CN108137650B

CN108137650B - 肽组合物及其制造方法

Info

Publication number: CN108137650B
Application number: CN201680061575.1A
Authority: CN
Inventors: 阿野泰久; 沓挂登志子
Original assignee: Kirin Holdings Co Ltd
Current assignee: Kirin Holdings Co Ltd
Priority date: 2015-11-16
Filing date: 2016-11-15
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2036-11-15
Also published as: JPWO2017086303A1; WO2017086303A1; JP7179908B2; JP2021119787A; CN108137650A

Abstract

本发明的目的在于提供含有功能性肽的肽组合物。根据本发明，可提供含有选自由相对于总肽含量为0.00001～0.2质量％的WY、相对于总肽含量为0.000001～0.1质量％的WL、相对于总肽含量为0.000001～0.1质量％的WV和相对于总肽含量为0.000005～0.2质量％的GTWY组成的组中的一种或两种以上的成分的肽组合物。

Description

肽组合物及其制造方法

相关申请的参考

本申请享有作为在先日本申请的特愿2015-224314(申请日：2015年11月16日)的优先权的利益，通过引用将其全部公开内容作为本说明书的一部分。

技术领域

本发明涉及肽组合物及其制造方法。

背景技术

在从青年人群至老年人群的广泛年龄层次中都要求脑功能的维持、提高和改善。记忆力、学习能力的维持、提高和改善不仅对于准备应试、资格考试等而学习的学生和社会人是很重要的，对于进行日常的工作和生活也是很重要的。另外，对于老年人群而言，记忆力的降低、认知功能的降低与生活的品质息息相关，因此要求预防脑功能的降低，维持、提高、改善脑功能。

此外，在老年期，由老化所伴随的脑功能的降低引起的精神障碍的增加随着老年人的增加也成为社会问题。作为由脑功能的降低引起的疾病，不仅有以阿尔茨海默氏病为代表的失智症，还报道了抑郁症、谵妄等精神疾病也起因于脑功能的降低(非专利文献1)。

随着对脑功能的了解的进展，正在积极进行增强脑功能的物质的探索。特别是出于不必担心副作用的理由，正在进行食品成分中是否含有提高脑功能的物质的分析。例如，记载了下述尝试：为了使脑内色氨酸浓度升高而引起血清素浓度的升高、从而给脑功能带来影响，给药乳清蛋白而使血浆中色氨酸浓度升高(非专利文献2)。

在专利文献1中，作为可有助于脑内色氨酸浓度升高的组合物，记载了色氨酸含量除以中性大型氨基酸含量所得到的值比特定值大的组合物，在专利文献2中记载了：通过1天摄取1瓶含有数10mg的溶菌酶来源的该组合物的饮料，可以期待其效果。在专利文献3中记载了：色氨酸含量除以中性大型氨基酸含量所得到的值大于特定值的组合物可以通过将α-乳球蛋白等优选用酸性蛋白酶水解而得到。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2011-523547号公报

专利文献2：日本特表2015-524265号公报

专利文献3：日本专利4642321号公报

非专利文献

非专利文献1：田中稔久、武田雅俊(2011)日本临床、增刊号、52～56页

非专利文献2：Am.J.Clin.Nutr.，2005，81，1026-33

发明内容

此次，本发明人发现了由乳清蛋白的酶解物构成的肽组合物并且发现该肽组合物中的肽对于脑功能的维持、提高、改善等有效。本发明人还发现了高效地制造具有脑功能的维持、提高、改善等功能的肽组合物的方法。本发明是基于这些见解而完成的。

即，本发明的目的在于，提供含有功能性肽的肽组合物及其制造方法。

根据本发明，提供以下的发明。

[1]一种肽组合物，其含有选自由相对于总肽含量为0.00001～0.2质量％的WY、相对于总肽含量为0.000001～0.1质量％的WL、相对于总肽含量为0.000001～0.1质量％的WV和相对于总肽含量为0.000005～0.2质量％的GTWY(序列号1)组成的组中的一种或两种以上的成分(优选为上述四种肽成分)。

[2]如上述[1]所述的肽组合物，其中，进一步含有KPTPEGDLEI(序列号2)和/或GYGGVSLP(序列号3)，相对于总肽含量，KPTPEGDLEI含量为0.000001～0.05质量％，GYGGVSLP含量为0.000005～0.2质量％。

[3]如上述[1]或[2]所述的肽组合物，其中，相对于总肽含量，WY、WL、WV、GTWY、KPTPEGDLEI和GYGGVSLP的总含量为0.00002～0.6质量％。

[4]如上述[1]～[3]中任一项所述的肽组合物，其为溶液形态。

[5]如上述[4]所述的肽组合物，其中，溶液中，WY的浓度为0.15ppm以上，WL的浓度为0.15ppm以上，WV的浓度为0.1ppm以上，GTWY的浓度为0.3ppm以上。

[6]如上述[4]或[5]所述的肽组合物，其中，溶液中的GTWY浓度为3ppm以上。

[7]如上述[4]～[6]中任一项所述的肽组合物，其中，溶液中的KPTPEGDLEI浓度为0.1ppm以上，GYGGVSLP浓度为0.1ppm以上。

[8]如上述[4]～[7]中任一项所述的肽组合物，其中，溶液中的WY浓度、WL浓度、WV浓度、GTWY浓度、KPTPEGDLEI浓度和GYGGVSLP浓度总计为1ppm以上。

[9]如上述[4]～[8]中任一项所述的肽组合物，其中，溶液中的WY浓度、WL浓度、WV浓度和GTWY浓度总计为0.5ppm以上。

[10]如上述[4]～[9]中任一项所述的肽组合物，其中，溶液中的WY浓度、WL浓度和WV浓度总计为0.5ppm以上。

[11]一种肽组合物，其为摄取形态的肽组合物，其含有选自由160～70000μg的WY、100～60000μg的WV、100～60000μg的WL和50～40000μg的GTWY组成的组中的一种或两种以上的成分。

[12]如上述[11]所述的肽组合物，其中，GTWY的含量为100～30000μg。

[13]如上述[11]或[12]所述的肽组合物，其中，进一步含有GYGGVSLP和/或KPTPEGDLEI，GYGGVSLP的含量为50～50000μg，KPTPEGDLEI的含量为160～70000μg。

[14]如上述[1]～[13]中任一项所述的肽组合物，其为食品形态。

[15]如上述[14]所述的组合物，其中，食品为饮料。

[16]一种食品，其配合有上述[1]～[13]中任一项所述的肽组合物。

[17]如上述[16]所述的食品，其为饮料。

[18]如上述[1]～[15]中任一项所述的肽组合物或者上述[16]或[17]所述的食品，其用于脑功能的维持、提高和/或改善。

[19]一种脑功能的维持方法、脑功能的提高方法和脑功能的改善方法，其包括：使人或非人动物摄取有效量的上述[1]～[15]中任一项所述的肽组合物或上述[16]或[17]所述的食品，或者，对人或非人动物给药有效量的上述[1]～[15]中任一项所述的肽组合物或上述[16]或[17]所述的食品。

[20]上述[1]～[15]中任一项所述的肽组合物在制造用于脑功能的维持、提高和/或改善的组合物和食品中的应用。

[21]上述[1]～[15]中任一项所述的肽组合物的制造方法，其包括使含有一种或两种以上的蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)来源的蛋白酶的酶制剂作用于乳清蛋白而得到酶解物的步骤。

[22]如上述[21]所述的制造方法，其中，通过在作用温度45～55℃下保持一定时间后、在作用温度60～75℃下保持一定时间来实施使酶作用于乳清蛋白的步骤。

[23]如上述[21]或[22]所述的制造方法，其中，进一步包括对乳清蛋白的酶解物进行稀释的步骤或者对乳清蛋白的酶解物进行浓缩的步骤。

根据本发明，可提供能够发挥脑功能的维持、提高、改善等功能的6种肽和含有这些肽的一部分或全部的肽组合物。本发明的6种肽和本发明的肽组合物能够利用食品的酶解物，因此，在能够作为对包括人在内的哺乳类安全的功能性材料利用的方面是有利的。

附图说明

图1(A)是示出Y型迷宫试验的概要的图。图1(B)是示出Y型迷宫试验的示意图的图。

图2是示出摄取了乳清分解物的小鼠的自发交替行为变动率(A)和向臂中的总进入数(B)的图。

图3是示出摄取了GTWY的小鼠的自发交替行为变动率(A)和向臂中的总进入数(B)的图。

图4是示出摄取了GYGGVSLP的小鼠的自发交替行为变动率(A)和向臂中的总进入数(B)的图。

图5是示出摄取了KPTPEGDLEI的小鼠的自发交替行为变动率(A)和向臂中的总进入数(B)的图。

图6是示出摄取了WY、WL和WV的小鼠的自发交替行为变动率(A)和向臂中的总进入数(B)的图。

具体实施方式

根据本发明的第一方面，可提供含有选自由WY、WL、WV和GTWY组成的组中的一种、两种、三种或四种成分作为肽的肽组合物(以下有时称为“第一肽组合物”)。该肽组合物中，相对于组合物中的总肽含量，WY含量为0.00001～0.2质量％(优选为0.00002～0.15质量％、更优选为0.05～0.2质量％)，WL含量为0.000001～0.1质量％(优选为0.000002～0.05质量％、更优选为0.025～0.055质量％)，WV含量为0.000001～0.1质量％(优选为0.000002～0.05质量％、更优选为0.015～0.045质量％)，GTWY含量为0.000005～0.2质量％(优选为0.00001～0.15质量％)。

在此，“总肽含量”是指具有氨基氮的化合物中分子量小于10kDa的肽的含量。另外，如后所述，本发明的第一肽组合物可以优选来源于乳清分解物，因此，成为“总肽含量”的计算基础的肽可以为乳清分解物来源的肽。

根据本发明的第一肽组合物的优选方式，可提供一种肽组合物，其为至少含有WY、WL、WV和GTWY作为肽的肽组合物，WY含量、WL含量、WV含量和GTWY含量如上所述。

本发明的第一肽组合物通过直接或者在浓缩或稀释后使包括人在内的哺乳动物摄取，能够发挥脑功能的维持、提高、改善等功能。因此，本发明的第一肽组合物能够用作功能性食品或药品的原料，并且也能够用作功能性食品或药品。

本发明的第一肽组合物可以含有肽以外的成分，总肽含量相对于组合物的全部固体成分质量可以为0.005％以上，优选为0.01％以上，更优选为0.05％以上。需要说明的是，上限可以为100％，这种情况下，组合物中的固体成分全部由肽构成。在此，总肽含量可以通过氨基酸分析、紫外线吸光度测定等常规方法进行测定。

本发明的第一肽组合物中，WY、WL、WV和GTWY的总含量相对于总肽含量可以为0.00005～0.4质量％，优选为0.00002～0.35质量％，更优选为0.2～0.35质量％。这种情况下，本发明的第一肽组合物优选为至少含有WY、WL、WV和GTWY的肽组合物，更优选为含有相对于总肽含量为0.000001～0.2质量％的WY、相对于总肽含量为0.000001～0.1质量％的WL、相对于总肽含量为0.000001～0.05质量％的WV和相对于总肽含量为0.000005～0.2质量％的GTWY的肽组合物。

本发明的第一肽组合物可以在WY、WL、WV和GTWY的基础上进一步含有KPTPEGDLEI和/或GYGGVSLP。KPTPEGDLEI含量相对于总肽含量可以为0.000001～0.05质量％(优选为0.0000015～0.04质量％)，GYGGVSLP含量相对于总肽含量可以为0.000001～0.2质量％(优选为0.000005～0.1质量％)。

即，根据本发明的第一肽组合物的优选方式，可提供一种肽组合物，其为至少含有WY、WL、WV、GTWY、KPTPEGDLEI和GYGGVSLP作为肽的肽组合物，WY含量、WL含量、WV含量、GTWY含量、KPTPEGDLEI含量和GYGGVSLP含量如上所述。

本发明的第一肽组合物中，WY、WL、WV、GTWY、KPTPEGDLEI和GYGGVSLP的总含量相对于总肽含量可以为0.00002～0.6质量％，优选为0.00004～0.5质量％，更优选为0.3～0.5质量％。这种情况下，本发明的第一肽组合物优选为至少含有WY、WL、WV、GTWY、KPTPEGDLEI和GYGGVSLP的肽组合物，更优选为含有相对于总肽含量为0.00001～0.2质量％的WY、相对于总肽含量为0.000001～0.1质量％的WL、相对于总肽含量为0.000001～0.05质量％的WV、相对于总肽含量为0.000005～0.2质量％的GTWY、相对于总肽含量为0.000001～0.05质量％的KPTPEGDLEI、相对于总肽含量为0.000005～0.2质量％的GYGGVSLP的肽组合物。

本发明中，WY、WL、WV、GTWY、KPTPEGDLEI和GYGGVSLP的含量的测定可以利用液相色谱-串联质谱分析法(LC/MS/MS)来实施。本领域技术人员可以容易地进行其条件设定，例如可以使用后述实施例的条件。此时，作为标准肽，当然可以使用LC/MS/MS测定用纯度的肽，例如可以使用SIGMA-ALDRICH公司制造的AQUA肽。

本发明的第一肽组合物可以来源于蛋白质的酶解物，优选来源于乳清蛋白的酶解物(本说明书中，有时简称为“乳清分解物”)。本发明的第一肽组合物包括乳清分解物本身、乳清分解物的浓缩物、乳清分解物的稀释物中的任意者。乳清蛋白的分解物的制造方法如后所述。

本发明的第一肽组合物只要以规定的含有比率含有肽，则其形态没有特别限定，例如可以为固体、半固体、粉末、溶液形态。溶液优选为水溶液。

在本发明的第一肽组合物为溶液形态的情况下，该组合物中的肽的浓度可以如下设定。即，WY的浓度可以为0.15ppm以上(例如0.15～100ppm)，优选为1.5ppm以上(例如1.5～100ppm)，更优选为15ppm以上(例如15～100ppm)。WL的浓度可以为0.15ppm以上(例如0.15～40ppm)，优选为1.5ppm以上(例如1.5～40ppm)，更优选为15ppm以上(例如15～40ppm)。WV的浓度可以为0.1ppm以上(例如0.1～30ppm)，优选为0.5ppm以上(例如0.5～30ppm)，更优选为1ppm以上(例如1～30ppm)。GTWY的浓度可以为0.3ppm以上(例如0.3～150ppm)，优选为3ppm以上(例如3～150ppm)，更优选为30ppm以上(例如30～150ppm)。

在本发明的第一肽组合物为溶液形态的情况下，可以含有KPTPEGDLEI和/或GYGGVSLP，该组合物中的KPTPEGDLEI浓度可以为0.1ppm以上(例如0.1～30ppm)，优选为1.0ppm以上(例如1.0～30ppm)，更优选为10ppm以上(例如10～30ppm)，GYGGVSLP浓度可以为0.1ppm以上(例如0.1～100ppm)，优选为1.0ppm以上(例如1.0～100ppm)，更优选为10ppm以上(例如10～100ppm)。

在本发明的第一肽组合物为溶液形态的情况下，该组合物中的WY浓度、WL浓度、WV浓度、GTWY浓度、KPTPEGDLEI浓度和GYGGVSLP浓度总计可以为1.0ppm以上(例如1.0～500ppm)，优选为2ppm以上(例如2～500ppm)，更优选为10ppm以上(例如10～500ppm)，进一步优选为100ppm以上(例如100～500ppm)。这种情况下，本发明的第一肽组合物优选为至少含有WY、WL、WV、GTWY、KPTPEGDLEI和GYGGVSLP的溶液形态的肽组合物，更优选为含有0.15ppm以上的WY、0.15ppm以上的WL、0.1ppm以上的WV、0.3ppm以上的GTWY、0.1ppm以上的KPTPEGDLEI、0.1ppm以上的GYGGVSLP的溶液形态的肽组合物。

在本发明的第一肽组合物为溶液形态的情况下，该组合物中的WY浓度、WL浓度、WV浓度和GTWY浓度总计可以为0.5ppm以上(例如0.5～300ppm)，优选为2ppm以上(例如2～300ppm)，更优选为10ppm以上(例如10～300ppm)，进一步优选为20ppm以上(例如20～300ppm)，最优选为100ppm以上(例如100～300ppm)。这种情况下，本发明的第一肽组合物优选为至少含有WY、WL、WV和GTWY的溶液形态的肽组合物，更优选为含有0.15ppm以上的WY、0.15ppm以上的WL、0.1ppm以上的WV和0.3ppm以上的GTWY的溶液形态的肽组合物。

在本发明的第一肽组合物为溶液形态的情况下，该组合物中的WY浓度、WL浓度和WV浓度总计可以为0.5ppm以上(例如0.5～200ppm)，优选为2ppm以上(例如2～200ppm)，更优选为5ppm以上(例如5～200ppm)，进一步优选为50ppm以上(例如50～200ppm)，最优选为100ppm以上(例如100～200ppm)。这种情况下，本发明的第一肽组合物优选为至少含有WY、WL和WV的溶液形态的肽组合物，更优选为含有0.15ppm以上的WY、0.15ppm以上的WL和0.1ppm以上的WV的溶液形态的肽组合物。

本发明的第一肽组合物的制造方法只要以规定的含有比率含有规定的肽，则没有特别限制，可以通过使含有蛋白酶的酶制剂作用于原料蛋白质而制造第一肽组合物。

原料蛋白质的酶处理可以如下进行。首先，作为原料的蛋白质可以使用全乳、乳粉、酪蛋白或乳清，优选为乳清。在此，“乳清(ホエイ)”也称为乳清、乳浆或乳清(ホエー)，是指从乳汁中除去乳脂肪成分、酪蛋白等后得到的水溶液。乳清由β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白等构成。本发明中使用的乳清的来源动植物没有限制，优选使用牛乳来源的乳清。

在使用乳清蛋白作为原料的情况下，供于酶反应的乳清蛋白的浓度只要蛋白质能够溶解，则没有限定，从抑制凝胶化或凝聚、节省浓缩的工夫和时间的观点出发，优选为1～30w/v％，更优选为1～20w/v％，进一步优选为5～15w/v％。

只要酶反应可进行，原料蛋白质溶解于任何水系溶剂中均可以，但考虑到作为食品的应用，优选溶解于水或食品添加物级的缓冲液中。为了使反应液的pH不会因酶反应中生成的氨基酸而发生变化，优选使用缓冲液。缓冲液的种类是任意的，考虑之后的应用和风味、味觉、矿物质的量来确定即可，优选能够将反应液的pH维持于4～9、优选维持于5～8、更优选维持于7～8的组成。最优选为磷酸钾缓冲液。缓冲液的浓度只要是可得到缓冲效果的范围则为任意的，考虑到风味、味觉、矿物质的量，可以为0.01～0.5M，优选为0.05～0.2M，更优选为约0.1M。

酶只要是含有蛋白酶的酶剂，则均可以使用，优选为含有中性蛋白酶的酶制剂。酶制剂可以使用例如来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、蜂蜜曲霉等微生物的酶制剂，其中优选米曲霉来源的酶制剂和蜂蜜曲霉来源的酶制剂，更优选为蜂蜜曲霉来源的酶制剂。

在本发明中，可以使用市售的酶制剂，例如可以从天野酶公司、新日本化学工业公司、DSM公司、丹尼斯克公司、诺维信公司、HBI公司等获得酶制剂。酶制剂的添加量是任意的，考虑到适度的水解反应速率和成本，例如可以为0.01～5w/v％，优选为0.05～4w/v％，更优选为0.1～0.5w/v％。

酶反应温度和酶反应时间可以按照原料蛋白质的水解能充分进行、酶解物的品质能得到保证的方式来设定。即，酶反应温度例如可以为30～70℃，优选为40～70℃，更优选为45～65℃。另外，酶反应时间可以为1～12小时，优选为2～10小时，更优选为4～5小时。

酶反应优选在升高温度的同时进行。例如，可以在用4～10小时从30℃升高至75℃的同时进行反应。优选可以在用5～8小时从35℃升高至75℃的同时进行反应，更优选可以在用6～8小时从35℃升高至75℃的同时进行反应。温度升高速度是任意的，优选使在45℃至55℃之间的保持时间长(5～7小时)，之后迅速升高至60℃，然后在60℃至75℃之间长时间(例如1～3小时)保持。最优选的是在50℃下将酶投入，保持5～7小时后，以任意的速度升温，在60～65℃或65～75℃的目标温度下保持1～3小时的方法。

反应时，从反应效率的观点出发，优选对反应液进行搅拌。为了使底物与酶充分接触，液体搅拌速度较快为宜，但过快时反应液有可能飞散，因此，例如可以为100～500rpm，优选为200～400rpm，更优选为约250rpm。

优选在得到所期望的肽之后将反应液交付于使酶反应停止的步骤。在酶反应停止步骤中，可以采用使反应液为高温或添加螯合剂而改变酶的化学结构的方法、或者通过膜处理将酶除去的方法。优选的方法为利用高温的失活处理。该方法可以通过在80～90℃下保持5～30分钟、优选在80～90℃下保持20～30分钟来实施。另外，在后述的浓缩步骤中达到高温的情况下，可以兼作浓缩步骤来进行。

经过酶反应步骤和酶反应停止步骤后的反应液(肽组合物)可以进一步交付于杀菌步骤。作为杀菌步骤，可以列举例如后述的膜处理步骤或高温杀菌步骤。加热杀菌步骤也可以兼作酶反应停止步骤，在简化制造步骤的方面是有利的。

经过酶反应步骤和酶反应停止步骤后的反应液(肽组合物)可以进一步交付于纯化步骤。作为纯化步骤，可以列举例如膜处理步骤，优选的膜处理为超滤。作为超滤的级分分子量，优选为3～100kDa，更优选为5～50kDa，最优选为10kDa。实施纯化步骤时，与未实施的情况相比，在能够改善肽组合物的风味的方面是有利的。另外，纯化步骤也可以兼作酶反应停止步骤和杀菌步骤，在简化制造步骤的方面也是有利的。

从保存和搬运的观点出发，经过酶反应步骤和酶反应停止步骤后的反应液(肽组合物)可以进一步交付于浓缩步骤。浓缩步骤可以选择任意的方法，优选减压浓缩、冷冻干燥和喷雾干燥(spary dry)、利用基于膜处理的浓缩(例如使用反渗透膜的方法)的方法，更优选为冷冻干燥和喷雾干燥。从大量且高效地实施浓缩的观点出发，特别优选喷雾干燥。另外，为了作为饮食品(特别是饮料)提供，经过酶反应步骤和酶反应停止步骤后的反应液(肽组合物)可以利用溶剂进行稀释。对所使用的溶剂没有限定，优选水系溶剂，可以列举例如水、含有糖分的水溶液、含有糖分和赋予酸味的物质的水溶液、任意的饮料液。

根据本发明的第一方面的优选方式，将乳清蛋白(更优选恒天然公司的WPC472)以达到10％的浓度的方式溶解于0.1M磷酸钾缓冲液中(pH7.0)，以达到0.2％的方式添加天野酶公司制造的蛋白酶P“Amano”3SD，以250rpm进行搅拌的同时在50℃下保持5小时，然后使温度升高，达到60℃后保持3小时，由此，能够制造本发明的第一肽组合物。

根据本发明的第二方面，可提供含有选自由WY、WL、WV和GTWY组成的组中的特定量的一种、两种、三种或四种肽作为肽的摄取形态的肽组合物(以下有时称为“第二肽组合物”)。第二肽组合物中，该组合物中的肽的含量可以如下设定。

WY：160～70000μg(优选4000～60000μg)

WV：100～60000μg(优选160～55000μg)

WL：100～60000μg(优选160～55000μg)

GTWY：50～40000μg(优选100～30000μg)

本发明的第二肽组合物除了含有选自由WY、WV、WL和GTWY组成的组中的一种或两种以上的肽以外，还可以进一步含有GYGGVSLP和/或KPTPEGDLEI。GYGGVSLP的含量可以为50～50000μg(优选为160～40000μg)，KPTPEGDLEI的含量可以为160～70000μg(优选为270～60000μg)。

本发明的第二肽组合物的制造方法只要以规定的含量含有规定的肽，则没有特别限制，可以与第一肽组合物同样地进行制造。即，可以通过使含有蛋白酶的酶制剂作用于全乳、乳粉、酪蛋白或乳清等原料蛋白质，并根据情况按照以规定的含量含有规定的肽的方式进行浓缩或稀释来制造。酶反应的详细情况可以参考第一肽组合物的制造方法的记载。

本发明的第二肽组合物为摄取形态，因此，可以直接使包括人在内的哺乳动物进行摄取，能够发挥脑功能的维持、提高、改善等功能。因此，本发明的第二肽组合物能够用作功能性食品、药品。

如后述实施例所示，乳清蛋白的酶解物以及WY、WL、WV、GTWY、KPTPEGDLEI和GYGGVSLP(以下有时称为“本发明的6种肽”)具有脑功能的维持、提高和改善作用。因此，本发明的第一肽组合物和第二肽组合物以及本发明的6种肽的一部分或全部能够作为用于脑功能的维持、提高和/或改善的组合物的有效成分使用，并且能够用于脑功能的维持方法、脑功能的提高方法和脑功能的改善方法。另外，第一肽组合物和第二肽组合物以及本发明的6种肽的一部分或全部能够作为脑功能的维持剂、脑功能的提高剂和脑功能的改善剂的有效成分使用。本发明中，“脑功能”以包含记忆学习功能和认知功能的含义使用。

即，根据本发明，可提供一种脑功能的维持方法、脑功能的提高方法和脑功能的改善方法，其包括使人或非人动物摄取有效量的本发明的第一肽组合物、第二肽组合物或本发明的6种肽的一部分或全部、或者对人或非人动物给药有效量的本发明的第一肽组合物、第二肽组合物或本发明的6种肽的一部分或全部。在实施本发明的这些方法的情况下，可以通过对需要其的包括人在内的哺乳类给药有效量的本发明的组合物或本发明的肽而实施。

另外，根据本发明，可提供本发明的第一肽组合物、第二肽组合物或本发明的6种肽的一部分或全部在制造用于脑功能的维持、提高和/或改善的组合物和食品中的应用。此外，根据本发明，可提供本发明的第一肽组合物、第二肽组合物或本发明的6种肽的一部分或全部在制造脑功能的维持剂、脑功能的提高剂和脑功能的改善剂中的应用。此外，根据本发明，还可提供用于脑功能的维持、提高和/或改善的本发明的第一肽组合物、第二肽组合物和本发明的6种肽的一部分或全部。

本发明中，“记忆学习功能的维持”包括例如抑制老年人群等中伴随年龄增加而产生的记忆力、学习能力的降低等。另外，“记忆学习功能的提高”包括例如瞬时记忆学习功能的提高、促进中长期记忆的巩固、进而促进脑的发育等。此外，“记忆学习功能的改善”包括例如因年龄增加以外的因素而暂时降低的功能或有降低迹象的功能的恢复等。

本发明中，“认知功能的维持”包括例如预防理解、判断、逻辑等智力功能、即认知能力的降低等。另外，“认知功能的提高”包括例如使认知能力与现状相比提高等。此外，“认知功能的改善”包括例如使暂时降低的认知能力或有降低迹象的症状恢复等。

虽然不受限于以下的理论，但认为本发明的第一肽组合物和第二肽组合物具有脑功能的维持、提高和改善作用的原因在于，这些组合物中含有的肽通过促进神经递质的产生等而增强脑的构造(仕組み)，结果带来了脑功能的维持、提高和改善。

本发明中的本发明的第一肽组合物和第二肽组合物以及本发明的6种肽的应用可以是在人和非人动物中的应用，可以指治疗性应用和非治疗性应用中的任意应用。本说明书中，“非治疗性”是指不包括对人进行手术、治疗或诊断的行为(即，针对人的医疗行为)的含义，具体而言，是指不包括医师或接受医师指示者对人进行手术、治疗或诊断的方法的含义。

另外，本发明中，本发明的第一肽组合物和第二肽组合物以及本发明的6种肽的一部分或全部能够作为用于脑功能的改善对其治疗、预防或改善有效的疾病和症状的治疗、预防和/或改善的组合物的有效成分使用，并且能够用于脑功能的改善对其治疗、预防或改善有效的疾病和症状的治疗方法、预防方法和改善方法。另外，第一肽组合物和第二肽组合物以及本发明的6种肽的一部分或全部能够作为脑功能的改善对其治疗、预防或改善有效的疾病和症状的治疗剂、预防剂和改善剂的有效成分使用。

即，根据本发明，可提供一种脑功能的改善对其治疗、预防或改善有效的疾病和症状的治疗方法、预防方法和改善方法，其包括使人或非人动物摄取有效量的本发明的第一肽组合物、第二肽组合物或本发明的6种肽的一部分或全部、或者对人或非人动物给药有效量的本发明的第一肽组合物、第二肽组合物或本发明的6种肽的一部分或全部。在实施本发明的治疗方法、预防方法和改善方法的情况下，可以通过对需要治疗、预防或改善的包括人在内的哺乳类给药有效量的本发明的组合物或本发明的肽而实施。

另外，根据本发明，可提供本发明的第一肽组合物、第二肽组合物或本发明的6种肽的一部分或全部在制造脑功能的改善对其治疗、预防或改善有效的疾病和症状的治疗用组合物、预防用组合物和改善用组合物中的应用。这些组合物优选为药物组合物。此外，根据本发明，可提供本发明的第一肽组合物、第二肽组合物或本发明的6种肽的一部分或全部在制造脑功能的改善对其治疗、预防或改善有效的疾病和症状的治疗剂、预防剂和改善剂中的应用。此外，根据本发明，还可提供用于脑功能的改善对其治疗、预防或改善有效的疾病和症状的治疗、预防和改善的本发明的第一肽组合物、第二肽组合物和本发明的6种肽的一部分或全部。

作为脑功能的改善对其治疗、预防或改善有效的疾病和症状，可以列举记忆学习功能和认知功能的改善对其治疗、预防或改善有效的疾病和症状，更具体而言，可以列举记忆障碍(无法想起记忆、无法记住新事物之类的症状)、定向障碍(时间、场所、人物的失定向)、认知功能障碍(计算能力的降低、判断力降低、失语、失认、失用、执行功能障碍)等。

本发明的用于脑功能的维持、提高和/或改善的组合物、以及本发明的脑功能的维持剂、提高剂和/或改善剂、以及本发明的脑功能的改善对其治疗、预防或改善有效的疾病和症状的治疗用组合物、预防用组合物和改善用组合物、以及本发明的脑功能的改善对其治疗、预防或改善有效的疾病和症状的治疗剂、预防剂和改善剂可以以药品、准药品(医薬部外品)、饮食品、饲料等形态提供，可以按照下述的记载来实施。另外，本发明的脑功能的维持方法、脑功能的提高方法、脑功能的改善方法以及本发明的治疗方法和预防方法可以按照下述的记载来实施。

作为本发明的有效成分的本发明的第一肽组合物和第二肽组合物以及本发明的6种肽的一部分或全部可以对人和非人动物进行经口给药或非经口给药，优选可以进行经口给药。作为经口剂，可以列举颗粒剂、散剂、片剂(包括糖衣片)、丸剂、胶囊剂、糖浆剂、乳剂、悬浊剂。作为非经口剂，可以列举注射剂(例如皮下注射剂、静脉内注射剂、肌肉内注射剂、腹腔内注射剂)、点滴剂、外用剂(例如经鼻给药制剂、经皮制剂、软膏剂)、栓剂(例如直肠栓剂、阴道栓剂)。这些制剂可以利用本领域中通常进行的方法使用药学上可接受的载体进行制剂化。作为药学上可接受的载体，可以列举赋形剂、粘结剂、稀释剂、添加剂、香料、缓冲剂、增稠剂、着色剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、助悬剂、防腐剂等，可以使用例如碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、砂糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂作为载体。

经口剂的制造方法没有特别限定，任意方法均可以使用。可以通过向有效成分中配合赋形剂(例如乳糖、白糖、淀粉、甘露醇)、崩解剂(例如碳酸钙、羧甲基纤维素钙)、粘结剂(例如α化淀粉、阿拉伯胶、羧甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、羟丙基纤维素)、稳定化剂和/或润滑剂(例如滑石、硬脂酸镁、聚乙二醇(polyethylene glycol)6000)等制剂用添加剂并进行压缩成形，接着根据需要出于掩味、肠溶性或持续性的目的利用公知的方法进行包衣来制造。作为包衣剂，可以使用例如乙基纤维素、羟甲基纤维素、聚氧乙二醇(polyoxyethylene glycol)、邻苯二甲酸乙酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和EUDRAGIT(ROHM公司)等。胶囊剂可以直接以有效成分制造、或者在有效成分中配合例如稳定化剂、分散剂、着色剂和/或保存剂等制剂用添加剂来制造。另外，胶囊可以为软胶囊也可以为硬胶囊，胶囊的原材料没有特别限定，可以使用例如明胶、植物性纤维或淀粉等，也可以实施防附着措施。

非经口剂中，注射剂可以通过将有效成分与分散剂(例如Tween80(Atlas Powder公司))、保存剂(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲醇、氯丁醇、苯酚)、等渗剂(例如氯化钠、甘油、山梨糖醇、葡萄糖、转化糖)等制剂用添加剂一同溶解、悬浮或乳化于水性溶剂(例如蒸馏水、生理盐水、林格氏液)或油性溶剂(例如橄榄油、芝麻油、棉籽油、玉米油等植物油、丙二醇)等中来制造。此时，可以根据期望添加增溶剂(例如水杨酸钠、乙酸钠)、稳定剂(例如人血清白蛋白)、舒缓剂(例如苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因)等添加物。

在将本发明的作为有效成分的第一肽组合物和第二肽组合物以及本发明的6种肽的一部分或全部作为食品提供的情况下，可以将它们直接作为食品提供，或者可以使它们含有在食品中来提供。这样提供的食品为含有有效量的第一肽组合物和第二肽组合物以及本发明的6种肽的一部分或全部的食品。本说明书中，“含有有效量的”第一肽组合物和第二肽组合物以及本发明的6种肽的一部分或全部是指：在摄取通常饮食的量的各食品的情况下，可在如后所述的范围内摄取第一肽组合物和第二肽组合物以及本发明的6种肽的一部分或全部的含量。另外，“食品”以包含健康食品、功能性食品、营养辅助食品、补充剂、保健功能食品(例如特定保健用食品、营养功能食品、功能性标示食品)、特殊用途食品(例如幼儿用食品、孕产妇用食品、患者用食品)的含义使用。

由于第一肽组合物和第二肽组合物以及本发明的6种肽的一部分或全部具有脑功能的维持、提高和/或改善作用，因此，可以含有在日常摄取的食品、以及作为补充剂摄取的食品中来提供。这种情况下，第一肽组合物和第二肽组合物以及本发明的6种肽的一部分或全部可以将每1餐所摄取的量以预先规定的单位包装形态来提供。作为每1餐的单位包装形态，可以列举例如利用袋、包、罐、瓶等规定了一定量的形态。为了更好地发挥第一肽组合物和第二肽组合物以及本发明的6种肽的各种作用，可以按照后述本发明的6种肽的每次的摄取量来确定每1餐的摄取量。本发明的食品的与摄取量相关的说明事项可以显示于包装上，或者可以与记载有说明事项的文件等一起提供。

本发明的食品可以附带具有脑功能的维持、提高和/或改善作用的内容的显示。这种情况下，为了易于消费者理解地进行显示，可以在本发明的食品上附带有下述的一部分或全部的显示。需要说明的是，本发明中，“脑功能的维持、提高和/或改善”当然以包含下述显示的含义使用。

·提高记忆力

·增强记忆力

·支持记忆力

·提高认知功能

·增强认知功能

·支持认知功能

·有益于记忆力的维持

·防止疏忽大意

·提高记忆的巩固

·抑制年龄增加所伴随的记忆的降低

“食品”的形态没有特别限定，例如可以为饮料的形态，也可以为半液体或凝胶状的形态。例如使上述酶制剂作用于乳、酸奶、奶酪等乳原材而生成本发明的6种肽的一部分或全部的乳制品也在本发明的食品的范围内。另外，作为补充剂，可以列举通过在本发明的6种肽的一部分或全部的干燥粉末中添加赋形剂、粘结剂等并捏合后进行压片而制造的片剂、或封入胶囊中等而得到的胶囊剂。

另外，本发明的食品中当然可以配合通常的食品的制造中所使用的食品上可接受的添加剂，从本发明的肽组合物的劣化防止和氧化防止的观点出发，可以在本发明的食品中配合可期待这些效果的成分。作为这样的成分，可以列举具有肽的劣化防止作用、抗氧化作用的香料制剂，优选可以使用天然物来源的组合物。

作为本发明中提供的食品，可以例示饭类、面类、面包类和意式面食类等含有碳水化合物的饮食品；饼干或蛋糕等西式点心类、馒头或羊羹等日式点心类、糖果类、口香糖类、酸奶或布丁等冷点心或冰点心等各种点心类；威士忌、波本威士忌、雪碧、利口酒、红酒、果实酒、日本酒、中国酒、烧酒、啤酒、酒精度1％以下的无酒精啤酒、发泡酒、其他杂酒、碳酸酒精饮料等酒精饮料；含果汁饮料、含蔬菜汁饮料、含果汁和蔬菜汁的饮料、清凉饮料水、碳酸饮料、牛奶、豆奶、乳饮料、饮料型酸奶、饮料型果冻、咖啡、可可饮料、茶饮料、营养饮料、运动饮料、矿物质水、近水饮料等无酒精饮料；使用鸡蛋的加工品、海产品类或畜肉(包括肝等内脏)的加工品(包括珍味)等，但并不限定于这些。需要说明的是，矿物质水包含发泡性和非发泡性的矿物质水中的任意的矿物质水。

作为茶饮料，包含发酵茶、半发酵茶和不发酵茶中的任意的茶，可以列举例如红茶、绿茶、大麦茶、玄米茶、煎茶、玉露茶、焙茶、乌龙茶、姜黄茶、普洱茶、南非红灌木茶、玫瑰茶、菊花茶、草本茶(例如薄荷茶、茉莉花茶)。

作为含果汁饮料、含果汁和蔬菜汁的饮料中使用的水果，可以列举例如苹果、柑橘、葡萄、香蕉、梨、桃子、芒果、巴西莓、蓝莓和梅子。另外，作为含蔬菜汁饮料、含果汁和蔬菜汁的饮料中使用的蔬菜，可以列举例如西红柿、胡萝卜、西芹、南瓜、黄瓜和西瓜。

就本发明的药品和食品而言，由于利用来源于人作为食品长年摄取的乳的酶解物，因此，毒性也低，可以对需要其的哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪、猴等)安全地使用。本发明的6种肽的摄取量或给药量可以依赖接受者的性别、年龄和体重、症状、给药时间、剂型、给药途径以及组合的药剂等来确定。将本发明的6种肽对成人(50kg)的每次的摄取量和给药量例示如下，可以由对象分数次进行摄取或给药。

WY：160～4200μg(优选为500～3600μg)

WV：100～3600μg(优选为160～3300μg)

WL：100～3600μg(优选为160～3300μg)

GTWY：50～2400μg(优选为100～1800μg)

GYGGVSLP：50～3000μg(优选为160～2400μg)

KPTPEGDLEI：160～4200μg(优选为270～3600μg)

需要说明的是，由于本发明的第一肽组合物和第二肽组合物包含本发明的6种肽的一部分或全部，因此可以按照各肽的每次的摄取量和给药量来确定第一肽组合物和第二肽组合物的组成和摄取量或给药量。例如，可以按照具有如上所述的各肽的每次的摄取量和给药量的方式来制备单位摄取形态或单位给药形态的第一肽组合物、单位摄取形态或单位给药形态的第二肽组合物。

实施例

实施例1：乳清分解物制造条件的研究

(1)原料蛋白质的选择

将各种乳清蛋白用含有蛋白酶的酶制剂(天野酶公司制造的蛋白酶P“Amano”3SD或Thermoase C100)分别进行酶处理，对生成的脑功能活性肽进行了研究。

具体而言，使各乳清蛋白以达到5w/v％的方式溶解于0.05M磷酸钾缓冲液中，向所得到的溶解液中添加酶制剂，使得各蛋白酶制剂的终浓度为0.125w/v％。使所得到的溶液在pH7.0、50℃下反应4小时后，在90℃下保持20分钟而使酶失活，得到酶处理样品。另外，除了添加酶制剂以外，进行同样的处理，将所得到的样品作为对照样品。

对于所得到的样品，通过目视进行观察，将结果示于下述表1。

[表1]

表1：所研究的乳清蛋白的来源和处理后的物性

另外，将所得到的样品离心分离，对上清进行超滤(10kDa)，将所得到的分析样品适当稀释，在下述分析条件下利用LC/MS/MS进行肽的定量。浓度换算利用将最小浓度设定为0.001ppm的标准曲线法进行。

[表2]

表2:LC/MS/MS分析条件

根据表1和表2的结果，通过酶反应、酶失活等热处理，在一部分乳清蛋白(分离乳清蛋白WP18855)中发生了凝聚(表1)，但除此以外，尽管生成了沉淀也可得到肽，其收率未观察到乳清蛋白的不同所带来的大的差异(肽收率的数据省略)。

因此可知，在本发明的乳清分解物的制造时，几乎可以使用所有的乳清蛋白作为原料。特别是可知，对于所研究的两种酶制剂，沉淀少的恒天然公司制造的WPC472综合而言是适合的。

(2)酶制剂的研究

在含有5w/v％乳清蛋白(恒天然公司制造的WPC472)的0.05M的磷酸钾缓冲液中添加表3所示的各种酶制剂，使蛋白酶制剂的终浓度为0.125w/v％。在pH7.0、50℃下反应4小时后，在90℃下保持20分钟而使酶失活，得到酶处理样品。需要说明的是，除了添加酶制剂以外，进行同样的处理，将所得到的样品作为对照样品。

将对所得到的样品进行超滤而得到的分析样品适当稀释，利用LC/MS/MS进行肽的定量。此时，对于市售的乳清水解物，也使其以达到10w/v％的浓度的方式溶解于水中，与上述样品进行同样的处理，并进行肽的定量。需要说明的是，分析条件按照实施例1所示的条件。将其结果示于下述表4。数值以将利用酶制剂号35(蜂蜜曲霉来源蛋白酶制剂)得到的反应液中的WY浓度设为100时的比来表示(表示的值＝实测浓度(ppm)/利用酶制剂号35得到的反应液中的WY浓度(ppm)×100)。

[表3]

表3：所使用的各种酶制剂

表3：所使用的各种酶制剂(续)

[表4]

表4：酶处理样品中的肽浓度(实测浓度(ppm)/利用酶制剂号35得到的WY浓度 (ppm)×100)

表4：酶处理样品中的肽浓度(实测浓度(ppm)/利用酶制剂号35得到的WY浓度 (ppm)×100)(续)

市售乳清水解物(1)：恒天然公司WPH817

市售乳清水解物(2)：恒天然公司WPH917

市售乳清水解物(3)：恒天然公司WPH7050

由表4的结果可知，通过使用含有米曲霉、枯草芽孢杆菌或蜂蜜曲霉来源的蛋白酶的酶制剂，具有脑功能活性肽的收率增多的倾向，特别是通过使用含有蜂蜜曲霉来源的蛋白酶的酶制剂，GTWY等的收率增多。另外可知，本发明的乳清分解物与市售的乳清水解物相比，本发明的6种肽浓度极高。

(3)酶反应条件的研究

本发明人在含有5～20w/v％各种乳清蛋白的0.05～0.2M浓度的缓冲液中添加蛋白酶P“Amano”3SD，使蛋白酶制剂的终浓度为0.1～0.5w/v％，使所得到的溶液在pH7.0、50℃下反应1～8小时，然后以80℃、30分钟使酶失活，在此条件下，确认到生成了所期望的肽(数据省略)。另外，在以250rpm进行搅拌的情况下，也确认到反应适当地进行(数据省略)。进而，还确认到下述方法是优选的：在含有10w/v％乳清蛋白(恒天然公司制造的WPC472)的0.1M磷酸钾缓冲液中添加蛋白酶P“Amano”3SD，使蛋白酶制剂的终浓度为0.2w/v％，将所得到的溶液在pH7.0、50℃下维持5～8小时，然后在80℃下维持30分钟，使酶失活(数据省略)。

因此，为了进一步增加乳清分解物中含有的特定肽的收率，对酶反应条件进一步进行了研究。具体而言，在含有10w/v％乳清蛋白(恒天然公司制造的WPC472)的0.1M磷酸钾缓冲液中添加蛋白酶P“Amano”3SD，使蛋白酶制剂的终浓度为0.2w/v％，对反应条件进行了研究。

对于在50℃下反应6～8小时的情况下所得到的乳清分解物的肽浓度，以将在50℃下反应6小时时的WY浓度设为100时的比(表示的值＝实测浓度(ppm)/在50℃下反应6小时时的WY浓度(ppm)×100)的形式示于下述表5。

[表5]

表5：酶反应条件的研究(1)

*：实测浓度(ppm)/在50℃下反应6小时时的WY浓度(ppm)×100

由表5的结果可知，到反应时间为7小时为止肽浓度有增加的倾向，但是在8小时时肽浓度降低。

接着，对于在反应第6小时以后改变温度并维持的情况下的结果，以将在50℃下反应5小时时的WY浓度设为100时的比(表示的值＝实测浓度(ppm)/在50℃下反应5小时时的WY浓度(ppm)×100)的形式示于下述表6。

[表6]

表6：酶反应条件的研究(2)

*：实测浓度(ppm)/在50℃下反应6小时时的WY浓度(ppm)×100

由表6的结果可知，通过在50℃下进行一定时间反应后，在60℃下进一步反应一定时间，然后在80℃下使酶失活，所得到的肽的量增加。特别是可知，对于WY，通过在50℃下反应5小时后在60℃下反应1～3小时，肽浓度增加。进而可知，在使反应温度从50℃向60℃升温的情况下，即使在总反应时间为8小时的情况下，肽的合计量也得以维持。

实施例2：肽分解物的制造

在含有10w/v％乳清蛋白(恒天然公司制造的WPC472)的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中添加蛋白酶P“Amano”3SD，使蛋白酶制剂的终浓度为0.2w/v％，在50℃下维持5小时，使其反应。然后，在80℃下维持30分钟，使酶失活。

使用EYELA公司制造的冷冻干燥机FDU-2100对所得到的含有乳清分解物的反应液和该乳清分解物进行使装有反应液的烧瓶外侧为室温的冷冻干燥。将粉末化的乳清分解物粉末中的肽浓度示于下述表7和8。

本试验中，以乳清500g作为原料，得到了约2g粉末化的肽分解物，认为该肽分解物的绝大部分为肽。

[表7]

表7：反应液中的本发明的乳清分解物的肽浓度(ppm)

[表8]

表8：粉末中的本发明的乳清分解物的肽浓度(ppm)

需要说明的是，粉末化的乳清分解物中的肽的含有比率视为与表7中记载的含有乳清分解物的水溶液(反应液中的肽含有比率)相等。

实施例3：乳清分解物摄取对记忆学习功能/认知功能的效果

(1)记忆学习功能/认知功能的评价方法(Y型迷宫试验)

小鼠本来具有选择与之前刚选择的路线不同的路线的性质。因此，在将小鼠放入具有宽度、长度等相等的三条臂的Y型迷宫中的情况下，通常会进入与之前刚进入过的臂不同的臂。Y型迷宫试验是利用小鼠的该性质进行短期记忆的评价的试验。

在本试验中，使用每条臂的长度为25cm、壁的高度为20cm、地板的宽度为5cm的三条臂各自以120度的角度连接而成的Y型迷宫作为用于Y型迷宫试验的装置。

将小鼠放到Y型迷宫的任意一条臂的前端，使其自由地探索8分钟，记录此时其移动的臂的顺序。在此，将连续3次选择不同的臂进入的情况称为自发交替行为。对时间内向臂中的总进入数和自发交替行为数进行计数，使用下述式(1)算出自发交替行为变动率(％)。

[数1]

自发交替行为变动率越高，表明越可保持短期记忆。

(2)乳清分解物摄取的效果

对6周龄雄性CD-1小鼠(由日本SLC公司获得)以0.3～3mg/kg体重的量向胃内强制经口给药实施例2中得到的乳清分解物粉末，40分钟后，为了诱发记忆障碍，腹腔内给药0.80mg/kg体重的东莨菪碱盐酸盐(SIGMA公司制造)。东莨菪碱腹腔内给药20分钟后，实施Y型迷宫试验(图1)。需要说明的是，各组以10只进行实验，求出平均值、标准误差。将其结果示于图2。

由图2的结果可知，未观察到乳清分解物给药所带来的总进入数的变动，即，乳清分解物给药对行为量没有造成影响(图2B)，但乳清分解物给药依赖于摄取量地使自发交替行为变动率提高(图2A)。这意味着利用乳清分解物可保持短期记忆。

实施例4：合成肽摄取对记忆学习功能/认知功能的效果

对6周龄雄性CD-1小鼠(由日本SLC公司获得)以0.1～3μmol/kg体重的量向胃内强制经口给药6种合成肽：GTWY、GYGGVSLP、KPTPEGDLEI、WL、WV、WY，40分后，为了诱发记忆障碍，腹腔内给药0.80mg/kg的东莨菪碱盐酸盐。东莨菪碱腹腔内给药20分钟后，实施实施例3(1)中记载的Y型迷宫试验。需要说明的是，各组以10只进行实验，求出平均值、标准误差。将其结果示于图3～7。

由图3～6的结果可知，摄取了GTWY的小鼠在摄取量为0.1～1μmol/kg体重的范围内与非摄取组相比自发交替行为变动率提高，保持了短期记忆。同样，可知：在GYGGVSLP、KPTPEGDLEI的情况下，也是在摄取量为0.1～1μmol/kg体重的范围内与非摄取组相比自发交替行为变动率提高，保持了短期记忆。特别是，观察到由GTWY、GYGGVSLP、KPTPEGDLEI引起的自发交替行为变动率的升高有依赖于肽摄取量的倾向。

由图7的结果可知，摄取了WL、WV、WY的小鼠在摄取量为0.3～3μmol/kg体重的范围内与非摄取组相比自发交替行为变动率以依赖于摄取量的方式提高，保持了短期记忆。

实施例5：添加有乳清分解物的饮料的评价

已知作为高甜度甜味剂的安赛蜜和三氯蔗糖与蔗糖等相比可感觉到甜味的回味。因此，针对乳清分解物对源自高甜度甜味剂的甜味的回味的效果进行了研究。

(1)样品饮料的制备

在离子交换水中以达到表9所示的含量的方式添加作为高甜度甜味剂的安赛蜜(MC食品科技公司制造)或三氯蔗糖(三荣源F.F.I.公司制造)，并在所得到的水溶液中以达到表9所示的含量的方式添加实施例2中得到的乳清分解物粉末，将所得物作为样品饮料。

(2)感官评价

将各样品饮料供于感官评价。具体而言，关于能否改善源自高甜度甜味剂的甜味的回味，按照以下的评价基准进行评价。

4：甜味极为清爽

3：甜味清爽

2：甜味略微清爽

1：甜味与无添加品相同

感官评价由经过训练的6名评审员来实施。各评审员以单位分值为0.5分的分数进行评价，计算6名评审员的评价分数的平均值，将2.5以上判断为有效果。

(3)评价结果

将感官评价的结果示于表9。

[表9]

表9：感官评价的结果

根据表9的结果，在安赛蜜K水溶液、三氯蔗糖水溶液中的任意水溶液中，都是在使乳清分解物浓度为1w/v％时甜味的回味最得到改善。但是，本样品饮料不含有高甜度甜味剂和乳清分解物以外的原料，因而在该浓度时也感觉到乳清分解物来源的苦味/涩味，因此，就综合性呈味而言，浓度低于1w/v％的样品饮料是优良的。

实施例7：风味得到改善的乳清分解物的制备

在本实施例中，对通过超滤膜处理所带来的肽组合物的风味改善进行了研究。

(1)样品饮料的制备

制备将实施例2中得到的乳清分解物粉末1g溶解于500mL的蒸馏水中而成的样品饮料(样品水1)和将样品水1利用超滤膜(级分分子量10kDa、默克密理博公司制造)进行过滤处理而得到的样品饮料(样品水2)，供于感官评价。

(2)感官评价

将各样品饮料以常温供于感官评价。具体而言，对于能否改善澄清度、涩味、苦味、异味和嗜好度这5个评价项目，分别以5个阶段进行评价。关于澄清度，将澄清度最低的情况作为1，将最高的情况作为5。关于涩味，将涩味最弱的情况作为1，将最强的情况作为5。关于苦味，将苦味最弱的情况作为1，将最强的情况作为5。关于异味，将异味最弱的情况作为1，将最强的情况作为5。关于嗜好度，将嗜好度最低的情况作为1，将最高的情况作为5。

感官评价由经过训练的4名评审员来实施。各评审员以单位分值为1的分数进行评价，计算4名评审员的评价分数的平均值。

(3)评价结果

将感官评价的结果示于表10。

[表10]

表10:感官评价的结果

由表10的结果确认了，通过实施过滤膜处理，乳清分解物溶液的澄清度、涩味、苦味、异味和嗜好度能够得到改善。即，表明了：通过过滤膜处理，能够制备风味得到改善的肽组合物。

实施例8：保存稳定性得到改善的含乳清分解物的饮料的制备

在本实施例中，对含乳清分解物的饮料的保存稳定性进行了研究。

(1)样品饮料的制备和保存

在市售的运动饮料中以浓度达到2mg/mL的方式添加实施例2中得到的乳清分解物粉末，进一步以达到表11所示的含量的方式添加混合作为具有肽的劣化防止作用的香料组合物的各种天然物来源组合物，将所得物作为样品饮料。将制备的各样品饮料填充至容量195mL的PET瓶中，保存1周后供于评价。保存条件设定为表11所示的温度和照度的条件(保存条件A和保存条件B)。需要说明的是，表中的照射是指保存中的照度为3000勒克斯(LX)。

[表11]

表11：所添加的天然物来源组合物和保存条件

(2)肽的含量评价

按照实施例1中记载的方法测定上述(1)中制备并保存的样品饮料中的肽浓度。将关于保存条件A的样品的测定结果示于表12，将关于保存条件B的样品的测定结果示于表13。肽浓度以将样品饮料1(未添加香料组合物、在暗处保存)的值设为100时的比(表示的值＝实测浓度(ppm)/样品饮料1的各肽浓度(ppm)×100)的形式表示。

[表12]

表12：由光所致的肽的损耗

[表13]

表13：由热压致的肽的损耗

由表12的结果确认了，在含有香料组合物的饮料(样品饮料3、4、5、6、7)中，由光所致的肽的损耗得到抑制。另外，由表13的结果确认了，在含有香料组合物的饮料(样品饮料3、4、5、6、7)中，由热所致的肽的损耗得到抑制。即，表明了：通过香料组合物的添加，能够制备保存稳定性得到改善的含乳清分解物的饮料。

序列表

<110>

麒麟株式会社（Kirin Kabushiki Kaisha）

<120> 肽组合物及其制造方法（A peptide composition and a preparationmethod thereof）

<130> 161076PX

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 1

Gly Thr Trp Tyr

1

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 2

Lys Pro Thr Pro Glu Gly Asp Leu Glu Ile

1 5 10

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 3

Gly Tyr Gly Gly Val Ser Leu Pro

1 5

Claims

1.一种肽组合物，其含有选自由相对于总肽含量为0.00001～0.2质量％的WY、相对于总肽含量为0.000001～0.1质量％的WL、相对于总肽含量为0.000001～0.1质量％的WV和相对于总肽含量为0.000005～0.2质量％的GTWY(序列号1)组成的组中的一种或两种以上的成分，进一步含有KPTPEGDLEI(序列号2)和/或GYGGVSLP(序列号3)，KPTPEGDLEI含量相对于总肽含量为0.000001～0.05质量％，GYGGVSLP含量相对于总肽含量为0.000005～0.2质量％。

2.如权利要求1所述的肽组合物，其中，相对于总肽含量，WY、WL、WV、GTWY、KPTPEGDLEI和GYGGVSLP的总含量为0.00002～0.6质量％。

3.如权利要求1所述的肽组合物，其为溶液形态。

4.如权利要求3所述的肽组合物，其中，溶液中，WY的浓度为0.15ppm以上，WL的浓度为0.15ppm以上，WV的浓度为0.1ppm以上，GTWY的浓度为0.3ppm以上。

5.如权利要求3所述的肽组合物，其中，溶液中的GTWY浓度为3ppm以上。

6.如权利要求3所述的肽组合物，其中，溶液中的KPTPEGDLEI浓度为0.1ppm以上，GYGGVSLP浓度为0.1ppm以上。

7.如权利要求3所述的肽组合物，其中，溶液中的WY浓度、WL浓度、WV浓度、GTWY浓度、KPTPEGDLEI浓度和GYGGVSLP浓度总计为1ppm以上。

8.如权利要求3所述的肽组合物，其中，溶液中的WY浓度、WL浓度、WV浓度和GTWY浓度总计为0.5ppm以上。

9.如权利要求3所述的肽组合物，其中，溶液中的WY浓度、WL浓度和WV浓度总计为0.5ppm以上。

10.一种肽组合物，其为摄取形态的肽组合物，其含有选自由160～70000μg的WY、100～6000μg的WV、100～6000μg的WL和50～40000μg的GTWY组成的组中的一种或两种以上的成分，进一步含有GYGGVSLP和/或KPTPEGDLEI，GYGGVSLP的含量为50～50000μg，KPTPEGDLEI的含量为160～70000μg。

11.如权利要求10所述的肽组合物，其中，GTWY的含量为100～30000μg。

12.如权利要求1～11中任一项所述的肽组合物，其为食品形态。

13.如权利要求12所述的肽组合物，其中，食品为饮料。

14.一种保健食品，其配合有权利要求1～11中任一项所述的肽组合物。

15.如权利要求14所述的保健食品，其为饮料。

16.权利要求1～13中任一项所述的肽组合物在制造用于脑功能的维持、提高和/或改善的组合物中的应用，所述脑功能是指记忆学习功能和/或认知功能。

17.权利要求1～13中任一项所述的肽组合物的制造方法，其包括使含有一种或两种以上的蜂蜜曲霉来源的蛋白酶的酶制剂作用于乳清蛋白而得到酶解物的步骤。

18.如权利要求17所述的制造方法，其中，通过在作用温度45～55℃下保持一定时间后、在作用温度60～75℃下保持一定时间来实施使酶作用于乳清蛋白的步骤。

19.如权利要求17或18所述的制造方法，其中，进一步包括对乳清蛋白的酶解物进行稀释的步骤或者对乳清蛋白的酶解物进行浓缩的步骤。