KR101780934B1

KR101780934B1 - 갈색거저리 추출물을 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물

Info

Publication number: KR101780934B1
Application number: KR1020160090621A
Authority: KR
Inventors: 윤은영; 황재삼; 김미애; 서민철; 윤영일
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2016-07-18
Filing date: 2016-07-18
Publication date: 2017-09-25

Abstract

본 발명은 갈색거저리 추출물을 함유하는 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 갈색거저리 추출물은 모모세포(human keratinocyte), 모유두세포(human dermal papilla cell), 섬유아세포(fibroblast)에서의 세포 생존율과 세포 증식 효과, 탈모 관련 사이토카인의 조절 능력이 우수하다. 게다가 본 발명의 갈색거저리 추출물은 기존의 탈모 억제 또는 발모용 조성물에 비해 사용상의 안전성 및 안정성이 높아 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물, 이를 함유한 약학조성물, 화장료, 건강기능식품으로서 용이하게 사용가능하다.

Description

갈색거저리 추출물을 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물 {Composition comprising extracts of Tenebrio molitor for preventing alopecia or promoting hair growth}

본 발명은 갈색거저리 추출물을 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물 에 관한 것이다.

인체의 모발은 약 10만 내지 15만개 정도이며, 각각의 모발은 서로 다른 주기를 가지며 성장기(anagen), 퇴행기(catagen), 휴지기(telogen)를 거쳐 성장, 탈락하게 된다. 이러한 주기는 36년에 걸쳐 반복되는데 그 결과 일일 평균 50 내지 100 개의 모발이 정상적으로 탈락하는 양상을 보인다.

탈모는 이러한 주기 중에서 성장기의 모발 비율이 짧아지고 퇴행기 또는 휴지기의 모발이 많아져 비정상적으로 모발이 탈락하는 숫자가 많아지고 정상적으로 자라는 머리털이 어떤 원인에 의해 빠지게 되면 이를 탈모증(alopecia 또는 hair loss)이라고 한다[비특허문헌 1]. 특히, 탈모 환자의 대부분을 차지하고 있는 남성형 탈모의 경우에는 모발 밀도의 감소는 없지만 모발의 굵기가 극단적으로 감소한다는 사실이 밝혀지고 있다. 탈모의 원인은 유전적원인, 환경오염, 호르몬의 불균형, 가공식품의 섭취, 고열, 항암제나 항갑상선제의 복용 등으로 인해 일어나게 된다[비특허문헌 2]. 탈모자체는 심각한 질환은 아니지만 탈모환자는 사회적으로 위축되며, 심각할 경우 우울증과 같은 정신질환으로 발전할 수 있다. 현재까지 알려진 탈모의 기작은 테스토스테론(testosterone)이 5α-리덕타제(5α-reductase)에 의해 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone:DHT)으로 전환되고, 전환된 디하이드로테스토스테론이 안드로겐(androgen) 수용체에 결합하여 탈모를 유도시키는 물질인 TGF-β1(transforming growth factor β1) 등을 통해 모낭을 파괴함으로써 탈모가 발생하는 것으로 알려져 있다[비특허문헌 1-3]. 또한 비듬균에 의해 염증이 유도된 모모세포에서 과도한 염증성 사이토카인의 생성 역시 모낭의 파괴를 일으켜 탈모를 유도하는 것으로 알려져있다[비특허문헌 4].

이러한 탈모증의 치료나 예방에 있어서 현재까지 가장 널리 사용되는 제제는 미녹시딜(Minoxidil) 함유 제제로서, 현재까지 미국 FDA의 승인을 받은 두 가지 발모제 성분 중의 하나입니다. 미녹시딜은 고혈압 치료제이었지만 사용상의 부작용으로 발모 현상이 나타나면서 현재에는 발모제로 더 유명한 약물이 되었다. 미녹시딜의 발모 작용기전에 대해서는 정확히 밝혀져 있지는 않지만, 혈관 확장 효과를 통한 혈류량 증가로 모근에 영양을 공급하여 모발 성장을 촉진하는 것으로 추측하고 있다. 이외에도 머크(Merck)사의 프로페시아(Propecia) 주성분인 피나스테라이드(finasteride)는 남성호르몬 테스토스테론(testosterone)이 더 강력한 형태의 남성호르몬인 디히드로테스토스테론(DHT: dihydrotestosterone)으로 전환되는 것을 억제한다고 알려져 있다.

그러나 현재 주로 사용되고 있는 화학적 탈모 치료제는 장기간 복용시 성호르몬 불균형을 초래하고, 피부염을 일으키는 등 여러가지 부작용이 보고 되고 있다[비특허문헌 5]. 따라서 최근에는 허브와 같은 천연물질에서 탈모 치료제를 개발하려는 노력이 계속 진행되고 있으며[비특허문헌 5 및 6], 천연물질과 기존의 치료제를 혼합사용하여 화학적 치료제의 부작용을 완화하려는 노력이 있어왔다.

갈색거저리에 대한 기능성 연구로는 BACE1(beta secretase 1)의 활성 억제효능과 간암세포의 세포사를 유도시키는 효과 등에 관한 연구결과가 있지만[비특허문헌 7 및 8] 현재까지 갈색거저리를 이용한 탈모에 대한 연구는 확인된 바 없다. 이에 본 연구에서는 곤충의 기능성 연구의 일환으로 모모세포(human keratinocyte, HACAT), 모유두세포(human dermal papilla cell), 섬유아세포(fibroblast, NIH-3T3)에 각각 LPS(lipopolysaccharide), 디하이드로테스토스테론, 톨부타미드(tolbutamide)로 탈모를 유도시킨 세포모델에 갈색거저리 에탄올 추출물을 동시 처리한 후, TNF-α(tumor necrosis factor-α), TGF-β1(transforming growth factor-β1)의 발현이 억제되고, Wnt, IGF-1(insulin-like growth factor-1), 제1형 콜라겐(type-1 collagen)의 생성량이 회복되는 것을 확인함으로서 이 추출물이 탈모 억제 또는 발모에 대한 효능이 있음을 확인하였다.

본 발명자들은 갈색거저리가 갖는 다양한 생리활성을 연구하던 중, 상기 갈색거저리의 추출물이 탈모 억제 및 발모 촉진 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

Choi, G.S. Hair characteristics and androgenetic alopecia in Koreans. J Korean Med Assoc, 2013, 56(1): 45-54. Hamilton, J.B. Patterned loss of hair in man; types and incidence. Annals of the New York Academy of Sciences 1951, 53: 708-728. Seale, L.R.; Eglini, A.N.; McMichael, A.J. Side Effects Related to 5 α-Reductase Inhibitor Treatment of Hair Loss in Women: A Review. J Drugs Dermatol. 2016, 15(4): 414-419. Christoph, T.; Muller-Rover, S.; Audring, H.; Tobin, D.J.; Hermes, B.; Cotsarelis, G.; Rㆌckert, R. Paus R. The human hair follicle immune system: cellular composition and immune privilege. Br J Dermatol. 2000, 142(5): 862-873. Rossi, A.; Cantisani, C.; Melis, L.; Iorio, A.; Scali, E.; Calvieri, S. Minoxidil use in dermatology, side effects and recent patents. Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov. 2012, 6(2): 130-136. Patel, S.; Sharma, V.; Chauhan, N.S.; Thakur, M.; Dixit, V.K. Hair Growth: Focus on Herbal Therapeutic Agent. Curr Drug Discov Technol. 2015, 12(1): 21-42. Youn, K.; Yun, E.Y.; Lee, J.; Kim, J.Y.; Hwang, J.S.; Jeong, W.S.; Jun, M. Oleic acid and linoleic acid from Tenebrio molitor larvae inhibit BACE1 activity in vitro: molecular docking studies. J Med Food. 2014, 17, 284-289. Lee, J.E.; Lee, A.J.; Jo, D.E.; Cho, J.H.; Youn, K.; Yun, E.Y.; Hwang, J.S.; Jun, M.; Kang, B.H. Cytotoxic effects of Tenebrio molitor larval extracts against hepatocellular carcinoma. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2015, 44, 200-207. Christoph, T.; Muller-Rover, S.; Audring, H.; Tobin, D.J.; Hermes, B.; Cotsarelis, G.; Rㆌckert, R. Paus R. The human hair follicle immune system: cellular composition and immune privilege. Br J Dermatol. 2000, 142(5): 862-873.

본 발명의 목적은 갈색거저리 추출물을 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물 을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 갈색거저리 추출물을 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물에 관한 것이다.

상기 갈색거저리 추출물은, 갈색거저리를 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출할 수 있다. 또한 상기 C1~C4 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸로 이루어진 군에서 선택되는 경구형 제형, 외용제, 좌제, 피부외용제 또는 멸균 주사용액의 형태로 이용가능하다.

이에 본 발명은 조성물에 미녹시딜(minoxidil), 피나스테라이드(finasteride) 및 스피로노락톤(spironolactone)로 이루어진 군 중에서 선택된 약물이 추가된 탈모방지 또는 발모촉진용 약학 조성물을 제공할 수 있다.

또다른 양태로서, 본 발명은 갈색거저리 추출물을 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 화장료는 헤어토닉, 헤어크림, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 헤어스프레이, 헤어에어졸, 포마드, 분말, 젤, 솔젤, 에멀젼, 오일, 왁스 및 에어졸로 이루어진 모발용 화장료에서 선택될 수 있다.

본 발명은 또한 갈색거저리 추출물을 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 건강기능식품에 관한 것이다.

상기 건강기능식품은 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제에서 선택될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 갈색거저리 추출물을 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물에 관한 것으로서, 상기 갈색거저리 추출물은, 갈색거저리를 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출할 수 있다. 또한 상기 C1~C4 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 갈색거저리 추출물의 제조시 사용되는 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액은 갈색거저리 사용 중량 기준 1~40배 부피(1kg 기준 1~40ℓ)를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 5~40배 부피를 사용할 수 있다. 상기 갈색거저리 추출물의 추출조건은 20~100℃에서 1분~48시간일 수 있다. 상기 과정은 1~4번까지 반복할 수 있다. 상기 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액은 바람직하게는 50~80%(v/v)의 C1~C4 알코올 수용액일 수 있으며, 더 바람직하게는 50~80%(v/v)의 에탄올 수용액일 수 있다.

또한, 당분야의 통상적인 방법으로서 상기 갈색거저리의 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액 추출물을 물에 녹인 후에 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 클로로포름, 에틸아세테이트, n-부탄올 등에서 선택되는 1종 이상의 용매를 사용하여 추가적으로 분획하여 분획물로 제조할 수 있다.

상기 추출물 또는 이의 분획물의 제조온도는 20 내지 100℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추출 또는 분획 시간은 특별히 제한되는 것은 아니나, 10분 내지 2일 이내에 추출하는 것이 바람직하며, 추출용 기기로는 통상의 추출기기, 초음파분쇄추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 이렇게 제조된 갈색거저리 추출물 또는 분획물은 열풍건조, 감압건조 또는 동결건조하여 용매를 제거할 수 있다. 또한, 상기 갈색거저리 추출물 또는 분획물은 칼럼크로마토그래피를 이용하여 정제하여 사용할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 이온교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography), 실리카겔 진공 액체 크로마토그래피(silica gel vacuum liquid chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 중에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 갈색거저리 추출물을 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 약학 조성물을 제공한다. 상기 갈색거저리 추출물은 본 발명의 약학 조성물에 0.001~100 중량%로 하여 첨가될 수 있다.

상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 피부외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 약학적 조성물 또는 화장료 조성물의 적용 대상이 되는 모발로는, 두발(頭髮), 눈썹(眉毛, 미모), 속눈썹(睫毛, 첩모), 음모(陰毛), 겨드랑이털, 가슴털, 코털, 다리털 등의 각종 체모가 포함될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 유효성분인 펩타이드 뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 또한, 본 발명의 조성물은 상술한 유효성분 이외에, 본 발명의 유효성분에 의한 탈모 방지 또는 발모 촉진 작용을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어 오던 발모제 또는 탈모 방지제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 담체로서, 정제수, 일가 알코올류(에탄올 또는 프로필 알코올), 다가알코올류(글리세롤, 1,3-부티렌글리콜 또는 프로필렌글리콜), 고급지방산류(팔미틸산 또는 리놀렌산), 유지류(소맥 배아유, 동백기름, 호호바유, 올리브유, 스쿠알렌, 해바라기유, 마카데미아땅콩유, 아보가드유, 또는 지방산 글리세라이드) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 필요에 따라, 계면활성제, 보습제, 방부제, 산화방지제 등을 첨가할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 계면활성제로는, 음이온계 계면활성제로서, 알킬벤젠설폰산염, 폴리옥시알킬렌알킬황산 에스테르염, 알킬황산 에스테르염, 올레핀설폰산염, 알킬인산염, 폴리옥시알킬렌알킬에테르 인산염, 디알킬설포석신산염, 지방산염 등을 들 수 있고, 비이온성 계면활성제로서, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌지방산 에스테르, 다가 알콜지방산 부분 에스테르, 폴리옥시에틸렌 다가 알콜지방산 부분 에스테르, 폴리글리세린지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 유도체, 지방산디에탄올아미드 등을 들 수 있다. 또한, 양이온성 계면활성제로서는, 3급 지방족 아민염, 알킬트리메틸암모늄할라이드, 디알킬디메틸암모늄할라이드 등을 들 수 있고, 양쪽성 계면활성제로서는, 아미드베타인형, 이미다졸리늄베타인형, 설포베타인형 등을 들 수 있다. 상기 보습제로서는, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨 등을 들 수 있다. 상기 방부제로서는, 벤조산, 데하이드로아세트산, 파라옥시벤조산에스테르(파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산부틸 등), 페녹시에탄올 등을 들 수 있다. 또한, 상기 산화방지제로서는, 아스코르브산, BHA 등을 들 수 있으며, 이외에도, 자외선 흡수제, 소염제 및 청량제 등을 첨가할 수 있다.

상기 화장료의 제형은 특별히 제한되지는 않지만, 바람직하게는 헤어토닉, 헤어크림, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 헤어스프레이, 헤어에어졸, 포마드, 분말, 젤, 솔젤, 에멀젼, 오일, 왁스 및 에어졸로 이루어진 모발용 화장료에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 갈색거저리 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 건강기능식품을 제공한다. 상기 갈색거저리 추출물은 본 발명의 건강기능식품에 0.001~100 중량%로 하여 첨가될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제 등이 있다.

도 1은 갈색거저리 추출물을 처리한 모모세포(human keratinocyte), 모유두세포(human dermal papilla cell), 섬유아세포(fibroblast)에서의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 LPS(lipopolysaccharide) 처리된 모모세포에서 갈색거저리 추출물이 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 발현을 억제하는 것을 나타내는 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 결과이다.
도 3은 디하이드로테스토스테론(DHT) 처리된 모유두세포에서 갈색거저리 추출물이 Wnt, IGF-1(insulin-like growth factor 1)의 발현을 증가시키고, TGF-β1(transforming growth factor β1)의 발현을 억제하는 것을 나타내는 ELISA 결과이다.
도 4는 LPS(lipopolysaccharide) 처리된 모모세포에서 갈색거저리 추출물이 카스파제-1(caspase-1)의 발현을 억제하는 것을 나타내는 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 결과이다.
도 5는 톨부타마이드(TMB) 처리된 섬유아세포에서 갈색거저리 추출물이 세포증식 효과가 있음을 나타내는 세포생존율 분석 결과와 제1형 콜라겐(Type-1 collagen)의 발현량 증가 효과가 있는 것을 나타내는 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 결과이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 갈색거저리 추출물의 제조>

갈색거저리 추출물 제조를 위해 사용된 3령 갈색거저리 유충은 가나안 농원 (경상남도, korea)에서 구매하여 사용하였다. 살아있는 갈색거저리를 흐르는 물에 2회 세척한 후, -70℃ 냉동고에 동결시킨 다음 동결 건조기(Eyela, Japan)를 이용하여 건조시켜 수분을 제거하고 다기능 분쇄기(Korea Medi, Korea)로 분쇄하여 분말을 제조하였다. 분말 현탁액 제조를 위해 분말을 70%(v/v) 에탄올 수용액에 용해시킨 후 초음파 파쇄기(LabaX, MA, USA)로 230 jule, 20초간 파쇄 후 4500 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 회수한 상층액을 0.25 μm syringe filter(Whatman, ND, USA)로 여과 후 건조하여 시료로 사용하였으며 이하 TME라 명명하여 사용하였다.

<실시예 2. 세포 배양>

모모세포(human keratinocyte, HACAT)는 페니실린-스트렙토마이신 100 unit/㎖과 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco, MD, USA)이 함유된 DMEM(Dublecco's Modified Eagle Medium; Gibco, MD, USA)을 사용하여 배양하였고, 모유두세포(human dermal papilla cell)는 DPM(dermal paphila medium)에서, 섬유아세포(fibroblast, NIH-3T3)는 10% CS(calf serum)이 들어간 DMEM 배지에서 배양하였다. 각 세포의 배양 조건은 37℃, 5% CO₂로 하였고, 2~3일 간격으로 계대 배양하였다.

<실시예 3. 세포 생존율 분석>

세포 생존율 측정을 위해 실시예 2에서 배양하고 있던 각각의 세포를 2×10⁵cells/㎖로 96웰 플레이트(96 well plate)에 분주하고 TME를 농도별(500, 2000 μg/㎖)로 처리 후 37℃, 5% CO₂조건에서 24시간 배양하였다.

세포 생존율은 CellTiter 96^?aqueousnon-radio active cell proliferation assay reagent(Promega, WI, USA)를 첨가한 후, 37℃, 5% CO₂incubator에서 4시간 반응시켜 마이크로플레이트 분석기(microplate reader : Beckman Coulter, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였고, 이를 도 1에 나타내었다.

도 1을 참고하면, 3종 세포 모두 TME 무처리군에 비해 세포생장률이 크게 증가되어(p<0.001) TME가 세포독성이 없는 것으로 확인된다.

<실시예 4. 탈모 관련 사이토카인의 발현량 확인>

모유두세포와 모모세포를 2×10⁵cells/㎖로 6웰 플레이트(6 well plate)에 분주하고 각각 디하이드로테스토스테론(DHT, 10^-5M) 및 LPS(400 ng/㎖)와 갈색거저리 추출물(TME)을 농도별(500, 2000 μg/㎖)로 동시 처리 후 37℃, 5% CO₂조건에서 24시간 배양하였고, 각 세포 배양액을 이용하여 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)를 수행하였다.

모모세포의 배양액에서는 TNF-α의 생성량을, 모유두세포의 배양액에서는 TGF-β1(transforming growth factor β1) ELISA kit (Thermo Fisher, MA, USA, Wnt ELISA kit (LifeSpan BioSciences, WA, USA) 및 IGF1 (insulin-like growth factor 1) ELISA kit (Thermo Fisher, MA, USA)를 이용하여 분석하였고, 450nm에서 흡광도를 찍어 각각 단백질 생성량을 환산한 후 %로 환산하여 수치화시켜 도 2 및 도 3에 그래프로 나타내었다.

도 2를 참고하면, LPS 처리된 모모세포에서 염증성 사이토카인 TNF-α의 단백질 발현이 갈색거저리 추출물(TME)의 처리농도에 따라 감소되는 것이 확인된다. 따라서 갈색거저리 추출물은 비듬균과 같은 병원균에 의해 과도하게 생성된 염증성 사이토카인을 억제함으로서, 염증성 탈모에 효과가 있는 것을 알 수 있다.

또한 도 3을 참고하면, 디하이드로테스토스테론(DHT) 처리된 모유두세포에서 갈색거저리 추출물(TME) 처리 농도에 따라 Wnt와 IGF1은 회복되며 TGFβ-1은 감소하는 것으로 확인된다. 이는 갈색거저리 추출물이 디하이드로테스토스테론으로 인해 활성화되는 안드로겐 수용체 신호전달 과정을 차단하여 안드로겐으로 발생하는 탈모 관련 효과를 억제하기 때문이다.

< 실시예 5. 카스파제 -1 유전자 발현 확인>

모모세포를 2×10⁵cells/㎖로 6웰 플레이트에 분주하여 배양시킨 다음 LPS (400ng/㎖)로 염증성 반응을 유도한 모모세포에 갈색거저리 추출물(TME)을 농도별(500, 2000 μg/㎖)로 동시 처리하여 24시간 배양하였다. 이 후 트리졸 용액(trizol reagent)을 이용해 RNA를 분리한 다음 cDNA를 합성하고 realtime PCR 분석을 통해 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 대비 카스파제-1(caspase-1) 유전자 발현을 조사하였다. 사용된 프라이머의 염기서열은 각각 human GAPDH(sense: AATCCCATCACCATCTTCCA, anti-sense: TGGACTCCACGACGTACTCA)와 human Caspase-1(sense: CTGATCTATCCAAGGGCTGGTG, anti-sense: TTTCTCTCCTCCCTTCTTGTGTG)을 이용해 유전자 분석을 수행하였고, 이에 대한 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4를 참고하면, 세포사멸을 유도하는 카스파제-1(caspase-1)의 유전자 발현이 갈색거저리 추출물(TME)의 처리농도에 따라 감소하는 것으로 확인된다. 따라서 갈색거저리 추출물이 비듬균과 같은 병원균에 의해 유발된 염증 관련 세포사를 억제함으로서, 염증성 탈모에 효과가 있는 것을 알 수 있다.

<실시예 6. 유사분열을 억제시킨 섬유아세포에 대한 TME의 세포생존률과 collagen 생성 회복확인>

섬유아세포를 2×10⁵cells/㎖로 6웰 플레이트에 분주하고 5% CS(calf serum)에 유사분열억제제인 톨부타마이드(TBM, 410 mM)와 갈색거저리 추출물(TME)을 농도별(500, 2000 μg/㎖)로 동시 처리 후 37℃, 5% CO₂조건에서 24시간 배양하였으며, 실시예 3에 개시된 세포 생존율 분석을 통해 세포 독성을 확인하고, type-1 collagen ELISA kit (Cosmo bio, CA, USA)를 통해 세포생존률 및 콜라겐 생성량을 분석하여 각 결과를 도 5에 기재하였다.

도 5A를 참고하면, 톨부타마이드(TBM) 처리로 인해 감소된 세포증식이 갈색거저리(TME)의 농도 의존적으로 회복되는 것이 확인된다. 또한 도 5B를 참고하면, 섬유아세포에 톨부타마이드(TBM) 처리시 억제되었던 제1형 콜라겐(type-1 collagen)의 생성량 역시 회복되는 것을 알 수 있다. 따라서, 갈색거저리는 유사분열 억제된 섬유아세포에 대해 세포생장 및 콜라겐 생성을 회복시켜 모발을 두피에서 건강하게 유지하는 효과를 부가하는 것으로 확인된다.

<제제예 1. 약학적 제제>

제제예 1-1. 정제의 제조

본 발명의 갈색거저리 추출물 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

제제예 1-2. 피부외용제의 제조

갈색거저리 추출물 1.0g, S-니트로소글루타치온 0.04g, 히알루론산 3.0g, 레시틴 3.0g, 디에틸세바케이트 8.0g, 경납 5.0g, 폴리옥시에틸렌올레일에테르 포스페이트 6.0g, 파라옥시안식향산에스테르 적량에 총 중량이 100g이 되도록 바셀린을 혼합하여 피부외용제(연고)를 제조하였다.

<제제예 2. 식품 제조>

제제예 2-1. 조리용 양념의 제조

본 발명의 갈색거저리 추출물을 조리용 양념에 1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

제제예 2-2. 밀가루 식품의 제조

본 발명의 갈색거저리 추출물을 밀가루에 0.1 중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

제제예 2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명의 갈색거저리 추출물을 스프 및 육즙에 0.1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 제조하였다.

제제예 2-4. 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 갈색거저리 추출물을 우유에 0.1 중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

제제예 2-5. 야채주스 제조

본 발명의 갈색거저리 추출물 0.5g을 토마토주스 또는 당근주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.

제제예 2-6. 과일주스 제조

본 발명의 갈색거저리 추출물 0.1g을 사과주스 또는 포도주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

<제형예 1. 화장료 제조>

제형예 1-1. 샴푸의 제조

갈색거저리 추출물 0.01g, S-니트로소글루타치온 0.04g, 히알루론산 1.5g, 레시틴 3.0g, 30% 라우릴황산나트륨 20.0g, 30% 폴리옥시에틸렌라우릴황산나트륨 20.0g, 야자유지방산디에탄올아미드 2.00g, 프로필렌글리콜 2.00g, 코카미도프로필베타인 3.00g, 카르복시비닐폴리머g, 0.30g, 폴리쿼터늄-10 0.50g, 파라옥시안식향산에스테르 0.20g, 구연산 적량g, 향료 적량에 총 중량이 100g이 되도록 정제수를 혼합하여 샴푸를 제조하였다.

제형예 1-2. 헤어토닉의 제조

갈색거저리 추출물 0.1g, S-니트로소글루타치온 0.04g, 히알루론산 1.5g, 레시틴 3.0g, 에탄올 50.00g, L-멘톨 0.10g, D-판테놀 0.20g, 글리세린 3.00g, 살리실산 0.10g, 토포케릴 아세테이트 0.10g, 폴리옥시에칠렌경화피마자유 0.50g, 향료 적량에 총 중량이 100g이 되도록 정제수를 혼합하여 헤어토닉 조성물을 제조하였다.

Claims

갈색거저리 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 갈색거저리 추출물은, 갈색거저리를 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출한 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 C1~C4 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸로 이루어진 군에서 선택되는 경구형 제형, 외용제, 좌제, 피부외용제 또는 멸균 주사용액의 형태인 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.
제1항의 조성물에 미녹시딜(minoxidil), 피나스테라이드(finasteride) 및 스피로노락톤(spironolactone)로 이루어진 군 중에서 선택된 약물이 추가된 탈모방지 또는 발모촉진용 약학 조성물.
갈색거저리 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물.
제6항에 있어서,
상기 화장료는 헤어토닉, 헤어크림, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 헤어스프레이, 헤어에어졸, 포마드, 분말, 젤, 솔젤, 에멀젼, 오일, 왁스 및 에어졸로 이루어진 모발용 화장료에서 선택되는 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물.
갈색거저리 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모촉진용 건강기능식품.
제8항에 있어서,
상기 건강기능식품은 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제에서 선택되는 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모촉진용 건강기능식품.