WO2020222369A1 - 골다공증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

골다공증 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2020222369A1
WO2020222369A1 PCT/KR2019/012105 KR2019012105W WO2020222369A1 WO 2020222369 A1 WO2020222369 A1 WO 2020222369A1 KR 2019012105 W KR2019012105 W KR 2019012105W WO 2020222369 A1 WO2020222369 A1 WO 2020222369A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
composition
extract
preventing
gentianweed
treating osteoporosis
Prior art date
Application number
PCT/KR2019/012105
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김홍식
Original Assignee
(주)펜즈
김홍식
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)펜즈, 김홍식 filed Critical (주)펜즈
Priority to US16/976,367 priority Critical patent/US20210000900A1/en
Priority to JP2020544900A priority patent/JP7089044B2/ja
Priority to CN201980018273.XA priority patent/CN112153976B/zh
Priority to EP19917527.4A priority patent/EP3750550B1/en
Publication of WO2020222369A1 publication Critical patent/WO2020222369A1/ko
Priority to US17/566,408 priority patent/US11786572B2/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/35—Caprifoliaceae (Honeysuckle family)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/51—Gentianaceae (Gentian family)
    • A61K36/515—Gentiana
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/331—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using water, e.g. cold water, infusion, tea, steam distillation or decoction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/37—Extraction at elevated pressure or temperature, e.g. pressurized solvent extraction [PSE], supercritical carbon dioxide extraction or subcritical water extraction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Definitions

  • the present invention relates to a composition for the prevention or treatment of osteoporosis, comprising the gentianweed and sphagnum extract.
  • Osteoblast progenitor cells are differentiated by various factors (BMP, ALP, TGF- ⁇ ) to change into osteoblasts, and fully differentiated osteoblasts are bone cells in the bone matrix by non-protein and protein components. osteocyte) form.
  • osteoblasts produce RANKL (receptor activator of NF-kB ligand) and its decoy receptor, OPG (osteoprotegerin).
  • osteoclasts A very important process in bone resorption is differentiation into osteoclasts.
  • the main ligand that mediates the differentiation is RANKL, and when RANKL binds to RANK, a receptor on the surface of osteoclast progenitor cells, osteoclasts become osteoclasts. It is maturation and bone resorption occurs.
  • genes that play an essential role in osteoclast differentiation are substances such as NF-kB and c-FOS.
  • osteoclasts that occur in blood cells (hematopoietic stem cells), which make holes in the bones and release a small amount of calcium into the bloodstream and are used to maintain body functions.
  • osteoblasts generated from bone cells fill the holes with collagen and cover the calcium and phosphorus deposits (hydroxyapatite) to make new hard bones and rebuild the skeleton.
  • osteoporosis is a representative disease.
  • osteoporosis Currently known treatment methods for osteoporosis include estrogen therapy, calcitonin therapy, calcium supplementation, and vitamin D derivative therapy, but the most commonly used methods are estrogen therapy and calcitonin therapy, but various side effects and administration timing are controlled. It is reported that there is a disadvantage that is difficult to do. Therefore, in recent years, research has been conducted to treat osteoporosis by developing natural products that have no side effects and are inexpensive.
  • Korean Patent Application Publication No. 10-2017-0054115 discloses a pharmaceutical composition for preventing or treating osteoporosis including an extract from germinated soybeans, and Korean Patent Publication No. 10-178311
  • a composition for the prevention or treatment of bone metabolic diseases containing a complex extract of Schisandra chinensis, chinensis and Goji chinensis as an active ingredient.
  • an object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating osteoporosis capable of increasing bone formation and inhibiting bone resorption.
  • composition for preventing or treating osteoporosis including the natural products gentianweed and sphenoid alley extract, which improves biocompatibility and has no side effects, and thus stably exhibits the effect of preventing or treating osteoporosis.
  • composition for the prevention or treatment of osteoporosis comprising the gentianweed and the alley extract according to an embodiment of the present invention.
  • the mixed weight ratio of the gentianweed extract and the sphenoid extract may be 1:0.1-10.
  • It may contain the extract of the gentianweed and the alley in an amount of 0.001 to 100% by weight based on the total weight of the composition.
  • the gentianweed and the alley extract may be extracted by hot water extraction.
  • the composition can improve the expression of genes related to bone formation.
  • the genes related to bone formation may be one or more genes selected from the group consisting of ALP, Osteocalcin, BMP, TGF- ⁇ , and osteoprotegerin.
  • the composition can inhibit the expression of genes related to bone resorption.
  • the genes related to bone formation may be one or more genes selected from the group consisting of NF-kB, c-FOS, NFATC-1, Cathepsin K, and MMP-9.
  • the present invention provides a method for preparing a composition for preventing or treating osteoporosis according to another embodiment.
  • step 2) It may include the step of concentrating the extract obtained from step 1) under reduced pressure.
  • the heating temperature in step 1) may be 80 to 100°C.
  • Step 2) may be a step performed at 30 ⁇ 70 °C.
  • composition for preventing or treating osteoporosis according to the present invention can provide an effect of increasing bone formation and inhibiting bone resorption.
  • composition for preventing or treating osteoporosis according to the present invention may stably provide an effect of preventing or treating osteoporosis since it has high biocompatibility and has no side effects, by including the natural gentianweed and the alley extract as main components.
  • FIG. 1 is a result of measuring the ALP activity according to the concentration of the extract according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 1A is Reference Example 1
  • FIG. 1B is Reference Example 2
  • FIG. 1C is Example 1
  • FIG. 1D is an Example. 2
  • FIG. 1E is a result corresponding to Example 3.
  • Figure 2 is a result of measuring the activity of the tartrate-resistant acid phosphate (TRAP) enzyme according to the concentration of the extract according to an embodiment of the present invention
  • Figure 2A is Reference Example 1
  • Figure 2B is Reference Example 2
  • Figure 2C is Example 1
  • FIG. 2D are results corresponding to Example 2
  • FIG. 2E is a third example.
  • FIG. 3 is a result of measuring the amount of ALP gene expression according to the concentration of the extract according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 3A is a reference example 1
  • FIG. 3B is a reference example 2
  • FIG. 3C is an example 1
  • FIG. 3D is Example 2 and FIG. 3E are results corresponding to Example 3.
  • Figure 4 is a result of measuring the amount of expression of Osteocalcin gene according to the concentration of the extract according to an embodiment of the present invention
  • Figure 4a is Reference Example 1
  • Figure 4B is Reference Example 2
  • Figure 4C is Example 1
  • Figure 4D is Example 2
  • FIG. 4E are results corresponding to Example 3.
  • Figure 5 is a result of measuring the amount of NFATC-1 gene expression according to the concentration of the extract according to an embodiment of the present invention
  • Figure 5a is Reference Example 1
  • Figure 5b is Reference Example 2
  • Figure 5c is Example 1
  • Figure 5 5D is a result corresponding to Example 2
  • FIG. 5E is Example 3.
  • Figure 6 is a result of measuring the Cathepsin K gene expression amount according to the concentration of the extract according to an embodiment of the present invention
  • Figure 6a is Reference Example 1
  • Figure 6b is Reference Example 2
  • Figure 6c is Example 1
  • Figure 6d Is a result corresponding to Example 2
  • FIG. 6E is Example 3.
  • FIG. 7 is a result of measuring the amount of MMP-9 gene expression according to the concentration of the extract according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 7A is Reference Example 1
  • FIG. 7B is Reference Example 2
  • FIG. 7C is Example 1
  • FIG. 7D is a result corresponding to Example 2
  • FIG. 7E is Example 3.
  • composition for preventing or treating osteoporosis contains a gentian herb and an alley extract as active ingredients.
  • Gentian herb used in the present invention is Gentian scabra Bunge var. buergeri (Miquel) Maxim, mainly distributed in Korea, Japan, northeastern China, and eastern Siberia. It is a perennial plant of the gentian gentian family, a dicotyledonous plywood group, and grows in the grassland of mountain regions.
  • the known efficacy and effect is that it has the effect of making the liver and phlegm angry, and it is used as a cheongyeol-moisture, sagan chatter, bitter dry placebo, and heat-draining medicine, and is effective in digestion, hyperactivity of the liver, and anti-inflammatory.
  • the present inventors have confirmed the effect of promoting bone formation and inhibiting bone resorption as a new effect of the gentian herb, and it has been confirmed that the gentian herb can be usefully used for preventing or treating osteoporosis among bone metabolic diseases.
  • gentianweed is geonwi, swelling, improvement, epilepsy, swelling, gyeongpung, roundworm, heart disease, eczema, gastritis, and hyperacidity.
  • gastric acidosis gastric catarrhal, and gastric diseases
  • the gentianweed may be a leaf, a shoot, a stem, or a root of a gentian, but is not limited thereto. It is preferably root.
  • the graft alley used in the present invention is Sambucus williamsii, a lead-leaved shrub belonging to the genus Elderberry, and has the effect of active blood circulation, so it is effective for customary arthritis, low back pain, fractures, trauma bleeding, and is mainly used for removal of blood stagnation and bruises after childbirth. .
  • the present inventors have confirmed that the bone alley can promote bone formation and inhibit bone resorption, and thus, it has been confirmed that it can be usefully used for preventing or treating osteoporosis among bone metabolic diseases.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays the onset of osteoporosis by administration of the composition.
  • treatment refers to any action in which symptoms caused by osteoporosis are improved or beneficially changed by administration of the composition.
  • the extract may be obtained by any one or more methods selected from a solvent extraction method, an ultrasonic extraction method, a supercritical extraction method, a fermentation method, and an extraction method by a foaming method, but is not limited thereto.
  • the solvent extraction method is characterized by using water, a C 1 to C 4 lower alcohol or a mixed solvent thereof.
  • the solvent extraction method is preferably used as the extraction method, and more preferably, a solvent extraction method using hot water is used, but is not limited thereto.
  • the solvent extraction method using hot water can safely extract the active ingredient contained in the natural product, and by extracting without using a compound, it is possible to reduce side effects that may occur from the final product or composition, and increase biocompatibility. .
  • the mixed weight ratio of the gentian extract and the sphenoid alley extract may be 1:0.1-10, preferably 1:0.4-2.5, but is not limited thereto.
  • the mixing weight ratio is 1:0.1 to 10
  • the effect of improving bone formation and the inhibitory effect on bone resorption may be balanced with each other.
  • the gentianweed and sphagnum extract may be included in an amount of 0.001 to 100% by weight based on the total weight of the total composition, preferably 0.001 to 50% by weight, more preferably 0.001 to 20% by weight, but is not limited thereto.
  • the extract is less than 0.001% by weight of the total composition, the concentration is too low, and the effect of inducing bone formation and inhibiting bone resorption may be insufficient.
  • the gentianweed extract may be included in an amount of 0.001 to 99.999% by weight based on the total composition, preferably 0.001 to 80% by weight, more preferably 30 to 70% by weight, but is not limited thereto.
  • the bone alley extract may be included in an amount of 0.001 to 99.999% by weight, preferably 0.001 to 80% by weight, more preferably 30 to 70% by weight, but is not limited thereto.
  • the composition may improve the expression of genes related to bone formation, wherein the expression of the gene means that the expression of the gene occurs together in the process of differentiating osteoblasts into osteoblasts or in the process of changing the osteoblasts into osteoblasts, and ,
  • the gene may be one or more genes selected from the group consisting of ALP, Osteocalcin, BMP, TGF- ⁇ , and osteoprotegerin, preferably ALP and Osteocalcin, the most important factor in the process of differentiating osteoblasts into osteoblasts
  • ALP ALP
  • Osteocalcin preferably ALP and Osteocalcin
  • the ALP is a gene that exists in bone tissue and is known to increase its activity when bone growth occurs actively.
  • Osteocalcin refers to a protein synthesized by osteoblasts during bone remodeling and bound to the extracelluar matrix of bone.
  • the composition may inhibit the expression of genes related to bone resorption, and at this time, it means that the expression of the gene occurs together in the process of differentiation into osteoclasts.
  • the gene may be one or more genes selected from the group consisting of NF-kB, c-FOS, NFATC-1, Cathepsin K and MMP-9, preferably NFATC-1, Cathepsin K, and MMP-9. At least one gene selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • NFATC-1 is a gene whose expression increases during the differentiation process of osteoclasts
  • Cathepsin K and MMP-9 are genes whose expression levels increase when the osteoclast differentiation process continues.
  • composition of the present invention may be used as a pharmaceutical composition, and may further include at least one additive selected from the group consisting of a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, and diluent.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as a pharmaceutically acceptable styrene, acetate, acetate, and acetate.
  • the composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the composition including a pharmaceutically acceptable carrier may be in various oral or parenteral formulations. In the case of formulation, it is prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants that are usually used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and these solid preparations include at least one excipient in one or more compounds, such as starch, calcium carbonate, sucrose, or lactose ( lactose), gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquid solutions, emulsions, and syrups.In addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, various excipients such as humectants, sweeteners, fragrances, preservatives, etc. have.
  • Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • the non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate may be used.
  • As a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogelatin, and the like can be used.
  • composition of the present invention includes oral administration agents such as tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, liquid solutions, emulsions, and syrups; And as a sterile injection solution, it may be formulated and used in the form of an aqueous solution, a non-aqueous solvent, a suspension, and a parenteral administration such as an emulsion, a freeze-dried preparation, and a suppository.
  • oral administration agents such as tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, liquid solutions, emulsions, and syrups
  • a sterile injection solution it may be formulated and used in the form of an aqueous solution, a non-aqueous solvent, a suspension, and a parenteral administration such as an emulsion, a freeze-dried preparation, and a suppository.
  • the administration route of the composition may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the composition of the present invention may be administered intraperitoneally, intravenously, intravenously, intramuscularly, intraosseous, intrauterine, dural administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, rectal administration.
  • Intravascular administration can be injected into the cerebrovascular (intracerebroventricular), but is not limited thereto.
  • the composition may be administered by any device capable of moving the active substance to the target cell.
  • composition of the present invention can be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the term "pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type and severity of the individual, age, sex, and type of infected virus. , Drug activity, sensitivity to drugs, time of administration, route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • composition of the present invention may be administered in an amount of 0.01g to 20g per day based on the mixed use amount of gentianweed and sphenoid.
  • an extract prepared using gentianweed and apex alley in the above content range may be considered as a daily dosage.
  • composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or administered in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent. And can be administered single or multiple. It is important to administer an amount capable of obtaining the maximum effect in a minimum amount without side effects in consideration of all the above factors, and can be easily determined by a person skilled in the art.
  • composition of the present invention may be used alone for the prevention or treatment of osteoporosis, or in combination with surgery, hormone therapy, drug therapy, and methods of using a biological response modifier.
  • the present invention provides a food composition for preventing or improving osteoporosis, comprising the gentianweed and the sphenoid alley extract as active ingredients.
  • the gentianweed and the extract of the alley are the same as described above.
  • the gentianweed and the extracts of apex alley can be prepared and consumed in the form of food that can improve osteoporosis while having common sense.
  • the content of the gentianweed and the extract of the alley in the food is not particularly limited thereto, but may be included in an amount of 0.001 to 100% by weight based on the total weight of the food composition as an example.
  • the food is a beverage, it may be included in a ratio of 0.01 to 60 g based on 100 ml as an example, and 0.1 to 60 g as another example.
  • the composition may include additional ingredients that are commonly used in food compositions to improve smell, taste, vision, and the like.
  • vitamins A, D, E, B1, B2, B6, B12, niacin, biotin, folate, panthotenic acid, and the like may be included.
  • minerals such as zinc (Zn), iron (Fe), calcium (Ca), chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn), and copper (Cu) may be included.
  • amino acids such as lysine, tryptophan, cysteine, and valine may be included.
  • preservatives (potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, sodium dehydroacetate, etc.), disinfectants (bleached and highly bleached, sodium hypochlorite, etc.), antioxidants (butylhydroxyanisole (BHA), butylhydroxytoleuene ( BHT), etc.), colorants (tar color, etc.), coloring agents (sodium nitrite, sodium nitrite, etc.), bleach (sodium sulfite), seasoning (MSG sodium glutamate, etc.), sweeteners (dulsin, cyclamate, saccharin, sodium, etc.) , Flavorings (vanillin, lactones, etc.), expanding agents (alum, D-potassium hydrogen stannate, etc.), reinforcing agents, emulsifying agents, thickening agents (thickening agents), coating agents, gum base agents, foam inhibitors, solvents, and food additives such as improving agents. ) Can be added.
  • the additive is
  • processed foods capable of improving osteoporosis may be manufactured using the food composition, for example, confectionery, beverages, alcoholic beverages, fermented foods, canned foods, processed milk foods, processed meat foods, or processed noodles. It can be manufactured as a health functional food.
  • the confectionery includes biscuits, pies, cakes, bread, candy, jelly, gum, cereals (including meal substitutes such as grain flour), and the like.
  • Beverages include drinking water, carbonated beverages, functional ionic beverages, juices (for example, apples, pears, grapes, aloe, tangerines, peaches, carrots, tomato juice, etc.), and sikhye.
  • Alcoholic beverages include sake, whiskey, shochu, beer, Western liquor, and fruit liquor.
  • Fermented foods include soy sauce, soybean paste, and red pepper paste.
  • Canned food includes canned seafood (e.g., canned tuna, mackerel, saury, conch, etc.), canned livestock (beef, pork, chicken, canned turkey, etc.), canned agricultural products (canned corn, peaches, pile apples, etc.).
  • Milk processed foods include cheese, butter, and yogurt.
  • Meat processed foods are pork cutlet, beef cutlet, chicken cutlet, and sausage. Includes sweet and sour pork, nuggets, and width.
  • Noodles include dried noodles, somen noodles, ramen noodles, udon noodles, cold noodles, and sealed packaged fresh noodles.
  • the composition may be used for retort foods, soups, and the like.
  • the term "functional food” of the present invention is the same term as food for special health use (FoSHU), and is processed to effectively display biomodulatory functions in addition to nutrition supply.
  • a method of preparing a composition for preventing or treating osteoporosis may be provided.
  • the step 1) is a step for extracting the active ingredients of the gentianweed and the alley, and is a step of effectively extracting the active ingredients of the gentianweed and the alley by heating by a solvent extraction method.
  • it may be a step of heating the gentianweed and the alley in water, respectively.
  • the heating temperature in step 1) may be 80 to 100°C.
  • the heating temperature is performed at 80 to 100° C., it is possible to prevent the active ingredient from being volatilized or vaporized while rapidly extracting the active ingredient.
  • the step 2) is a step of concentrating by decompressing each of the extracts of gentianweed and sphagnum extract obtained from step 1).
  • step 2) may be performed at 30 to 70° C., and when concentrated in the temperature range, the concentration time may be reduced.
  • the method for preparing a composition for preventing or treating osteoporosis is after step 2),
  • It may further include the step of mixing the powdered gentianweed and the extract of the alley obtained from step 3).
  • the step 3) is a step of lyophilizing the extract concentrated from the step 2), and through the step, the gentianweed and the extract of apex alley can be obtained in powder form.
  • the step 4) is a step of obtaining a mixture of the gentianweed and the alley extract, which can be easily changed by a person skilled in the art.
  • MC3T3-L1 cells 1 ⁇ 10 4 MC3T3-L1 cells were dispensed into a 96-well plate, and DMEM containing 10% FBS was used as the culture medium. After incubation for 12 hours, each extract (Examples 1 to 5) was treated with 100-1000 ⁇ g/ml and cultured for 24 hours. Thereafter, 20 ⁇ l of WST reagent was added to block light with a foil and reacted for 3 hours to minimize WST reduction by light. Optical density was measured at a wavelength of 560 nm using an iMARK TM Microplate Reader (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA).
  • Alkaline phosphatase (basic phosphatase; ALP) is present in most tissues, and ALP present in bone tissue is known to increase its activity when bone growth occurs actively.
  • 5X10 3 MC3T3-L1 cells were dispensed into a 6 well plate, and 50 ⁇ g/ml of ascorbic acid and 10 mM of ⁇ -glycerophosphate were added to induce differentiation into osteoblasts.
  • Reference Examples 1, 2 and Examples 1 to 3 were treated at different concentrations of 50 ⁇ g/ml, 100 ⁇ g/ml, and 200 ⁇ g/ml, respectively, and incubated for 48 hours in a CO 2 incubator at 37°C and 5%, followed by 2 with PBS. After washing twice, 0.2% triton X-100 was added and lysed for 30 minutes in a 37°C incubator.
  • the NC of FIG. 1 is an experimental group in which nothing was treated as a control.
  • the activity of the TRAP enzyme increases when osteoclasts perform bone resorption. After the formation of mononuclear osteoclasts, multinuclear osteoclasts are formed and adhere to the bone surface.
  • TRAP exhibits activity in the presence of Nitrophenyl phosphate and ATP, and is the only osteolytic enzyme present in osteoclasts.
  • the NC of FIG. 2 is an experimental group in which nothing was treated as a control.
  • Real-time PCR was performed to determine the expression of osteoblast differentiation-related factors in the progenitor osteoblasts when treated with the extracts of gentianweed and sp.
  • 1 ⁇ 10 5 MC3T3-E1 cells were dispensed into a 12 well plate, and Reference Examples 1, 2, and Examples 1 to 3 were treated at concentrations of 50, 100, and 200 ⁇ g/mL, respectively, and then cultured for 48 hours.
  • RNA extraction was performed according to the manufacturer's protocol with an RNeasy extraction kit (Qiagen, Gaithersburg, Maryland, USA).
  • cDNA was synthesized using the iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA).
  • Real-time quantitative PCR was performed using SYBR Green (iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad Bio-Rad Laboratories Inc.) to measure the expression of genes, and the instrument was Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). ) was used.
  • the nucleotide sequence of the gene used for measurement is shown in Table 3 below.
  • 2 ⁇ l of cDNA and 10 ⁇ l of 2X SYBR mix, 1 ⁇ l of 100 pmol/ ⁇ l each for forward and reverse primers were added to a total of 20 ⁇ l, and the rest was filled with H 2 O.
  • the PCR amplification step was as follows, and the amplification cycle was performed for 40 cycles.
  • Osteocalcin is a protein synthesized by osteoblasts during bone remodeling and bound to the extracelluar matrix of bones, so it was confirmed that the gentianweed and sphenoid bone extracts of the present invention can induce bone remodeling.
  • RNA extraction was performed according to the protocol of.
  • cDNA was synthesized using the iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA). Real-time quantitative PCR was performed using SYBR Green (iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad Bio-Rad Laboratories Inc.) to measure the expression of genes, and the instrument was Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). ) was used.
  • SYBR Green iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad Bio-Rad Laboratories Inc.
  • PCR amplification step was as follows, and the amplification cycle was performed for 40 cycles. For hot start, repeat at 95°C for 8 minutes, amplification step denaturation at 95°C for 15 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and extension at 72°C for 30 seconds, and values were recorded after extension of each cycle. After all cycles were completed, a melting curve analysis was performed to confirm the specificity of the primer. The analysis of the results was analyzed with One step system software v2.1 provided by Applied Biosystems.
  • the differentiation of osteoclasts is initiated by the binding of the receptor activator of nuclear facotr-kb ligand (RANKL), an osteoclast-inducing factor secreted from osteoblasts and activated T lymphocytes, to the receptor RANK expressed in osteoclasts.
  • RANKL nuclear facotr-kb ligand
  • RANKL nuclear facotr-kb ligand
  • Cathepsin K and MMP9 increases, and thus the differentiation of osteoclasts continues.
  • FIG. 7 Shown in.
  • the NC of FIGS. 5 to 7 is an experimental group in which the differentiation induction experiment of osteoclasts was not performed as a control group and no treatment was performed, and C is an experimental group in which the differentiation induction experiment of osteoclasts was performed as a control group, but nothing was treated.
  • NFATC-1 gene expression was significantly decreased by 54.96%, 65.10%, and 76.56%, respectively, compared to the experimental group without treatment after osteoclast differentiation induction. Confirmed.
  • MMP-9 gene expression was significantly reduced by 52.51%, 58.17%, and 72.12%, respectively, compared to the experimental group without treatment after inducing osteoclast differentiation. Confirmed.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

본 발명은 용담초 및 접골목 추출물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 목적은 골 형성을 높이고, 골 흡수를 억제할 수 있는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 있다. 아울러, 천연물인 용담초 및 접골목 추출물을 포함하여 생체친화성을 높이고 부작용이 없어 안정적으로 골다공증 예방 또는 치료효과를 나타내는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 있다.

Description

골다공증 예방 또는 치료용 조성물
본 출원은 2019년 4월 29일자 한국 특허 출원 제10-2019-0049946호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 발명은 용담초 및 접골목 추출물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
현재 고령사회로 접어들면서 골대사 질환이 큰 문제로 대두되고 있으며, 골 대사 질환 중 골다공증이 가장 큰 비중을 차지한다. 한편, 골다공증이란, 칼슘대사의 불균형으로 인해 골격의 조성이 변화되어 뼈의 질량(bone mass)이 감소되어 요골 및 대퇴부, 척추의 골절을 쉽게 초래하는 질병으로, 특히, 폐경 후 여성들에게서 발생빈도가 가장 높게 나타나며, estrogen의 분비가 주요원인으로 보고되고 있다.
뼈는 성장이 끝난 이후에도 재형성(bone remodeling)이 지속적으로 일어나며 이 과정을 통해 조골세포(osteoblast)에 의한 골 형성과 파골세포(osteoclast)에 의한 골 흡수 간의 항상성이 유지되며, 정상적인 조건에서의 골 조직은 골 형성과 골 흡수가 균형을 이루고 있다.
조골전구세포가 다양한 인자(BMP, ALP, TGF-β)들에 의해 분화되어 조골세포로 변화하고, 완전 분화된 조골세포는 비단백질 및 단백질 성분에 의해 골 기질(bone matrix) 내에서 골세포(osteocyte) 형태로 존재한다. 한편, 조골세포는 RANKL(receptor activator of NF-kB ligand)와 이것의 유도 수용체(decoy receptor)인 OPG(osteoprotegerin)를 생성한다.
골 흡수에 있어 매우 중요한 과정은 파골세포로의 분화이며, 분화를 매개하는 주된 리간드는 RANKL로, RANKL가 파골전구세포(osteoclast progenitor cell) 표면에 있는 수용체인 RANK에 결합하면 파골전구세포가 파골세포로 성숙화 (maturation)되어 골 흡수(bone resorption)가 일어난다. 또한, 파골세포 분화에 필수적인 역할을 하는 유전자는 NF-kB, c-FOS와 같은 물질이다.
그러나 OPG(osteoprotegerin)가 RANKL과 결합하면 RANKL 과 RANK 간 결합이 차단되어 파골세포의 형성이 억제되고 필요 이상의 골 흡수가 일어나지 않게 된다. 오래된 뼈의 홉수 또는 파괴는 혈액세포(조혈모세포)에서 생기는 파골세포에 의해 이루어지며 이는 뼈에 구멍을 내어 적은 양의 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지하는데 사용된다. 한편 뼈세포에서 생성된 조골세포는 교원질로 구멍을 채우고 칼슘과 인의 침척물 (hydroxyapatite)을 덮어서 단단한 새로운 뼈를 만들어 골격을 재건한다.
뼈가 파괴되기 시작하여 다시 새로운 뼈로 재형성되기까지는 약 100 일 정도 걸린다. 유아에서는 1 년 내에 뼈의 칼슘이 100% 바뀌지만 성인에서는 매년 골격의 약 10-30%가 이런 과정을 통하여 재형성되며，파골속도와 조골속도가 동일해야만 전과 같은 골밀도를 유지할 수 있다. 이와 같이 중요한 뼈에 균형이 깨질 경우 많은 질병이 야기될 수 있는데 특히 골다공증이 대표적인 질환이다.
현재까지 알려진 골다공증의 치료방법은 estrogen 요법, calcitonin 요법, 칼슘보충제, 비타민 D유도체 요법 등이 존재하지만 가장 많이 이용되는 방법으로는 estrogen 요법과 calcitonin 요법으로 보고되고 있으나, 여러 가지 부작용과 투여시기를 조절하기 어려운 단점이 있는 것으로 보고되고 있다. 그로 인해, 최근에는 부작용이 없고, 가격이 저렴한 천연물을 개발하여 골다공증을 치료하고자 하는 연구가 이루어지고 있다.
이에 따라, 천연물을 이용한 종래기술로서 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0054115호에는 콩 발아배아 추출물을 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 공지되어 있으며, 대한민국 등록특허공보 제10-178311호에는 오미자, 두충 및 구기자의 복합 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 대사질환의 예방 또는 치료용 조성물이 공지되어 있다.
그러나, 앞서 상술한 종래기술에서는 천연물을 이용하여 조골세포의 증식능 및 분화능 또는 조골세포와 관련된 인자 발현을 높일 수 있음을 나타내고 있으나, 파골세포에 의한 골 흡수에 대한 효과는 기재하고 있지 않으므로, 골 형성 및 골 흡수의 항상성을 유지할 수 있는 새로운 천연물질의 골다공증 치료제 개발이 필요하다.
전술한 문제점을 해소하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 골 형성을 높이고, 골 흡수를 억제할 수 있는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 있다.
아울러, 천연물인 용담초 및 접골목 추출물을 포함하여 생체친화성을 높이고 부작용이 없어 안정적으로 골다공증 예방 또는 치료효과를 나타내는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 있다.
본 발명의 실시예에 따른 용담초 및 접골목 추출물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 용담초 추출물과 상기 접골목 추출물의 혼합 중량비는 1:0.1~10일 수 있다.
상기 용담초 및 접골목의 추출물을 전체 조성물 총 중량에 대해 0.001 ~ 100 중량%로 포함할 수 있다.
상기 용담초 및 접골목 추출물은 열수추출에 의해 추출된 것일 수 있다.
상기 조성물은 골 형성과 관련된 유전자의 발현을 향상시킬 수 있다.
상기 골 형성과 관련된 유전자는 ALP, Osteocalcin, BMP, TGF-β 및 osteoprotegerin으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자일 수 있다.
상기 조성물은 골 흡수와 관련된 유전자의 발현을 억제시킬 수 있다.
상기 골 형성과 관련된 유전자는 NF-kB, c-FOS, NFATC-1, Cathepsin K 및 MMP-9으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자일 수 있다.
본 발명은 다른 일 실시예 따른 골다공증 예방 또는 치료용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
상기 조성물의 제조 방법은
1) 용담초 및 접골목을 용매에 넣고 가열하여 추출물을 얻는 단계;
2) 상기 1) 단계로부터 얻은 추출물을 감압 하에 농축하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 1) 단계의 가열온도는 80 ~ 100℃일 수 있다.
상기 2) 단계는 30 ~ 70℃에서 수행하는 단계일 수 있다.
본 발명에 의한 골다공증 예방 또는 치료용 조성물은 골 형성을 높이고, 골 흡수를 억제하는 효과를 제공할 수 있다.
아울러, 본 발명에 의한 골다공증 예방 또는 치료용 조성물은 천연물인 용담초 및 접골목 추출물을 주성분으로 포함함으로써 생체친화성이 높고 부작용이 없어 안정적으로 골다공증 예방 또는 치료효과를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 추출물의 농도에 따른 ALP 활성을 측정한 결과로, 도 1a는 참고예 1, 도 1b는 참고예 2, 도 1c는 실시예 1, 도 1d는 실시예 2, 도 1e는 실시예 3에 해당하는 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 추출물의 농도에 따른 tartrate-resistant acid phosphate(TRAP) 효소의 활성을 측정한 결과로, 도 2a는 참고예 1, 도 2b는 참고예 2, 도 2c는 실시예 1, 도 2d는 실시예 2, 도 2e는 실시예 3에 해당하는 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 추출물의 농도에 따른 ALP 유전자 발현양을 측정한 결과로, 도 3a는 참고예 1, 도 3b는 참고예 2, 도 3c는 실시예 1, 도 3d는 실시예 2, 도 3e는 실시예 3에 해당하는 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 추출물의 농도에 따른 Osteocalcin 유전자 발현양을 측정한 결과로, 도 4a는 참고예 1, 도 4b는 참고예 2, 도 4c는 실시예 1, 도 4d는 실시예 2, 도 4e는 실시예 3에 해당하는 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 추출물의 농도에 따른 NFATC-1 유전자 발현양을 측정한 결과로, 도 5a는 참고예 1, 도 5b는 참고예 2, 도 5c는 실시예 1, 도 5d는 실시예 2, 도 5e는 실시예 3에 해당하는 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 추출물의 농도에 따른 Cathepsin K 유전자 발현양을 측정한 결과로, 도 6a는 참고예 1, 도 6b는 참고예 2, 도 6c는 실시예 1, 도 6d는 실시예 2, 도 6e는 실시예 3에 해당하는 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 추출물의 농도에 따른 MMP-9 유전자 발현양을 측정한 결과로, 도 7a는 참고예 1, 도 7b는 참고예 2, 도 7c는 실시예 1, 도 7d는 실시예 2, 도 7e는 실시예 3에 해당하는 결과이다.
본 발명에 있어 첨부된 도면은 종래 기술과의 차별성 및 명료성, 그리고 기술 파악의 편의를 위해 과장된 표현으로 도시되어 있을 수 있다. 또한, 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어로써, 사용자, 운용자의 의도 또는 관례에 따라 달라질 수 있으므로, 이러한 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 기술적 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 한편, 실시예는 본 발명의 청구범위에 제시된 구성요소의 예시적 사항에 불과하고, 본 발명의 권리범위를 한정하는 것이 아니며, 권리범위는 본 발명의 명세서 전반에 걸친 기술적 사상을 토대로 해석되어야 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 골다공증 예방 또는 치료용 조성물은 용담초 및 접골목 추출물을 유효성분으로 함유한다.
본 발명에서 사용되는 용담초는 Gentian scabra Bunge var. buergeri (Miquel) Maxim으로, 한국, 일본, 중국 동북부, 시베리아 동부에 주로 분포되어 있으며, 쌍떡잎식물 합판화군 용담목 용담과의 여러해살이풀로 산지의 풀밭에서 자란다. 또한 알려진 효능 및 효과는 간, 담의 화가 왕성한 것을 내리게 하는 효능이 있으며, 청열조습, 사간담화, 쓴맛 건위약, 열물내기약으로 이용되며, 소화작용, 간기능항진 및 항염증에 효과가 있다.
본 발명자들은 용담초의 새로운 효과로서 골 형성을 촉진 및 골 흡수 억제 효과를 확인하였으며, 용담초가 골 대사 질환 중 골다공증을 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
일반적으로 용담초는 건위, 창종, 개선, 간질, 도한, 경풍, 회충, 심장병, 습진, 위염, 위산과다증. 위산과소증, 위 카타르, 위질환에 효능이 있다고 알려져 있으나, 골 대사 질환과 관련되어 골다공증 예방 또는 치료에 효과가 있다는 것은 본 발명자들에 의해 최초로 확인되었다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 용담초는 용담초의 잎, 순, 줄기 또는 뿌리일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 뿌리이다.
본 발명에서 사용되는 접골목은 Sambucus williamsii으로, 딱총나무속에 속하는 납엽관목으로 활혈지통의 효능이 있어 풍습성관절염, 요통, 골절상, 외상출혈에 유효하고, 산후의 어혈제거 및 타박상에 주로 사용된다.
본 발명자들은 접골목이 골 형성을 촉진시키고 골 흡수를 억제할 수 있음을 확인하였으며, 이에 따라, 골 대사 질환 중 골다공증을 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "예방"이란 조성물의 투여에 의해 골다공증을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "치료"란 조성물의 투여에 의해 골다공증에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 추출물은 용매 추출법, 초음파 추출법, 초임계 추출법, 발효법 및 포제법에 의한 추출법으로부터 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수득할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 용매 추출법은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매를 이용한 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 추출방법으로는 상기 용매 추출법이 바람직하게 사용되며, 더욱 바람직하게는 열수를 이용한 용매 추출법이 사용되나 이에 제한되지 않는다.
이때, 상기 열수를 이용한 용매 추출법은 천연물에 함유된 유효성분을 안전하게 추출할 수 있을 뿐만 아니라 화합물을 이용하지 않고 추출함으로써 최종산물 또는 조성물로부터 초래될 수 있는 부작용을 줄이고, 생체친화성을 높일 수 있다.
상기 용담초 추출물과 상기 접골목 추출물의 혼합 중량비는 1:0.1~10일 수 있으며, 바람직하게는 1:0.4 ~2.5이나, 이에 제한되지 않는다. 여기서, 상기 혼합 중량비가 1:0.1~10일 경우 골 형성에 대한 향상효과 및 골 흡수에 대한 억제효과가 서로 균형을 이룰 수 있다.
상기 용담초 및 접골목 추출물은 전체 조성물 총 중량에 대해 0.001 ~ 100 중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.001 ~ 50 중량%이며, 더욱 바람직하게는 0.001 ~ 20 중량%이나 이에 제한되지 않는다. 상기 추출물이 전체 조성물에 대해 0.001 중량% 미만일 경우 농도가 너무 낮아 골 형성유도 및 골 흡수 억제 효과가 미비할 수 있다.
상기 용담초 추출물은 전체 조성물에 대해 0.001 ~ 99.999 중량% 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.001 ~ 80 중량% 이며, 더욱 바람직하게는 30 ~ 70 중량%이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 접골목 추출물은 0.001 ~ 99.999 중량% 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.001 ~ 80 중량% 이며, 더욱 바람직하게는 30 ~ 70 중량%이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 골 형성과 관련된 유전자의 발현을 향상시킬 수 있으며, 여기서, 상기 유전자의 발현은 조골전구세포가 조골세포로 분화하는 과정 또는 조골세포가 골세포 형태로 변화하는 과정에서 함께 일어나는 것을 의미하고, 이때 유전자는 ALP, Osteocalcin, BMP, TGF-β 및 osteoprotegerin으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자일 수 있으며, 바람직하게는 ALP 및 Osteocalcin으로 조골전구세포가 조골세포로 분화하는 과정에 있어 가장 중요한 인자이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 ALP는 골 조직에 존재하며, 골 성장이 활발히 일어날 때 그 활성이 증가하는 것으로 알려져 있는 유전자이다.
상기 Osteocalcin은 골재형성시 조골세포에 의해 합성되고 뼈의 extracelluar matrix에 결합되는 단백질을 의미한다.
또한, 상기 조성물은 골 흡수와 관련된 유전자의 발현을 억제시킬 수 있으며, 이때, 상기 유전자의 발현은 파골세포로의 분화과정에서 함께 일어나는 것을 의미한다. 여기서, 상기 유전자는 NF-kB, c-FOS, NFATC-1, Cathepsin K 및 MMP-9으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이상의 유전자일 수 있으며, 바람직하게는 NFATC-1, Cathepsin K 및 MMP-9으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이상의 유전자이나, 이에 제한되지 않는다.
이때, NFATC-1는 파골세포의 분화과정에서 발현이 증가하게 되는 유전자이며, 한편 Cathepsin K와 MMP-9는 파골세포의 분화과정이 지속될 경우 발현양이 증가되는 유전자이다.
본 발명의 조성물은 약학 조성물로 이용될 수 있으며, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 약학 조성물에 추가적을 포함되는 첨가제의 종류와 양은 관련 기술 분야에서 통상적으로 알려진 바에 따른다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등의 경구투여제; 및 멸균된 주사용액으로서 수용액, 비수성용제, 현탁제, 및 유제, 동결건조제제, 좌제 등의 비경구 투여제 등의 형태로 적용 형태에 알맞게 제형화 하여 사용될 수 있다.
상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 복강 내 투여, 정맥 투여, 동맥 투여, 근육 내 투여, 골내 투여, 자궁 내 투여, 경막 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여, 뇌혈관 내 (intracerebroventricular) 주사될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.
본 발명에서 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 조성물은 용담초 및 접골목의 혼합 사용량을 기준으로 1일 기준 0.01g 내지 20g의 량으로 투여될 수 있다. 구체적으로 추출물인 경우, 상기 함량범위의 용담초 및 접골목을 사용하여 제조된 추출물이 1일 투여량으로 고려될 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 골다공증 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 일 실시예로, 상기 용담초 및 접골목 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
이때, 상기 용담초 및 접골목 추출물은 앞서 상술한 바와 동일하다.
상기 용담초 및 접골목 추출물을 상식할 수 있으면서도 골다공증의 개선을 도모할 수 있는 식품의 형태로 제조되어 섭취할 수 있다. 이때, 상기 식품에 포함되는 상기 용담초 및 접골목 추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 식품 조성물의 총 중량에 대하여 0.001 내지 100 중량%로 포함될 수 있다. 식품이 음료인 경우에는 일 예로서 100㎖를 기준으로 0.01 내지 60g, 다른 예로서 0.1 내지 60g의 비율로 포함될 수 있다.
또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비타민 A, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용된다.
한편, 상기 용담초 및 접골목 추출물을 이용하여 골다공증 개선용 기능성 식품을 제조할 수 있다.
구체적인 예로, 상기 식품 조성물을 이용하여 골다공증을 개선시킬 수 있는 가공식품을 제조할 수 있는데, 예들 들어, 과자, 음료, 주류, 발효식품, 통조림, 우유가공식품, 육류가공식품 또는 국수가공식품의 형태인 건강기능성 식품으로 제조될 수 있다. 이때, 과자는 비스킷, 파이, 케익, 빵, 캔디, 젤리, 껌, 시리얼(곡물푸레이크 등의 식사대용품류 포함) 등을 포함한다. 음료는 음용수, 탄산음료, 기능성이온음료, 쥬스(예들 들어, 사과, 배, 포도, 알로에, 감귤, 복숭아, 당근, 토마토 쥬스 등), 식혜 등을 포함한다. 주류는 청주, 위스키, 소주, 맥주, 양주, 과실주 등을 포함한다. 발효식품은 간장, 된장, 고추장 등을 포함한다. 통조림은 수산물 통조림(예들 들어, 참치, 고등어, 꽁치, 소라 통조림 등), 축산물 통조림(쇠고기, 돼지고기, 닭고기, 칠면조 통조림 등), 농산물 통조림(옥수수, 복숭아, 파일애플 통조림 등)을 포함한다. 우유가공식품은 치즈, 버터, 요구르트 등을 포함한다. 육류가공식품은 돈까스, 비프까스, 치킨까스, 소세지. 탕수육, 너겟류, 너비아니 등을 포함한다. 국수가공식품은 건면, 소면, 라면, 우동면, 냉면, 밀봉포장생면 등을 포함한다. 이 외에도 상기 조성물은 레토르트식품, 스프류 등에 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "건강기능성 식품(functional food)"이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 골다공증의 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면 상기 골다공증 예방 또는 치료용 조성물의 제조 방법을 제공할 수 있다.
상기 조성물의 제조 방법은
1) 용담초 및 접골목을 용매에 넣고 가열하여 추출물을 얻는 단계; 및
2) 상기 1) 단계로부터 얻은 추출물을 감압 하에 농축하는 단계를 포함한다.
상기 1) 단계는 용담초 및 접골목의 유효성분을 추출하기 위한 단계로, 용매 추출법으로 가열하여 효과적으로 용담초 및 접골목의 유효성분을 추출하는 단계이다. 일 예로, 용담초 및 접골목을 각각 물에 넣어 가열하는 단계일 수 있다.
상기 1) 단계의 가열온도는 80 ~ 100℃일 수 있다. 상기 가열온도를 80 ~ 100℃로 수행할 경우, 유효성분을 빠르게 추출하면서 수행도중 유효성분이 휘발되거나 기화되는 것을 막을 수 있다.
상기 2) 단계는 상기 1) 단계로부터 얻은 각각의 용담초, 접골목 추출물을 감압하여 농축하는 단계이다.
이때, 상기 2) 단계는 30 ~ 70℃에서 수행할 수 있으며, 이의 온도 범위에서 농축할 경우, 농축시간을 줄일 수 있다.
상기 골다공증 예방 또는 치료용 조성물의 제조 방법은 상기 2) 단계 이후에,
3) 상기 2) 단계로부터 얻은 농축된 추출물을 동결건조 하는 단계; 및
4) 상기 3) 단계로부터 얻은 분말 형태의 용담초 및 접골목 추출물을 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 3) 단계는 상기 2) 단계로부터 농축된 추출물을 동결건조시키는 단계로, 해당 단계를 통해여 용담초 및 접골목 추출물을 분말형태로 얻을 수 있다.
그 다음, 상기 4) 단계는 용담초 및 접골목 추출물을 혼합한 혼합물 얻는 단계로, 해당기술분야의 기술자가 용이하게 변경할 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시 형태들을 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
제조예 1. 용담초 및 접골목 추출물 제조
용담초 추출물과 접골목 추출물을 제조하기 위해 각각의 100g의 원물에 증류수 2L 넣고 90℃에서 5시간 열수 추출하였다. 여과된 추출 용액을 50℃에서 감압 농축하여 동결건조를 통해 분말 형태의 시료를 수득하였다. 용담초 추출물과 접골목 추출물의 수율은 각각 15.4%, 9.27% 였다.
실시예
하기 표 1에 나열한 바와 같이 실시예를 준비하였으며, 표 1 내에 기재된 용담초 추출물과 접골목 추출물은 상기 제조예 1에 따라 제조하였다.
구분 실시예
참고예 1 용담초 추출물
참고예 2 접골목 추출물
실시예 1 용담초 추출물 : 접골목 추출물을 7:3으로 혼합한 추출물
실시예 2 용담초 추출물 : 접골목 추출물을 5:5으로 혼합한 추출물
실시예 3 용담초 추출물 : 접골목 추출물을 3:7으로 혼합한 추출물
실험예 1. 세포독성평가
본 실험예에서는 본 발명의 접골목 및 용담초 추출물을 처리하였을 때 세포 독성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 실험을 수행하였다.
1X104개의 MC3T3-L1세포를 96well plate에 분주하고 배양액은 10% FBS를 함유한 DMEM을 사용하였다. 12시간동안 배양한 후 각 추출물(실시예 1 내지 5)을 100-1000㎍/㎖로 처리하여 24시간동안 배양하였다. 그 후, WST reagent 20㎕를 첨가하여 빛에 의한 WST 환원을 최소화하기 위해서 호일로 빛을 차단하고 3시간동안 반응시켰다. iMARKTM Microplate Reader(Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)를 이용하여 560nm 파장에서 optical density를 측정하였다.
각 추출물의 세포독성을 ED50(cell viability가 50%가 되는 농도)으로 구한 결과를 하기 표 2에 나타냈다. 이의 결과, 본 발명의 용담초 및 접골목 추출물은 600㎍/㎖ 이상의 고농도에서도 안전한 것으로 나타났다.
구분 ED50(㎍/㎖)
참고예 1 1779.12
참고예 2 868.95
실시예 1 760.415
실시예 2 814.69
실시예 3 678.93
실험예 2. Alkaline phosphatase acitivity(ALP acitivity) 측정
본 실험예에서는 본 발명의 용담초 및 접골목 추출물을 농도별로 처리하였을 때 Alkaline phosphatase acitivity에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실험을 수행하였다. 한편, Alkaline phosphatase(염기성 인산분해효소; ALP)는 대부분의 조직에 존재하며, 골 조직에 존재하는 ALP는 골 성장이 활발히 일어날 때 그 활성이 증가하는 것으로 알려져 있다.
5X103개의 MC3T3-L1 세포를 6 well plate에 분주하고 50㎍/㎖의 ascorbic acid와 10 mM의 β-glycerophosphate를 첨가하여 조골세포로의 분화를 유도하였다. 참고예 1, 2 및 실시예 1 내지 3을 각각 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖의 농도별로 처리한 후 37℃, 5%의 CO2 incubator에서 48시간 배양 후 PBS로 2회 세척하고 0.2% triton X-100을 넣은 다음 37℃ incubator에서 30분간 lysis 시켰다. 2,500rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 추해 단백질을 정량하고, 나머지 상층액은 0.1N glycine과 100mM p-nitrophenylphosphate(p-NPP)를 첨가한 뒤 37℃에서 30분간 incubation 후 0.1N NaOH을 넣어 반응을 정지시킨 다음, 405nm에서 흡광도를 측정하여 ALP 효소에 의해 p-nitrophenol로 전환된 양을 산출하였다. 이의 결과를 도 1에 나타냈다. 상기 도 1의 NC는 대조군으로 아무것도 처리하지 않은 실험군이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 각 추출물에 따라 농도가 증가할수록 ALP 활성이 증가하는 것을 확인하였고, 참고예 1(도 1a) 또는 2(도 1b)에 비해 실시예 1 내지 3(도 1c 내지 도 1e)이 더 우수한 ALP 활성이 나타나는 것을 확인하였다. 즉, 용담초 또는 접골목 추출물을 단독으로 처리하였을 때 보다 용담초 및 접골목 추출물을 처리할 경우 ALP 활성이 현저하게 더 높은 것을 확인하였다. 이에 따라 본 발명의 용담초 및 접골목 추출물은 골 성장 유도효과가 우수한 것을 확인하였다.
실험예 3. tartrate-resistant acid phosphate(TRAP) 측정
본 실험예에서는 본 발명의 용담초 및 접골목 추출물을 농도별로 처리시 파골세포의 분화정도에 미치는 영향을 확인하기 위하여 실험을 수행하였다. 구체적으로, 파골세포가 골 흡수 작용을 할 때 증가하는 TRAP 효소의 활성을 측정하여 파골세포의 분화정도에 얼마나 영향을 미치는지 확인하였다.
한편, TRAP 효소의 활성은 파골세포가 골 흡수 작용을 할 때 증가하는 것으로, 단핵의 파골전구세포를 형성한 후 세포가 융합되는 다핵의 성국 파골세포를 형성하게 되고 골 표면에 부착한다. 또한 TRAP은 Nitrophenyl phosphate, ATP 존재 하에 활성을 나타내는 것으로 파골세포에서만 유일하게 존재하는 골 분해 효소이다.
먼저, 1X105개의 RAW 264.7 파골전구세포를 6 well plate에 분주하고 30ng/㎖ 농도의 RANKL을 각 웰에 넣은 다음 참고예 1, 2 및 실시예 1 내지 3을 각각 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖의 농도별로 처리한 조골세포의 조건배양액을 처리하여 3일간 배양하였다. 기질용액으로 citrate-acetone 및 formaldehyde 혼합 용액으로 고정한 세포를 1.36 mg/mL의 4-nitrophenyl phosphate disodium salt, 10 mM의 tartrate를 포함하는 50 mM의 citrate buffer를 제조하였고, 고정한 세포에 기질용액을 분주하고 37℃, 5%의 CO2 incubator에서 30분간 반응시킨 후 효소반응액을 0.1N NaOH로 반응을 중지시키고 405 nm에서 파장에서 optical density를 3회 측정하여 그에 대한 평균값과 표준 편차를 구하였으며, 이의 결과를 도 2에 나타냈다. 상기 도 2의 NC는 대조군으로 아무것도 처리하지 않은 실험군이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 실험군에 비해 각 추출물에 따라 농도가 증가할수록 TRAP 효소 활성이 감소하는 것을 확인하였고, 참고예 1(도 2a) 또는 2(도 2b)에 비해 실시예 1 내지 3(도 2c 내지 도 2e)이 더 현저히 TRAP 효소 활성이 낮아지는 것을 확인하였다. 즉, 용담초 또는 접골목 추출물을 단독으로 처리하였을 때 보다 용담초 및 접골목 추출물을 처리할 경우 TRAP 효소 활성이 더 현저하게 낮아지는 것을 확인하였으며, 이에 따라 본 발명의 용담초 및 접골목 추출물은 골 흡수를 저해할 수 있음을 확인하였다.
실험예 4. 전조골세포에서 조골세포 분화관련 인자 발현 측정
용담초 및 접골목 추출물을 처리하였을 때 전조골세포에서 조골세포 분화 관련 인자에 대하여 발현여부를 알아보기 위해, real time PCR을 실시하였다. 먼저, 1X105개의 MC3T3-E1 세포를 12 well plate에 분주하고 참고예 1, 2 및 실시예 1 내지 3을 각각 50, 100, 200μg/mL의 농도별로 처리한 후 48 시간 동안 배양한 뒤, 세포를 수집하여 RNeasy extraction kit(Qiagen, Gaithersburg, Maryland, USA)로 제조사의 protocol에 따라 RNA 추출을 실시하였다. iScript cDNA synthesis kit(Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위하여 SYBR Green(iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad Bio-Rad Laboratories Inc.)을 이용한 실시간 정량 PCR을 실시하였고, 기기는 Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하였다. 측정하기 위해 사용한 유전자의 염기서열은 하기 표 3에 나타냈다. Real time PCR 반응은 총 20㎕ 내에 cDNA 2㎕와 2X SYBR mix 10㎕, forward, reverse primer는 각각 100 pmol/㎕를 1㎕씩 첨가하였고, 나머지는 H2O로 채워주었다. PCR 증폭 단계는 다음과 같고 증폭 cycle은 40 cycle을 실시하였다. Hot start를 위해 95℃에서 8분, 증폭 단계의 denaturation을 95℃에서 15초, annealing을 55℃에서 30초, extension을 72℃에서 30초간 반복하며, 각 cycle의 extension 후에 값이 기록되었다. 모든 cycle이 완료된 후 primer의 특이성을 확인하기 위해 melting curve 분석을 실시하였다. 결과의 분석은 Applied Biosystems에서 제공하는 One step system software v2.1로 분석하였다. ALP 유전자 발현양을 측정한 결과는 도 3에, Osteocalcin 유전자 발현양을 측정한 결과는 도 4에 나타냈다. 상기 도 3 및 도 4의 NC는 대조군으로 조골세포의 분화유도 실험도 수행하지 않고, 아무것도 처리하지 않은 실험군이다.
Gene Primer sequences 서열번호
GAPDH F 5’-ATGGAAATCCCATCACCATCTT-3’ 1
R 5’-CGCCCCACTTGATTTTGG-3’ 2
ALP F 5’-CCGCTTTAACCAGTGCAACA-3’ 3
R 5’-CCCGATTCATCACGGAGATG-3’ 4
Osteocalcin F 5'-CAGGAGGGCAGCGAGGTA-3' 5
R 5'-GCTCCCAGCCATTGATACA-3' 6
NFATC-1 F 5'-TGGCCTCCCGCTTATCTCT-3' 7
R 5'-GGATAACGCAGGCGAATTGT-3' 8
Cathepsin K F 5'-GATAATGTGAACCATGCAGTGTTG-3' 9
R 5'-CCAGTGCTTGCTTCCCTTCT-3' 10
MMP-9 F 5'-ACGCCACGCATTTTCAAAA-3' 11
R 5'-GGCCCATTCCCTCCACAT-3' 12
도 3에 나타낸 바와 같이, 각 추출물에 따라 농도가 증가할수록 ALP 유전자의 발현이 높아지는 것을 확인하였고, 참고예 1(도 3a) 또는 2(도 3b)에 비해 실시예 1 내지 3(도 3c 내지 도 3e)이 더 많이 ALP 유전자 발현이 나타나는 것을 확인하였다. 즉, 용담초 또는 접골목 추출물을 단독으로 처리하였을 때 보다 용담초 및 접골목 추출물을 처리할 경우 ALP 유전자 발현 유도 효과가 뛰어난 것을 확인하였다. 이에 따라 본 발명의 용담초 및 접골목 추출물은 골 성장 유도효과가 우수한 것을 확인하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 각 추출물에 따라 농도가 증가할수록 Osteocalcin(OC)의 발현이 높아지는 것을 확인하였고, 참고예 1(도 4a) 또는 2(도 4b)에 비해 실시예 1 내지 3(도 4c 내지 도 4e)이 더 많이 Osteocalcin 발현이 나타나는 것을 확인하였다. 즉, 용담초 또는 접골목 추출물을 단독으로 처리하였을 때 보다 용담초 및 접골목 추출물을 처리할 경우 Osteocalcin 발현 유도 효과가 뛰어난 것을 확인하였다. 한편, Osteocalcin(OC)은 골재형성시 조골세포에 의해 합성되고 뼈의 extracelluar matrix에 결합되는 단백질이므로, 본 발명의 용담초 및 접골목 추출물은 골 재형성을 유도할 수 있음을 확인하였다.
실험예 5. 전파골세포에서 파골세포 분화관련 인자 발현 측정
용담초 및 접골목 추출물을 처리하였을 때 전파골세포에서 파골세포 분화 관련 인자 발현을 알아보기 위해 real time PCR을 실시하였다. 5X105개의 RAW246.7 세포를 12 well plate에 분주하고 10 ng/mL의 RNAKL과 10 ng/mL의 M-CSF를 첨가하여 파골세포로의 분화를 유도 후. 참고예 1, 2 및 실시예 1 내지 3을 각각 50, 100, 200μg/mL의 농도별로 처리하고, 48시간이 지난 뒤, 세포를 수집하여 RNeasy extraction kit (Qiagen, Gaithersburg, Maryland, USA)로 제조사의 protocol에 따라 RNA 추출을 실시하였다. iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위하여 SYBR Green (iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad Bio-Rad Laboratories Inc.)을 이용한 실시간 정량 PCR을 실시하였고, 기기는 Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하였다. 측정하고자 하는 유전자의 염기서열은 상기 표 3에 나타내었다. Real time PCR 반응은 총 20㎕ 내에 cDNA 2㎕와 2X SYBR mix 10㎕, forward, reverse primer는 각각 100 pmol/㎕를 1㎕씩 첨가하였고, 나머지는 H2O로 채워주었다. PCR 증폭 단계는 다음과 같고 증폭 cycle은 40 cycle을 실시하였다. Hot start를 위해 95℃에서 8분, 증폭 단계의 denaturation을 95℃에서 15초, annealing을 55℃에서 30초, extension을 72℃에서 30초간 반복하며, 각 cycle의 extension 후에 값이 기록되었다. 모든 cycle이 완료된 후 primer의 특이성을 확인하기 위해 melting curve 분석을 실시하였다. 결과의 분석은 Applied Biosystems에서 제공하는 One step system software v2.1로 분석하였다.
파골세포분화는 조골세포와 활성화된 T 림프구에서 분비되는 파골세포 유도인자인 receptor activatior of nuclear facotr-kb ligand(RANKL)와 파골전구세포에서 발현되는 그 수용체 RANK의 결합에 의해 시작된다. RANKL과 RANK의 결합이 진행되면, c-fos와 NFATC-1의 발현이 증가하게 되고 그 결과로 인해 Cathepsin K와 MMP9의 발현이 증가하게 되고 이로 인해 파골세포의 분화가 지속되게 된다. 이로써, 실험예 5에서는 NFATC-1 유전자 발현양을 측정하여 이의 결과를 도 5에, Cathepsin K 유전자 발현양을 측정하여 이의 결과를 도 6에, MMP-9 유전자 발현양 측정하여 이의 결과를 도 7에 나타냈다. 상기 도 5 내지 도 7의 NC는 대조군으로 파골세포의 분화유도 실험도 수행하지 않고 아무것도 처리하지 않은 실험군이며, C는 비교군으로 파골세포의 분화유도 실험은 수행하였으나, 아무것도 처리하지 않은 실험군이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 각 추출물에 따라 농도가 증가할수록 NFATC-1 유전자의 발현이 감소하는 것을 확인하였고, 참고예 1(도 5a) 또는 2(도 5b)에 비해 실시예 1 내지 3(도 5c 내지 도 5e)이 NFATC-1 유전자 발현양이 현저히 낮은 것을 확인하였다. 즉, 용담초 또는 접골목 추출물을 단독으로 처리하였을 때 보다 용담초 및 접골목 추출물을 처리할 경우 NFATC-1 유전자 발현 억제 효과가 뛰어난 것을 확인하였다. 특히, 실시예 1 내지 3을 200㎍/㎖로 처리한 결과는 파골세포 분화 유도 후 아무것도 처리하지 않은 실험군에 비해 NFATC-1 유전자 발현이 각각 54.96%, 65.10%, 76.56% 유의적으로 감소하였음을 확인하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 각 추출물에 따라 농도가 증가할수록 Cathepsin K 유전자의 발현이 감소하는 것을 확인하였고, 참고예 1(도 6a) 또는 2(도 6b)에 비해 실시예 1 내지 3(도 6c 내지 도 6e)이 Cathepsin K 유전자 발현양이 현저히 낮은 것을 확인하였다. 즉, 용담초 또는 접골목 추출물을 단독으로 처리하였을 때 보다 용담초 및 접골목 추출물을 처리할 경우 Cathepsin K 유전자 발현 억제 효과가 뛰어난 것을 확인하였다. 특히, 실시예 1 내지 3을 200㎍/㎖로 처리한 결과는 파골세포 분화 유도 후 아무것도 처리하지 않은 실험군에 비해 Cathepsin K 유전자 발현이 각각 46.98%, 59.49%, 74.98% 유의적으로 감소하였음을 확인하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 각 추출물에 따라 농도가 증가할수록 MMP-9 유전자의 발현이 감소하는 것을 확인하였고, 참고예 1(도 7a) 또는 2(도 7b)에 비해 실시예 1 내지 3(도 7c 내지 도 7e)이 MMP-9 유전자 발현양이 현저히 낮은 것을 확인하였다. 즉, 용담초 또는 접골목 추출물을 단독으로 처리하였을 때 보다 용담초 및 접골목 추출물을 처리할 경우 MMP-9 유전자 발현 억제 효과가 뛰어난 것을 확인하였다. 특히, 실시예 1 내지 3을 200㎍/㎖로 처리한 결과는 파골세포 분화 유도 후 아무것도 처리하지 않은 실험군에 비해 MMP-9 유전자 발현이 각각 52.51%, 58.17%, 72.12% 유의적으로 감소하였음을 확인하였다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 하여 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술이 속하는 분야에서 통상의 지식을 기초로 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해해야 한다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 이하 기술할 청구범위에 의하며, 상술한 발명의 구체적 내용을 토대로 정해져야 할 것이다.

Claims (11)

  1. 용담초 및 접골목 추출물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 용담초 추출물과 상기 접골목 추출물의 혼합 중량비는 1:0.1~10인, 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 용담초 및 접골목의 추출물을 전체 조성물 총 중량에 대해 0.001 ~ 100 중량%로 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 용담초 및 접골목 추출물은 열수추출에 의해 추출된 것인, 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 골 형성과 관련된 유전자의 발현을 향상시키는 것인, 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 골 형성과 관련된 유전자는 ALP, Osteocalcin, BMP, TGF-β 및 osteoprotegerin으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이상의 유전자인, 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 골 흡수와 관련된 유전자의 발현을 억제시키는 것인, 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 골 형성과 관련된 유전자는 NF-kB, c-FOS, NFATC-1, Cathepsin K 및 MMP-9으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자인, 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  9. 1) 용담초 및 접골목을 용매에 넣고 가열하여 추출물을 얻는 단계; 및
    2) 상기 1) 단계로부터 얻은 추출물을 감압 하에 농축하는 단계;
    를 포함하는 제 1 항에 따른 골다공증 예방 또는 치료용 조성물의 제조 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 1) 단계의 가열온도는 80 ~ 100℃인, 골다공증 예방 또는 치료용 조성물의 제조 방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 2) 단계는 30 ~ 70℃에서 수행하는 단계인, 골다공증 예방 또는 치료용 조성물의 제조 방법.
PCT/KR2019/012105 2019-04-29 2019-09-19 골다공증 예방 또는 치료용 조성물 WO2020222369A1 (ko)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/976,367 US20210000900A1 (en) 2019-04-29 2019-09-19 Compositon for preventing or treating osteoporosis
JP2020544900A JP7089044B2 (ja) 2019-04-29 2019-09-19 骨粗しょう症の予防または治療用組成物
CN201980018273.XA CN112153976B (zh) 2019-04-29 2019-09-19 用于预防或治疗骨质疏松症的组合物
EP19917527.4A EP3750550B1 (en) 2019-04-29 2019-09-19 Composition for preventing or treating osteoporosis
US17/566,408 US11786572B2 (en) 2019-04-29 2021-12-30 Composition for preventing or treating osteoporosis

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190049946A KR102022983B1 (ko) 2019-04-29 2019-04-29 골다공증 예방 또는 치료용 조성물
KR10-2019-0049946 2019-04-29

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/976,367 A-371-Of-International US20210000900A1 (en) 2019-04-29 2019-09-19 Compositon for preventing or treating osteoporosis
US17/566,408 Division US11786572B2 (en) 2019-04-29 2021-12-30 Composition for preventing or treating osteoporosis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020222369A1 true WO2020222369A1 (ko) 2020-11-05

Family

ID=68067770

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2019/012105 WO2020222369A1 (ko) 2019-04-29 2019-09-19 골다공증 예방 또는 치료용 조성물

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20210000900A1 (ko)
EP (1) EP3750550B1 (ko)
JP (1) JP7089044B2 (ko)
KR (1) KR102022983B1 (ko)
CN (1) CN112153976B (ko)
WO (1) WO2020222369A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230006131A (ko) 2021-07-02 2023-01-10 재단법인 경남한방항노화연구원 피부미백용 화장료 조성물

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07101868A (ja) * 1993-10-05 1995-04-18 Suntory Ltd ニワトコ属植物抽出物を有効成分とする骨疾患の予防・治療剤
KR0178311B1 (ko) 1995-12-14 1999-03-20 배순훈 석유 연소기의 기화 혼합장치
KR20050007716A (ko) * 2003-07-11 2005-01-21 주식회사한국야쿠르트 카뎁신 케이의 활성을 저해하는 접골목 추출물
JP2005281221A (ja) * 2004-03-30 2005-10-13 Taisho Pharmaceut Co Ltd 骨吸収抑制剤
CN104147409A (zh) * 2014-07-22 2014-11-19 竺妙飞 一种治疗阴虚内热证型绝经妇女骨质疏松的中药
KR101607545B1 (ko) * 2015-07-02 2016-03-30 류한결 생약추출 혼합물을 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR20170054115A (ko) 2015-11-09 2017-05-17 대한민국(농촌진흥청장) 콩 발아배아 추출물을 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20190049946A (ko) 2015-01-05 2019-05-09 로레알 코스메틱 어플리케이터

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1260984A (zh) * 1999-01-15 2000-07-26 董世民 一种治疗外伤的外用中药制剂
KR100540033B1 (ko) 2002-01-18 2005-12-29 주식회사 팬제노믹스 관절염 치료용 생약 조성물 및 그 제조방법
CN101773490B (zh) * 2010-01-25 2013-02-20 香港理工大学深圳研究院 具有降低绝经期妇女骨相关疾病发病风险的接骨木活性部位及其应用
SG10201402819WA (en) 2014-06-02 2016-01-28 Beauty Nation Pte Ltd Composition for prevention and treatment of joint pain and the method of preparation thereof
KR101783119B1 (ko) 2015-01-15 2017-09-28 경희대학교 산학협력단 오미자, 두충 및 구기자의 복합 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 대사질환의 예방 또는 치료용 조성물
CN105311473A (zh) 2015-11-27 2016-02-10 黄凤玲 快速止血的药物
CN105412569A (zh) * 2015-12-24 2016-03-23 福和寿（武汉）健康管理有限公司 一种增加骨密度的组合物及其制剂和制法
CN107569657A (zh) 2016-07-05 2018-01-12 郝纪涛 一种疏经活血的中药方

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07101868A (ja) * 1993-10-05 1995-04-18 Suntory Ltd ニワトコ属植物抽出物を有効成分とする骨疾患の予防・治療剤
KR0178311B1 (ko) 1995-12-14 1999-03-20 배순훈 석유 연소기의 기화 혼합장치
KR20050007716A (ko) * 2003-07-11 2005-01-21 주식회사한국야쿠르트 카뎁신 케이의 활성을 저해하는 접골목 추출물
JP2005281221A (ja) * 2004-03-30 2005-10-13 Taisho Pharmaceut Co Ltd 骨吸収抑制剤
CN104147409A (zh) * 2014-07-22 2014-11-19 竺妙飞 一种治疗阴虚内热证型绝经妇女骨质疏松的中药
KR20190049946A (ko) 2015-01-05 2019-05-09 로레알 코스메틱 어플리케이터
KR101607545B1 (ko) * 2015-07-02 2016-03-30 류한결 생약추출 혼합물을 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR20170054115A (ko) 2015-11-09 2017-05-17 대한민국(농촌진흥청장) 콩 발아배아 추출물을 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
KR102022983B1 (ko) 2019-09-19
JP7089044B2 (ja) 2022-06-21
EP3750550A9 (en) 2021-04-28
EP3750550B1 (en) 2023-03-01
US20210000900A1 (en) 2021-01-07
CN112153976B (zh) 2022-04-29
US20220118039A1 (en) 2022-04-21
US11786572B2 (en) 2023-10-17
EP3750550A4 (en) 2021-11-17
EP3750550A1 (en) 2020-12-16
JP2021525222A (ja) 2021-09-24
CN112153976A (zh) 2020-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2011162523A2 (ko) 쌍화탕 또는 이의 유산균 발효물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물
US20230414688A1 (en) Food composition for promoting height growth and pharmaceutical composition for promoting height growth including humulus japonicus extract or ground humulus japonicus as active ingredient
KR20060128117A (ko) 발효녹용추출물을 포함하는 조성물
KR101709281B1 (ko) 생약 추출물 또는 이의 유산균 발효물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물
WO2020222369A1 (ko) 골다공증 예방 또는 치료용 조성물
KR101199961B1 (ko) 방풍통성산 또는 이의 유산균 발효물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물
KR101242635B1 (ko) 권백 추출물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물
KR101502465B1 (ko) 고량강 추출물을 포함하는 골 관련 질환 또는 혈관 석회화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR20200065170A (ko) 흰목이버섯 발효물을 유효성분으로 함유하는 골다공증, 당뇨 및 비만의 예방 및 치료용 조성물
KR102379612B1 (ko) 갈색거저리 유충 발효 추출물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물
KR101760433B1 (ko) 골다공증의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20200000957A (ko) 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물
GB2427823A (en) Inhibition of weight gain with epsilon-polylysine
KR102102267B1 (ko) 유산균 복합균주 및 n-아세틸글루코사민을 유효성분으로 함유하는 피부보습 및 골다공증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 및 식품 조성물
KR20120044450A (ko) 대계 추출물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물
KR102253131B1 (ko) 갈색거저리 오일을 포함하는 골형성 촉진용 약학적 조성물
WO2020122373A1 (ko) 자감초 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성갱년기 증후군의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR101903905B1 (ko) 핑클루비 (Sedeveria Pink Ruby) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 항암 또는 항산화용 조성물
KR100718490B1 (ko) 파골세포 분화억제 효과를 갖는 대추 추출물 및 이를 포함하는 건강기능식품 조성물
KR102557284B1 (ko) 백수오 배양근 추출물을 유효성분으로 함유하는 골성장 촉진 또는 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR101970353B1 (ko) 몰루긴 및 bmp-2를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR20050104091A (ko) 골성장촉진활성을 갖는 엘루테로사이드 이 및 이를함유하는 기능성 식품 및 약학적 제제
KR20050003989A (ko) 난유래 골강화 조성물
KR102197296B1 (ko) 세모고랭이의 추출물을 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20060026938A (ko) 골성장 촉진활성을 갖는 엘루테로사이드 ｅ를 함유하는약학조성물

Legal Events

Date Code Title Description
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020544900

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019917527

Country of ref document: EP

Effective date: 20200908

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19917527

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE