4의 A는 핵 내에 존재하는 NF-kB를 Western Blot으로 확인한 결과이다.
도 4의 B는 세포질 내에 존재하는 NF-kB를 Western Blot으로 확인한 결과이다.
도 5는 갈색거저리 유충 현탁액의 세포 독성을 측정한 결과이다.
도 6은 갈색거저리 유충 현탁액의 자유 라디칼 소거능을 DPPH assay로 측정한 결과이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

갈색거저리 유충 현탁액 제조 및 세포 준비

<1-1> 갈색거저리 유충 현탁액 제조

갈색거저리분말은 국내산 고성곤충생태원(경남고성시)에서 키운 거저리를 분양 받아서 이를 이용하여 제조하였다. 분말을 만드는 조건은 고압멸균기로 멸균한 밀기울을 먹인 거저리를 선발하여 2일 동안 굶긴 후 액체질소를 부은 후 급속 동결하여 영하 70℃의 초저온 냉동고에 24시간 동안 동결시킨 후 동결건조기에서 수분이 완전히 제거될 때까지 건조시켰다. 이 건조된 거저리를 115℃, 5분 동안 멸균 한 후 믹서로 세절하여 가루를 얻은 후 에탄올과 멸균된 3차 증류수(D.W.)를 7:3의 비율로 넣어서 70% 에탄올을 만든 후 분말을 넣은 후 초음파 분쇄기로 230 jule의 세기로 10초 동안 2번 나눠서 분쇄 하였다. 분쇄된 분말을 4500 rpm에서 10분 동안 원심분리 시킨 후 상층액을 얻었다. 이 상층액을 0.25㎛ 주사기 필터로 여과하였다. 여과된 상층액을 동결건조기에 넣어 건조 시킨 후 건조 중량을 구한 다음 실험에 이용하였다. 비 멸균된 현탁액은 위 과정 중 사료멸균과 동결 건조된 갈색거저리를 멸균 시키는 조건을 생략하였다.

<1-2> 대식세포 배양

Raw 264.7 세포를 Penicillin-Streptomycin 100 unit/ml과 10% FBS이 함유된 DMEM 배지로 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대 배양을 시행하였다. 실험군을 형성하기 위해, Raw 264.7 세포를 1x10⁶cfu/ml 농도로 24 well plate에 각각 분주하고 LPS 100 ng/ml을 처리한 후, 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 갈색거저리 유충 현탁액을 0, 10, 100, 500, 1000 ㎍/ml 농도로 각각 처리하였다. 음성대조군은 LPS와 갈색거저리 유충 현탁액을 모두 처리하지 않았다. 상기 실험군들과 음성대조군은 아래 실험들에 사용하였다.

<실험예 1>

Nitric oxide(NO) 소거능

상기 실시예 <1-2>에서 준비한 실험군 및 음성대조군 외에 LPS만 처리한 대조군과 토코페롤 10 ug/mL을 처리한 양성 대조군을 추가로 준비하였다. 각 실험군에 물질들을 처리한지 24시간 후, 배양액을 분리하여 Nitric oxide detection kit (Intron biotechnology)으로 NO 소거능을 측정하였다. 측정 결과는 [도 1]에 표시하였다.

비멸균 그룹과 멸균 그룹 간에 NO 소거능은 큰 차이가 없었고, 두 그룹 모두 농도가 증가할수록 NO 소거 활성도 높았다. 높은 농도에서는 항산화제인 토코페롤과 비슷한 NO 소거능 활성을 보였다.

<실험예 2>

iNOS , TNF -α, IL -6의 유전자 발현 분석

갈색거저리 유충의 항염증 효능을 분석하기 위해 iNOS, TNF-α, IL-6 물질들의 유전자 발현 수준을 real time-PCR로 확인하였다. 실시예 <1-1>에서 설정한 실험군 외에 양성대조군을 LPS만 처리하여 준비했다.

각 실험군별로 해당 물질을 처리하여 24시간 배양 후, 세포의 배양액을 버리고 Trizol reagent를 처리하여 cell scraper로 긁어낸 후, chloroform을 넣고 12000 G에서 15분 동안 원심분리하여 상층액으로부터 isopropanol을 이용하여 RNA를 추출하였다. RNA 2ug을 취하여 cDNA를 합성한 후, Real time PCR 기기(AB 7500, UK)를 통해 cytokine의 유전자 발현수준을 조사 하였다. 사용된 프라이머는 아래 [표 1]에 표시하였고, 유전자 발현분석은 항존 유전자(housekeeping gene)인 GAPDH를 이용하여 GAPDH에 대한 각각 유전자들의 상대 정량값을 취하였다.

결과는 [도 2]에 유전자 발현은 비멸균, 멸균 여부에 관계없이 비슷하였고, 농도 의존적으로 세 유전자의 발현율이 감소하였음을 확인할 수 있다.

Name	Sequence		서열번호
IL-6	Forward	5'-TTGGGAGYGGTATCCTCTGT-3'	1
	Reverse	5'-CCACGGCCTTCCCTACTTC-3'	2
iNOS	Forward	5'-TGAAGCGTTTCGGGATCTG-3'	3
	Reverse	5'-CCACGGCCTTCCCTACTTC-3'	4
TNF-α	Forward	5'-ACAGCACCGCAGTACCTGAG-3'	5
	Reverse	5'-CCACGGCCTTCCCTACTTC-3'	6
GAPDH	Forward	5'-GCCTCACCCCATTTGATGTT-3'	7
	Reverse	5'-GGGAAGCCCATCACCATCT-3'	8

<실시예 3>

cytokine의 정량

본 발명의 갈색거저리 유충 현탁액의 항염증 활성을 알아보기 위해, TNF-α, IL-1ß 의 분비량을 정량하였다. 실시예 <1-1>에서 설정한 실험군 외에 양성대조군을 LPS 만 처리하여 준비하였다.

각 실험군별로 해당 물질을 처리하여 24시간 배양 후, 배양액을 분리하여 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) kit(Thermo, USA)으로 TNF-α(Cat No. EMTNFA), IL-1ß(Cat No. EM2IL6) 농도를 측정하였다. 결과는 [도 3]에 기재하였다. 멸균, 비멸균 그룹의 사이토카인 분비량은 비슷하였고, 농도의존적으로 분비량이 감소하였다.

< 실험예 4>

NF-kB 의 세포내 위치 확인

염증반응에 작용하는 주요 전사인자인 NF-kB의 세포 내 위치를 확인하기 위해 Western Blot을 실시하였다. 실시예 <1-2>에서 준비한 실험군 외에, LPS 만 처리한 양성대조군도 추가하여 실험을 진행하였다.

NE-PER?Nuclear and Cytoplasmic Extraction reagents를 이용하여 세포질과 핵질을 분리한 후, 10 % SDS PAGE 후 transfer를 50 V에서 2시간 동안 수행 하였다. 상온에서 1시간 동안 blocking을 수행 한 후 NF-kB 1차 항체를 1:500의 희석배율(TBST 완충용액으로 희석)로 상온에서 한 시간 반응 시킨 후 TBST 완충용액(10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20)으로 씻은 다음 HRP(horse radish peroxidase)가 붙어있는 2차 항체를 상온에서 한 시간 반응 시킨 후 단백질 발현을 FluorChem(Alpha innotech, USA)를 이용해 확인 하였다. 실험결과는 [도 4]에 기재하였다.

[도 4]에서 확인할 수 있듯이, LPS로 염증이 유도된 양성 대조군은 핵에서 뚜렷하게 NF-kB 가 확인되었으며([도 4]의 A), 갈색거저리 유충 현탁액을 처리한 실험군의 경우, 500ug/ml 의 농도부터는 세포질에 NF-kB 가 존재함을 알 수 있다([도 4]의 B). 즉, 갈색거저리 유충 현탁액이 NF-kB가 핵으로 이동하는 것을 차단한다는 것이고, 이는 뚜렷한 항염증 효능을 증명하는 것이다.

<실험예 5>

세포독성 테스트

Raw 264.7 세포에 대한 독성여부를 측정하기 위해, 각 실험군들을 24시간 배양 후, CellTiter 96Solution Cell proliferation Assay kit (MTS assay kit, Promega) 및 microplate reader (Beckman, USA/ 흡광도-450nm)를 이용하여 세포 생장률을 측정하였다. 결과는 [도 5]에 기재하였고, [도 5]에서 멸균 그룹 및 비 멸균 그룹 모두 세포 생장률이 대조군보다 저해되지 않음을 확인할 수 있다.

<실험예 6>

DPPH assay

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)를 이용해서 라디칼 소거활성을 조사 하였다(Blois M. S., Nature 181, pp1199-1200, 1958). 갈색거저리 유충 시료를 70% 에탄올로 녹여 최종 농도가 10, 100, 500, 1000 ㎍/mL이 되도록 정량하여 96 well plate에 각 시료를 150 L를 주입하고. 동시에 0.3 mM DPPH 50 l를 넣어 총량이 200㎕가 되도록 하였다. 실온에서 30분간 반응시킨 후 ELISA reader로 595 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 시료 용액의 첨가군과 무첨가군 사이의 흡광도의 차이를 백분율로 나타내었다. 양성대조군으로 토코페롤을 10 ㎍/ml의 농도로 처리 하였다. 라디칼을 제거하는 공식은 DPPH 라디칼 소거 활성(%)= 1-(시료 첨가군 흡광도/ 시료 무첨가군 흡광도)을 이용하여 계산하였다. 상기 실험의 결과는 [도 6]에 표시하였다.

상기 도 6에서 갈색거저리 유충의 시료가 농도 의존적으로 라디컬 소거 활성이 우수한 것을 확인할 수 있다. 멸균과 비 멸균 그룹 간에 효과 차이는 유의적이지 않았다.

본 발명에 따른 갈색거저리 유충은 염증 관련 인자들인 NO, iNOS, TNF-α, IL-6, IL-1ß, NF-κB 의 발현을 억제하여 항염증활성을 보이고, 대식세포에 대한 독성이 없으며, 산화적 스트레스로 인해 발생하는 NO 및 자유 라디컬을 소거하는 항산화 활성을 보이는 바, 항염증 기능을 가진 약학적 조성물, 식품 조성물, 사료용 조성물 및 항산화 식품 조성물의 제조에 이용할 수 있어, 산업상 이용가능성이 높다.

<110> Republic of Korea (Rural Advancement Commissioner) <120> composition for treating inflammatory disease comprising Tenebrio molitor larvae <130> NP12-0046 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer to amplify IL-6 <400> 1 ttgggagygg tatcctctgt 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer to amplify IL-6 <400> 2 ccacggcctt ccctacttc 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer to amplify iNOS <400> 3 tgaagcgttt cgggatctg 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer to amplify iNOS <400> 4 ccacggcctt ccctacttc 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer to amplify TNF alpha <400> 5 acagcaccgc agtacctgag 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer to amplify TNF alpha <400> 6 ccacggcctt ccctacttc 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer to amplify GAPDH <400> 7 gcctcacccc atttgatgtt 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer to amplify GAPDH <400> 8 gggaagccca tcaccatct 19

Claims (6)

1. 갈색거저리 유충을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기과지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자어 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, 혈관염 증후군과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성 근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(neuropathic joint disease), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉐라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 척추측만증(scoliosis), 혈색소증, 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury), 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia) 및 염증성 피부질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 갈색거저리 유충이 NO(nitric oxide), iNOS(inducible nitric oxide synthase), TNF-α(Tumor necrosis factor - α), IL-6 (Interleukin - 6), IL-1ß(Interleukin - 1ß) 및 NF-κB (nuclear factor keppa B)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 갈색거저리 유충을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   
5. 갈색거저리 유충을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 사료용 조성물.
   
6. 갈색거저리 유충을 유효성분으로 포함하는 항산화 식품 조성물.

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