JP2021525222A - 骨粗しょう症の予防または治療用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
1)龍膽草及び接骨木を溶媒に入れ、加熱して抽出物を得る段階;
2)前記1)段階から得た抽出物を減圧下で濃縮する段階を含むことができる。
1)龍膽草及び接骨木を溶媒に入れ、加熱して抽出物を得る段階;及び
2)前記1)段階から得た抽出物を減圧下で濃縮する段階を含む。
3)前記2)段階から得た濃縮された抽出物を凍結乾燥する段階;及び
4)前記3)段階から得た粉末状の龍膽草及び接骨木抽出物を混合する段階をさらに含むことができる。
龍膽草抽出物と接骨木抽出物を製造するために、それぞれの100gの原水に蒸留水2Lを入れ、90℃で5時間熱水抽出した。濾過された抽出液を50℃で減圧濃縮して凍結乾燥により粉末状の試料を得た。龍膽草抽出物と接骨木抽出物の収率は、それぞれ15.4%、9.27%であった。
本実験例では、本発明の接骨木及び龍膽草抽出物を処理したとき、細胞毒性に及ぼす影響を確認するために実験を行った。
本実験例では、本発明の龍膽草及び接骨木抽出物を濃度別に処理したとき、Alkaline phosphatase acitivityに及ぼす影響を確認するために、実験を行った。一方、Alkaline phosphatase(塩基性リン酸分解酵素;ALP)は、ほとんどの組織に存在し、骨組織に存在するALPは骨成長が活発に起こるときにその活性が増加すると知られている。
本実験例では、本発明の龍膽草及び接骨木抽出物を濃度別に処理時、破骨細胞の分化程度に及ぼす影響を確認するために実験を行った。具体的に、破骨細胞が骨吸収作用をするときに増加するTRAP酵素の活性を測定し、破骨細胞の分化程度にどのように影響を及ぼすかを確認した。
龍膽草及び接骨木抽出物を処理したとき、前骨芽細胞で造骨細胞分化関連因子について発現するかどうかを調べるために、real time PCRを行った。まず、1×105個のMC3T3−E1細胞を12well plateに分注し、参考例1、2及び実施例1〜3をそれぞれ50、100、200μg/mLの濃度別に処理した後、48時間培養した後、細胞を収集してRNeasy extraction kit(Qiagen,Gaithersburg,Maryland,USA)で製造社のprotocolによりRNA抽出を行った。iScript cDNA synthesis kit(Bio−Rad Laboratories Headquarters,Hercules,CA,USA)を用いてcDNA合成した。遺伝子の発現を測定するために、SYBR Green(iQ SYBR Green Supermix,Bio−Rad Bio−Rad Laboratories Inc.)を用いた実時間定量PCRを行い、機器はReal−Time PCR(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA )を用いた。測定するために用いた遺伝子の塩基配列は表3に示した。Real time PCR反応は、総20μl内にcDNA 2μlと2X SYBR mix10μl、forward、reverse primerはそれぞれ100pmol/μlを1μlずつ添加し、残りはH2Oで満たされた。RCR増幅段階は次の通りであり、増幅cycleは40cycleを行った。Hot startのために95℃で8分、増幅段階のdenaturationを95℃で15秒、annealingを55℃で30秒、extensionを72℃で30秒間繰り返し、各cycleのextension後の値が記録された。すべてのcycleが完了した後、primerの特異性を確認するために、melting curve分析を行った。結果の分析は、Applied Biosystemsから提供されるOne step system software v2.1で分析した。ALP遺伝子発現量を測定した結果は図3に、Osteocalcin遺伝子発現量を測定した結果は図4に示した。前記図3及び図4のNCは、対照群として造骨細胞の分化誘導実験も行わず、何も処理しない実験群である。
龍膽草及び接骨木抽出物を処理したとき、前破骨細胞で破骨細胞分化関連因子の発現を調べるために、real time PCRを行った。5×105個のRAW246.7細胞を12well plateに分注し、10ng/mLのRNAKLと10ng/mLのM−CSFを添加して破骨細胞への分化を誘導した後、参考例1、2及び実施例1〜3をそれぞれ50、100、200μg/mLの濃度別に処理し、48時間が経過した後、細胞を収集し、RNeasy extraction kit(Qiagen,Gaithersburg,Maryland,USA)で製造社のprotocolによりRNA抽出を行った。iScript cDNA synthesis kit(Bio−Rad Laboratories Headquarters,Hercules,CA,USA)を用いてcDNAを合成した。遺伝子の発現を測定するために、SYBR Green(iQ SYBR Green Supermix,Bio−Rad Bio−Rad Laboratories Inc.)を用いた実時間定量PCRを行い、機器はReal−Time PCR(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA )を用いた。測定しようとする遺伝子の塩基配列は前記表3に示した。Real time PCR反応は、総20μl内にcDNA2μlと2X SYBR mix 10μl、forward、reverse primerはそれぞれ100pmol/μlを1μlずつ添加し、残りはH2Oで満たされた。RCR増幅段階は次の通りであり、増幅cycleは40 cycleを行った。Hot startのために95℃で8分、増幅段階のdenaturationを95℃で15秒、annealingを55℃で30秒、extensionを72℃で30秒間繰り返し、各cycleのextension後に値が記録された。すべてのcycleが完了した後、primerの特異性を確認するために、melting curve分析を行った。結果の分析は、Applide Biosystemsから提供されるOne step system software v2.1で分析した。
Claims (11)
- 龍膽草及び接骨木抽出物を含む骨粗しょう症の予防または治療用組成物。
- 前記龍膽草抽出物及び前記接骨木抽出物の混合重量比は、1:0.1〜10である、請求項1に記載の骨粗しょう症の予防または治療用組成物。
- 前記龍膽草及び接骨木の抽出物を全体組成物の総重量に対して0.001〜100重量%で含む、請求項1に記載の骨粗しょう症の予防または治療用組成物。
- 前記龍膽草及び接骨木抽出物は、熱水抽出により抽出されたものである、請求項1に記載の骨粗しょう症の予防または治療用組成物。
- 前記組成物は、骨形成に関連する遺伝子の発現を向上させるものである、請求項1に記載の骨粗しょう症の予防または治療用組成物。
- 前記骨形成に関連する遺伝子は、ALP、Osteocalcin、BMP、TGF−β及びosteoprotegerinからなる群より選択された1種以上の遺伝子である、請求項5に記載の骨粗しょう症の予防または治療用組成物。
- 前記組成物は、骨吸収に関連する遺伝子の発現を抑制させるものである、請求項1に記載の骨粗しょう症の予防または治療用組成物。
- 前記骨形成に関連する遺伝子は、NF−kB、c−FOS、NFATC−1、Cathepsin K及びMMP−9からなる群より選択された1種以上の遺伝子である、請求項7に記載の骨粗しょう症の予防または治療用組成物。
- 1)龍膽草及び接骨木を溶媒に入れ、加熱して抽出物を得る段階;及び
2)前記1)段階から得た抽出物を減圧下で濃縮する段階;
を含む請求項1に記載の骨粗しょう症の予防または治療用組成物の製造方法。 - 前記1)段階の加熱温度は、80〜100℃である、請求項9に記載の骨粗しょう症の予防または治療用組成物の製造方法。
- 前記2)段階は、30〜70℃で行う段階である、請求項9に記載の骨粗しょう症の予防または治療用組成物の製造方法。
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