JP7231313B2

JP7231313B2 - 血圧を降下させるための組成物

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Publication number: JP7231313B2
Application number: JP2018236151A
Authority: JP
Inventors: 泰久阿野; 真弘喜多; 啓子小林
Original assignee: Kirin Holdings Co Ltd
Current assignee: Kirin Holdings Co Ltd
Priority date: 2018-12-18
Filing date: 2018-12-18
Publication date: 2023-03-01
Anticipated expiration: 2038-12-18
Also published as: JP2020097535A

Description

本発明は、血圧を降下させるための組成物に関する。

食生活、運動習慣等の生活習慣の変化や、高齢化の進展に伴い、いわゆる生活習慣病が増加している。生活習慣病の一つである高血圧は、血管の中を流れる血液の圧力が強くなり続けている状態をいう。この状態が進行すると血管壁の弾力性やしなやかさが失われ、さらに血管壁に傷が生じると、その傷にＬＤＬコレステロール等が沈着し、脳梗塞や心筋梗塞等の原因となる動脈硬化が促進される。また、高血圧状態は心臓、腎臓、脳、網膜等の様々な臓器・器官にも悪影響を及ぼす。このため高血圧はサイレントキラーと呼ばれており、高血圧状態の予防や改善は生活習慣病対策として極めて重要である。

これまでに日常摂取を目的として、血圧降下作用を有する食品素材が開発されている。例えば、牛乳由来カゼインの酵素分解物に含まれるトリペプチドを有効成分とする血圧降下剤が知られている（特許文献１）。しかしながら、血圧を健康状態に維持・改善可能な、日常生活において手軽に摂取できる食品素材は未だ少ないのが現状である。

国際公開第２００５／０１２５４２号

本発明は血圧を降下させることができる新規素材およびそれを含む組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは今般、ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するテトラペプチドと、それを含むホエイタンパク質酵素分解物がアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有することを見出した。本発明者らはまた、該テトラペプチドを含むホエイタンパク質酵素分解物がヒトにおいて血圧降下作用を有することを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。

本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］乳タンパク質酵素分解物を有効成分として含んでなる、血圧を降下させるための組成物および血圧降下剤であって、前記乳タンパク質酵素分解物が、ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドを含む、組成物および用剤。
［２］乳タンパク質酵素分解物が、ホエイタンパク質酵素分解物である、上記［１］に記載の組成物および用剤。
［３］ホエイタンパク質酵素分解物を、ヒト１日当たり０．０１～１００ｇ（固形分換算）で摂取させる、上記［１］または［２］に記載の組成物および用剤。
［４］ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含んでなる、血圧を降下させるための組成物および血圧降下剤。
［５］前記ペプチドを、ヒト１日当たり０．０１～１００ｍｇ（固形分換算）で摂取させる、上記［１］または［４］に記載の組成物および用剤。
［６］食品の形態である、上記［１］～［５］のいずれかに記載の組成物および用剤。

上記［１］および［４］の組成物を本明細書において「本発明の組成物」と、上記［１］および［４］の用剤を本明細書において「本発明の用剤」と、それぞれいうことがある。

本発明の組成物および用剤が有効成分とする前記テトラペプチドおよびそれを含有するホエイタンパク質酵素分解物は、長年にわたり食経験がある素材である。従って、本発明の組成物および用剤は、血圧降下作用を有する機能性食品として利用できるとともに、ヒトを含む哺乳類に安全な機能性食品として利用できる点で有利である。

ヒト試験における収縮期血圧に対するホエイ分解物（試験食品群）の効果を示した図である。＊はＰ＜０．０５（ｔ検定ｖｓ．対照食品群）を示す。ヒト試験における拡張期血圧に対するホエイ分解物（試験食品群）の効果を示した図である。

発明の具体的説明

本発明の組成物および用剤の有効成分である乳タンパク質酵素分解物（以下、「本発明の乳タンパク質分解物」ということがある）は、乳タンパク質の酵素分解物である限り特に限定されない。乳タンパク質としては、全乳、粉乳、ミルクプロテインまたはホエイを用いることができ、好ましくはホエイである。ここで、「ホエイ」とは、乳清、乳漿またはホエーともいい、乳から乳脂肪分やカゼインなどを除いた水溶液を意味する。ホエイはβ－ラクトグロブリン、α－ラクトアルブミン、血清アルブミン、免疫グロブリン等から構成される。本発明で使用するホエイの由来動植物は問わないが、牛乳由来ホエイを用いることが好ましい。本発明の乳タンパク質分解物は、好ましくはホエイタンパク質酵素分解物（以下、単に「ホエイ分解物」ということがある）である。

本発明の組成物および用剤は、本発明の乳タンパク質分解物を単独で使用することができ、あるいは、他の成分と混合して使用することもできる。本発明の組成物および用剤における本発明の乳タンパク質分解物の含有量（固形分換算）は、その目的、用途、形態、剤型、症状、年齢などに応じて任意に定めることができ、本発明はこれに限定されないが、例えば、全体量に対して、０．００１～９９質量％（好ましくは０．０１～９５質量％）とすることができる。本発明においては、本発明の用剤を本発明の乳タンパク質分解物からなるものとし、本発明の組成物を本発明の乳タンパク質分解物と他の成分とを含んでなるものとすることができる。

本発明の乳タンパク質分解物（特に、ホエイ分解物）は、好ましくはＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチド（以下、「本発明のペプチド」ということがある）およびＷＹのアミノ酸配列を有するペプチドを含有してなるものを使用することができる。ここで、「アミノ酸配列を有するペプチド」とは、該アミノ酸配列により配列が特定されたペプチドを意味する。

本発明の乳タンパク質分解物（特に、ホエイ分解物）中のテトラペプチドＧＴＷＹの含有量（固形分換算）は、例えば、０．０１～１質量％（好ましくは０．０５～０．５質量％）であり、ジペプチドＷＹの含有量（固形分換算）は、例えば、０．００５～０．５質量％（好ましくは０．０１～０．１質量％）である。

本発明の組成物および用剤における本発明のペプチドの含有量（固形分換算）は、その目的、用途、形態、剤型、症状、体重等に応じて任意に定めることができ、本発明はこれに限定されないが、例えば、全体量に対して、０．００００１～５０質量％（好ましくは０．０００１～１０質量％）とすることができる。

本発明の乳タンパク質分解物（特に、本発明のペプチドを含有する乳タンパク質分解物）の製造方法は公知であり、例えば、国際公開公報第２０１７／０８６３０３号の記載に従って製造することができる。あるいは、市販されているホエイ分解物（例えば、ＨＷ－３（雪印メグミルク社製））を本発明の乳タンパク質分解物として用いてもよい。

本発明のペプチドを含有する乳タンパク質分解物は、例えば、原料タンパク質にタンパク質分解酵素を含む酵素製剤を作用させることにより製造することができる。

原料としてホエイタンパク質を用いる場合、酵素反応に供されるホエイタンパク質の濃度は、タンパク質が溶解し得る限り限定されないが、タンパク質が溶解し得る限り限定されないが、ゲル化や凝集を抑制し、濃縮の手間を省く観点から、１～３０ｗ／ｖ％とすることが好ましく、より好ましくは１～２０ｗ／ｖ％であり、さらに好ましくは５～１５ｗ／ｖ％である。

原料タンパク質が乳清や乳漿のような水溶液の場合、そのままで、あるいは濃縮または希釈して酵素反応に供すればよく、必要に応じｐＨ調整等をすることができる。原料タンパク質が紛体等の固形物の場合、酵素反応が進行する限りいずれの水系溶媒に溶解させてもかまわないが、食品としての利用を考慮し、水または食品添加物グレードの緩衝液に溶解させることが好ましい。酵素反応で生じたアミノ酸により反応液のｐＨが変化しないようにするため緩衝液を使用することが好ましい。緩衝液の種類は任意であり、その後の利用や風味・味覚・ミネラル量を考慮して決定すればよいが、反応液のｐＨを４～９、好ましくは５～８、より好ましくは７～８に維持できるような組成が好ましい。最も好ましくはリン酸カリウム緩衝液である。緩衝液の濃度は緩衝効果が得られる範囲であれば任意であるが、風味・味覚・ミネラル量を考慮すると、０．０１～０．５Ｍとすることができ、好ましくは０．０５～０．２Ｍであり、より好ましくは約０．１Ｍである。

酵素はタンパク質分解酵素を含む酵素剤であればいずれも使用できるが、中性プロテアーゼを含む酵素製剤であることが好ましく、１種類またはそれ以上を組合せて使用することができる。酵素製剤は、たとえばバチルス・サブティリス、アスペルギルス・オリゼ、アルペルギルス・メレウスなどの微生物を由来としたものを使用することができ、このうちアスペルギルス・オリゼ由来の酵素製剤とアルペルギルス・メレウス由来の酵素製剤が好ましく、より好ましくはアルペルギルス・メレウス由来の酵素製剤である。

本発明では市販の酵素製剤を使用することができ、例えば、天野エンザイム社、新日本化学工業社、ＤＳＭ社、ダニスコ社、ノボザイム社、ＨＢＩ社などから酵素製剤を入手可能である。酵素製剤の添加量は任意であるが、適度な加水分解反応速度と、コストを考慮すると、例えば、０．０１～５ｗ／ｖ％、好ましくは０．０５～４ｗ／ｖ％、より好ましくは０．１～０．５ｗ／ｖ％とすることができる。

酵素反応温度と酵素反応時間は原料タンパク質の加水分解が十分になされ、酵素分解物の品質が保たれるように設定することができる。すなわち、酵素反応温度は、例えば、３０～７０℃とすることができ、好ましくは４０～７０℃であり、より好ましくは４５～６５℃である。また、酵素反応時間は１～１２時間とすることができ、好ましくは２～１０時間であり、より好ましくは４～５時間である。なお、反応温度と反応時間は本発明のペプチドの生成量を確認しながら適宜調整することができる。

酵素反応は温度を上昇させながら行うこともできる。例えば、３０℃から７５℃にまで４～１０時間かけて上昇させながら反応させることができる。好ましくは、３５℃から７５℃まで５～８時間かけて上昇させながら反応させることができ、より好ましくは３５℃から７５℃まで６～８時間かけて反応させることができる。温度上昇スピードは任意であるが、４５℃から５５℃の間での保持時間を長めにし（５～７時間）、その後６０℃まですみやかに上昇させた後に６０℃から７５℃の間で長めに（たとえば１～３時間）保持することが好ましい。最も好ましいのは５０℃で酵素を投入し、５～７時間保持後、任意の速度で昇温させ、６０～６５℃あるいは６５～７５℃の目標温度で１～３時間保持する方法である。

反応に際しては反応効率の観点から反応液を撹拌することが好ましい。基質が酵素とよく接するように、液撹拌速度は速い方がよいが、速すぎると反応液が飛び散る恐れがあるため、例えば、１００～５００ｒｐｍとすることができ、好ましくは２００～４００ｒｐｍであり、より好ましくは約２５０ｒｐｍである。

所望のペプチドが得られたら反応液は酵素反応を停止工程に付すことが好ましい。酵素反応停止工程では、反応液を高温にしたり、キレート剤を添加して酵素の化学構造を変化させたりする方法や、膜処理により酵素を除去する方法を採用することができる。好ましい手法は高温による失活処理である。該方法は８０～９０℃で５～３０分、好ましくは８０～９０℃で２０～３０分間保持することで実施することができる。また、後述の濃縮工程で高温になる場合には、濃縮工程を兼ねて行うことができる。

酵素反応工程および酵素反応停止工程を経た反応液（乳タンパク質分解物）は、さらに殺菌工程に付してもよい。殺菌工程としては、例えば、後述の膜処理工程や高温殺菌工程が挙げられる。加熱殺菌工程は酵素反応停止工程を兼ねることもでき、製造工程の簡略化の点で有利である。

酵素反応工程および酵素反応停止工程を経た反応液（乳タンパク質分解物）は、さらに精製工程に付してもよい。精製工程としてはたとえば膜処理工程が挙げられ、好ましい膜処理は限外ろ過である。限外ろ過の分画分子量としては３～１００ｋＤａのものが好ましく、５～５０ｋＤａがより好ましい。精製工程を実施すると、実施しなかった場合と比較してペプチド組成物の風味を改善することができる点で有利である。また、精製工程は酵素反応停止工程および殺菌工程を兼ねることもでき、製造工程の簡略化の点でも有利である。

酵素反応工程および酵素反応停止工程を経た反応液（乳タンパク質分解物）は、保管や運搬の観点からさらに濃縮工程に付してもよい。濃縮工程は任意の方法を選択することができるが、減圧濃縮、凍結乾燥および噴霧乾燥（スプレードライ）、膜処理による濃縮（例えば、逆浸透膜を用いる方法）による方法が好ましく、より好ましくは凍結乾燥および噴霧乾燥である。濃縮を大量かつ効率的に実施する観点から噴霧乾燥が特に好ましい。

本発明のペプチドの含有量の測定は、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により実施することができる。当業者であればその条件設定は容易に行うことができ、測定の際に標準ペプチドとしてＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定用の純度のものを使用することはいうまでもないが、例えば、ＳＩＧＭＡＡＬＤＲＩＣＨ社製ＡＱＵＡペプチドを使用することができる。

本発明の組成物および用剤は、血圧を降下させるためのものである。ここで、「血圧を降下させる」とは、文字通り血圧を低下させることに加え、血圧の上昇抑制を含む意味で用いられる。ここで、「血圧の上昇抑制」は、血圧上昇のリスク（例えば、塩分過剰摂取、運動不足、喫煙、飲酒等による血圧上昇のリスク）がある対象において該リスクを低減することを含む。また、「血圧」は、収縮期血圧および拡張期血圧を含む。血圧の測定は公知の方法に従って行うことができ、例えば、非観血式血圧計を用いて測定することができる。

後記実施例に示される通り、ホエイタンパク質酵素分解物を摂取させることにより対象の血圧を降下させることができる。従って、本発明の組成物および用剤は、高血圧症の対象および高血圧症のリスクがある対象に摂取させることができる。ここで、「高血圧症」とは、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上および拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上の少なくともいずれかを満たす状態をいう。また、「高血圧症のリスクがある対象」は、高血圧症ではないが、将来において高血圧症の発症の恐れがある対象を含む意味で用いられ、例えば、収縮期血圧が１３０～１３９ｍｍＨｇおよび拡張期血圧が８５～８９ｍｍＨｇの少なくともいずれかを満たす正常高値血圧の対象が挙げられる。

本発明の組成物および用剤は、医薬品（例えば、医薬組成物）、医薬部外品、食品（例えば、食品組成物）、飼料（ペットフード含む）等の形態で提供することができ、下記の記載に従って実施することができる。

本発明の組成物および用剤は、ヒトおよび非ヒト動物に経口投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学上許容される担体を用いて製剤化することができる。薬学上許容される担体としては、賦形剤、結合剤、希釈剤、添加剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。

本発明の乳タンパク質分解物および本発明のペプチドを食品として提供する場合には、それをそのまま食品として提供することができ、あるいはそれを食品に含有させて提供することができる。例えば、本発明の乳タンパク質分解物あるいは本発明のペプチドを食品として提供する場合には、ホエイ分解物等の乳タンパク質の酵素分解物あるいは本発明のペプチドを、そのまま食品として提供することができ、あるいはそれを食品に含有させて提供することができる。このようにして提供された食品は本発明の乳タンパク質分解物または本発明のペプチドを有効量含有した食品である。本明細書において、本発明の乳タンパク質分解物または本発明のペプチドを「有効量含有した」とは、個々の食品において通常喫食される量を摂取した場合に後述するような範囲で本発明の乳タンパク質分解物または本発明のペプチドが摂取されるような含有量をいう。また「食品」とは、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、保健機能食品（例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品）、特別用途食品（例えば、幼児用食品、妊産婦用食品、病者用食品）およびサプリメントを含む意味で用いられる。なお、本発明の乳タンパク質分解物または本発明のペプチドをヒト以外の動物に摂取させる場合には、本発明でいう食品が飼料として使用されることはいうまでもない。

本発明の乳タンパク質分解物または本発明のペプチドは、上記のような血圧降下作用を有するため、日常摂取する食品に含有させることができ、あるいは、サプリメントとして提供することができる。すなわち、本発明の組成物および用剤は食品の形態で提供することができる。この場合、本発明の組成物および用剤は１食当たりに摂取する量が予め定められた単位包装形態で提供することができる。１食当たりの単位包装形態としては、例えば、パック、包装、缶、ボトル等で一定量を規定する形態が挙げられる。本発明の組成物および用剤の各種作用をよりよく発揮させるためには、後述する、本発明の血圧降下機能の１日当たりの摂取量に従って１食当たりの摂取量を決定できる。本発明の食品は、摂取量に関する説明事項が包装に表示されるか、あるいは説明事項が記載された文書等と一緒に提供されてもよい。

単位包装形態においてあらかじめ定められた１食当たりの摂取量は、１日当たりの有効摂取量であっても、１日当たりの有効摂取量を２回またはそれ以上（好ましくは２または３回）に分けた摂取量であってもよい。従って、本発明の組成物および用剤の単位包装形態には、後述のヒト１日当たりの摂取量で本発明の乳タンパク質分解物または本発明のペプチドを含有させることができ、あるいは、後述のヒト１日当たりの摂取量の２分の１から３分の１の量で本発明の乳タンパク質分解物または本発明のペプチドを含有させることができる。本発明の組成物および用剤は、摂取の便宜上、１食当たりの摂取量が１日当たりの有効摂取量である、「１食当たりの単位包装形態」で提供することが好ましい。

「食品」の形態は特に限定されるものではなく、例えば、飲料の形態であっても、半液体やゲル状の形態であっても、固形体や粉末状の形態であってもよい。また、「サプリメント」としては、本発明の乳タンパク質分解物または本発明のペプチドに賦形剤、結合剤等を加え練り合わせた後に打錠することにより製造された錠剤や、カプセル等に封入されたカプセル剤が挙げられる。

本発明で提供される食品は、本発明の乳タンパク質分解物または本発明のペプチドを含有する限り、特に限定されるものではないが、例えば、清涼飲料水、炭酸飲料、果汁入り飲料、野菜汁入り飲料、果汁および野菜汁入り飲料、牛乳等の畜乳、豆乳、乳飲料、乳酸菌飲料、ドリンクタイプのヨーグルト、ドリンクタイプやスティックタイプのゼリー、コーヒー、ココア、茶飲料、栄養ドリンク、エナジー飲料、スポーツドリンク、ミネラルウォーター、ニア・ウォーター、ノンアルコールのビールテイスト飲料等の非アルコール飲料；飯類、麺類、パン類およびパスタ類等炭水化物含有飲食品；チーズ類、ハードタイプまたはソフトタイプのヨーグルト、畜乳その他の油脂原料による生クリーム、アイスクリーム等の乳製品；クッキー、ケーキ、チョコレート等の洋菓子類、饅頭や羊羹等の和菓子類、ラムネ等のタブレット菓子（清涼菓子）、キャンディー類、ガム類、ゼリーやプリン等の冷菓や氷菓、スナック菓子等の各種菓子類；ウイスキー、バーボン、スピリッツ、リキュール、ワイン、果実酒、日本酒、中国酒、焼酎、ビール、アルコール度数１％以下のノンアルコールビール、発泡酒、その他雑酒、酎ハイ等のアルコール飲料；卵を用いた加工品、魚介類や畜肉（レバー等の臓物を含む）の加工品（珍味を含む）、味噌汁等のスープ類等の加工食品、みそ、しょうゆ、ふりかけ、その他シーズニング調味料等の調味料、濃厚流動食等の流動食等を例示することができる。なお、ミネラルウォーターは、発泡性および非発泡性のミネラルウォーターのいずれもが包含される。また、本発明で提供される食品には、食品製造原料および食品添加物のいずれもが含まれる。

茶飲料としては、発酵茶、半発酵茶および不発酵茶のいずれもが包含され、例えば、紅茶、緑茶、麦茶、玄米茶、煎茶、玉露茶、ほうじ茶、ウーロン茶、ウコン茶、プーアル茶、ルイボスティー、ローズ茶、キク茶、イチョウ葉茶、ハーブ茶（例えば、ミント茶、ジャスミン茶）が挙げられる。

果汁入り飲料や果汁および野菜汁入り飲料に用いられる果物としては、例えば、リンゴ、ミカン、ブドウ、バナナ、ナシ、モモ、マンゴー、アサイー、ブルーベリーおよびウメが挙げられる。また、野菜汁入り飲料や果汁および野菜汁入り飲料に用いられる野菜としては、例えば、トマト、ニンジン、セロリ、カボチャ、キュウリおよびスイカが挙げられる。

本発明の乳タンパク質分解物および本発明のペプチドはヒトが食品として長年摂取してきた乳タンパク質の分解物等に含まれる成分であることから、毒性も低く、それを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル、イルカ、アシカ等）に対し安全に用いることができる。本発明の乳タンパク質分解物および本発明のペプチドの摂取量または投与量は、受容者の性別、年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与経路並びに組み合わせる薬剤等に依存して決定できる。血圧降下作用を目的とした本発明の乳タンパク質分解物の成人１日当たりの摂取量および投与量（固形分換算）は、例えば、０．０１～１００ｇ（好ましくは０．１～１０ｇ）である。血圧降下作用を目的とした本発明のペプチドの成人１日当たりの摂取量および投与量（固形分換算）は、例えば、０．０１～１００ｍｇ（好ましくは０．１～１０ｍｇ）である。

本発明の乳タンパク質分解物および本発明のペプチドは、例えば、血圧降下作用を期待する日時よりも前に摂取を開始することが望ましく、その開始時期は上記期待日時の３日前（好ましくは５日前、より好ましくは１０日前）とすることができる。本発明の乳タンパク質分解物および本発明のペプチドはまた、血圧降下作用を期待する期間内は摂取を継続することが好ましい。

本発明の乳タンパク質分解物および本発明のペプチドの摂取期間は、前記した１日量での摂取を少なくとも３日間（好ましくは１週間）とすることができる。また、本発明の乳タンパク質分解物および本発明のペプチドの摂取間隔は、前記した１日量での摂取を３日に１回、２日に１回または１日１回とすることができる。

本発明の乳タンパク質分解物および本発明のペプチドに関する上記摂取量、摂取タイミング、摂取期間および摂取間隔は、本発明の乳タンパク質分解物および本発明のペプチドを非治療目的および治療目的のいずれで使用する場合にも適用があり、治療目的の場合には摂取は投与に読み替えることができる。

本発明の組成物および用剤並びに食品には、血圧降下作用を有する旨の表示が付されてもよい。この場合、消費者に理解しやすい表示とするため本発明の組成物および用剤並びに食品には以下の一部または全部の表示が付されてもよい。なお、本発明において「血圧を降下させる」ことが以下の表示を含む意味で用いられることはいうまでもない。
・血圧が気になる方に
・血圧が高めの方（正常高値の方）に
・血圧を健康に保つ
・血圧を正常に維持する
・高めの血圧を改善する

本発明の別の面によれば、有効量の本発明の乳タンパク質酵素分解物または本発明のペプチドあるいはそれを含む組成物を、それを必要としている対象に摂取させるか、あるいは投与することを含んでなる、血圧降下方法が提供される。本発明の方法は、本発明の組成物および用剤に関する記載に従って実施することができる。

本発明のさらに別の面によれば、血圧降下剤の製造のための、血圧降下剤としての、あるいは、本発明の血圧降下方法における、本発明の乳タンパク質酵素分解物または本発明のペプチドの使用が提供される。本発明の使用は、本発明の組成物および用剤に関する記載に従って実施することができる。

本発明のさらにまた別の面によれば、血圧降下に用いるための、あるいは、本発明の血圧降下方法に用いるための、乳タンパク質酵素分解物またはＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドが提供される。上記の乳タンパク質酵素分解物およびテトラペプチドは、本発明の組成物および用剤に関する記載に従って実施することができる。

本発明の方法および本発明の使用はヒトを含む哺乳動物における使用であってもよく、治療的使用と非治療的使用のいずれもが意図される。本明細書において、「非治療的」とはヒトを手術、治療または診断する行為（すなわち、ヒトに対する医療行為）を含まないことを意味し、具体的には、医師または医師の指示を受けた者がヒトに対して手術、治療または診断を行う方法を含まないことを意味する。

以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

例１：ホエイ分解物含有タブレットの調製並びにテトラペプチドＧＴＷＹおよびジペプチドＷＹの含有量の測定
（１）タブレットの調製
ホエイ分解物（ＨＷ－３、雪印メグミルク社製）と、賦形剤および結合剤を混合して練り合わせた後、打錠することによりホエイ分解物含有タブレット（３００ｍｇ／粒）を製造した。タブレット１粒中のホエイ分解物の含有量は１６８ｍｇであった。上記ホエイ分解物は、ホエイタンパク質にタンパク質分解酵素を含む酵素製剤を作用させ、次いで膜処理を行って未分解物を除去し、乾燥させて得られた製品であり、後述のようにテトラペプチドＧＴＷＹおよびジペプチドＷＹを含有するものである。

（２）分析試料の調製
上記（１）で調製したタブレット１００粒（約３０ｇ）を乳鉢でよくすり潰し、その２０ｍｇを秤量し、滅菌水１ｍＬを加えてよく懸濁させた。懸濁液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、室温、３分）して得られた上清５００μＬを限外ろ過フィルター（１０ｋＤａ）でろ過し、ろ液を１０００倍希釈して測定試料とした。

（３）分析方法
上記（２）で得られた測定試料中のテトラペプチドＧＴＷＹおよびジペプチドＷＹの濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法により下記の分析条件で定量した。なお、ＡＱＵＡＰｅｐｔｉｄｅ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社製）を標準試料とする検量線法により測定試料のＧＴＷＹ濃度を算出した。

＜分析条件＞
質量分析装置：４０００ＱＴＲＡＰ（エービー・サイエックス社製）
ＨＰＬＣ装置：Ａｇｉｌｅｎｔ１２００Ｓｅｒｉｅｓ（アジレント・テクノロジー社製）
カラム：ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ－１００Ｖ３μｍ２．０ｍｍＩ．Ｄ．Ｘ１５０ｍｍ（東ソー社製）
カラム温度：７０℃
移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル溶液
グラジエント条件：表１に示すグラジエント条件を適用した。

流量：０．２ｍＬ／分
試料注入量：２μＬ
イオン化法：ＥＳＩ（正イオン検出モード）
カーテンガス：４０ｐｓｉ
ネブライザーガス：５０ｐｓｉ
乾燥ガス：８０ｐｓｉ
乾燥ガス温度：６００℃
コリジョンガス：窒素
イオン化電圧：５０００Ｖ

＜テトラペプチドＧＴＷＹの分析条件＞
設定質量数（ｍ／ｚ）／コリジョンエネルギー（ｅＶ）：５２６．４→１５９．２／４７、５２６．４→３６８．３／２３
ＤＰ電圧（Ｖ）：３６

＜ジペプチドＷＹの分析条件＞
設定質量数（ｍ／ｚ）／コリジョンエネルギー（ｅＶ）：３６８．２→３５１．１／１９、３６８．２→１５９．２／３３
ＤＰ電圧（Ｖ）：５１

（４）分析結果
ホエイ分解物含有タブレット１粒（３００ｍｇ）中にテトラペプチドＧＴＷＹは０．２７ｍｇ（０．０９７質量％）、ジペプチドＷＹは０．１０ｍｇ（０．０３３質量％）それぞれ含まれていることが確認された。

例２：アンジオテンシン変換酵素活性に対するホエイ分解物および２種のペプチドの効果
（１）試験の概要
ホエイ分解物およびホエイ分解物に含まれるペプチド（ＧＴＷＹ、ＷＹ）について血圧調節に関与する系であるアンジオテンシン変換酵素阻害活性を評価した。

（２）試験手順
アンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定は、Le Hoang Lamらの報告（Biochem.,2007, 364, 104.）およびLe Hoang Lamらの報告（Anal. Sci., 2008, 24, 1057.）に基づく測定キット（同仁化学社ACE Kit-WST）を使用した。該キットは、３－ヒドロキシブチリル－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（３ＨＢ－ＧＧＧ）にアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を作用させたときに産生する３－ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）の量を、発色を利用した酵素法により４５０ｎｍの吸光度として求めるものである。被験試料の希釈倍率を変えた７点の測定試料と共存させたときに得られる発色強度と被験試料非共存時の発色強度から被験試料の５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）を算出した。

具体的には、ホエイ分解物（ＨＷ－３、雪印メグミルク社製）０．１％水溶液、ＧＴＷＹのアミノ酸配列を有するペプチド（合成品）０．１％水溶液、またはＷＹのアミノ酸配列を有するペプチド（合成品）０．１％水溶液を被験試料とし、被験試料を純水で６段階に希釈して測定試料とした。９６穴プレートに測定試料または純水を入れ、そこにキット添付の（３ＨＢ－ＧＧＧ）を含む基質溶液とＡＣＥ溶液を含むEnzyme working solutionを添加し３７℃で６０分間インキュベートした。さらに発色のためのIndicator working solutionまたは純水を添加し、室温で１０分間インキュベートした。プレートリーダーを用い４５０ｎｍの吸光度を測定し、得られた吸光度からＡＣＥ阻害活性値（阻害率％）を下記式により求めた。

なお、表２に記載される通り、測定試料の代わりに純水を入れて反応させたものをブランク１とし、純水で反応させ、かつEnzyme working solutionの代わりに純水を入れて反応させたものをブランク２とした。

（３）結果
アンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定の結果、ホエイ分解物、ＧＴＷＹ、ＷＹのＩＣ_５０はそれぞれ３２．０μｇ／ｍＬ、１２．０μｇ／ｍＬ、５．０μｇ／ｍＬであった。

（４）考察
ホエイ分解物、ＧＴＷＹ、ＷＹにはそれぞれＡＣＥ阻害活性が認められることがわかった。また、ホエイ分解物のＡＣＥ阻害活性に関してＧＴＷＹのＡＣＥ阻害効果の寄与は小さくないものと考えられた。

高血圧の原因となる、強力な血管収縮物質であるアンジオテンシンＩＩは、不活性型ペプチドであるアンジオテンシンＩから、それが肺および腎臓を循環する間にＣ末端側のＨｉｓ－ＬｅｕがアンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）により切断されることによって生成されることが知られている。このアンジオテンシンＩからアンジオテンシンＩＩへの変換を伴う腎臓のレニン－アンジオテンシン系（ＲＡＳ）が、高血圧症の約９０％を占める本態性高血圧の発症に密接に関連していることが知られている。一方で、アンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）は、キニン－カリクレイン系において降圧ペプチドであるブラジキニンの分解を不活化する反応も触媒する（日大医誌,73(1):6-7(2014)）。これらのことから、ＡＣＥ活性を阻害すれば、血圧上昇が抑制され、高血圧の抑制につながると考えられる。従って、ペプチドＧＴＷＹと、該ペプチドを含有するホエイ分解物は血圧降下に有効であると考えられた。

例３：ヒト血圧に対するホエイ分解物の効果
（１）試験の概要
ホエイ分解物が血圧低下に及ぼす効果を検証するヒト試験を実施した。本試験は、プラセボを対照とした無作為化二重盲検並行群間比較試験とした。試験期間は１２週間とし、試験期間中は試験食品または対照食品を摂取させた。具体的には、５０歳以上７５歳以下の健康な男女に試験食品として「ホエイ分解物含有タブレット」を、対照食品として「ホエイ分解物非含有タブレット」をそれぞれ摂取させて、ホエイ分解物の血圧低下に対する効果を確認した。

（２）被験者
事前検査において医師から健常と判断された者を試験食品群（５１名）と対照食品群（５３名）に無作為に割り付けた。被験者には、試験期間中は試験期間前と同様の生活を継続させた。

（３）被験食品
試験期間中（１２週間）、試験食品群には６粒の試験食品を、対照食品群には６粒の対照食品（以下、「プラセボ」ということがある。）を１日１回水またはぬるま湯と共に毎日摂取させた。試験食品としては、「ホエイ分解物含有タブレット」（タブレット６粒中にＧＴＷＹを乾燥質量換算で１７４ｍｇ含有し、ＷＹを乾燥質量換算で０．６０ｍｇ含有する）を用いた。また、対照食品としてはホエイ分解物に代えて、マルトデキストリンを配合する以外は同様の方法によって製造した「ホエイ分解物非含有タブレット」を用いた。１粒あたりの試験食品の処方は表３に示す通りである。

（４）測定
被験者に対して非観血式血圧計を用いて血圧測定を行った。具体的には、試験食品摂取開始前、摂取開始後６週時および摂取開始後１２週時の被験者の来院時に１回実施した。なお、６週時および１２週時において、試験食品の摂取は測定の３０分前を目安に行った。

（５）評価と解析
各測定時期における測定値から試験食品摂取開始前の測定値を差引いた値（差分、以下「血圧変化量」という）を評価した。血圧変化量については対応のないｔ検定を用いて群間比較した。

（６）結果
ア被験者
解析対象者は、試験食品群では５１名（男性１７名、女性３４名）、対照食品群では５３名（男性２０名、女性３３名）であり、解析対象者の年齢（平均値±標準偏差）は試験食品群が６０．７±５．７歳、対照食品群が６１．２±５．６歳であった。被験食品摂取開始前の血圧は表４のとおりであり、収縮期血圧、拡張期血圧とも群間差は認められなかった。

イ血圧
収縮期血圧についての結果を図１に、拡張期血圧についての結果を図２に示した。各測定時期における血圧変化量（平均値±標準偏差）は、概ね試験食品群の方が低く推移し、収縮期血圧については摂取８５日目において群間の有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）。

（７）考察
ＧＴＷＹとＷＹを含有するホエイ分解物は、血圧を降下させる作用を有することがわかった。本ヒト試験の被験者が健常な者であることを考慮すると、ＧＴＷＹとＷＹを含有するホエイ分解物による降圧効果は、高血圧傾向のある被験者に対してはより顕著に作用することが予想された。さらに、例２の結果（ホエイ分解物によるＡＣＥ阻害効果にＧＴＷＹによるＡＣＥ阻害効果の寄与が大きかったこと）とあわせて考えると、ＧＴＷＹもまた血圧を降下させる作用を有すると考えられた。

Claims

乳タンパク質酵素分解物を有効成分として含んでなる、血圧を降下させるための組成物であって、前記乳タンパク質酵素分解物が、ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列からなるテトラペプチドを含む、組成物。
乳タンパク質酵素分解物が、ホエイタンパク質酵素分解物である、請求項１に記載の組成物。
ホエイタンパク質酵素分解物を、ヒト１日当たり０．０１～１００ｇ（固形分換算）で摂取させる、請求項１または２に記載の組成物。
アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を阻害するためのものである、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列からなるテトラペプチドを有効成分とする、血圧降下剤。
ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列からなるテトラペプチドを有効成分とする、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤。
前記テトラペプチドを、ヒト１日当たり０．０１～１００ｍｇ（固形分換算）で摂取させる、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物、または請求項５または６に記載の剤。
食品の形態である、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物または請求項５～７のいずれか一項に記載の剤。