WO2017086303A1 - ペプチド組成物およびその製造方法 - Google Patents

ペプチド組成物およびその製造方法 Download PDF

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WO2017086303A1
WO2017086303A1 PCT/JP2016/083792 JP2016083792W WO2017086303A1 WO 2017086303 A1 WO2017086303 A1 WO 2017086303A1 JP 2016083792 W JP2016083792 W JP 2016083792W WO 2017086303 A1 WO2017086303 A1 WO 2017086303A1
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peptide
peptide composition
ppm
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English (en)
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泰久 阿野
登志子 沓掛
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キリン株式会社
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/04—Animal proteins
    • A23J3/08—Dairy proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/52—Adding ingredients
    • A23L2/66—Proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a peptide composition and a method for producing the same.
  • Maintenance, improvement, and improvement of brain function are required by a wide range of generations from young to old. Maintenance, improvement, and improvement of memory and learning skills are important not only for students and adults studying for exams and qualification exams, but also for daily work and life. Moreover, since the decline in memory and cognitive function is related to the quality of life in the elderly, it is required to prevent, maintain, improve and improve the brain function.
  • Non-Patent Literature a disease caused by a decrease in brain function, not only dementia typified by Alzheimer's disease, but also mental disorders such as depression and delirium have been reported to be caused by a decrease in brain function.
  • Non-patent Document 2 an attempt to administer whey protein and increase plasma tryptophan concentration has been described for the purpose of increasing brain tryptophan concentration and inducing serotonin concentration increase to affect brain function.
  • Patent Document 1 describes a composition that can contribute to an increase in the tryptophan concentration in the brain, in which the value obtained by dividing the tryptophan content by the neutral large amino acid content is greater than a specific value, and Patent Document 2 is derived from lysozyme. It is described that the effect can be expected by taking one drink per day containing several tens mg of the present composition.
  • Patent Document 3 describes that a composition having a value obtained by dividing the tryptophan content by the neutral large amino acid content greater than a specific value can be obtained by hydrolyzing ⁇ -lactoglobulin or the like, preferably with an acidic protease. Yes.
  • a peptide composition comprising an enzymatic degradation product of whey protein and a peptide in the peptide composition are effective in maintaining, improving and improving brain function.
  • the present inventors have also found a method for efficiently producing a peptide composition having functions such as maintenance, improvement and improvement of brain function. The present invention is based on these findings.
  • an object of the present invention is to provide a peptide composition containing a functional peptide and a method for producing the same.
  • WY of 0.00001 to 0.2% by mass with respect to the total peptide content, 0.000001 to 0.1% by mass of WL with respect to the total peptide content, and 0.000 with respect to the total peptide content.
  • the total content of WY, WL, WV, GTWY, KPTPEGDLEI and GYGGVSLP is 0.00002 to 0.6% by mass, based on the total peptide content, according to [1] or [2] above Peptide composition.
  • [4] The peptide composition according to any one of [1] to [3] above, which is in the form of a solution.
  • the concentration of WY is 0.15 ppm or more
  • the concentration of WL is 0.15 ppm or more
  • the concentration of WV is 0.1 ppm or more
  • the concentration of GTWY is 0.3 ppm or more.
  • [6] The peptide composition according to [4] or [5] above, wherein the GTWY concentration in the solution is 3 ppm or more.
  • An effective amount of the peptide composition according to any one of [1] to [15] above or the food according to [16] or [17] above is ingested or administered to a human or non-human animal.
  • a method for maintaining brain function, a method for improving brain function, and a method for improving brain function comprising: [20] Use of the peptide composition according to any one of the above [1] to [15] for the production of a composition and a food for maintaining, improving and / or improving brain function.
  • peptides capable of exhibiting functions such as maintenance, improvement and improvement of brain function
  • peptide compositions containing a part or all of them are provided.
  • the six peptides of the present invention and the peptide composition of the present invention are advantageous in that they can be used as a functional functional material that is safe for mammals including humans, because they can utilize enzymatic degradation products of food.
  • (A) is the figure which showed the outline
  • (B) is the figure which showed the schematic diagram of the Y-shaped maze test. It is the figure which showed the voluntary exchange action fluctuation rate (A) of the mouse
  • a peptide composition comprising one, two, three or four components selected from the group consisting of WY, WL, WV and GTWY as a peptide (hereinafter “A first peptide composition ”).
  • the WY content is 0.00001 to 0.2% by mass (preferably 0.00002 to 0.15% by mass, more preferably 0% to the total peptide content in the composition).
  • the WL content is 0.000001 to 0.1% by mass (preferably 0.000002 to 0.05% by mass, more preferably 0.025 to 0.055% by mass).
  • the WV content is 0.000001 to 0.1% by mass (preferably 0.000002 to 0.05% by mass, more preferably 0.015 to 0.045% by mass), and GTWY is contained.
  • the amount is 0.000005 to 0.2% by mass (preferably 0.00001 to 0.15% by mass).
  • total peptide content means the content of peptides having a molecular weight of less than 10 kDa among compounds having amino nitrogen.
  • first peptide composition of the present invention can be preferably derived from a whey degradation product as described later, the peptide from which the “total peptide content” is calculated is derived from the whey degradation product. It can be.
  • a peptide composition comprising at least WY, WL, WV and GTWY as a peptide, the WY content, the WL content, the WV content and the GTWY content
  • a peptide composition is provided wherein the amount is as described above.
  • the first peptide composition of the present invention can exhibit functions such as maintenance, improvement and improvement of brain function by ingesting it as it is, concentrated or diluted, to mammals including humans. Therefore, the first peptide composition of the present invention can be used as a raw material for functional foods and pharmaceuticals, and can also be used as functional foods and pharmaceuticals.
  • the first peptide composition of the present invention may contain components other than peptides, but the total peptide content relative to the total solid content of the composition can be 0.005% or more, preferably 0.01 % Or more, and more preferably 0.05% or more.
  • the upper limit can be set to 100%.
  • all solids in the composition are composed of peptides.
  • the total peptide content can be measured by conventional methods such as amino acid analysis and ultraviolet absorbance measurement.
  • the total content of WY, WL, WV and GTWY with respect to the total peptide content can be 0.00005 to 0.4 mass%, preferably 0.00002 to The amount is 0.35% by mass, more preferably 0.2 to 0.35% by mass.
  • the first peptide composition of the present invention is preferably a peptide composition comprising at least WY, WL, WV and GTWY, and more preferably 0.000001 to 0.2% by weight WY, 0.000001-0.1% by weight WL for total peptide content, 0.000001-0.05% by weight WV for total peptide content and total peptide content Is a peptide composition comprising 0.000005 to 0.2% by mass of GTWY.
  • the first peptide composition of the present invention may further contain KPTPEGDLEI and / or GYGGVSLP in addition to WY, WL, WV and GTWY.
  • the KPTPEGDLEI content with respect to the total peptide content can be 0.000001 to 0.05% by mass (preferably 0.0000015 to 0.04% by mass), and the GYGGVSLP content with respect to the total peptide content is 0.000001. It can be set to ⁇ 0.2% by mass (preferably 0.000005 to 0.1% by mass).
  • a peptide composition comprising at least WY, WL, WV, GTWY, KPTPEGDLEI and GYGGVSLP as a peptide, wherein the WY content, the WL content , WV content, GTWY content, KPTPEGDLEI content and GYGGVSLP content are as described above.
  • the total content of WY, WL, WV, GTWY, KPTPEGDLEI and GYGGVSLP with respect to the total peptide content can be 0.00002 to 0.6% by mass, preferably It is 0.00004 to 0.5% by mass, more preferably 0.3 to 0.5% by mass.
  • the first peptide composition of the present invention is preferably a peptide composition comprising at least WY, WL, WV, GTWY, KPTPEGDLEI and GYGGVSLP, and more preferably based on the total peptide content.
  • peptide composition comprising 2% by weight of GYGGVSLP.
  • the content of WY, WL, WV, GTWY, KPTPEGDLEI and GYGGVSLP can be measured by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC / MS / MS).
  • LC / MS / MS liquid chromatography tandem mass spectrometry
  • Those skilled in the art can easily set the conditions.
  • the conditions of the examples described later can be used.
  • a standard peptide having a purity for LC / MS / MS measurement is used.
  • an AQUA peptide manufactured by SIGMA-ALDRICH can be used.
  • the first peptide composition of the present invention can be derived from an enzymatic degradation product of a protein, preferably from an enzymatic degradation product of whey protein (sometimes referred to simply as “whey degradation product” in this specification). be able to.
  • the first peptide composition of the present invention includes any of the whey degradation product itself, the whey degradation product concentrate, and the whey degradation product dilution. A method for producing a degradation product of whey protein will be described later.
  • the form of the first peptide composition of the present invention is not particularly limited as long as the peptide is contained in a predetermined content ratio, but can take the form of, for example, solid, semi-solid, powder, or solution.
  • the solution is preferably an aqueous solution.
  • the concentration of the peptide in the composition can be as follows. That is, the concentration of WY can be 0.15 ppm or more (for example, 0.15 to 100 ppm), preferably 1.5 ppm or more (for example, 1.5 to 100 ppm), more preferably 15 ppm or more (for example, 15 ⁇ 100 ppm).
  • the concentration of WL can be 0.15 ppm or more (for example, 0.15 to 40 ppm), preferably 1.5 ppm or more (for example, 1.5 to 40 ppm), more preferably 15 ppm or more (for example, 15 to 40 ppm). It is.
  • the concentration of WV can be 0.1 ppm or more (for example, 0.1 to 30 ppm), preferably 0.5 ppm or more (for example, 0.5 to 30 ppm), more preferably 1 ppm or more (for example, 1 to 30 ppm). It is.
  • the concentration of GTWY can be 0.3 ppm or more (for example, 0.3 to 150 ppm), preferably 3 ppm or more (for example, 3 to 150 ppm), more preferably 30 ppm or more (for example, 30 to 150 ppm).
  • the first peptide composition of the present invention can contain KPTPEGDLEI and / or GYGGVSLP, and the KPTPEGDLEI concentration in the composition is 0.1 ppm or more (for example, 0.1 to 30 ppm)
  • the KPTPEGDLEI concentration in the composition is 0.1 ppm or more (for example, 0.1 to 30 ppm)
  • it is 1.0 ppm or higher (eg, 1.0 to 30 ppm), more preferably 10 ppm or higher (eg, 10 to 30 ppm)
  • the GYGGVSLP concentration is 0.1 ppm or higher (eg, 0.1 to 100 ppm).
  • 1.0 ppm or more for example, 1.0 to 100 ppm
  • 10 ppm or more for example, 10 to 100 ppm.
  • the total of WY concentration, WL concentration, WV concentration, GTWY concentration, KPTPEGDLEI concentration and GYGGVSLP concentration in the composition is 1.0 ppm or more (for example, 1 0.0 to 500 ppm), preferably 2 ppm or more (eg, 2 to 500 ppm), more preferably 10 ppm or more (eg, 10 to 500 ppm), and even more preferably 100 ppm or more (eg, 100 to 500 ppm).
  • the first peptide composition of the present invention is preferably a solution form peptide composition comprising at least WY, WL, WV, GTWY, KPTPEGDLEI and GYGGVSLP, more preferably 0.15 ppm.
  • a peptide composition in the form of a solution comprising the above WY, 0.15 ppm or more WL, 0.1 ppm or more WV, 0.3 ppm or more GTWY, 0.1 ppm or more KPTPEGDLEI, 0.1 ppm or more GYGGVSLP is there.
  • the total of WY concentration, WL concentration, WV concentration, and GTWY concentration in the composition is 0.5 ppm or more (for example, 0.5 to 300 ppm)
  • it is 2 ppm or more (for example, 2 to 300 ppm), more preferably 10 ppm or more (for example, 10 to 300 ppm), still more preferably 20 ppm or more (for example, 20 to 300 ppm), and most preferably 100 ppm or more ( For example, 100 to 300 ppm).
  • the first peptide composition of the present invention is preferably a solution form peptide composition comprising at least WY, WL, WV and GTWY, more preferably 0.15 ppm or more of WY, A peptide composition in the form of a solution comprising 0.15 ppm or more of WL, 0.1 ppm or more of WV and 0.3 ppm or more of GTWY.
  • the total of WY concentration, WL concentration and WV concentration in the composition may be 0.5 ppm or more (for example, 0.5 to 200 ppm).
  • 0.5 ppm or more for example, 0.5 to 200 ppm.
  • 2 ppm or more eg, 2 to 200 ppm
  • 5 ppm or more eg, 5 to 200 ppm
  • 50 ppm or more eg, 50 to 200 ppm
  • 100 ppm or more eg, 100 to 100 ppm.
  • the first peptide composition of the present invention is preferably a peptide composition in a solution form comprising at least WY, WL and WV, more preferably 0.15 ppm or more of WY,.
  • a peptide composition in solution form comprising 15 ppm or more WL and 0.1 ppm or more WV.
  • the method for producing the first peptide composition of the present invention is not particularly limited as long as it contains a predetermined peptide in a predetermined content ratio, but the first peptide can be obtained by allowing an enzyme preparation containing a proteolytic enzyme to act on a raw protein. A composition can be produced.
  • the enzyme treatment of the raw material protein can be performed as follows. First, whole milk, powdered milk, casein or whey can be used as the raw material protein, preferably whey.
  • whey is also called whey, whey or whey and means an aqueous solution obtained by removing milk fat or casein from milk. Whey is composed of ⁇ -lactoglobulin, ⁇ -lactalbumin, serum albumin, immunoglobulin and the like.
  • the whey-derived plants and animals used in the present invention are not limited, but it is preferable to use milk-derived whey.
  • the concentration of whey protein subjected to the enzyme reaction is not limited as long as the protein can be dissolved. From the viewpoint of suppressing gelation and aggregation and saving the time for concentration, 1 to 30 w / w It is preferably v%, more preferably 1 to 20 w / v%, still more preferably 5 to 15 w / v%.
  • the raw material protein may be dissolved in any aqueous solvent as long as the enzymatic reaction proceeds, but it is preferably dissolved in water or a food additive grade buffer in consideration of its use as a food. It is preferable to use a buffer solution so that the pH of the reaction solution does not change due to amino acids generated by the enzyme reaction.
  • the type of the buffer solution is arbitrary, and may be determined in consideration of subsequent use and the amount of flavor, taste, and mineral, but the pH of the reaction solution is 4 to 9, preferably 5 to 8, more preferably 7 to 8.
  • a composition that can be maintained at a high level is preferable. Most preferred is a potassium phosphate buffer.
  • the concentration of the buffer solution is arbitrary as long as the buffering effect can be obtained, but considering the flavor, taste, and amount of mineral, it can be 0.01 to 0.5 M, preferably 0.05 to 0.00. 2M, more preferably about 0.1M.
  • Any enzyme can be used as long as the enzyme contains a proteolytic enzyme, but an enzyme preparation containing a neutral protease is preferable.
  • enzyme preparations derived from microorganisms such as Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae, and Alpergillus oryzae can be used. Among them, enzyme preparations derived from Aspergillus oryzae and enzyme preparations derived from Alpergillus oryzae An enzyme preparation derived from Alpergillusnets is more preferable.
  • enzyme preparations can be obtained from Amano Enzyme, Shin Nippon Chemical Industry, DSM, Danisco, Novozyme, HBI, and the like.
  • the amount of the enzyme preparation added is arbitrary, but considering an appropriate hydrolysis reaction rate and cost, for example, 0.01 to 5 w / v%, preferably 0.05 to 4 w / v%, more preferably 0 .1 to 0.5 w / v%.
  • the enzyme reaction temperature and the enzyme reaction time can be set so that the raw material protein is sufficiently hydrolyzed and the quality of the enzyme degradation product is maintained. That is, the enzyme reaction temperature can be, for example, 30 to 70 ° C., preferably 40 to 70 ° C., and more preferably 45 to 65 ° C.
  • the enzyme reaction time can be 1 to 12 hours, preferably 2 to 10 hours, and more preferably 4 to 5 hours.
  • the enzyme reaction is preferably performed while increasing the temperature.
  • the reaction can be carried out while increasing the temperature from 30 ° C. to 75 ° C. over 4 to 10 hours.
  • the reaction can be carried out while increasing from 35 ° C. to 75 ° C. over 5 to 8 hours, and more preferably from 35 ° C. to 75 ° C. over 6 to 8 hours.
  • the temperature rise speed is arbitrary, but the holding time between 45 ° C and 55 ° C is lengthened (5-7 hours), and after that, the temperature is gradually raised to 60 ° C and then longer between 60 ° C and 75 ° C. It is preferable to hold (for example, 1 to 3 hours).
  • Most preferred is a method in which an enzyme is added at 50 ° C., held for 5 to 7 hours, then heated at an arbitrary rate, and held at a target temperature of 60 to 65 ° C. or 65 to 75 ° C. for 1 to 3 hours.
  • the liquid stirring speed is preferably high so that the substrate is in good contact with the enzyme. However, if the speed is too high, the reaction liquid may scatter, and thus, for example, it can be set to 100 to 500 rpm, and preferably 200 to 400 rpm. More preferably, it is about 250 rpm.
  • the reaction solution is preferably subjected to an enzyme reaction stop step.
  • an enzyme reaction stop step a method of raising the temperature of the reaction solution, adding a chelating agent to change the chemical structure of the enzyme, or a method of removing the enzyme by membrane treatment can be employed.
  • a preferred method is a deactivation treatment at a high temperature. The method can be carried out by holding at 80 to 90 ° C. for 5 to 30 minutes, preferably at 80 to 90 ° C. for 20 to 30 minutes.
  • it becomes high temperature by the below-mentioned concentration process it can carry out also as a concentration process.
  • the reaction solution (peptide composition) that has undergone the enzyme reaction step and the enzyme reaction stop step may be further subjected to a sterilization step.
  • a sterilization process the below-mentioned film processing process and high temperature sterilization process are mentioned, for example.
  • the heat sterilization process can also serve as an enzyme reaction stopping process, which is advantageous in terms of simplifying the manufacturing process.
  • the reaction solution (peptide composition) that has undergone the enzyme reaction step and the enzyme reaction stop step may be further subjected to a purification step.
  • An example of the purification step is a membrane treatment step, and a preferred membrane treatment is ultrafiltration.
  • the molecular weight cut off for ultrafiltration is preferably 3 to 100 kDa, more preferably 5 to 50 kDa, and most preferably 10 kDa.
  • the reaction solution (peptide composition) that has undergone the enzyme reaction step and the enzyme reaction stop step may be further subjected to a concentration step from the viewpoint of storage and transportation.
  • a concentration step a method by concentration under reduced pressure, freeze-drying and spray-drying (spray drying), or concentration by membrane treatment (for example, a method using a reverse osmosis membrane) is preferable, and more preferably freezing. Drying and spray drying. Spray drying is particularly preferred from the viewpoint of carrying out the concentration in a large amount and efficiently.
  • a solvent is not limited, an aqueous solvent is preferable, and examples thereof include water, a sugar-containing aqueous solution, a sugar and a sour-contributing substance-containing aqueous solution, and any beverage.
  • whey protein (more preferably, Fontera WPC472) is dissolved in 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) to a concentration of 10%, and Amano Enzyme Protease P “Amano” 3SD was added to 0.2%, held at 50 ° C. for 5 hours while stirring at 250 rpm, and then the temperature was raised to 60 ° C. for 3 hours.
  • the first peptide composition can be produced.
  • the intake form comprising a specific amount of one, two, three or four peptides selected from the group consisting of WY, WL, WV and GTWY as a peptide
  • the peptide composition (hereinafter sometimes referred to as “second peptide composition”) is provided.
  • the content of the peptide in the composition can be set as follows. WY: 160-70000 ⁇ g (preferably 4000-60000 ⁇ g) WV: 100 to 60000 ⁇ g (preferably 160 to 55000 ⁇ g) WL: 100 to 60000 ⁇ g (preferably 160 to 55000 ⁇ g) GTWY: 50-40000 ⁇ g (preferably 100-30000 ⁇ g)
  • the second peptide composition of the present invention may further contain GYGGVSLP and / or KPTPEGDLEI in addition to one or two or more peptides selected from the group consisting of WY, WV, WL and GTWY.
  • the content of GYGGVSLP can be 50 to 50000 ⁇ g (preferably 160 to 40000 ⁇ g), and the content of KPTPEGDLEI can be 160 to 70000 ⁇ g (preferably 270 to 60000 ⁇ g).
  • the method for producing the second peptide composition of the present invention is not particularly limited as long as it contains a predetermined peptide in a predetermined content, but can be produced in the same manner as the first peptide composition.
  • the enzyme preparation containing a proteolytic enzyme is allowed to act on raw protein such as whole milk, powdered milk, casein or whey, and in some cases, it is concentrated or diluted so that a predetermined peptide is contained in a predetermined content. Can be manufactured.
  • the details of the enzyme reaction can be referred to the description of the method for producing the first peptide composition.
  • the second peptide composition of the present invention is in an intake form, it can be taken as it is by mammals including humans, and functions such as maintenance, improvement and improvement of brain function can be exhibited. Therefore, the second peptide composition of the present invention can be used as a functional food or a pharmaceutical product.
  • first peptide composition and the second peptide composition of the present invention and the six peptides of the present invention are active ingredients of the composition for maintaining, enhancing and / or improving brain function.
  • a method for maintaining brain function a method for improving brain function, and a method for improving brain function.
  • first peptide composition and the second peptide composition and the six peptides of the present invention are active ingredients of a brain function maintenance agent, a brain function improvement agent, and a brain function improvement agent.
  • a brain function maintenance agent e.g., a brain function improvement agent
  • a brain function improvement agent e.g., a brain function improvement agent
  • brain function improvement agent e.g., a cognitive function.
  • a human or non-human animal is allowed to ingest an effective amount of part or all of the first peptide composition, the second peptide composition, or the six peptides of the present invention.
  • a method for maintaining brain function, a method for improving brain function, and a method for improving brain function which comprise administering.
  • the practice of these methods of the invention can be accomplished by administering an effective amount of a composition of the invention or a peptide of the invention to a mammal, including a human in need thereof.
  • the first peptide composition of the present invention, the second peptide composition of the present invention or the present invention for the production of a composition and food for maintaining, improving and / or improving brain function is also provided.
  • Use of some or all of the six peptides is provided.
  • the first peptide composition of the present invention, the second peptide composition of the present invention or the present invention for producing a brain function maintaining agent, a brain function improving agent and a brain function improving agent are further provided.
  • Use of some or all of the six peptides is provided.
  • a part of the first peptide composition of the present invention, the second peptide composition of the present invention and the six peptides of the present invention for use in maintaining, improving and / or improving brain function or All are provided.
  • “maintaining a memory learning function” includes, for example, suppressing a decrease in memory ability and learning ability caused by aging in the elderly and the like. Further, “improvement of the memory learning function” includes, for example, temporarily improving the memory learning function, promoting the establishment of memory in the medium to long term, and further promoting the growth of the brain. Furthermore, “improvement of the memory learning function” includes, for example, recovery of a function that has once decreased due to aging or other factors, or a function that has a sign of decrease.
  • maintenance of cognitive function includes, for example, intellectual functions such as understanding, judgment, logic, etc., that is, preventing deterioration of cognitive ability.
  • Improving cognitive function includes, for example, enhancing cognitive ability from the current level.
  • improvement of cognitive function includes, for example, recovering symptoms that have been once reduced and cognitive ability or signs of decline.
  • the first peptide composition and the second peptide composition of the present invention have an action of maintaining, improving and improving brain function.
  • the peptide strengthening the brain mechanism by promoting the production of neurotransmitters it is thought that this led to the maintenance, improvement and improvement of brain function.
  • non-therapeutic means not including the act of operating, treating, or diagnosing a human (that is, a medical act on a human), and specifically, receiving a doctor or doctor's instructions It means that the person does not include a method of performing surgery, treatment or diagnosis on humans.
  • improvement in brain function is effective for the treatment, prevention or improvement of part or all of the first and second peptide compositions of the present invention and the six peptides of the present invention.
  • a method for treating diseases and conditions that can be used as an active ingredient of a composition for the treatment, prevention, and / or improvement of diseases and conditions that are, and for which improvement of brain function is effective for the treatment, prevention, or improvement Can be used in prevention methods and amelioration methods.
  • the first peptide composition, the second peptide composition, and part or all of the six peptides of the present invention are therapeutic agents for diseases and symptoms in which improvement of brain function is effective for the treatment, prevention or improvement thereof. It can be used as an active ingredient in preventives and improvers.
  • a human or non-human animal is allowed to ingest an effective amount of part or all of the first peptide composition, the second peptide composition, or the six peptides of the present invention.
  • a method of treating, preventing, and improving a disease and symptom in which improvement of brain function is effective for its treatment, prevention, or amelioration it is carried out by administering an effective amount of the composition of the present invention or the peptide of the present invention to mammals including humans in need of treatment, prevention or improvement. can do.
  • the first aspect of the present invention for the manufacture of a composition for the treatment, prevention and improvement of diseases and conditions for which improvement of brain function is effective in the treatment, prevention or improvement thereof is also described.
  • a composition for the treatment, prevention and improvement of diseases and conditions for which improvement of brain function is effective in the treatment, prevention or improvement thereof is also described.
  • These compositions are preferably pharmaceutical compositions.
  • the first peptide composition of the present invention for the production of a therapeutic agent, preventive agent and ameliorating agent for diseases and symptoms for which improvement of brain function is effective for the treatment, prevention or improvement thereof,
  • a second peptide composition or use of some or all of the six peptides of the present invention is provided.
  • the first peptide composition of the present invention for use in the treatment, prevention and amelioration of diseases and conditions for which improvement of brain function is effective in the treatment, prevention or improvement thereof
  • Some or all of the compositions and six peptides of the present invention are provided.
  • Diseases and conditions for which improvement of brain function is effective for the treatment, prevention or improvement include diseases and conditions for which improvement of memory learning function and cognitive function are effective for its treatment, prevention or improvement, and more specific Memory impairment (symptoms of not being able to remember memory, not being able to remember new things), disorientation (improper time / place / person misrepresentation), cognitive impairment (decrease in computing ability / decision) Aphasia, agnosia, apraxia, and executive function failure).
  • composition for maintaining, improving and / or improving the brain function of the present invention and the brain function maintaining agent, improving agent and / or improving agent of the present invention and the improvement of the brain function of the present invention can be treated, prevented or improved.
  • an improvement agent can be provided with forms, such as a pharmaceutical, a quasi-drug, food-drinks, and a feed, and can be implemented according to the following description.
  • the method for maintaining brain function, the method for improving brain function, the method for improving brain function, and the treatment method and prevention method of the present invention of the present invention can be carried out according to the following description.
  • Part or all of the first peptide composition and second peptide composition of the present invention and the six peptides of the present invention, which are active ingredients of the present invention, are orally or parenterally administered to humans and non-human animals. Preferably administered orally.
  • Oral preparations include granules, powders, tablets (including sugar-coated tablets), pills, capsules, syrups, emulsions, and suspensions.
  • parenteral preparations include injections (for example, subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections), drops, and external preparations (for example, nasal preparations, transdermal preparations, ointments) ), Suppositories (for example, rectal suppositories, vaginal suppositories).
  • injections for example, subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections
  • external preparations for example, nasal preparations, transdermal preparations, ointments
  • Suppositories for example, rectal suppositories, vaginal suppositories.
  • These preparations can be formulated using a pharmaceutically acceptable carrier by a technique usually performed in this field.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include excipients, binders, diluents, additives, fragrances, buffers, thickeners, colorants, stabilizers, emulsifiers, dispersants,
  • magnesium carbonate magnesium stearate, talc, sugar, lactose, pectin, dextrin, starch, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, low melting point wax, cocoa butter can be used as a carrier.
  • the method for producing the oral preparation is not particularly limited, and any method can be used.
  • Active ingredients include excipients (eg lactose, sucrose, starch, mannitol), disintegrants (eg calcium carbonate, carboxymethylcellulose calcium), binders (eg pregelatinized starch, gum arabic, carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, Hydroxypropyl cellulose), stabilizers and / or lubricants (eg, talc, magnesium stearate, polyethylene glycol 6000) and then compression molded, then, if necessary, taste masking, intestinal It can be produced by coating by a known method for the purpose of solubility or durability.
  • excipients eg lactose, sucrose, starch, mannitol
  • disintegrants eg calcium carbonate, carboxymethylcellulose calcium
  • binders eg pregelatinized starch, gum arabic, carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, Hydroxypropy
  • the coating agent for example, ethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, polyoxyethylene glycol, cellulose acetate phthalate, hydroxypropyl methylcellulose phthalate, Eudragit (Rohm) and the like can be used.
  • Capsules may be produced by using the active ingredient as it is or by blending the active ingredient with pharmaceutical additives such as stabilizers, dispersants, colorants and / or preservatives.
  • the capsule may be a soft capsule or a hard capsule, and the material of the capsule is not particularly limited. For example, gelatin, vegetable fiber, starch, or the like may be used, and an adhesion preventing measure may be taken.
  • injections contain active ingredients as dispersants (for example, Tween 80 (Atlas Powder)), preservatives (for example, methyl paraben, propyl paraben, benzyl alcohol, chlorobutanol, phenol), isotonic agents (for example, Aqueous solvents (eg, distilled water, physiological saline, Ringer's solution) or oily solvents (eg, olive oil, sesame oil, cottonseed oil, corn oil, etc.) together with pharmaceutical additives such as sodium chloride, glycerin, sorbitol, glucose, invert sugar) In vegetable oil, propylene glycol) and the like.
  • dispersants for example, Tween 80 (Atlas Powder)
  • preservatives for example, methyl paraben, propyl paraben, benzyl alcohol, chlorobutanol, phenol
  • isotonic agents for example, Aqueous solvents (eg, distilled water, physiological saline, Ringer
  • additives such as a solubilizing agent (for example, sodium salicylate, sodium acetate), a stabilizer (for example, human serum albumin), a soothing agent (for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride) are added. Also good.
  • a solubilizing agent for example, sodium salicylate, sodium acetate
  • a stabilizer for example, human serum albumin
  • a soothing agent for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride
  • the first peptide composition and the second peptide composition which are the active ingredients of the present invention, and the six peptides of the present invention as foods
  • these should be provided as foods as they are. Or these can be provided in food.
  • the food provided in this manner is a food containing an effective amount of the first peptide composition, the second peptide composition, and part or all of the six peptides of the present invention.
  • “containing an effective amount” of the first peptide composition, the second peptide composition, and the six types of peptides of the present invention means an amount normally consumed in individual foods.
  • Food means health food, functional food, nutritional supplement, supplement, health functional food (eg, food for specified health use, functional nutrition food, functional indication food), food for special use (eg, food for infants) , Food for pregnant women, food for sick people).
  • first peptide composition, the second peptide composition, and the six peptides of the present invention have an action of maintaining, improving and / or improving brain function, foods to be taken daily, and supplements It can be provided by being included in foods to be taken in.
  • a part or all of the first peptide composition and the second peptide composition and the six peptides of the present invention may be provided in a unit package form in which the amount taken per meal is predetermined. it can.
  • the unit packaging form per serving include a form in which a certain amount is specified by a pack, packaging, can, bottle, or the like.
  • the amount of intake of each of the six peptides of the present invention to be described later The intake per serving can be determined according to
  • the food item of the present invention may be provided together with a document or the like on which the explanation items regarding the intake amount are displayed on the package or the explanation items are described.
  • the food of the present invention may be labeled as having a function of maintaining, improving and / or improving brain function.
  • the food of the present invention may be given the following partial or full display.
  • “maintaining, improving and / or improving brain function” is used in the meaning including the following indications. ⁇ Improving memory ⁇ Enhance memory ⁇ Support memory ⁇ Improve cognitive function ⁇ Enhance cognitive function ⁇ Support cognitive function ⁇ Help maintain memory ⁇ Prevent inadvertentness ⁇ Improve memory retention Suppresses the decline in memory associated with aging
  • the form of “food” is not particularly limited, and may be, for example, a beverage form, a semi-liquid form or a gel form.
  • a dairy product in which the enzyme preparation described above is allowed to act on milk materials such as milk, yogurt, cheese, etc. to produce part or all of the six peptides of the present invention is also within the scope of the food of the present invention.
  • some or all of the six peptides of the present invention are encapsulated in tablets, capsules, etc. produced by tableting after adding and kneading excipients and binders to some or all of the dry powder. Encapsulated capsules.
  • the food of the present invention can be mixed with food-acceptable additives used in the production of ordinary foods, but from the viewpoint of preventing deterioration and oxidation of the peptide composition of the present invention.
  • Ingredients that are expected to be effective may be added to the food of the present invention. Examples of such a component include flavor preparations having a peptide degradation preventing action and an antioxidant action, and a composition derived from a natural product can be preferably used.
  • Foods provided in the present invention include foods and drinks containing carbohydrates such as rice, noodles, breads and pasta; Western confectionery such as cookies and cakes; Japanese confectionery such as buns and sheepskin; candy, gums, yogurt and Various confectionery such as pudding and frozen desserts; whiskey, bourbon, spirits, liqueur, wine, fruit liquor, sake, sake, shochu, beer, non-alcoholic beer with alcohol content of 1% or less, sparkling liquor, other miscellaneous sake , Alcoholic beverages such as strawberry high; beverages with fruit juice, beverages with vegetable juice, beverages with fruit juice and vegetable juice, soft drinks, carbonated beverages, milk, soy milk, milk beverages, drink-type yogurt, drink-type jelly, coffee, Non-alcohol such as cocoa, tea drinks, energy drinks, sports drinks, mineral water, and near water Beverages; eggs processed article using, workpiece seafood or meat (including offal levers, etc.) and the like can be exemplified (including delicacies), but is not limited thereto.
  • the mineral water includes both foaming
  • Tea beverages include fermented tea, semi-fermented tea, and non-fermented tea. , Rose tea, chrysanthemum tea, herbal tea (for example, mint tea, jasmine tea).
  • fruits used in fruit juice-containing beverages and fruit and vegetable juice-containing beverages include apples, mandarin oranges, grapes, bananas, pears, peaches, mangoes, acais, blueberries, and ume.
  • vegetables used in vegetable juice-containing beverages, fruit juices, and vegetable juice-containing beverages include tomato, carrot, celery, pumpkin, cucumber, and watermelon.
  • the pharmaceuticals and foods of the present invention utilize milk-derived enzymatic degradation products that humans have taken as foods for many years, they have low toxicity and mammals that require it (for example, humans, mice, rats, rabbits, dogs) , Cats, cows, horses, pigs, monkeys, etc.).
  • the intake or dosage of the six peptides of the present invention can be determined depending on the recipient's sex, age and weight, symptoms, administration time, dosage form, administration route, combined drugs and the like. Examples of intakes and doses of the six peptides of the present invention per adult (50 kg) are as follows, but depending on the subject, they may be taken or administered in several doses.
  • the 1st peptide composition and 2nd peptide composition of this invention contain a part or all of six types of peptides of this invention, according to the intake and dose per time of each peptide
  • the composition and intake or dose of the first peptide composition and the second peptide composition can be determined.
  • the first peptide composition of the unit intake form or unit dosage form or the second peptide of the unit intake form or unit dosage form so as to have the intake and dose of each peptide as described above A composition can be prepared.
  • Example 1 Examination of conditions for production of whey degradation product (1) Selection of raw material protein Each whey protein was enzymatically treated with an enzyme preparation containing a proteolytic enzyme (Protein P “Amano” 3SD or Samoaase C100 manufactured by Amano Enzyme). Then, the brain functionally active peptide produced was examined.
  • a proteolytic enzyme Protein P “Amano” 3SD or Samoaase C100 manufactured by Amano Enzyme.
  • each proteolytic enzyme preparation is 0.125 w / v% in a solution obtained by dissolving each whey protein in 0.05 M potassium phosphate buffer so as to be 5 w / v%.
  • the enzyme preparation was added as follows. The obtained solution was reacted at pH 7.0 and 50 ° C. for 4 hours, and then kept at 90 ° C. for 20 minutes to deactivate the enzyme to obtain an enzyme-treated sample. A sample obtained by the same treatment except that the enzyme preparation was added was used as a control sample.
  • the obtained sample was centrifuged, and the analytical sample obtained by ultrafiltration (10 kDa) of the supernatant was appropriately diluted, and the peptide was quantified by LC / MS / MS under the following analytical conditions. . Concentration conversion was based on a calibration curve method with a minimum concentration of 0.001 ppm.
  • the analytical sample obtained by ultrafiltration of the obtained sample was appropriately diluted, and the peptide was quantified by LC / MS / MS.
  • the commercially available whey hydrolyzate was also dissolved in water so as to have a concentration of 10 w / v% and treated in the same manner as in the above sample to quantify the peptides.
  • the analysis conditions were the same as those shown in Example 1.
  • the results are shown in Table 4 below.
  • the inventors of the present invention used various whey proteins in a buffer solution of 0.05 to 0.2M containing 5 to 20 w / v%, and protease P “Amano” 3SD as a proteolytic enzyme.
  • the final concentration of the preparation was added to 0.1 to 0.5 w / v%, and the resulting solution was reacted at pH 7.0 and 50 ° C. for 1 to 8 hours, and then at 80 ° C. and 30 minutes. It was confirmed that the desired peptide was produced under the conditions for inactivating the enzyme (data not shown). It was also confirmed that the reaction proceeds appropriately when stirring at 250 rpm (data not shown).
  • the enzyme reaction conditions were further examined for the purpose of increasing the yield of the specific peptide contained in the whey degradation product. Specifically, 0.1M potassium phosphate buffer containing 10 w / v of whey protein (Fontera WPC472), protease P “Amano” 3SD with a final proteolytic enzyme concentration of 0.2 w / v The reaction conditions were examined.
  • Example 2 Production of Peptide Degradation Product Protease P “Amano” 3SD was added to 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 10 w / v% of whey protein (WPC472 manufactured by Fontera Co., Ltd.). It added so that a density
  • P “Amano” 3SD was added to 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 10 w / v% of whey protein (WPC472 manufactured by Fontera Co., Ltd.). It added so that a density
  • the obtained whey decomposed product-containing reaction solution and the whey decomposed product were freeze-dried using a freeze-dryer FDU-2100 manufactured by EYELA, with the outside of the flask containing the reaction solution at room temperature.
  • the peptide concentrations in the powdered whey decomposition product powder are shown in Tables 7 and 8 below.
  • the content ratio of the peptide in the powdered whey decomposition product is considered to be equal to the whey decomposition product-containing aqueous solution (peptide content ratio in the reaction solution) described in Table 7.
  • Example 3 Effect of intake of whey degradation product on memory learning function / cognitive function (1) Evaluation method of memory learning function / cognitive function (Y-maze test) The mouse originally has a property of selecting a route different from the route selected immediately before. Therefore, when a mouse is put into a Y-shaped maze having three arms having the same width, length, etc., it normally enters an arm different from the arm that has just entered.
  • the Y-maze test is a test that uses the properties of mice to evaluate short-term memory.
  • the order of the moved arm was recorded when the mouse was put in the tip of any arm of the Y-shaped maze and allowed to search freely for 8 minutes.
  • spontaneous alternation behavior a case where different arms are selected three times in succession and entered is called spontaneous alternation behavior.
  • the total number of intrusions into the arm and the number of spontaneous alternation actions in time were counted, and the voluntary alternation behavior fluctuation rate (%) was calculated using the following formula (1).
  • a higher voluntary alternation behavior variation rate indicates that short-term memory is retained.
  • Example 4 Effect of Synthetic Peptide Intake on Memory Learning Function / Cognitive Function
  • Six-week-old male CD-1 mice (obtained from SLC, Japan) had six synthetic peptides: GTWY, GYGGVSLP, KPTPEGDLEI, WL, WV, WY was forcibly orally administered into the stomach in an amount of 0.1 to 3 ⁇ mol / kg body weight, and 40 minutes later, 0.80 mg / kg scopolamine hydrochloride was intraperitoneally administered to induce memory impairment. Twenty minutes after intraperitoneal administration of scopolamine, the Y-maze test described in Example 3 (1) was performed. In addition, it experimented by 10 animals in each group, and calculated
  • mice that received GTWY had a higher rate of voluntary alternation behavior in the intake range of 0.1 to 1 ⁇ mol / kg body weight compared to the non-intake group, and retained short-term memory.
  • GYGGVSLP and KPTPEGDLEI also had a high rate of voluntary alternation behavior in the intake range of 0.1 to 1 ⁇ mol / kg body weight, and retained short-term memory.
  • an increase in the rate of voluntary alternation behavior due to GTWY, GYGGVSLP, and KPTPEGDLEI tended to depend on peptide intake.
  • mice fed with WL, WV, and WY the voluntary alternation behavior change rate depending on the intake in the range of intake 0.3 to 3 ⁇ mol / kg body weight compared to the non-intake group. It became clear that short-term memory was maintained.
  • Example 5 Evaluation of beverages with added whey degradation product It is known that acesulfame potassium and sucralose, which are high-intensity sweeteners, have a postpone in sweetness compared to sucrose and the like. Therefore, the effect of the whey degradation product on the post-sweetness caused by the high-intensity sweetener was examined.
  • Example 7 Preparation of Whey Degradation Product with Improved Flavor
  • improvement of the flavor of the peptide composition by ultrafiltration membrane treatment was examined.
  • sample beverage obtained by dissolving 1 g of the whey decomposition product powder obtained in Example 2 in 500 mL of distilled water, and sample water 1 were subjected to ultrafiltration membrane (fractionated molecular weight 10 kDa, A sample beverage (sample water 2) obtained by filtration with Merck Millipore) was prepared and subjected to sensory evaluation.
  • Sensory evaluation was conducted by 4 trained panelists. Each panelist evaluated by the score of 1 step, and calculated the average value of the evaluation score of four panelists.
  • Example 8 Preparation of whey degradation product-containing beverage with improved storage stability
  • the storage stability of a whey degradation product-containing beverage was examined.
  • sample beverage Flavor composition having an action of preventing degradation of peptides by adding whey degradation product powder obtained in Example 2 to a commercially available sports drink beverage so as to have a concentration of 2 mg / mL.
  • Samples were prepared by adding and mixing various natural product-derived compositions so as to have the contents shown in Table 11.
  • Each prepared sample beverage was filled in a 195 mL PET bottle and stored for 1 week for evaluation.
  • the storage conditions were the temperature and illuminance conditions shown in Table 11 (storage conditions A and B).
  • the irradiation in the table indicates that the illuminance during storage was 3000 lux (LX).

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Abstract

本発明は機能性ペプチドを含有するペプチド組成物を提供することを目的とする。本発明によれば、全ペプチド含有量に対して０．００００１～０．２質量％のＷＹ、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．１質量％のＷＬ、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．１質量％のＷＶおよび全ペプチド含有量に対して０．０００００５～０．２質量％のＧＴＷＹからなる群から選択される１種または２種以上の成分を含んでなるペプチド組成物が提供される。

Description

ペプチド組成物およびその製造方法 関連出願の参照
　本願は、先行する日本国出願である特願２０１５－２２４３１４（出願日：２０１５年１１月１６日）の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。
　本発明はペプチド組成物およびその製造方法に関する。
　脳機能の維持、向上、改善は、若年層から老年層まで幅広い世代で求められている。記憶力や学習能力の維持、向上、改善は、受験、資格試験等に備えて勉強する学生や社会人だけではなく、日々の仕事や生活を行う上でも重要である。また、老年層では記憶力の低下、認知機能の低下は生活の質に関わるため、脳機能の低下を予防し、これを維持、向上、改善させることが求められている。
　さらに、老年期においては、老化に伴う脳機能の低下に起因する精神障害の増加が高齢者の増加とともに社会問題となっている。脳機能の低下に起因する疾患としては、アルツハイマー病に代表される認知症だけではなく、うつ病、せん妄等の精神疾患も脳機能の低下が原因であることが報告されている（非特許文献１）。
　脳機能の解明が進むにつれ、脳機能を増強させる物質の探索が盛んに行われている。特に、副作用を心配することがないことから、食品成分中に脳機能を向上させる物質が含まれていないか解析が行われている。例えば、脳内トリプトファン濃度を上昇させセロトニン濃度上昇を惹起させ脳機能に影響を与えることを目的に、ホエイタンパクを投与し血漿中トリプトファン濃度を上昇させる試みが記載されている（非特許文献２）。
　特許文献１には、脳内トリプトファン濃度上昇に寄与しうる組成物として、トリプトファン含量を中性大型アミノ酸含量で除した値が特定の値より大きいものが記載され、特許文献２にはリゾチーム由来の本組成物を数１０ｍｇ含む飲料を１日１本摂ることで効果が期待できることが記載されている。特許文献３にはトリプトファン含量を中性大型アミノ酸含量で除した値が特定の値より大きい組成物は、α－ラクトグロブリン等を好ましくは酸性プロテアーゼで加水分解して得ることができる旨記載されている。
特表２０１１－５２３５４７号公報 特表２０１５－５２４２６５号公報 特許４６４２３２１号公報
田中稔久、武田雅俊（2011）日本臨床、増刊号、５２～５６頁 Am.J.Clin.Nutr.,2005,81,1026-33
　今般、本発明者らは、ホエイタンパク質の酵素分解物からなるペプチド組成物と該ペプチド組成物中のペプチドが脳機能の維持、向上、改善等に有効であることを見出した。本発明者らはまた、脳機能の維持、向上、改善等の機能を有するペプチド組成物を効率的に製造する方法を見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
　すなわち、本発明は機能性ペプチドを含有するペプチド組成物とその製造方法を提供することを目的とする。
　本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］全ペプチド含有量に対して０．００００１～０．２質量％のＷＹ、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．１質量％のＷＬ、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．１質量％のＷＶおよび全ペプチド含有量に対して０．０００００５～０．２質量％のＧＴＷＹ（配列番号１）からなる群から選択される１種または２種以上の成分（好ましくは上記４種のペプチド成分）を含んでなるペプチド組成物。
［２］ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ（配列番号２）および／またはＧＹＧＧＶＳＬＰ（配列番号３）をさらに含んでなり、全ペプチド含有量に対してＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ含有量が０．０００００１～０．０５質量％であり、ＧＹＧＧＶＳＬＰ含有量が０．０００００５～０．２質量％である、上記［１］に記載のペプチド組成物。
［３］全ペプチド含有量に対して、ＷＹ、ＷＬ、ＷＶ、ＧＴＷＹ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩおよびＧＹＧＧＶＳＬＰの合計含有量が０．００００２～０．６質量％である、上記［１］または［２］に記載のペプチド組成物。
［４］溶液の形態である、上記［１］～［３］のいずれかに記載のペプチド組成物。
［５］溶液中、ＷＹの濃度が０．１５ｐｐｍ以上であり、ＷＬの濃度が０．１５ｐｐｍ以上であり、ＷＶの濃度が０．１ｐｐｍ以上であり、ＧＴＷＹの濃度が０．３ｐｐｍ以上である、上記［４］に記載のペプチド組成物。
［６］溶液中のＧＴＷＹ濃度が３ｐｐｍ以上である、上記［４］または［５］に記載のペプチド組成物。
［７］溶液中のＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ濃度が０．１ｐｐｍ以上であり、ＧＹＧＧＶＳＬＰ濃度が０．１ｐｐｍ以上である、上記［４］～［６］のいずれかに記載のペプチド組成物。
［８］溶液中のＷＹ濃度、ＷＬ濃度、ＷＶ濃度、ＧＴＷＹ濃度、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ濃度およびＧＹＧＧＶＳＬＰ濃度の合計が１ｐｐｍ以上である、上記［４］～［７］のいずれかに記載のペプチド組成物。
［９］溶液中のＷＹ濃度、ＷＬ濃度、ＷＶ濃度およびＧＴＷＹ濃度の合計が０．５ｐｐｍ以上である、上記［４］～［８］のいずれかに記載のペプチド組成物。
［１０］溶液中のＷＹ濃度、ＷＬ濃度およびＷＶ濃度の合計が０．５ｐｐｍ以上である、上記請求項［４］～［９］のいずれかに記載のペプチド組成物。
［１１］摂取形態のペプチド組成物であって、１６０～７００００μｇのＷＹ、１００～６００００μｇのＷＶ、１００～６００００μｇのＷＬおよび５０～４００００μｇのＧＴＷＹからなる群から選択される１種または２種以上の成分を含んでなるペプチド組成物。
［１２］ＧＴＷＹの含有量が１００～３００００μｇである、上記［１１］に記載のペプチド組成物。
［１３］ＧＹＧＧＶＳＬＰおよび／またはＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩをさらに含んでなり、ＧＹＧＧＶＳＬＰの含有量が５０～５００００μｇであり、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩの含有量が１６０～７００００μｇである、上記［１１］または［１２］に記載のペプチド組成物。
［１４］食品の形態である、上記［１］～［１３］のいずれかに記載のペプチド組成物。
［１５］食品が飲料である、上記［１４］に記載の組成物。
［１６］上記［１］～［１３］のいずれかに記載のペプチド組成物が配合されてなる、食品。
［１７］飲料である、上記［１６］に記載の食品。
［１８］脳機能の維持、向上および／または改善のための、上記［１］～［１５］のいずれかに記載のペプチド組成物または上記［１６］または［１７］に記載の食品。
［１９］有効量の上記［１］～［１５］のいずれかに記載のペプチド組成物または上記［１６］または［１７］に記載の食品を、ヒトまたは非ヒト動物に摂取させるか、あるいは投与することを含んでなる、脳機能の維持方法、脳機能の向上方法および脳機能の改善方法。
［２０］脳機能の維持、向上および／または改善のための組成物および食品の製造のための、上記［１］～［１５］のいずれかに記載のペプチド組成物の使用。
［２１］ホエイタンパク質に１種または２種以上のアスペルギルス・メレウス由来のタンパク質分解酵素を含む酵素製剤を作用させて酵素分解物を得る工程を含む、上記［１］～［１５］のいずれかに記載のペプチド組成物の製造方法。
［２２］ホエイタンパク質に酵素を作用させる工程を、作用温度４５～５５℃で一定時間保持した後に、作用温度６０～７５℃で一定時間保持することにより実施する、上記［２１］に記載の製造方法。
［２３］ホエイタンパク質の酵素分解物を希釈する工程またはホエイタンパク質の酵素分解物を濃縮する工程をさらに含む、上記［２１］または［２２］に記載の製造方法。
　本発明によれば、脳機能の維持、向上、改善等の機能を発揮することができる６種のペプチドおよびこれらの一部または全部を含有するペプチド組成物が提供される。本発明の６種のペプチドと本発明のペプチド組成物は食品の酵素分解物を利用することができることから、ヒトを含む哺乳類に安全な機能性素材として利用できる点で有利である。
（Ａ）はＹ字迷路試験の概要を示した図である。（Ｂ）はＹ字迷路試験の模式図を示した図である。 ホエイ分解物を摂取させたマウスの自発的交換行動変動率（Ａ）とアームへの総進入数（Ｂ）を示した図である。 ＧＴＷＹを摂取させたマウスの自発的交換行動変動率（Ａ）とアームへの総進入数（Ｂ）を示した図である。 ＧＹＧＧＶＳＬＰを摂取させたマウスの自発的交換行動変動率（Ａ）とアームへの総進入数（Ｂ）を示した図である。 ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩを摂取させたマウスの自発的交換行動変動率（Ａ）とアームへの総進入数（Ｂ）を示した図である。 ＷＹ、ＷＬおよびＷＶを摂取させたマウスの自発的交換行動変動率（Ａ）とアームへの総進入数（Ｂ）を示した図である。
発明の具体的説明
　本発明の第一の面によれば、ペプチドとしてＷＹ、ＷＬ、ＷＶおよびＧＴＷＹからなる群から選択される１種、２種、３種または４種の成分を含んでなるペプチド組成物（以下「第一のペプチド組成物」ということがある）が提供される。このペプチド組成物においては、組成物中の全ペプチド含有量に対して、ＷＹ含有量が０．００００１～０．２質量％（好ましくは、０．００００２～０．１５質量％、より好ましくは０．０５～０．２質量％）であり、ＷＬ含有量が０．０００００１～０．１質量％（好ましくは、０．０００００２～０．０５質量％、より好ましくは０．０２５～０．０５５質量％）であり、ＷＶ含有量が０．０００００１～０．１質量％（好ましくは、０．０００００２～０．０５質量％、より好ましくは０．０１５～０．０４５質量％）であり、ＧＴＷＹ含有量が０．０００００５～０．２質量％（好ましくは、０．００００１～０．１５質量％）である。
　ここで「全ペプチド含有量」とは、アミノ態窒素を有する化合物のうち、分子量が１０ｋＤａより小さいペプチドの含有量を意味する。また、後述のように本発明の第一のペプチド組成物は好ましくはホエイ分解物由来とすることができることから、「全ペプチド含有量」の算出のもとになるペプチドはホエイ分解物由来のものとすることができる。
　本発明の第一のペプチド組成物の好ましい態様によれば、ペプチドとして少なくともＷＹ、ＷＬ、ＷＶおよびＧＴＷＹを含んでなるペプチド組成物であってＷＹ含有量、ＷＬ含有量、ＷＶ含有量およびＧＴＷＹ含有量が上記の通りであるペプチド組成物が提供される。
　本発明の第一のペプチド組成物はそのままあるいは濃縮または希釈してヒトを含む哺乳動物に摂取させることで脳機能の維持、向上、改善等の機能を発揮することができる。従って、本発明の第一のペプチド組成物は機能性食品や医薬品の原料として用いることができるとともに、機能性食品や医薬品として用いることもできる。
　本発明の第一のペプチド組成物は、ペプチド以外の成分を含んでもよいが、組成物の全固形分質量に対する全ペプチド含有量は０．００５％以上とすることができ、好ましくは０．０１％以上であり、より好ましくは０．０５％以上である。なお、上限は１００％とすることができ、この場合は組成物中の固形分はすべてペプチドにより構成されることになる。ここで、全ペプチド含有量はアミノ酸分析、紫外部吸光度測など常法により測定することができる。
　本発明の第一のペプチド組成物においては、全ペプチド含有量に対するＷＹ、ＷＬ、ＷＶおよびＧＴＷＹの合計含有量は０．００００５～０．４質量％とすることができ、好ましくは０．００００２～０．３５質量％、より好ましくは０．２～０．３５質量％である。この場合、本発明の第一のペプチド組成物は、好ましくは、ＷＹ、ＷＬ、ＷＶおよびＧＴＷＹを少なくとも含んでなるペプチド組成物であり、より好ましくは、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．２質量％のＷＹ、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．１質量％のＷＬ、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．０５質量％のＷＶおよび全ペプチド含有量に対して０．０００００５～０．２質量％のＧＴＷＹを含んでなるペプチド組成物である。
　本発明の第一のペプチド組成物は、ＷＹ、ＷＬ、ＷＶおよびＧＴＷＹに加えて、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩおよび／またはＧＹＧＧＶＳＬＰをさらに含んでいてもよい。全ペプチド含有量に対するＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ含有量は０．０００００１～０．０５質量％（好ましくは、０．０００００１５～０．０４質量％）とすることができ、全ペプチド含有量に対するＧＹＧＧＶＳＬＰ含有量は０．０００００１～０．２質量％（好ましくは、０．０００００５～０．１質量％）とすることができる。
　すなわち、本発明の第一のペプチド組成物の好ましい態様によれば、ペプチドとして少なくともＷＹ、ＷＬ、ＷＶ、ＧＴＷＹ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩおよびＧＹＧＧＶＳＬＰを含んでなるペプチド組成物であって、ＷＹ含有量、ＷＬ含有量、ＷＶ含有量、ＧＴＷＹ含有量、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ含有量およびＧＹＧＧＶＳＬＰ含有量が上記の通りであるペプチド組成物が提供される。
　本発明の第一のペプチド組成物においては、全ペプチド含有量に対するＷＹ、ＷＬ、ＷＶ、ＧＴＷＹ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩおよびＧＹＧＧＶＳＬＰの合計含有量は０．００００２～０．６質量％とすることができ、好ましくは０．００００４～０．５質量％、より好ましくは０．３～０．５質量％である。この場合、本発明の第一のペプチド組成物は、好ましくは、ＷＹ、ＷＬ、ＷＶ、ＧＴＷＹ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩおよびＧＹＧＧＶＳＬＰを少なくとも含んでなるペプチド組成物であり、より好ましくは、全ペプチド含有量に対して０．００００１～０．２質量％のＷＹ、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．１質量％のＷＬ、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．０５質量％のＷＶ、全ペプチド含有量に対して０．０００００５～０．２質量％のＧＴＷＹ、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．０５質量％のＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ、全ペプチド含有量に対して０．０００００５～０．２質量％のＧＹＧＧＶＳＬＰを含んでなるペプチド組成物である。
　本発明において、ＷＹ、ＷＬ、ＷＶ、ＧＴＷＹ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩおよびＧＹＧＧＶＳＬＰの含有量の測定は、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により実施することができる。当業者であればその条件設定は容易に行うことができるが、たとえば後記実施例の条件を用いることができる。その際、標準ペプチドとしてＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定用の純度のものを使用することはいうまでもないが、例えば、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製ＡＱＵＡペプチドを使用することができる。
　本発明の第一のペプチド組成物はタンパク質の酵素分解物由来とすることができ、好ましくはホエイタンパク質の酵素分解物（本明細書中、単に「ホエイ分解物」ということがある）由来とすることができる。本発明の第一のペプチド組成物は、ホエイ分解物そのもの、ホエイ分解物の濃縮物、ホエイ分解物の希釈物のいずれをも含むものである。ホエイタンパク質の分解物の製造方法は後述する。
　本発明の第一のペプチド組成物は所定の含有比率でペプチドが含まれる限りその形態に特に限定はないが、例えば、固形、半固形、粉末、溶液の形態をとることができる。溶液は好ましくは水溶液である。
　本発明の第一のペプチド組成物が溶液の形態である場合、該組成物中のペプチドの濃度は以下のようにすることができる。すなわち、ＷＹの濃度は０．１５ｐｐｍ以上（例えば、０．１５～１００ｐｐｍ）とすることができ、好ましくは１．５ｐｐｍ以上（例えば、１．５～１００ｐｐｍ）、より好ましくは１５ｐｐｍ以上（例えば、１５～１００ｐｐｍ）である。ＷＬの濃度は０．１５ｐｐｍ以上（例えば、０．１５～４０ｐｐｍ）とすることができ、好ましくは１．５ｐｐｍ以上（例えば、１．５～４０ｐｐｍ）、より好ましくは１５ｐｐｍ以上（例えば１５～４０ｐｐｍ）である。ＷＶの濃度は０．１ｐｐｍ以上（例えば、０．１～３０ｐｐｍ）とすることができ、好ましくは０．５ｐｐｍ以上（例えば、０．５～３０ｐｐｍ）、より好ましくは１ｐｐｍ以上（例えば１～３０ｐｐｍ）である。ＧＴＷＹの濃度は０．３ｐｐｍ以上（例えば、０．３～１５０ｐｐｍ）とすることができ、好ましくは３ｐｐｍ以上（例えば、３～１５０ｐｐｍ）、より好ましくは３０ｐｐｍ以上（例えば、３０～１５０ｐｐｍ）である。
　本発明の第一のペプチド組成物が溶液の形態である場合、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩおよび／またはＧＹＧＧＶＳＬＰを含むことができ、該組成物中のＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ濃度は０．１ｐｐｍ以上（例えば、０．１～３０ｐｐｍ）とすることができ、好ましくは１．０ｐｐｍ以上（例えば、１．０～３０ｐｐｍ）、より好ましくは１０ｐｐｍ以上（例えば１０～３０ｐｐｍ）であり、ＧＹＧＧＶＳＬＰ濃度は０．１ｐｐｍ以上（例えば、０．１～１００ｐｐｍ）とすることができ、好ましくは１．０ｐｐｍ以上（例えば、１．０～１００ｐｐｍ）、より好ましくは１０ｐｐｍ以上（例えば１０～１００ｐｐｍ）である。
　本発明の第一のペプチド組成物が溶液の形態である場合、該組成物中のＷＹ濃度、ＷＬ濃度、ＷＶ濃度、ＧＴＷＹ濃度、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ濃度およびＧＹＧＧＶＳＬＰ濃度の合計は１．０ｐｐｍ以上（例えば、１．０～５００ｐｐｍ）とすることができ、好ましくは２ｐｐｍ以上（例えば、２～５００ｐｐｍ）、より好ましくは１０ｐｐｍ以上（例えば、１０～５００ｐｐｍ）、さらに好ましくは１００ｐｐｍ以上（例えば、１００～５００ｐｐｍ）である。この場合、本発明の第一のペプチド組成物は、好ましくは、ＷＹ、ＷＬ、ＷＶ、ＧＴＷＹ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩおよびＧＹＧＧＶＳＬＰを少なくとも含んでなる、溶液形態のペプチド組成物であり、より好ましくは、０．１５ｐｐｍ以上のＷＹ、０．１５ｐｐｍ以上のＷＬ、０．１ｐｐｍ以上のＷＶ、０．３ｐｐｍ以上のＧＴＷＹ、０．１ｐｐｍ以上のＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ、０．１ｐｐｍ以上のＧＹＧＧＶＳＬＰを含んでなる、溶液形態のペプチド組成物である。
　本発明の第一のペプチド組成物が溶液の形態である場合、該組成物中のＷＹ濃度、ＷＬ濃度、ＷＶ濃度、およびＧＴＷＹ濃度の合計は０．５ｐｐｍ以上（例えば、０．５～３００ｐｐｍ）とすることができ、好ましくは２ｐｐｍ以上（例えば、２～３００ｐｐｍ）、より好ましくは１０ｐｐｍ以上（例えば、１０～３００ｐｐｍ）、さらに好ましくは２０ｐｐｍ以上（例えば、２０～３００ｐｐｍ）、最も好ましくは１００ｐｐｍ以上（例えば、１００～３００ｐｐｍ）である。この場合、本発明の第一のペプチド組成物は、好ましくは、ＷＹ、ＷＬ、ＷＶおよびＧＴＷＹを少なくとも含んでなる、溶液形態のペプチド組成物であり、より好ましくは、０．１５ｐｐｍ以上のＷＹ、０．１５ｐｐｍ以上のＷＬ、０．１ｐｐｍ以上のＷＶおよび０．３ｐｐｍ以上のＧＴＷＹを含んでなる、溶液形態のペプチド組成物である。
　本発明の第一のペプチド組成物が溶液の形態である場合、該組成物中のＷＹ濃度、ＷＬ濃度およびＷＶ濃度の合計は０．５ｐｐｍ以上（例えば、０．５～２００ｐｐｍ）とすることができ、好ましくは２ｐｐｍ以上（例えば、２～２００ｐｐｍ）、より好ましくは５ｐｐｍ以上（例えば、５～２００ｐｐｍ）、さらに好ましくは５０ｐｐｍ以上（例えば、５０～２００ｐｐｍ）、最も好ましくは１００ｐｐｍ以上（例えば、１００～２００ｐｐｍ）である。この場合、本発明の第一のペプチド組成物は、好ましくは、ＷＹ、ＷＬおよびＷＶを少なくとも含んでなる、溶液形態のペプチド組成物であり、より好ましくは、０．１５ｐｐｍ以上のＷＹ、０．１５ｐｐｍ以上のＷＬおよび０．１ｐｐｍ以上のＷＶを含んでなる、溶液形態のペプチド組成物である。
　本発明の第一のペプチド組成物の製造方法は、所定のペプチドを所定の含有比率で含む限り特に制限はないが、原料タンパク質にタンパク質分解酵素を含む酵素製剤を作用させることにより第一のペプチド組成物を製造することができる。
　原料タンパク質の酵素処理は以下のようにして行うことができる。まず、原料となるタンパク質は、全乳、粉乳、カゼインまたはホエイを用いることができ、好ましくはホエイである。ここで、「ホエイ」とは、乳清、乳漿またはホエーともいい、乳から乳脂肪分やカゼインなどを除いた水溶液を意味する。ホエイはβ－ラクトグロブリン、α－ラクトアルブミン、血清アルブミン、免疫グロブリン等から構成される。本発明で使用するホエイの由来動植物は問わないが、牛乳由来ホエイを用いることが好ましい。
　原料としてホエイタンパク質を用いる場合、酵素反応に供されるホエイタンパク質の濃度は、タンパク質が溶解し得る限り限定されないが、ゲル化や凝集を抑制し、濃縮の手間を省く観点から、１～３０ｗ／ｖ％とすることが好ましく、より好ましくは１～２０ｗ／ｖ％であり、さらに好ましくは５～１５ｗ／ｖ％である。
　原料タンパク質は、酵素反応が進行する限りいずれの水系溶媒に溶解させてもかまわないが、食品としての利用を考慮し、水または食品添加物グレードの緩衝液に溶解させることが好ましい。酵素反応で生じたアミノ酸により反応液のｐＨが変化しないようにするため緩衝液を使用することが好ましい。緩衝液の種類は任意であり、その後の利用や風味・味覚・ミネラル量を考慮して決定すればよいが、反応液のｐＨを４～９、好ましくは５～８、より好ましくは７～８に維持できるような組成が好ましい。最も好ましくはリン酸カリウム緩衝液である。緩衝液の濃度は緩衝効果が得られる範囲であれば任意であるが、風味・味覚・ミネラル量を考慮すると、０．０１～０．５Ｍとすることができ、好ましくは０．０５～０．２Ｍであり、より好ましくは約０．１Ｍである。
　酵素はタンパク質分解酵素を含む酵素剤であればいずれも使用できるが、中性プロテアーゼを含む酵素製剤であることが好ましい。酵素製剤は、たとえばバチルス・サブティリス、アスペルギルス・オリゼ、アルペルギルス・メレウスなどの微生物を由来としたものを使用することができ、このうちアスペルギルス・オリゼ由来の酵素製剤とアルペルギルス・メレウス由来の酵素製剤が好ましく、より好ましくはアルペルギルス・メレウス由来の酵素製剤である。
　本発明では市販の酵素製剤を使用することができ、例えば、天野エンザイム社、新日本化学工業社、ＤＳＭ社、ダニスコ社、ノボザイム社、ＨＢＩ社などから酵素製剤を入手可能である。酵素製剤の添加量は任意であるが、適度な加水分解反応速度と、コストを考慮すると、例えば、０．０１～５ｗ／ｖ％、好ましくは０．０５～４ｗ／ｖ％、より好ましくは０．１～０．５ｗ／ｖ％とすることができる。
　酵素反応温度と酵素反応時間は原料タンパク質の加水分解が十分になされ、酵素分解物の品質が保たれるように設定することができる。すなわち、酵素反応温度は、例えば、３０～７０℃とすることができ、好ましくは４０～７０℃であり、より好ましくは４５～６５℃である。また、酵素反応時間は１～１２時間とすることができ、好ましくは２～１０時間であり、より好ましくは４～５時間である。
　酵素反応は温度を上昇させながら行うことが好ましい。例えば、３０℃から７５℃にまで４～１０時間かけて上昇させながら反応させることができる。好ましくは、３５℃から７５℃まで５～８時間かけて上昇させながら反応させることができ、より好ましくは３５℃から７５℃まで６～８時間かけて反応させることができる。温度上昇スピードは任意であるが、４５℃から５５℃の間での保持時間を長めにし（５～７時間）、その後６０℃まですみやかに上昇させた後に６０℃から７５℃の間で長めに（たとえば１～３時間）保持することが好ましい。最も好ましいのは５０℃で酵素を投入し、５～７時間保持後、任意の速度で昇温させ、６０～６５℃あるいは６５～７５℃の目標温度で１～３時間保持する方法である。
　反応に際しては反応効率の観点から反応液を撹拌することが好ましい。基質が酵素とよく接するように、液撹拌速度は速い方がよいが、速すぎると反応液が飛び散る恐れがあるため、例えば、１００～５００ｒｐｍとすることができ、好ましくは２００～４００ｒｐｍであり、より好ましくは約２５０ｒｐｍである。
　所望のペプチドが得られたら反応液は酵素反応を停止工程に付すことが好ましい。酵素反応停止工程では、反応液を高温にしたり、キレート剤を添加して酵素の化学構造を変化させたりする方法や、膜処理により酵素を除去する方法を採用することができる。好ましい手法は高温による失活処理である。該方法は８０～９０℃で５～３０分、好ましくは８０～９０℃で２０～３０分間保持することで実施することができる。また、後述の濃縮工程で高温になる場合には、濃縮工程を兼ねて行うことができる。
　酵素反応工程および酵素反応停止工程を経た反応液（ペプチド組成物）は、さらに殺菌工程に付してもよい。殺菌工程としては、例えば、後述の膜処理工程や高温殺菌工程が挙げられる。加熱殺菌工程は酵素反応停止工程を兼ねることもでき、製造工程の簡略化の点で有利である。
　酵素反応工程および酵素反応停止工程を経た反応液（ペプチド組成物）は、さらに精製工程に付してもよい。精製工程としてはたとえば膜処理工程が挙げられ、好ましい膜処理は限外ろ過である。限外ろ過の分画分子量としては３～１００ｋＤａのものが好ましく、５～５０ｋＤａがより好ましく、１０ｋＤａがもっとも好ましい。精製工程を実施すると、実施しなかった場合と比較してペプチド組成物の風味を改善することができる点で有利である。また、精製工程は酵素反応停止工程および殺菌工程を兼ねることもでき、製造工程の簡略化の点でも有利である。
　酵素反応工程および酵素反応停止工程を経た反応液（ペプチド組成物）は、保管や運搬の観点からさらに濃縮工程に付してもよい。濃縮工程は任意の方法を選択することができるが、減圧濃縮、凍結乾燥および噴霧乾燥（スプレードライ）、膜処理による濃縮（例えば、逆浸透膜を用いる方法）による方法が好ましく、より好ましくは凍結乾燥および噴霧乾燥である。濃縮を大量かつ効率的に実施する観点から噴霧乾燥が特に好ましい。また、酵素反応工程および酵素反応停止工程を経た反応液（ペプチド組成物）は、飲食品（特に飲料）として提供するために溶媒により希釈されてもよい。使用される溶媒に限定はないが、水系溶媒が好ましく、例えば、水、糖分含有水溶液、糖分および酸味寄与物質含有水溶液、任意の飲料液が挙げられる。
　本発明の第一の面の好ましい態様によれば、ホエイタンパク質（より好ましくはフォンテラ社ＷＰＣ４７２）を１０％の濃度となるよう０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液に溶解し（ｐＨ７．０）、天野エンザイム社製プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤを０．２％となるよう添加し、２５０ｒｐｍで撹拌しながら５０℃×５時間保持、その後温度を上昇させ６０℃に達したら３時間保持することで本発明の第一のペプチド組成物を製造することができる。
　本発明の第二の面によれば、ペプチドとしてＷＹ、ＷＬ、ＷＶおよびＧＴＷＹからなる群から選択される特定量の１種、２種、３種または４種のペプチドを含んでなる、摂取形態のペプチド組成物（以下「第二のペプチド組成物」ということがある）が提供される。第二のペプチド組成物においては、該組成物中のペプチドの含有量は以下のように設定することができる。
ＷＹ：１６０～７００００μｇ（好ましくは４０００～６００００μｇ）
ＷＶ：１００～６００００μｇ（好ましくは１６０～５５０００μｇ）
ＷＬ：１００～６００００μｇ（好ましくは１６０～５５０００μｇ）
ＧＴＷＹ：５０～４００００μｇ（好ましくは１００～３００００μｇ）
　本発明の第二のペプチド組成物は、ＷＹ、ＷＶ、ＷＬおよびＧＴＷＹからなる群から選択される１種または２種以上のペプチドに加えて、ＧＹＧＧＶＳＬＰおよび／またはＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩをさらに含んでいてもよい。ＧＹＧＧＶＳＬＰの含有量は５０～５００００μｇ（好ましくは１６０～４００００μｇ）とすることができ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩの含有量は１６０～７００００μｇ（好ましくは２７０～６００００μｇ）とすることができる。
　本発明の第二のペプチド組成物の製造方法は、所定のペプチドを所定の含有量で含む限り特に制限はないが、第一のペプチド組成物と同様に製造することができる。すなわち、全乳、粉乳、カゼインまたはホエイなどの原料タンパク質にタンパク質分解酵素を含む酵素製剤を作用させ、場合によっては所定のペプチドが所定の含有量で含まれるように濃縮あるいは希釈を行うことによりを製造することができる。酵素反応の詳細は第一のペプチド組成物の製造方法の記載を参照することができる。
　本発明の第二のペプチド組成物は摂取形態であるため、そのままヒトを含む哺乳動物に摂取させることができ、脳機能の維持、向上、改善等の機能を発揮させることができる。従って、本発明の第二のペプチド組成物は機能性食品や医薬品として用いることができる。
　後記実施例に示されるように、ホエイタンパク質の酵素分解物並びにＷＹ、ＷＬ、ＷＶ、ＧＴＷＹ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩおよびＧＹＧＧＶＳＬＰ（以下「本発明の６種のペプチド」ということがある）は脳機能の維持、向上および改善作用を有する。従って、本発明の第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部は脳機能の維持、向上および／または改善のための組成物の有効成分として使用することができるとともに、脳機能の維持方法、脳機能の向上方法および脳機能の改善方法に使用することができる。また、第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部は脳機能の維持剤、脳機能の向上剤および脳機能の改善剤の有効成分として使用することができる。本発明において「脳機能」は記憶学習機能および認知機能を含む意味で用いられる。
　すなわち、本発明によれば、有効量の本発明の第一のペプチド組成物、第二のペプチド組成物あるいは本発明の６種のペプチドの一部または全部を、ヒトまたは非ヒト動物に摂取させるか、あるいは投与することを含んでなる、脳機能の維持方法、脳機能の向上方法および脳機能の改善方法が提供される。本発明のこれらの方法を実施する場合にはそれを必要としているヒトを含む哺乳類に有効量の本発明の組成物または本発明のペプチドを投与することにより実施することができる。
　本発明によればまた、脳機能の維持、向上および／または改善のための組成物および食品の製造のための、本発明の第一のペプチド組成物、第二のペプチド組成物あるいは本発明の６種のペプチドの一部または全部の使用が提供される。本発明によればさらに、脳機能の維持剤、脳機能の向上剤および脳機能の改善剤の製造のための、本発明の第一のペプチド組成物、第二のペプチド組成物あるいは本発明の６種のペプチドの一部または全部の使用が提供される。本発明によればさらにまた、脳機能の維持、向上および／または改善に用いるための本発明の第一のペプチド組成物、第二のペプチド組成物および本発明の６種のペプチドの一部または全部が提供される。
　本発明において、「記憶学習機能の維持」とは、例えば、老年層等において、加齢に伴って生じる記憶力や学習能力の低下を抑制することなどを含む。また、「記憶学習機能の向上」とは、例えば、一過的な記憶学習機能の向上や、中長期的な記憶の定着を促進、ひいては、脳の発育を促進させることなどを含む。さらに、「記憶学習機能の改善」とは、例えば、加齢その他の要因により一旦低下した機能や低下の兆しがある機能について回復することなどを含む。
　本発明において「認知機能の維持」とは、例えば、理解、判断、論理などの知的機能、すなわち認知能力の低下を予防することなどを含む。また、「認知機能の向上」とは、例えば、認知能力を現状より高めることなどを含む。さらに、「認知機能の改善」とは、例えば、いったん低下した認知能力や低下の兆しがある症状を回復させることなどを含む。
　以下の理論に拘束されるものではないが、本発明の第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物が脳機能の維持、向上および改善作用を有するのは、これらの組成物に含まれるペプチドが神経伝達物質の産生を促すなどにより脳の仕組みを補強する結果として、脳機能の維持、向上および改善に繋がったものと考えられる。
　本発明における本発明の第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの使用はヒトおよび非ヒト動物における使用であってもよく、治療的使用と非治療的使用のいずれもが意図される。本明細書において、「非治療的」とはヒトを手術、治療または診断する行為（すなわち、ヒトに対する医療行為）を含まないことを意味し、具体的には、医師または医師の指示を受けた者がヒトに対して手術、治療または診断を行う方法を含まないことを意味する。
　本発明においては、また、本発明の第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部は脳機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状の治療、予防および／または改善のための組成物の有効成分として使用することができるとともに、脳機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状の治療方法、予防方法および改善方法に使用することができる。また、第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部は脳機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状の治療剤、予防剤および改善剤の有効成分として使用することができる。
　すなわち、本発明によれば、有効量の本発明の第一のペプチド組成物、第二のペプチド組成物あるいは本発明の６種のペプチドの一部または全部を、ヒトまたは非ヒト動物に摂取させるか、あるいは投与することを含んでなる、脳機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状の治療方法、予防方法および改善方法が提供される。本発明の治療方法、予防方法および改善方法を実施する場合には治療、予防または改善を必要としているヒトを含む哺乳類に有効量の本発明の組成物または本発明のペプチドを投与することにより実施することができる。
　本発明によればまた、脳機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状の治療用組成物、予防用組成物および改善用組成物の製造のための、本発明の第一のペプチド組成物、第二のペプチド組成物あるいは本発明の６種のペプチドの一部または全部の使用が提供される。これら組成物は好ましくは医薬組成物である。本発明によればさらに、脳機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状の治療剤、予防剤および改善剤の製造のための、本発明の第一のペプチド組成物、第二のペプチド組成物あるいは本発明の６種のペプチドの一部または全部の使用が提供される。本発明によればさらにまた、脳機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状の治療、予防および改善に用いるための本発明の第一のペプチド組成物、第二のペプチド組成物および本発明の６種のペプチドの一部または全部が提供される。
　脳機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状としては、記憶学習機能および認知機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状が挙げられ、より具体的には記憶障害（記憶を思い出すことができない、新たなことを覚えることができないという症状）、見当識障害（時間・場所・人物の失見当）、認知機能障害（計算能力の低下・判断力低下失語・失認・失行・実行機能障害）などが挙げられる。
　本発明の脳機能の維持、向上および／または改善のための組成物および本発明の脳機能の維持剤、向上剤および／または改善剤並びに本発明の脳機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状の治療用組成物、予防用組成物および改善用組成物および本発明の脳機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状の治療剤、予防剤および改善剤は、医薬品、医薬部外品、飲食品、飼料などの形態で提供することができ、下記の記載に従って実施することができる。また本発明の脳機能の維持方法、脳機能の向上方法、脳機能の改善方法並びに本発明の治療方法および予防方法は下記の記載に従って実施することができる。
　本発明の有効成分である本発明の第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部はヒトおよび非ヒト動物に経口投与または非経口投与することができ、好ましくは経口投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。非経口剤としては、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学上許容される担体を用いて製剤化することができる。薬学上許容される担体としては、賦形剤、結合剤、希釈剤、添加剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられ、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバターを担体として使用できる。
　経口剤の製造方法は特に限定されずいずれの方法をも使用することができる。有効成分に賦形剤（例えば、乳糖、白糖、デンプン、マンニトール）、崩壊剤（例えば、炭酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム）、結合剤（例えば、α化デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース）、安定化剤および／または滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００）などの製剤用添加剤を配合して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため公知の方法でコーティングすることにより製造することができる。コーティング剤としては、例えば、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびオイドラギット（ローム社）などを用いることができる。カプセル剤は有効成分をそのまままたは有効成分にたとえば安定化剤、分散剤、着色剤および／または保存剤などの製剤用添加剤を配合して製造してもよい。また、カプセルはソフトカプセルでもハードカプセルでもよく、カプセルの素材は特に限定されずたとえばゼラチンや植物性繊維や澱粉などを用いることができ、付着防止措置を施してもよい。
　非経口剤のうち注射剤は、有効成分を分散剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０（アトラスパウダー社））、保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、ソルビトール、ブドウ糖、転化糖）などの製剤用添加剤と共に水性溶剤（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リンゲル液）あるいは油性溶剤（例えば、オリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油などの植物油、プロピレングリコール）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造することができる。この際、所望により溶解補助剤（例えば、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン）等の添加物を添加してもよい。
　本発明の有効成分である第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部を食品として提供する場合には、これらをそのまま食品として提供することができ、あるいはこれらを食品に含有させて提供することができる。このようにして提供された食品は第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部を有効量含有した食品である。本明細書において、第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部を「有効量含有した」とは、個々の食品において通常喫食される量を摂取した場合に後述するような範囲で第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部が摂取されるような含有量をいう。また「食品」とは、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、保健機能食品（例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品）、特別用途食品（例えば、幼児用食品、妊産婦用食品、病者用食品）を含む意味で用いられる。
　第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部は脳機能の維持、向上および／または改善作用を有するため、日常摂取する食品、さらにはサプリメントとして摂取する食品に含有させて提供することができる。この場合、第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部は１食当たりに摂取する量が予め定められた単位包装形態で提供することができる。１食当たりの単位包装形態としては、例えば、パック、包装、缶、ボトル等で一定量を規定する形態が挙げられる。第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの各種作用をよりよく発揮させるためには、後述する、本発明の６種のペプチドの１回当たりの摂取量に従って１食当たりの摂取量を決定できる。本発明の食品は、摂取量に関する説明事項が包装に表示されるか、あるいは説明事項が記載された文書等と一緒に提供されてもよい。
　本発明の食品には脳機能の維持、向上および／または改善作用を有する旨の表示が付されてもよい。この場合、消費者に理解しやすい表示とするため本発明の食品には以下の一部または全部の表示が付されてもよい。なお、本発明において「脳機能の維持、向上および／または改善」が以下の表示を含む意味で用いられることはいうまでもない。
・記憶力を向上させる
・記憶力を増強する
・記憶力をサポートする
・認知機能を向上させる
・認知機能を増強する
・認知機能をサポートする
・記憶力の維持に役立つ
・うっかりを防止する
・記憶の定着を向上させる
・加齢に伴う記憶の低下を抑制する
　「食品」の形態は特に限定されるものではなく、例えば、飲料の形態であっても、半液体やゲル状の形態であってもよい。例えば、乳、ヨーグルト、チーズ等の乳素材に前述の酵素製剤を作用させ、本発明の６種のペプチドの一部または全部を生成させた乳製品も本発明の食品の範囲内である。また、サプリメントとしては、本発明の６種のペプチドの一部または全部の乾燥粉末に賦形剤、結合剤等を加え練り合わせた後に打錠することにより製造された錠剤や、カプセルになどに封入されたカプセル剤が挙げられる。
　また、本発明の食品には通常の食品の製造に使用される食品上許容される添加剤を配合できることはいうまでもないが、本発明のペプチド組成物の劣化防止および酸化防止の観点からこれらの効果が期待される成分を本発明の食品に配合してもよい。このような成分としてはペプチドの劣化防止作用や抗酸化作用を有するフレーバー製剤が挙げられ、天然物由来の組成物を好ましくは用いることができる。
　本発明で提供される食品としては、飯類、麺類、パン類およびパスタ類等炭水化物含有飲食品；クッキーやケーキなどの洋菓子類、饅頭や羊羹等の和菓子類、キャンディー類、ガム類、ヨーグルトやプリンなどの冷菓や氷菓などの各種菓子類；ウイスキー、バーボン、スピリッツ、リキュール、ワイン、果実酒、日本酒、中国酒、焼酎、ビール、アルコール度数１％以下のノンアルコールビール、発泡酒、その他雑酒、酎ハイなどのアルコール飲料；果汁入り飲料、野菜汁入り飲料、果汁および野菜汁入り飲料、清涼飲料水、炭酸飲料、牛乳、豆乳、乳飲料、ドリンクタイプのヨーグルト、ドリンクタイプのゼリー、コーヒー、ココア、茶飲料、栄養ドリンク、スポーツドリンク、ミネラルウォーター、ニア・ウォーターなどの非アルコール飲料；卵を用いた加工品、魚介類や畜肉（レバー等の臓物を含む）の加工品（珍味を含む）などを例示することができるが、これらに限定されるものではない。なお、ミネラルウォーターは、発泡性および非発泡性のミネラルウォーターのいずれもが包含される。
　茶飲料としては、発酵茶、半発酵茶および不発酵茶のいずれもが包含され、例えば、紅茶、緑茶、麦茶、玄米茶、煎茶、玉露茶、ほうじ茶、ウーロン茶、ウコン茶、プーアル茶、ルイボスティー、ローズ茶、キク茶、ハーブ茶（例えば、ミント茶、ジャスミン茶）が挙げられる。
　果汁入り飲料や果汁および野菜汁入り飲料に用いられる果物としては、例えば、リンゴ、ミカン、ブドウ、バナナ、ナシ、モモ、マンゴー、アサイー、ブルーベリーおよびウメが挙げられる。また、野菜汁入り飲料や果汁および野菜汁入り飲料に用いられる野菜としては、例えば、トマト、ニンジン、セロリ、カボチャ、キュウリおよびスイカが挙げられる。
　本発明の医薬品および食品はヒトが食品として長年摂取してきた乳由来の酵素分解物を利用することから、毒性も低く、それを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）に対し安全に用いることができる。本発明の６種のペプチドの摂取量または投与量は、受容者の性別、年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与経路並びに組み合わせる薬剤等に依存して決定できる。本発明の６種のペプチドの成人（５０ｋｇ）１回当たりの摂取量および投与量を例示すると以下の通りであるが、対象者によっては数回に分けて摂取させ、あるいは投与してもよい。
ＷＹ：１６０～４２００μｇ（好ましくは５００～３６００μｇ）
ＷＶ：１００～３６００μｇ（好ましくは１６０～３３００μｇ）
ＷＬ：１００～３６００μｇ（好ましくは１６０～３３００μｇ）
ＧＴＷＹ：５０～２４００μｇ（好ましくは１００～１８００μｇ）
ＧＹＧＧＶＳＬＰ：５０～３０００μｇ（好ましくは１６０～２４００μｇ）
ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ：１６０～４２００μｇ（好ましくは２７０～３６００μｇ）
　なお、本発明の第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物は本発明の６種のペプチドの一部または全部を含むものであることから、各ペプチドの１回当たりの摂取量および投与量に従って第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物の組成と摂取量または投与量を決定することができる。例えば、上記のような各ペプチドの１回当たりの摂取量および投与量を有するように、単位摂取形態または単位投与形態の第一のペプチド組成物や単位摂取形態または単位投与形態の第二のペプチド組成物を調製することができる。
実施例１：ホエイ分解物製造の条件の検討
（１）原料タンパクの選択
各種ホエイタンパク質を、タンパク質分解酵素を含む酵素製剤（アマノエンザイム社製プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤまたはサモアーゼＣ１００）でそれぞれ酵素処理し、生成される脳機能活性ペプチドについて検討を行った。
　具体的には、各ホエイタンパク質を０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液に５ｗ／ｖ％となるように溶解させた溶解液に、各タンパク質分解酵素製剤の終濃度が０．１２５ｗ／ｖ％となるように酵素製剤を添加した。得られた溶液をｐＨ７．０、５０℃にて４時間反応させた後、９０℃で２０分保持して酵素を失活させ、酵素処理サンプルを得た。なお、酵素製剤を添加する以外は同様の処理をして得られたサンプルを対照サンプルとした。
　得られたサンプルについて目視により観察した結果を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、得られたサンプルを遠心分離し、上清を限外ろ過（１０ｋＤａ）して得られた分析サンプルを適宜希釈し、以下の分析条件でＬＣ／ＭＳ／ＭＳにてペプチドの定量を行った。濃度換算は最少濃度を０．００１ｐｐｍとする検量線法によった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１および２の結果から、酵素反応や酵素失活などの熱処理によって、一部のホエイタンパク質（分離ホエイタンパクＷＰ１８８５５）においては凝集が生じたが（表１）、それ以外については沈殿が生じながらもペプチドは得られ、その収量はホエイタンパク質の違いによる大きな差は見られなかった（ペプチド収量のデータは省略）。
　したがって、本発明のホエイ分解物の製造にあたっては、ほとんどすべてのホエイタンパク質を原料として使用できることがわかった。なかでも、検討した２種の酵素製剤に対して沈殿が少なかったフォンテラ社製ＷＰＣ４７２が総合的に適していることがわかった。
（２）酵素製剤の検討
　ホエイタンパク質（フォンテラ社製ＷＰＣ４７２）を５ｗ／ｖ％含有する０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液に、表３に示す各種酵素製剤をタンパク質分解酵素製剤の終濃度が０．１２５ｗ／ｖ％となるように添加した。ｐＨ７．０、５０℃にて４時間反応させた後、９０℃で２０分保持して酵素を失活させ、酵素処理サンプルを得た。なお、酵素製剤を添加する以外は同様の処理をして得られたサンプルを対照サンプルとした。
　得られたサンプルを限外ろ過して得た分析サンプルを適宜希釈し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにてペプチドの定量を行った。このとき、市販のホエイ加水分解物についても１０ｗ／ｖ％濃度となるよう水に溶解させ上記サンプルと同様の処理をしてペプチドの定量を行った。なお、分析条件は実施例１に示す条件に従った。その結果を以下の表４に示す。数値は、酵素製剤番号３５（アスペルギルス・メレウス由来タンパク質分解酵素製剤）により得られた反応液中のＷＹ濃度を１００としたときの比で表示した（表示の値＝実測濃度（ｐｐｍ）／酵素製剤番号３５により得られた反応液中のＷＹ濃度（ｐｐｍ）×１００）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
　表４の結果から、アスペルギルス・オリゼ、バチルス・サブティリスまたはアスペルギルス・メレウス由来のタンパク質分解酵素を含む酵素製剤の使用により、脳機能活性ペプチドの収量が多くなる傾向があり、なかでもアスペルギルス・メレウス由来のタンパク質分解酵素を含む酵素製剤の使用によりＧＴＷＹなどの収量が多くなることが分かった。また、本発明のホエイ分解物は、市販のホエイ加水分解物と比較して本発明の６種のペプチド濃度が極めて高いことが分かった。
（３）酵素反応条件の検討
　本発明者らは、各種ホエイタンパク質を５～２０ｗ／ｖ％を含有する０．０５～０．２Ｍ濃度の緩衝液に、プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤをタンパク質分解酵素製剤の終濃度が０．１～０．５ｗ／ｖ％となるように添加し、得られた溶液をｐＨ７．０、５０℃にて１～８時間反応させた後、８０℃、３０分で酵素を失活させる条件において、所望のペプチドが生成されることを確認した（データ省略）。また、２５０ｒｐｍで撹拌した場合に反応が適切に進行することも確認した（データ省略）。さらに、ホエイタンパク質（フォンテラ社製ＷＰＣ４７２）を１０ｗ／ｖ％含有する０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液に、プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤをタンパク質分解酵素製剤の終濃度が０．２ｗ／ｖ％となるように添加し、得られた溶液をｐＨ７．０、５０℃にて５～８時間維持し、その後８０℃で３０分維持して酵素を失活させる方法が好ましいことも確認した（データ省略）。
　そこで、さらにホエイ分解物に含まれる特定ペプチドの収量を増加させることを目的として酵素反応条件についてさらに検討を行った。具体的には、ホエイタンパク質（フォンテラ社製ＷＰＣ４７２）を１０ｗ／ｖ％含有する０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液に、プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤをタンパク質分解酵素製剤の終濃度が０．２ｗ／ｖ％となるように添加し、反応条件を検討した。
　５０℃で６～８時間反応させた場合に得られたホエイ分解物のペプチド濃度を、５０℃で６時間反応させたときのＷＹ濃度を１００としたときの比（表示の値＝実測濃度（ｐｐｍ）／５０℃で６時間反応させたときのＷＹ濃度（ｐｐｍ）×１００）として以下の表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表５の結果から、反応時間が７時間まではペプチド濃度が増加傾向にあるものの、８時間ではペプチド濃度が低減することが分かった。
　次に、反応６時間目以降に温度を変更して維持した場合の結果を、５０℃で５時間反応させたときのＷＹ濃度を１００としたときの比（表示の値＝実測濃度（ｐｐｍ）／５０℃で５時間反応させたときのＷＹ濃度（ｐｐｍ）×１００）として以下の表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表６の結果から、５０℃で一定時間反応を行った後、６０℃でさらに一定時間反応させ、その後８０℃で酵素を失活させることにより、得られるペプチドの量が増加することが分かった。特に、ＷＹについては、５０℃で５時間反応させた後、６０℃で１～３時間反応させることにより、ペプチド濃度が増加することが分かった。さらに、５０℃から６０℃へ反応温度を昇温させた場合は、総反応時間が８時間の場合であっても、ペプチドの合計量が維持されることが分かった。
実施例２：ペプチド分解物の製造
　ホエイタンパク質（フォンテラ社製ＷＰＣ４７２）を１０ｗ／ｖ％含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にプロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤをタンパク質分解酵素製剤の終濃度が０．２ｗ／ｖ％となるように添加し、５０℃で５時間維持し反応させた。その後、８０℃にて３０分間維持し酵素を失活させた。
　得られたホエイ分解物含有反応液および該ホエイ分解物をＥＹＥＬＡ社製凍結乾燥機 ＦＤＵ‐２１００を使用し反応液の入ったフラスコ外側を室温とした凍結乾燥を行った。粉末化したホエイ分解物粉末中のペプチド濃度を以下の表７および８に示す。
　本試験ではホエイ５００ｇを原料とし、約２ｇの粉末化したペプチド分解物が得られているところ、該ペプチド分解物のほとんどはペプチドであると考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　なお、粉末化したホエイ分解物中のペプチドの含有比率は、表７に記載したホエイ分解物含有水溶液（反応液中のペプチド含有比率）に等しいとみなしている。
実施例３：記憶学習機能・認知機能に対するホエイ分解物摂取の効果
（１）記憶学習機能・認知機能の評価方法（Ｙ字迷路試験）
　マウスは本来、直前に選択したルートとは異なるルートを選択する性質がある。そのため、幅、長さ等が等価の３本のアームを持つＹ字迷路にマウスを入れた場合、通常は直前に進入したアームとは異なるアームに進入する。Ｙ字迷路試験は、マウスのその性質を短期記憶の評価に利用する試験である。
　本試験では、一本のアームの長さが２５ｃｍ、壁の高さが２０ｃｍ、床の幅が５ｃｍの３本のアームが各々１２０度の角度で接続されたＹ字迷路をＹ字迷路試験のための装置として使用した。
　マウスをＹ字迷路のいずれかのアームの先端へ入れて自由に８分間探索させた際の移動したアームの順を記録した。ここで、３回連続で異なるアームを選択し、進入した場合を自発的交替行動と呼ぶ。時間内のアームへの総進入数および自発的交替行動数をカウントし、下記式（１）を用いて自発的交替行動変動率（％）を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000012
 　自発的交替行動変動率が高いほど、短期記憶が保持されていることを示す。
（２）ホエイ分解物摂取の効果
　６週齢雄のＣＤ－１マウス（日本ＳＬＣ社より入手）に、実施例２で得られたホエイ分解物粉末を０．３～３ｍｇ／ｋｇ体重の量で胃内へ強制経口投与し、その４０分後、記憶障害を誘発するために０．８０ｍｇ／ｋｇ体重のスコポラミン塩酸塩（ＳＩＧＭＡ社製）を腹腔内投与した。スコポラミンの腹腔内投与２０分後、Ｙ字迷路試験を実施した（図１）。なお、各群１０匹で実験を行い、平均、標準誤差を求めた。その結果を図２に示す。
　図２の結果から、ホエイ分解物投与による総進入数の変動は認められず、すなわち、ホエイ分解物投与は行動量には影響を与えないが（図２Ｂ）、ホエイ分解物投与は摂取量依存的に自発的交替行動変動率を高めることが分かった（図２Ａ）。このことは、ホエイ分解物により短期記憶が保持されることを意味する。
実施例４：記憶学習機能・認知機能に対する合成ペプチド摂取の効果
　６週齢雄のＣＤ－１マウス（日本ＳＬＣ社より入手）に、６種の合成ペプチド：ＧＴＷＹ、ＧＹＧＧＶＳＬＰ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ、ＷＬ、ＷＶ、ＷＹを０．１～３μｍｏｌ／ｋｇ体重の量で胃内へ強制経口投与し、その４０分後、記憶障害を誘発するために０．８０ｍｇ／ｋｇのスコポラミン塩酸塩を腹腔内投与した。スコポラミンの腹腔内投与２０分後、実施例３（１）に記載されるＹ字迷路試験を実施した。なお、各群１０匹で実験を行い、平均、標準誤差を求めた。その結果を図３～７に示す。
　図３～６の結果から、ＧＴＷＹを摂取させたマウスは、摂取量０．１～１μｍｏｌ／ｋｇ体重の範囲で非摂取群と比較して自発的交替行動変動率が高くなり、短期記憶が保持されたことがわかった。同様に、ＧＹＧＧＶＳＬＰ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩでも摂取量０．１～１μｍｏｌ／ｋｇ体重の範囲で非摂取群と比較して自発的交替行動変動率が高くなり、短期記憶が保持されたことがわかった。特に、ＧＴＷＹ、ＧＹＧＧＶＳＬＰ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩによる自発的交替行動変動率の上昇はペプチド摂取量に依存する傾向が認められた。
　図７の結果から、ＷＬ、ＷＶ、ＷＹを摂取させたマウスでは、摂取量０．３～３μｍｏｌ／ｋｇ体重の範囲で非摂取群と比較して摂取量に依存して自発的交替行動変動率が高くなり、短期記憶が保持されたことがわかった。
実施例５：ホエイ分解物を添加した飲料の評価
　高甘味度甘味料であるアセスルファムカリウムやスクラロースはショ糖などと比較すると甘味に後引きが感じられることが知られている。そこで、高甘味度甘味料に起因する甘さの後引きに対するホエイ分解物の効果について検討した。
（１）サンプル飲料の調製
　イオン交換水に高甘味度甘味料としてアセスルファムカリウム（ＭＣフードスペシャリティーズ社製）またはスクラロース（三栄源エフエフアイ社製）を表９に示す含有量となるように添加した水溶液に、実施例２で得られたホエイ分解物粉末を表９に示す含有量となるように添加したものをサンプル飲料とした。
（２）官能評価
　各サンプル飲料を官能評価に供した。具体的には、高甘味度甘味料に起因する甘さの後引きを改善できるか否かについて、以下の評価基準に従って評価を行った。
　　４：甘さが極めてすっきりする
　　３：甘さがすっきりする
　　２：少し甘さがすっきりする
　　１：無添加のものと同じ甘さ
　官能評価は訓練されたパネラー６名により実施した。各パネラーは０．５点刻みのスコアで評価し、パネラー６名の評価スコアの平均値を計算し、２．５以上を効果ありと判断した。
（３）評価結果
　官能評価の結果を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
表９の結果から、アセスルファムＫ水溶液、スクラロース水溶液のいずれにおいても、ホエイ分解物濃度を１ｗ／ｖ％としたときに甘さの後引きが最も改善された。しかし、本サンプル飲料は高甘味度甘味料とホエイ分解物以外の原料を含有しないため、この濃度ではホエイ分解物由来の苦み・えぐみも感じられるようになることから、総合的な呈味は１ｗ／ｖ％よりも低い濃度のサンプル飲料の方が優れていた。
実施例７：風味が改善されたホエイ分解物の調製
　本実施例では限外ろ過膜処理によるペプチド組成物の風味改善について検討した。
（１）サンプル飲料の調製
　実施例２で得られたホエイ分解物粉末１ｇを５００ｍＬの蒸留水に溶解したサンプル飲料（サンプル水１）と、サンプル水１を限外ろ過膜（分画分子量１０ｋＤａ、メルクミリポア社製）でろ過処理して得られたサンプル飲料（サンプル水２）を調製し、官能評価に供した。
（２）官能評価
　各サンプル飲料を常温で官能評価に供した。具体的には、５つの評価項目：清澄度、渋味、苦味、異臭および嗜好度を改善できるか否かについて、それぞれ５段階で評価を行った。清澄度については清澄度が最も低い場合を１とし、最も高い場合を５とした。渋味については渋味が最も弱い場合を１とし、最も強い場合を５とした。苦味については苦味が最も弱い場合を１とし、最も強い場合を５とした。異臭については異臭が最も弱い場合を１とし、最も強い場合を５とした。嗜好度については嗜好度が最も低い場合を１とし、最も高い場合を５とした。
　官能評価は訓練されたパネラー４名により実施した。各パネラーは１刻みのスコアで評価し、パネラー４名の評価スコアの平均値を計算した。
（３）評価結果
　官能評価の結果を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表１０の結果から、ろ過膜処理を施すことにより、ホエイ分解物溶液の清澄度、渋味、苦味、異臭および嗜好度が改善できることが確認された。すなわち、ろ過膜処理により風味が改善されたペプチド組成物を調製できることが示された。
実施例８：保存安定性が改善されたホエイ分解物含有飲料の調製
　本実施例ではホエイ分解物含有飲料の保存安定性について検討した。
（１）サンプル飲料の調製および保存
　市販のスポーツドリンク飲料に、実施例２で得られたホエイ分解物粉末を濃度が２ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、さらにペプチドの劣化防止作用を有するフレーバー組成物として各種天然物由来組成物を表１１に示す含有量となるように添加混合したものをサンプル飲料とした。調製した各サンプル飲料は１９５ｍＬ容ＰＥＴボトルに充填し１週間保存のうえ評価に供した。保存条件は、表１１に示す温度および照度の条件（保存条件Ａおよび保存条件Ｂ）とした。なお、表中の照射とは、保存中の照度が３０００ルクス（ＬＸ）であったことを指す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
（２）ペプチドの含有量評価
　上記（１）で調製し保存されたサンプル飲料中のペプチド濃度を実施例１に記載した方法に従って測定した。保存条件Ａのサンプルについての測定結果を表１２に、保存条件Ｂのサンプルについての測定結果を表１３に示す。ペプチド濃度は、サンプル飲料１（フレーバー組成物非添加、暗所にて保存）の値を１００としたときの比（表示の値＝実測濃度（ｐｐｍ）／サンプル飲料１の各ペプチド濃度（ｐｐｍ）×１００）として示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　表１２の結果から、フレーバー組成物を含有する飲料（サンプル飲料３、４、５、６、７）ではペプチドの光による減耗が抑制されることが確認された。また、表１３の結果から、フレーバー組成物を含有する飲料（サンプル飲料３、４、５、６、７）ではペプチドの熱による減耗が抑制されることが確認された。すなわち、フレーバー組成物の添加により保存安定性が改善されたホエイ分解物含有飲料を調製できることが示された。

Claims (23)

  1. 　全ペプチド含有量に対して０．００００１～０．２質量％のＷＹ、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．１質量％のＷＬ、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．１質量％のＷＶおよび全ペプチド含有量に対して０．０００００５～０．２質量％のＧＴＷＹ（配列番号１）からなる群から選択される１種または２種以上の成分を含んでなるペプチド組成物。
  2. 　ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ（配列番号２）および／またはＧＹＧＧＶＳＬＰ（配列番号３）をさらに含んでなり、全ペプチド含有量に対してＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ含有量が０．０００００１～０．０５質量％であり、全ペプチド含有量に対してＧＹＧＧＶＳＬＰ含有量が０．０００００５～０．２質量％である、請求項１に記載のペプチド組成物。
  3. 　全ペプチド含有量に対して、ＷＹ、ＷＬ、ＷＶ、ＧＴＷＹ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩおよびＧＹＧＧＶＳＬＰの合計含有量が０．００００２～０．６質量％である、請求項１または２に記載のペプチド組成物。
  4. 　溶液の形態である、請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチド組成物。
  5. 　溶液中、ＷＹの濃度が０．１５ｐｐｍ以上であり、ＷＬの濃度が０．１５ｐｐｍ以上であり、ＷＶの濃度が０．１ｐｐｍ以上であり、ＧＴＷＹの濃度が０．３ｐｐｍ以上である、請求項４に記載のペプチド組成物。
  6. 　溶液中のＧＴＷＹ濃度が３ｐｐｍ以上である、請求項４または５に記載のペプチド組成物。
  7. 　溶液中のＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ濃度が０．１ｐｐｍ以上であり、ＧＹＧＧＶＳＬＰ濃度が０．１ｐｐｍ以上である、請求項４～６のいずれか一項に記載のペプチド組成物。
  8. 　溶液中のＷＹ濃度、ＷＬ濃度、ＷＶ濃度、ＧＴＷＹ濃度、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ濃度およびＧＹＧＧＶＳＬＰ濃度の合計が１ｐｐｍ以上である、請求項４～７のいずれか一項に記載のペプチド組成物。
  9. 　溶液中のＷＹ濃度、ＷＬ濃度、ＷＶ濃度およびＧＴＷＹ濃度の合計が０．５ｐｐｍ以上である、請求項４～８のいずれか一項に記載のペプチド組成物。
  10. 　溶液中のＷＹ濃度、ＷＬ濃度およびＷＶ濃度の合計が０．５ｐｐｍ以上である、請求項４～９のいずれか一項に記載のペプチド組成物。
  11. 　摂取形態のペプチド組成物であって、１６０～７００００μｇのＷＹ、１００～６０００μｇのＷＶ、１００～６０００μｇのＷＬおよび５０～４００００μｇのＧＴＷＹからなる群から選択される１種または２種以上の成分を含んでなるペプチド組成物。
  12. 　ＧＴＷＹの含有量が１００～３００００μｇである、請求項１１に記載のペプチド組成物。
  13. 　ＧＹＧＧＶＳＬＰおよび／またはＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩをさらに含んでなり、ＧＹＧＧＶＳＬＰの含有量が５０～５００００μｇであり、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩの含有量が１６０～７００００μｇである、請求項１１または１２に記載のペプチド組成物。
  14. 　食品の形態である、請求項１～１３のいずれか一項に記載のペプチド組成物。
  15. 　食品が飲料である、請求項１４に記載の組成物。
  16. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載のペプチド組成物が配合されてなる、食品。
  17. 　飲料である、請求項１６に記載の食品。
  18. 　脳機能の維持、向上および／または改善のための、請求項１～１５のいずれか一項に記載のペプチド組成物または請求項１６または１７に記載の食品。
  19. 　有効量の請求項１～１５のいずれか一項に記載のペプチド組成物または請求項１６または１７に記載の食品を、ヒトまたは非ヒト動物に摂取させるか、あるいは投与することを含んでなる、脳機能の維持方法、脳機能の向上方法および脳機能の改善方法。
  20. 　脳機能の維持、向上および／または改善のための組成物および食品の製造のための、請求項１～１５のいずれか一項に記載のペプチド組成物の使用。
  21. 　ホエイタンパク質に１種または２種以上のアスペルギルス・メレウス由来のタンパク質分解酵素を含む酵素製剤を作用させて酵素分解物を得る工程を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のペプチド組成物の製造方法。
  22. 　ホエイタンパク質に酵素を作用させる工程を、作用温度４５～５５℃で一定時間保持した後に、作用温度６０～７５℃で一定時間保持することにより実施する、請求項２１に記載の製造方法。
  23. 　ホエイタンパク質の酵素分解物を希釈する工程またはホエイタンパク質の酵素分解物を濃縮する工程をさらに含む、請求項２１または２２に記載の製造方法。
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