KR102253131B1 - 갈색거저리 오일을 포함하는 골형성 촉진용 약학적 조성물 - Google Patents
갈색거저리 오일을 포함하는 골형성 촉진용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 갈색거저리 오일을 포함하는 골형성 촉진용 약학적 조성물, 골형성 촉진용 식품 조성물, 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 골질환 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명은 조골세포 분화를 촉진시키는 갈색거저리 오일을 유효성분으로 포함함으로써 골형성 촉진, 골소실 또는 골 대사 불균형으로 인한 골질환의 효과적인 예방 및 치료, 성장기의 골강화 및 성장발육에 도움을 줄 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 갈색거저리 오일을 포함하는 골형성 촉진용 약학적 조성물, 골형성 촉진용 식품 조성물, 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 골질환 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
골조직은 골 재형성(bone remodeling) 과정을 통해 골 항상성(skeletal homeostasis)을 유지하며 골량(bone mass)은 노화된 골을 흡수하는 파골세포와 뼈기질을 합성하고 채우는 조골세포의 상반된 작용에 의해 결정된다. 골 재형성 과정은 국소적으로 좁은 부위에서 일정한 주기로 일어나고, 골격계의 구조와 기능은 전신적인 호르몬과 국소적 인자 사이의 상호작용에 의해 조절된다.
조골세포와 파골세포 활성간의 불균형은 전체적인 뼈의 감소(osteoporosis)나 증가(osteosclerosis)로 인한 골격의 이상을 유발한다. 이와 같은 골 대사 불균형으로 인한 골질환의 예방 또는 치료 측면에서 젊은 때부터 골질량을 높이는 것이 상당히 중요하며, 뼈의 건강을 유지하는 것은 성별이나 연령과 관계없이 중요한 문제이다. 이에, 최근 가장 흔한 골질환인 골다공증의 예방 및 치료를 위해서도 골형성 증가 및 골조직 재생능력에 미치는 영향 등에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.
한편, 갈색거저리(Tenebrio molitor)는 딱정벌레목 거저리과(Tenebrionidae)에 속하는 곤충으로, 한국을 비롯한 전세계에 분포되어 있다. 갈색거저리의 유충은 밀웜(mealworm)이라 하는데 단백질 함량이 50~55%로 높고 성장이 빠르며 번식률이 매우 높아 미래식량자원으로 주목 받고 있다. 최근 갈색거저리에 대한 연구가 활발히 이루어져 혈관확장, 혈액순환 개선, 발기부전 예방, 기억력 증진, 치매예방, 혈당강하, 항염, 항산화, 피부 미백 등에 효과적인 것으로 알려져 있다. 갈색거저리 유충에는 풍부한 단백질과 17종의 아미노산이 함유되어 있으며 그 중 알코올성 간 독성에 효과가 있는 글리신, 알라닌, 세린을 비롯하여 어린이들의 성장호르몬 합성 및 성인 체내에서 혈액순환 개선에 관여하는 아르기닌이 다량 함유되어 다양한 효능을 보이는 것으로 예상되고 있다. 한편, 갈색거저리로부터 추출된 오일 및 이의 기능성에 대한 연구는 미미한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 골소실로 인한 골질환의 효과적인 예방과 치료를 가능하게 하는 곤충 유래의 새로운 신약 후보물질을 연구하던 중, 갈색거저리 오일이 조골세포의 분화 및 골형성을 촉진시키는 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 갈색거저리 오일을 포함하는 골형성 촉진용 약학적 조성물 및 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 갈색거저리 오일을 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 골질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 갈색거저리 오일을 포함하는 골형성 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 갈색거저리 오일을 포함하는 골형성 촉진용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 갈색거저리 오일을 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 갈색거저리 오일을 포함하는 골질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명은 조골세포 분화를 촉진시키는 갈색거저리 오일을 유효성분으로 포함함으로써 골형성 촉진, 골소실 또는 골 대사 불균형으로 인한 골질환의 효과적인 예방 및 치료, 성장기의 골강화 및 성장발육에 도움을 줄 것으로 기대된다.
도 1은 갈색거저리 오일 농도(0.5, 1, 2, 5, 8, 10%(v/v))에 따른 세포 생존율측정 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 갈색거저리 오일 농도(0.5, 1, 2, 5, 8, 10%(v/v))에 따른 ALP 활성 측정 결과를 나타낸 도이다(*p<0.05).
도 3은 갈색거저리 오일 농도(0.5, 1, 2, 5, 8, 10%(v/v))에 따른 ALP 활성 측정 결과(세포 염색)를 나타낸 도이다.
도 4는 조골세포 분화 관련 유전자(ALP, Runx2) 발현 변화를 확인한 도이다(*p<0.05).
도 5는 조골세포 분화 관련 단백질(ALP, Runx2) 발현 변화를 확인한 도이다(*p<0.05).
도 2는 갈색거저리 오일 농도(0.5, 1, 2, 5, 8, 10%(v/v))에 따른 ALP 활성 측정 결과를 나타낸 도이다(*p<0.05).
도 3은 갈색거저리 오일 농도(0.5, 1, 2, 5, 8, 10%(v/v))에 따른 ALP 활성 측정 결과(세포 염색)를 나타낸 도이다.
도 4는 조골세포 분화 관련 유전자(ALP, Runx2) 발현 변화를 확인한 도이다(*p<0.05).
도 5는 조골세포 분화 관련 단백질(ALP, Runx2) 발현 변화를 확인한 도이다(*p<0.05).
본 발명은 갈색거저리 오일을 포함하는 골형성 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
본 발명에 있어서, 갈색거저리 오일은 시판되는 갈색거저리 오일을 사용하거나 또는 수증기증류법, 열수추출법, 용매추출법, 압착법, 탄산가스추출법, 환류냉각 추출법, 냉침법 및 용출법 등 천연물로부터 오일을 추출하는 방법으로서 당업계에 알려진 다양한 방법을 통해 제조된 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 갈색거저리 오일은 갈색거저리 유충을 절식시키고 세척 및 탈수한 후 건조기를 사용하여 건조하고, 건조된 갈색거저리 유충을 압착하여 착유하는 방식으로 제조될 수 있다. 상기 건조는 열풍을 가하거나, 적외선을 조사하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 갈색거저리 오일은 갈색거저리 유충 건조 전 마이크로파를 조사하여 가열 전처리하는 단계를 더 수행하여 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 갈색거저리 오일은 착유된 후 착유하여 얻은 기름을 저온저장한 후, 생성된 침전물을 제거하고 원심분리하여 상층액만을 수거하는 단계를 더 포함하여 제조될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, (제1단계) 갈색거저리 유충을 건조하는 단계; (제2단계) 건조된 갈색거저리 유충을 압착하여 착유하는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 갈색거저리 오일을 사용하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 인간 골육종으로부터 추출된 세포로 ALP(Alkaline phosphatase), Runx2(Runt-related transcription factor 2) 및 OPG(Osteoprotegerin) 등 다양한 골 형성 관련 인자들이 발현되어 골 형성 연구에 폭넓게 사용되는 MG-63 세포를 사용하여, 갈색거저리 오일 처리에 따라 조골세포의 분화 활성이 증가하고, 조골세포 분화 관련 유전자 또는 단백질 발현이 현저히 증가함을 확인하여, 본 발명에 따른 갈색거저리 오일이 골성장, 골형성 촉진을 효과적으로 도울 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 골형성의 촉진 또는 골질환의 예방 또는 치료를 목적으로 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하여 약학적 조성물로 제제화될 수 있으며, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있다.
상기 약학적으로 허용가능한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한다. 또한, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함한다. 경구용 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 포함할 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함할 수 있다. 경구용 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 비경구용 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제를 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함한다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
상기 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 상기 약학적 조성물의 1일 투여량은 0.1 내지 300 ㎎/㎏/일 또는 약 0.5 내지 50 ㎎/㎏/일 또는 약 1 내지 10 ㎎/㎏/일의 투여량이 일반적으로 충분하다.
또한, 본 발명은 갈색거저리 오일을 포함하는 골형성 촉진용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물이 식품용으로 사용되는 경우, 상기 식품 조성물은 건강기능식품으로서 그 자체로 제형화를 거쳐 사용되거나, 건강기능식품의 첨가물로서 다른 건강기능식품에 포함될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 식품 첨가물의 제조에 사용되는 통상의 성분들, 구체적으로, 향미제; 천연 탄수화물로서 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제; 영양제; 비타민; 전해질; 착색제; 유기산; 보호성 콜로이드 증점제; pH 조절제; 안정화제; 방부제; 글리세린; 알코올; 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물 또는 건강기능식품은 골형성, 골강화 또는 성장발육 촉진을 목적으로 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안정청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 갈색거저리 오일을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와의 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다.
또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 제피제로 제피할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질캅셀제는 통상의 경질캅셀에 갈색거저리 오일을 부형제 등의 첨가제와의 혼합물 또는 그의 입상물 또는 제피한 입상물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캅셀제는 갈색거저리 오일을 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 갈색거저리 오일과 부형제, 결합제, 붕해제 등과의 혼합물을 적당한 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.
과립형태의 건강기능식품은 상기 갈색거저리 오일과 부형제, 결합제, 붕해제 등과의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다.
또한, 본 발명은 갈색거저리 오일을 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 갈색거저리 오일을 포함하는 골질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 있어서, 용어 “골질환”은 골형성과 골흡수의 균형이 깨짐으로써 발병하는 모든 골 관련 질환을 제한 없이 포함하며, 예를 들어 골다공증(osteoporosis), 불유합(non-union) 골절, 골괴사증(osteonecrosis), 골연화증(osteomalacia), 골결손, 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 골관절염(osteoarthritis), 치주질환(periodontal disease), 무혈성 대퇴골괴사(Avascular necrosis of the Femoral Head) 등이 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 조성물이 조골세포 분화를 유도 및 촉진할 수 있음을 확인하여, 갈색거저리 오일이 골형성 활성을 가지며, 잠재적인 뼈 재생성 치료제로 사용될 수 있고, 이를 통해 골질환의 개선, 치료 또는 예방 효과를 나타낼 수 있음을 확인하고 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
1. 실험 준비
갈색거저리 유충 오일은 사육농가로부터 구입한 갈색거저리 유충(Tenebrio molitor)을 중적외선 건조기(MS3-6, Lichtzen, Korea)를 이용하여 건조 후 수분함량이 3.5%인 건조 갈색거저리 유충을 착유기(명진종합기계)에서 500 kgf/cm2의 압력으로 착유하여 준비하였다. 시료량은 2 kg씩 나누어 착유하였으며, 착유 시간은 압력도달시간 15분, 압력지속시간 15분으로 설정하여 착유하였다. 착유된 오일은 Filtration 후 사용 전까지 4℃에 냉장보관하여 사용하였다.
인간유래 MG-63 조골세포는 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며 10% FBS (fetal bovine serum) (Hyclone, Logan, UT, USA)와 1× 페니실린-스트렙토마이신 (Hyclone)이 첨가된 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium) (Hyclone)을 사용하여 배양하였고 세포는 37℃, 5% CO2의 배양조건을 유지하였다. 세포가 충분히 성장하는 2-3일 간격으로 계대 배양하며 실험을 진행하였다.
실시예
2.
갈색거저리
오일이 조골세포의 생존능력에 미치는 영향 관찰
본 발명에 따른 갈색거저리 오일이 MG-63 조골세포의 증식 및 독성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 세포 독성 실험을 수행하였다. 구체적으로, 본 발명에 따른 갈색거저리 유충 오일이 MG-63 조골세포의 세포독성 및 세포증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 세포를 96-웰 플레이트에 5.0 × 103 cells/웰로 분주하여 세포밀도(confluence)가 약 80%에 도달할 때까지 10% FBS가 들어있는 배지에서 약 24시간 동안 배양하였다. 그 후 갈색거저리 유충 오일을 농도(0.5, 1, 2, 5, 8, 10%(v/v))에 따라 처리하고 24시간 및 48시간 동안 추가 배양한 후 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) reagent를 사용하여 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 갈색거저리 오일은 10%(v/v) 범위까지 MG-63 세포 독성을 유발하지 않았으며, 48시간 동안 배양한 경우 0.5%(v/v)부터 농도의존적으로 세포 생존율이 증가함을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 갈색거저리 오일이 우수한 세포증식 효능을 발휘함을 확인하였다. 이후 실험은 갈색거저리 오일을 8% 이하의 농도로 사용하였다.
실시예
3.
갈색거저리
오일이 조골세포의 분화에 미치는 영향 관찰
3-1. ALP 활성 측정
염기성 인산 분해 효소(alkaline phosphatase, ALP)는 거의 모든 조직에 분포하며 특히 골 조직에서는 골 성장이 일어날 때 그 활성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 조골세포에서 조골세포 분화의 조기 분화 마커이며 골 기질(bone matrix) 단백질인 ALP 활성을 측정하여 갈색거저리 오일이 조골세포의 골 세포 분화에 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로, 인간 조골 세포주 MG-63을 사용하여 갈색거저리 오일을 농도(0.5, 1, 2, 5, 8, 10%(v/v))에 따라 처리한 후 시간(3일 또는 5일)에 따라 배양하였다. 그 다음 ALP 키트를 이용하여 ALP 효소 활성을 측정하였다. 구체적으로, MG-63세포를 96-웰 플레이트에 1.5 × 104 cells/웰 농도로 분주하여 24시간 배양한 다음, 갈색거저리 유충 오일을 농도별(0.5, 1, 2, 5, 8, 10%(v/v))로 처리하고 2일마다 배지를 갈아주며 5일간 배양하였다. 배양한 세포는 PBS로 세척하고 0.1% Triton X-100을 20 μl씩 분주하여 37℃5% CO2 조건에서 30분간 용해시킨 후, 100 l의 p-NPP (sigma)을 분주하여 30분간 반응시켰다. 반응 후 3 M NaOH로 반응을 정지한 후 405 nm에서 흡광도를 측정하여 ALP 효소에 의해 p-나이트로페놀(p-nitrophenol)로 전환된 양을 측정하였고 이를 통해 ALP 효소 활성을 산출하였다. 조골세포의 ALP 활성은 시료 처리를 하지 않은 대조군(control, CTR) 군에 대한 비율로 나타내었으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 갈색거저리 오일을 농도별로 처리한 결과 0.5% 농도부터 활성이 유의적으로 증가하였고 8% 농도에서는 대조군에 비해 1.8배 정도 활성이 증가하는 것으로 나타났다 (*p<0.05).
상기 조골세포의 ALP 활성 및 조골세포의 분화 정도를 확인하기 위하여 ALP 염색을 통해 염색 정도를 확인하였다. 구체적으로, MG-63세포를 96-웰 플레이트에 1.5 × 104 cells/웰 농도로 분주하여 24시간 배양한 다음, 농도별 갈색거저리 유충 오일(0.5, 1, 2, 5, 8, 10%(v/v))을 처리하여 2일마다 배지를 갈아주며 5일간 배양하였다. 배양된 세포는 PBS로 세척하였고 10% 포르말린을 사용하여 세포를 고정한 후, BCIP/NBT 기질 용액 (sigma)을 분주하여 빛이 없는 조건에서 방치하였다. 세포에 푸르게 염색된 정도를 통해 조골세포의 분화 및 ALP 활성을 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 세포 염색결과도 갈색거저리 오일의 농도에 비례하여 푸른색이 더욱 진하게 염색된 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 갈색거저리 오일은 MG-63 조골세포의 ALP 활성을 증가시키며, 이에 따라 조골세포의 분화를 증가시켜 골 성장 촉진에 도움을 줄 수 있음을 확인하였다.
3-2. 조골세포 분화 관련 유전자 발현 측정
본 발명에 따른 갈색거저리 오일이 조골세포에서 조골세포 분화 유전자 마커인 alkaline phosphatase(ALP) 및 Runt-related transcription factor 2(Runx2)의 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로, 본 발명에 따른 갈색거저리 오일을 처리하고 5일 후, MG-63 조골세포로부터 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, alkaline phosphatase(ALP) 유전자는 발현량이 대조군에 비하여 농도 의존적으로 약 2배까지 증가하였음을 확인하였다. Runt-related transcription factor 2(Runx2) 유전자 역시 ALP의 발현양상과 유사하게 8% 농도에서 대조군에 비해 약 4배의 매우 높은 발현량 증가율을 나타내었다. 상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 갈색거저리 오일은 ALP 및 Runx2 유전자 발현을 촉진시키며, 따라서 조골세포의 분화 및 골 형성을 효과적으로 촉진할 수 있음을 확인하였다.
3-3. 조골세포 분화 관련 단백질 발현 측정
본 발명에 따른 갈색거저리 오일이 조골세포에서 조골세포 분화 유전자 마커인 alkaline phosphatase(ALP) 및 Runt-related transcription factor 2(Runx2)의 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로, 본 발명에 따른 갈색거저리 오일을 처리하고 5일 후, MG-63 조골세포로부터 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 양성 대조군으로는 분화유도배지(differentiation medium, DM; 10 mM β(β-글리세로포스페이트)와 50 ㎍/mL 아스코르브산(ascorbic acid) 첨가)를 사용하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, ALP 단백질의 경우 앞서 유전자 발현을 확인한결과와 유사하게 갈색거저리 오일의 농도가 증가함에 따라 농도의존적으로 발현이 증가함을 확인하였다. Runx2 단백질의 경우 마찬가지로 앞서 유전자 발현을 확인한 결과와 유사하게 1%, 2%(v/v) 농도에서는 발현이 증가하지 않았으나 4%, 8%(v/v) 농도에서는 갈색거저리 오일의 농도에 따라 발현이 증가됨을 확인하였다. 한편, 양성 대조군인 DM군에서는 Runx2의 발현량이 증가하지 않았는데 이는 Runx2의 발현은 아스코르브산으로부터 영향을 받지 않는 이전의 연구에 부합하는 결과인 것으로 생각되었다. 상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 갈색거저리 오일은 MG-63 조골세포에서 ALP 및 Runx2의 단백질 발현을 증가시키며, 이를 통해 MG-63 조골세포의 분화 및 골 형성을 촉진하고, 궁극적으로 골다공증을 비롯한 다양한 골질환 예방 및 치료에 도움을 줄 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 조성물은 조골세포 분화를 촉진시키는 갈색거저리 오일을 유효성분으로 포함함으로써 골형성 촉진, 골소실 또는 골 대사 불균형으로 인한 골질환의 효과적인 예방 및 치료, 성장기의 골강화 및 성장발육에 도움을 줄 것으로 기대된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (7)
- 건조 갈색거저리를 착유하여 수득한 갈색거저리 오일을 포함하는 골형성 촉진용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 갈색거저리 오일은 조골세포 분화 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 갈색거저리 오일은 조골세포에서 ALP(alkaline phosphatase) 또는 Runx2(Runt-related transcription factor 2) 유전자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 건조 갈색거저리를 착유하여 수득한 갈색거저리 오일을 포함하는 골형성 촉진용 식품 조성물.
- 건조 갈색거저리를 착유하여 수득한 갈색거저리 오일을 포함하는 골다공증, 골괴사증, 골연화증, 골감소증, 골위축증 및 무혈성 대퇴골 괴사로 이루어진 군으로부터 선택되는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 삭제
- 건조 갈색거저리를 착유하여 수득한 갈색거저리 오일을 포함하는 골다공증, 골괴사증, 골연화증, 골감소증, 골위축증 및 무혈성 대퇴골 괴사로 이루어진 군으로부터 선택되는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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