JP7179908B2 - ペプチド組成物およびその製造方法 - Google Patents

Description

本発明はペプチド組成物およびその製造方法に関する。

脳機能の維持、向上、改善は、若年層から老年層まで幅広い世代で求められている。記憶力や学習能力の維持、向上、改善は、受験、資格試験等に備えて勉強する学生や社会人だけではなく、日々の仕事や生活を行う上でも重要である。また、老年層では記憶力の低下、認知機能の低下は生活の質に関わるため、脳機能の低下を予防し、これを維持、向上、改善させることが求められている。

さらに、老年期においては、老化に伴う脳機能の低下に起因する精神障害の増加が高齢者の増加とともに社会問題となっている。脳機能の低下に起因する疾患としては、アルツハイマー病に代表される認知症だけではなく、うつ病、せん妄等の精神疾患も脳機能の低下が原因であることが報告されている（非特許文献１）。

脳機能の解明が進むにつれ、脳機能を増強させる物質の探索が盛んに行われている。特に、副作用を心配することがないことから、食品成分中に脳機能を向上させる物質が含まれていないか解析が行われている。例えば、脳内トリプトファン濃度を上昇させセロトニン濃度上昇を惹起させ脳機能に影響を与えることを目的に、ホエイタンパクを投与し血漿中トリプトファン濃度を上昇させる試みが記載されている（非特許文献２）。

特許文献１には、脳内トリプトファン濃度上昇に寄与しうる組成物として、トリプトファン含量を中性大型アミノ酸含量で除した値が特定の値より大きいものが記載され、特許文献２にはリゾチーム由来の本組成物を数１０ｍｇ含む飲料を１日１本摂ることで効果が期待できることが記載されている。特許文献３にはトリプトファン含量を中性大型アミノ酸含量で除した値が特定の値より大きい組成物は、α－ラクトグロブリン等を好ましくは酸性プロテアーゼで加水分解して得ることができる旨記載されている。

特表２０１１－５２３５４７号公報 特表２０１５－５２４２６５号公報 特許４６４２３２１号公報

田中稔久、武田雅俊（2011）日本臨床、増刊号、５２～５６頁 Am.J.Clin.Nutr.,2005,81,1026-33

今般、本発明者らは、ホエイタンパク質の酵素分解物からなるペプチド組成物と該ペプチド組成物中のペプチドが脳機能の維持、向上、改善等に有効であることを見出した。本発明者らはまた、脳機能の維持、向上、改善等の機能を有するペプチド組成物を効率的に製造する方法を見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。

すなわち、本発明は機能性ペプチドを含有するペプチド組成物とその製造方法を提供することを目的とする。

本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］全ペプチド含有量に対して０．００００１～０．２質量％のＷＹ、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．１質量％のＷＬ、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．１質量％のＷＶおよび全ペプチド含有量に対して０．０００００５～０．２質量％のＧＴＷＹ（配列番号１）からなる群から選択される１種または２種以上の成分（好ましくは上記４種のペプチド成分）を含んでなるペプチド組成物。
［２］ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ（配列番号２）および／またはＧＹＧＧＶＳＬＰ（配列番号３）をさらに含んでなり、全ペプチド含有量に対してＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ含有量が０．０００００１～０．０５質量％であり、ＧＹＧＧＶＳＬＰ含有量が０．０００００５～０．２質量％である、上記［１］に記載のペプチド組成物。
［３］全ペプチド含有量に対して、ＷＹ、ＷＬ、ＷＶ、ＧＴＷＹ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩおよびＧＹＧＧＶＳＬＰの合計含有量が０．００００２～０．６質量％である、上記［１］または［２］に記載のペプチド組成物。
［４］溶液の形態である、上記［１］～［３］のいずれかに記載のペプチド組成物。
［５］溶液中、ＷＹの濃度が０．１５ｐｐｍ以上であり、ＷＬの濃度が０．１５ｐｐｍ以上であり、ＷＶの濃度が０．１ｐｐｍ以上であり、ＧＴＷＹの濃度が０．３ｐｐｍ以上である、上記［４］に記載のペプチド組成物。
［６］溶液中のＧＴＷＹ濃度が３ｐｐｍ以上である、上記［４］または［５］に記載のペプチド組成物。
［７］溶液中のＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ濃度が０．１ｐｐｍ以上であり、ＧＹＧＧＶＳＬＰ濃度が０．１ｐｐｍ以上である、上記［４］～［６］のいずれかに記載のペプチド組成物。
［８］溶液中のＷＹ濃度、ＷＬ濃度、ＷＶ濃度、ＧＴＷＹ濃度、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ濃度およびＧＹＧＧＶＳＬＰ濃度の合計が１ｐｐｍ以上である、上記［４］～［７］のいずれかに記載のペプチド組成物。
［９］溶液中のＷＹ濃度、ＷＬ濃度、ＷＶ濃度およびＧＴＷＹ濃度の合計が０．５ｐｐｍ以上である、上記［４］～［８］のいずれかに記載のペプチド組成物。
［１０］溶液中のＷＹ濃度、ＷＬ濃度およびＷＶ濃度の合計が０．５ｐｐｍ以上である、上記請求項［４］～［９］のいずれかに記載のペプチド組成物。
［１１］摂取形態のペプチド組成物であって、１６０～７００００μｇのＷＹ、１００～６００００μｇのＷＶ、１００～６００００μｇのＷＬおよび５０～４００００μｇのＧＴＷＹからなる群から選択される１種または２種以上の成分を含んでなるペプチド組成物。
［１２］ＧＴＷＹの含有量が１００～３００００μｇである、上記［１１］に記載のペプチド組成物。
［１３］ＧＹＧＧＶＳＬＰおよび／またはＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩをさらに含んでなり、ＧＹＧＧＶＳＬＰの含有量が５０～５００００μｇであり、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩの含有量が１６０～７００００μｇである、上記［１１］または［１２］に記載のペプチド組成物。
［１４］食品の形態である、上記［１］～［１３］のいずれかに記載のペプチド組成物。
［１５］食品が飲料である、上記［１４］に記載の組成物。
［１６］上記［１］～［１３］のいずれかに記載のペプチド組成物が配合されてなる、食品。
［１７］飲料である、上記［１６］に記載の食品。
［１８］脳機能の維持、向上および／または改善のための、上記［１］～［１５］のいずれかに記載のペプチド組成物または上記［１６］または［１７］に記載の食品。
［１９］有効量の上記［１］～［１５］のいずれかに記載のペプチド組成物または上記［１６］または［１７］に記載の食品を、ヒトまたは非ヒト動物に摂取させるか、あるいは投与することを含んでなる、脳機能の維持方法、脳機能の向上方法および脳機能の改善方法。
［２０］脳機能の維持、向上および／または改善のための組成物および食品の製造のための、上記［１］～［１５］のいずれかに記載のペプチド組成物の使用。
［２１］ホエイタンパク質に１種または２種以上のアスペルギルス・メレウス由来のタンパク質分解酵素を含む酵素製剤を作用させて酵素分解物を得る工程を含む、上記［１］～［１５］のいずれかに記載のペプチド組成物の製造方法。
［２２］ホエイタンパク質に酵素を作用させる工程を、作用温度４５～５５℃で一定時間保持した後に、作用温度６０～７５℃で一定時間保持することにより実施する、上記［２１］に記載の製造方法。
［２３］ホエイタンパク質の酵素分解物を希釈する工程またはホエイタンパク質の酵素分解物を濃縮する工程をさらに含む、上記［２１］または［２２］に記載の製造方法。

本発明によれば、脳機能の維持、向上、改善等の機能を発揮することができる６種のペプチドおよびこれらの一部または全部を含有するペプチド組成物が提供される。本発明の６種のペプチドと本発明のペプチド組成物は食品の酵素分解物を利用することができることから、ヒトを含む哺乳類に安全な機能性素材として利用できる点で有利である。

（Ａ）はＹ字迷路試験の概要を示した図である。（Ｂ）はＹ字迷路試験の模式図を示した図である。 ホエイ分解物を摂取させたマウスの自発的交換行動変動率（Ａ）とアームへの総進入数（Ｂ）を示した図である。 ＧＴＷＹを摂取させたマウスの自発的交換行動変動率（Ａ）とアームへの総進入数（Ｂ）を示した図である。 ＧＹＧＧＶＳＬＰを摂取させたマウスの自発的交換行動変動率（Ａ）とアームへの総進入数（Ｂ）を示した図である。 ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩを摂取させたマウスの自発的交換行動変動率（Ａ）とアームへの総進入数（Ｂ）を示した図である。 ＷＹ、ＷＬおよびＷＶを摂取させたマウスの自発的交換行動変動率（Ａ）とアームへの総進入数（Ｂ）を示した図である。

発明の具体的説明

本発明の第一の面によれば、ペプチドとしてＷＹ、ＷＬ、ＷＶおよびＧＴＷＹからなる群から選択される１種、２種、３種または４種の成分を含んでなるペプチド組成物（以下「第一のペプチド組成物」ということがある）が提供される。このペプチド組成物においては、組成物中の全ペプチド含有量に対して、ＷＹ含有量が０．００００１～０．２質量％（好ましくは、０．００００２～０．１５質量％、より好ましくは０．０５～０．２質量％）であり、ＷＬ含有量が０．０００００１～０．１質量％（好ましくは、０．０００００２～０．０５質量％、より好ましくは０．０２５～０．０５５質量％）であり、ＷＶ含有量が０．０００００１～０．１質量％（好ましくは、０．０００００２～０．０５質量％、より好ましくは０．０１５～０．０４５質量％）であり、ＧＴＷＹ含有量が０．０００００５～０．２質量％（好ましくは、０．００００１～０．１５質量％）である。

ここで「全ペプチド含有量」とは、アミノ態窒素を有する化合物のうち、分子量が１０ｋＤａより小さいペプチドの含有量を意味する。また、後述のように本発明の第一のペプチド組成物は好ましくはホエイ分解物由来とすることができることから、「全ペプチド含有量」の算出のもとになるペプチドはホエイ分解物由来のものとすることができる。

本発明の第一のペプチド組成物の好ましい態様によれば、ペプチドとして少なくともＷＹ、ＷＬ、ＷＶおよびＧＴＷＹを含んでなるペプチド組成物であってＷＹ含有量、ＷＬ含有量、ＷＶ含有量およびＧＴＷＹ含有量が上記の通りであるペプチド組成物が提供される。

本発明の第一のペプチド組成物はそのままあるいは濃縮または希釈してヒトを含む哺乳動物に摂取させることで脳機能の維持、向上、改善等の機能を発揮することができる。従って、本発明の第一のペプチド組成物は機能性食品や医薬品の原料として用いることができるとともに、機能性食品や医薬品として用いることもできる。

本発明の第一のペプチド組成物は、ペプチド以外の成分を含んでもよいが、組成物の全固形分質量に対する全ペプチド含有量は０．００５％以上とすることができ、好ましくは０．０１％以上であり、より好ましくは０．０５％以上である。なお、上限は１００％とすることができ、この場合は組成物中の固形分はすべてペプチドにより構成されることになる。ここで、全ペプチド含有量はアミノ酸分析、紫外部吸光度測など常法により測定することができる。

本発明の第一のペプチド組成物においては、全ペプチド含有量に対するＷＹ、ＷＬ、ＷＶおよびＧＴＷＹの合計含有量は０．００００５～０．４質量％とすることができ、好ましくは０．００００２～０．３５質量％、より好ましくは０．２～０．３５質量％である。この場合、本発明の第一のペプチド組成物は、好ましくは、ＷＹ、ＷＬ、ＷＶおよびＧＴＷＹを少なくとも含んでなるペプチド組成物であり、より好ましくは、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．２質量％のＷＹ、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．１質量％のＷＬ、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．０５質量％のＷＶおよび全ペプチド含有量に対して０．０００００５～０．２質量％のＧＴＷＹを含んでなるペプチド組成物である。

本発明の第一のペプチド組成物は、ＷＹ、ＷＬ、ＷＶおよびＧＴＷＹに加えて、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩおよび／またはＧＹＧＧＶＳＬＰをさらに含んでいてもよい。全ペプチド含有量に対するＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ含有量は０．０００００１～０．０５質量％（好ましくは、０．０００００１５～０．０４質量％）とすることができ、全ペプチド含有量に対するＧＹＧＧＶＳＬＰ含有量は０．０００００１～０．２質量％（好ましくは、０．０００００５～０．１質量％）とすることができる。

すなわち、本発明の第一のペプチド組成物の好ましい態様によれば、ペプチドとして少なくともＷＹ、ＷＬ、ＷＶ、ＧＴＷＹ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩおよびＧＹＧＧＶＳＬＰを含んでなるペプチド組成物であって、ＷＹ含有量、ＷＬ含有量、ＷＶ含有量、ＧＴＷＹ含有量、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ含有量およびＧＹＧＧＶＳＬＰ含有量が上記の通りであるペプチド組成物が提供される。

本発明の第一のペプチド組成物においては、全ペプチド含有量に対するＷＹ、ＷＬ、ＷＶ、ＧＴＷＹ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩおよびＧＹＧＧＶＳＬＰの合計含有量は０．００００２～０．６質量％とすることができ、好ましくは０．００００４～０．５質量％、より好ましくは０．３～０．５質量％である。この場合、本発明の第一のペプチド組成物は、好ましくは、ＷＹ、ＷＬ、ＷＶ、ＧＴＷＹ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩおよびＧＹＧＧＶＳＬＰを少なくとも含んでなるペプチド組成物であり、より好ましくは、全ペプチド含有量に対して０．００００１～０．２質量％のＷＹ、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．１質量％のＷＬ、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．０５質量％のＷＶ、全ペプチド含有量に対して０．０００００５～０．２質量％のＧＴＷＹ、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．０５質量％のＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ、全ペプチド含有量に対して０．０００００５～０．２質量％のＧＹＧＧＶＳＬＰを含んでなるペプチド組成物である。

本発明において、ＷＹ、ＷＬ、ＷＶ、ＧＴＷＹ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩおよびＧＹＧＧＶＳＬＰの含有量の測定は、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により実施することができる。当業者であればその条件設定は容易に行うことができるが、たとえば後記実施例の条件を用いることができる。その際、標準ペプチドとしてＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定用の純度のものを使用することはいうまでもないが、例えば、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製ＡＱＵＡペプチドを使用することができる。

本発明の第一のペプチド組成物はタンパク質の酵素分解物由来とすることができ、好ましくはホエイタンパク質の酵素分解物（本明細書中、単に「ホエイ分解物」ということがある）由来とすることができる。本発明の第一のペプチド組成物は、ホエイ分解物そのもの、ホエイ分解物の濃縮物、ホエイ分解物の希釈物のいずれをも含むものである。ホエイタンパク質の分解物の製造方法は後述する。

本発明の第一のペプチド組成物は所定の含有比率でペプチドが含まれる限りその形態に特に限定はないが、例えば、固形、半固形、粉末、溶液の形態をとることができる。溶液は好ましくは水溶液である。

本発明の第一のペプチド組成物が溶液の形態である場合、該組成物中のペプチドの濃度は以下のようにすることができる。すなわち、ＷＹの濃度は０．１５ｐｐｍ以上（例えば、０．１５～１００ｐｐｍ）とすることができ、好ましくは１．５ｐｐｍ以上（例えば、１．５～１００ｐｐｍ）、より好ましくは１５ｐｐｍ以上（例えば、１５～１００ｐｐｍ）である。ＷＬの濃度は０．１５ｐｐｍ以上（例えば、０．１５～４０ｐｐｍ）とすることができ、好ましくは１．５ｐｐｍ以上（例えば、１．５～４０ｐｐｍ）、より好ましくは１５ｐｐｍ以上（例えば１５～４０ｐｐｍ）である。ＷＶの濃度は０．１ｐｐｍ以上（例えば、０．１～３０ｐｐｍ）とすることができ、好ましくは０．５ｐｐｍ以上（例えば、０．５～３０ｐｐｍ）、より好ましくは１ｐｐｍ以上（例えば１～３０ｐｐｍ）である。ＧＴＷＹの濃度は０．３ｐｐｍ以上（例えば、０．３～１５０ｐｐｍ）とすることができ、好ましくは３ｐｐｍ以上（例えば、３～１５０ｐｐｍ）、より好ましくは３０ｐｐｍ以上（例えば、３０～１５０ｐｐｍ）である。

本発明の第一のペプチド組成物が溶液の形態である場合、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩおよび／またはＧＹＧＧＶＳＬＰを含むことができ、該組成物中のＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ濃度は０．１ｐｐｍ以上（例えば、０．１～３０ｐｐｍ）とすることができ、好ましくは１．０ｐｐｍ以上（例えば、１．０～３０ｐｐｍ）、より好ましくは１０ｐｐｍ以上（例えば１０～３０ｐｐｍ）であり、ＧＹＧＧＶＳＬＰ濃度は０．１ｐｐｍ以上（例えば、０．１～１００ｐｐｍ）とすることができ、好ましくは１．０ｐｐｍ以上（例えば、１．０～１００ｐｐｍ）、より好ましくは１０ｐｐｍ以上（例えば１０～１００ｐｐｍ）である。

本発明の第一のペプチド組成物が溶液の形態である場合、該組成物中のＷＹ濃度、ＷＬ濃度、ＷＶ濃度、ＧＴＷＹ濃度、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ濃度およびＧＹＧＧＶＳＬＰ濃度の合計は１．０ｐｐｍ以上（例えば、１．０～５００ｐｐｍ）とすることができ、好ましくは２ｐｐｍ以上（例えば、２～５００ｐｐｍ）、より好ましくは１０ｐｐｍ以上（例えば、１０～５００ｐｐｍ）、さらに好ましくは１００ｐｐｍ以上（例えば、１００～５００ｐｐｍ）である。この場合、本発明の第一のペプチド組成物は、好ましくは、ＷＹ、ＷＬ、ＷＶ、ＧＴＷＹ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩおよびＧＹＧＧＶＳＬＰを少なくとも含んでなる、溶液形態のペプチド組成物であり、より好ましくは、０．１５ｐｐｍ以上のＷＹ、０．１５ｐｐｍ以上のＷＬ、０．１ｐｐｍ以上のＷＶ、０．３ｐｐｍ以上のＧＴＷＹ、０．１ｐｐｍ以上のＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ、０．１ｐｐｍ以上のＧＹＧＧＶＳＬＰを含んでなる、溶液形態のペプチド組成物である。

本発明の第一のペプチド組成物が溶液の形態である場合、該組成物中のＷＹ濃度、ＷＬ濃度、ＷＶ濃度、およびＧＴＷＹ濃度の合計は０．５ｐｐｍ以上（例えば、０．５～３００ｐｐｍ）とすることができ、好ましくは２ｐｐｍ以上（例えば、２～３００ｐｐｍ）、より好ましくは１０ｐｐｍ以上（例えば、１０～３００ｐｐｍ）、さらに好ましくは２０ｐｐｍ以上（例えば、２０～３００ｐｐｍ）、最も好ましくは１００ｐｐｍ以上（例えば、１００～３００ｐｐｍ）である。この場合、本発明の第一のペプチド組成物は、好ましくは、ＷＹ、ＷＬ、ＷＶおよびＧＴＷＹを少なくとも含んでなる、溶液形態のペプチド組成物であり、より好ましくは、０．１５ｐｐｍ以上のＷＹ、０．１５ｐｐｍ以上のＷＬ、０．１ｐｐｍ以上のＷＶおよび０．３ｐｐｍ以上のＧＴＷＹを含んでなる、溶液形態のペプチド組成物である。

本発明の第一のペプチド組成物が溶液の形態である場合、該組成物中のＷＹ濃度、ＷＬ濃度およびＷＶ濃度の合計は０．５ｐｐｍ以上（例えば、０．５～２００ｐｐｍ）とすることができ、好ましくは２ｐｐｍ以上（例えば、２～２００ｐｐｍ）、より好ましくは５ｐｐｍ以上（例えば、５～２００ｐｐｍ）、さらに好ましくは５０ｐｐｍ以上（例えば、５０～２００ｐｐｍ）、最も好ましくは１００ｐｐｍ以上（例えば、１００～２００ｐｐｍ）である。この場合、本発明の第一のペプチド組成物は、好ましくは、ＷＹ、ＷＬおよびＷＶを少なくとも含んでなる、溶液形態のペプチド組成物であり、より好ましくは、０．１５ｐｐｍ以上のＷＹ、０．１５ｐｐｍ以上のＷＬおよび０．１ｐｐｍ以上のＷＶを含んでなる、溶液形態のペプチド組成物である。

本発明の第一のペプチド組成物の製造方法は、所定のペプチドを所定の含有比率で含む限り特に制限はないが、原料タンパク質にタンパク質分解酵素を含む酵素製剤を作用させることにより第一のペプチド組成物を製造することができる。

原料タンパク質の酵素処理は以下のようにして行うことができる。まず、原料となるタンパク質は、全乳、粉乳、カゼインまたはホエイを用いることができ、好ましくはホエイである。ここで、「ホエイ」とは、乳清、乳漿またはホエーともいい、乳から乳脂肪分やカゼインなどを除いた水溶液を意味する。ホエイはβ－ラクトグロブリン、α－ラクトアルブミン、血清アルブミン、免疫グロブリン等から構成される。本発明で使用するホエイの由来動植物は問わないが、牛乳由来ホエイを用いることが好ましい。

原料としてホエイタンパク質を用いる場合、酵素反応に供されるホエイタンパク質の濃度は、タンパク質が溶解し得る限り限定されないが、ゲル化や凝集を抑制し、濃縮の手間を省く観点から、１～３０ｗ／ｖ％とすることが好ましく、より好ましくは１～２０ｗ／ｖ％であり、さらに好ましくは５～１５ｗ／ｖ％である。

原料タンパク質は、酵素反応が進行する限りいずれの水系溶媒に溶解させてもかまわないが、食品としての利用を考慮し、水または食品添加物グレードの緩衝液に溶解させることが好ましい。酵素反応で生じたアミノ酸により反応液のｐＨが変化しないようにするため緩衝液を使用することが好ましい。緩衝液の種類は任意であり、その後の利用や風味・味覚・ミネラル量を考慮して決定すればよいが、反応液のｐＨを４～９、好ましくは５～８、より好ましくは７～８に維持できるような組成が好ましい。最も好ましくはリン酸カリウム緩衝液である。緩衝液の濃度は緩衝効果が得られる範囲であれば任意であるが、風味・味覚・ミネラル量を考慮すると、０．０１～０．５Ｍとすることができ、好ましくは０．０５～０．２Ｍであり、より好ましくは約０．１Ｍである。

酵素はタンパク質分解酵素を含む酵素剤であればいずれも使用できるが、中性プロテアーゼを含む酵素製剤であることが好ましい。酵素製剤は、たとえばバチルス・サブティリス、アスペルギルス・オリゼ、アルペルギルス・メレウスなどの微生物を由来としたものを使用することができ、このうちアスペルギルス・オリゼ由来の酵素製剤とアルペルギルス・メレウス由来の酵素製剤が好ましく、より好ましくはアルペルギルス・メレウス由来の酵素製剤である。

本発明では市販の酵素製剤を使用することができ、例えば、天野エンザイム社、新日本化学工業社、ＤＳＭ社、ダニスコ社、ノボザイム社、ＨＢＩ社などから酵素製剤を入手可能である。酵素製剤の添加量は任意であるが、適度な加水分解反応速度と、コストを考慮すると、例えば、０．０１～５ｗ／ｖ％、好ましくは０．０５～４ｗ／ｖ％、より好ましくは０．１～０．５ｗ／ｖ％とすることができる。

酵素反応温度と酵素反応時間は原料タンパク質の加水分解が十分になされ、酵素分解物の品質が保たれるように設定することができる。すなわち、酵素反応温度は、例えば、３０～７０℃とすることができ、好ましくは４０～７０℃であり、より好ましくは４５～６５℃である。また、酵素反応時間は１～１２時間とすることができ、好ましくは２～１０時間であり、より好ましくは４～５時間である。

酵素反応は温度を上昇させながら行うことが好ましい。例えば、３０℃から７５℃にまで４～１０時間かけて上昇させながら反応させることができる。好ましくは、３５℃から７５℃まで５～８時間かけて上昇させながら反応させることができ、より好ましくは３５℃から７５℃まで６～８時間かけて反応させることができる。温度上昇スピードは任意であるが、４５℃から５５℃の間での保持時間を長めにし（５～７時間）、その後６０℃まですみやかに上昇させた後に６０℃から７５℃の間で長めに（たとえば１～３時間）保持することが好ましい。最も好ましいのは５０℃で酵素を投入し、５～７時間保持後、任意の速度で昇温させ、６０～６５℃あるいは６５～７５℃の目標温度で１～３時間保持する方法である。

反応に際しては反応効率の観点から反応液を撹拌することが好ましい。基質が酵素とよく接するように、液撹拌速度は速い方がよいが、速すぎると反応液が飛び散る恐れがあるため、例えば、１００～５００ｒｐｍとすることができ、好ましくは２００～４００ｒｐｍであり、より好ましくは約２５０ｒｐｍである。

所望のペプチドが得られたら反応液は酵素反応を停止工程に付すことが好ましい。酵素反応停止工程では、反応液を高温にしたり、キレート剤を添加して酵素の化学構造を変化させたりする方法や、膜処理により酵素を除去する方法を採用することができる。好ましい手法は高温による失活処理である。該方法は８０～９０℃で５～３０分、好ましくは８０～９０℃で２０～３０分間保持することで実施することができる。また、後述の濃縮工程で高温になる場合には、濃縮工程を兼ねて行うことができる。

酵素反応工程および酵素反応停止工程を経た反応液（ペプチド組成物）は、さらに殺菌工程に付してもよい。殺菌工程としては、例えば、後述の膜処理工程や高温殺菌工程が挙げられる。加熱殺菌工程は酵素反応停止工程を兼ねることもでき、製造工程の簡略化の点で有利である。

酵素反応工程および酵素反応停止工程を経た反応液（ペプチド組成物）は、さらに精製工程に付してもよい。精製工程としてはたとえば膜処理工程が挙げられ、好ましい膜処理は限外ろ過である。限外ろ過の分画分子量としては３～１００ｋＤａのものが好ましく、５～５０ｋＤａがより好ましく、１０ｋＤａがもっとも好ましい。精製工程を実施すると、実施しなかった場合と比較してペプチド組成物の風味を改善することができる点で有利である。また、精製工程は酵素反応停止工程および殺菌工程を兼ねることもでき、製造工程の簡略化の点でも有利である。

酵素反応工程および酵素反応停止工程を経た反応液（ペプチド組成物）は、保管や運搬の観点からさらに濃縮工程に付してもよい。濃縮工程は任意の方法を選択することができるが、減圧濃縮、凍結乾燥および噴霧乾燥（スプレードライ）、膜処理による濃縮（例えば、逆浸透膜を用いる方法）による方法が好ましく、より好ましくは凍結乾燥および噴霧乾燥である。濃縮を大量かつ効率的に実施する観点から噴霧乾燥が特に好ましい。また、酵素反応工程および酵素反応停止工程を経た反応液（ペプチド組成物）は、飲食品（特に飲料）として提供するために溶媒により希釈されてもよい。使用される溶媒に限定はないが、水系溶媒が好ましく、例えば、水、糖分含有水溶液、糖分および酸味寄与物質含有水溶液、任意の飲料液が挙げられる。

本発明の第一の面の好ましい態様によれば、ホエイタンパク質（より好ましくはフォンテラ社ＷＰＣ４７２）を１０％の濃度となるよう０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液に溶解し（ｐＨ７．０）、天野エンザイム社製プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤを０．２％となるよう添加し、２５０ｒｐｍで撹拌しながら５０℃×５時間保持、その後温度を上昇させ６０℃に達したら３時間保持することで本発明の第一のペプチド組成物を製造することができる。

本発明の第二の面によれば、ペプチドとしてＷＹ、ＷＬ、ＷＶおよびＧＴＷＹからなる群から選択される特定量の１種、２種、３種または４種のペプチドを含んでなる、摂取形態のペプチド組成物（以下「第二のペプチド組成物」ということがある）が提供される。第二のペプチド組成物においては、該組成物中のペプチドの含有量は以下のように設定することができる。
ＷＹ：１６０～７００００μｇ（好ましくは４０００～６００００μｇ）
ＷＶ：１００～６００００μｇ（好ましくは１６０～５５０００μｇ）
ＷＬ：１００～６００００μｇ（好ましくは１６０～５５０００μｇ）
ＧＴＷＹ：５０～４００００μｇ（好ましくは１００～３００００μｇ）

本発明の第二のペプチド組成物は、ＷＹ、ＷＶ、ＷＬおよびＧＴＷＹからなる群から選択される１種または２種以上のペプチドに加えて、ＧＹＧＧＶＳＬＰおよび／またはＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩをさらに含んでいてもよい。ＧＹＧＧＶＳＬＰの含有量は５０～５００００μｇ（好ましくは１６０～４００００μｇ）とすることができ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩの含有量は１６０～７００００μｇ（好ましくは２７０～６００００μｇ）とすることができる。

本発明の第二のペプチド組成物の製造方法は、所定のペプチドを所定の含有量で含む限り特に制限はないが、第一のペプチド組成物と同様に製造することができる。すなわち、全乳、粉乳、カゼインまたはホエイなどの原料タンパク質にタンパク質分解酵素を含む酵素製剤を作用させ、場合によっては所定のペプチドが所定の含有量で含まれるように濃縮あるいは希釈を行うことによりを製造することができる。酵素反応の詳細は第一のペプチド組成物の製造方法の記載を参照することができる。

本発明の第二のペプチド組成物は摂取形態であるため、そのままヒトを含む哺乳動物に摂取させることができ、脳機能の維持、向上、改善等の機能を発揮させることができる。従って、本発明の第二のペプチド組成物は機能性食品や医薬品として用いることができる。

後記実施例に示されるように、ホエイタンパク質の酵素分解物並びにＷＹ、ＷＬ、ＷＶ、ＧＴＷＹ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩおよびＧＹＧＧＶＳＬＰ（以下「本発明の６種のペプチド」ということがある）は脳機能の維持、向上および改善作用を有する。従って、本発明の第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部は脳機能の維持、向上および／または改善のための組成物の有効成分として使用することができるとともに、脳機能の維持方法、脳機能の向上方法および脳機能の改善方法に使用することができる。また、第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部は脳機能の維持剤、脳機能の向上剤および脳機能の改善剤の有効成分として使用することができる。本発明において「脳機能」は記憶学習機能および認知機能を含む意味で用いられる。

すなわち、本発明によれば、有効量の本発明の第一のペプチド組成物、第二のペプチド組成物あるいは本発明の６種のペプチドの一部または全部を、ヒトまたは非ヒト動物に摂取させるか、あるいは投与することを含んでなる、脳機能の維持方法、脳機能の向上方法および脳機能の改善方法が提供される。本発明のこれらの方法を実施する場合にはそれを必要としているヒトを含む哺乳類に有効量の本発明の組成物または本発明のペプチドを投与することにより実施することができる。

本発明によればまた、脳機能の維持、向上および／または改善のための組成物および食品の製造のための、本発明の第一のペプチド組成物、第二のペプチド組成物あるいは本発明の６種のペプチドの一部または全部の使用が提供される。本発明によればさらに、脳機能の維持剤、脳機能の向上剤および脳機能の改善剤の製造のための、本発明の第一のペプチド組成物、第二のペプチド組成物あるいは本発明の６種のペプチドの一部または全部の使用が提供される。本発明によればさらにまた、脳機能の維持、向上および／または改善に用いるための本発明の第一のペプチド組成物、第二のペプチド組成物および本発明の６種のペプチドの一部または全部が提供される。

本発明において、「記憶学習機能の維持」とは、例えば、老年層等において、加齢に伴って生じる記憶力や学習能力の低下を抑制することなどを含む。また、「記憶学習機能の向上」とは、例えば、一過的な記憶学習機能の向上や、中長期的な記憶の定着を促進、ひいては、脳の発育を促進させることなどを含む。さらに、「記憶学習機能の改善」とは、例えば、加齢その他の要因により一旦低下した機能や低下の兆しがある機能について回復することなどを含む。

本発明において「認知機能の維持」とは、例えば、理解、判断、論理などの知的機能、すなわち認知能力の低下を予防することなどを含む。また、「認知機能の向上」とは、例えば、認知能力を現状より高めることなどを含む。さらに、「認知機能の改善」とは、例えば、いったん低下した認知能力や低下の兆しがある症状を回復させることなどを含む。

以下の理論に拘束されるものではないが、本発明の第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物が脳機能の維持、向上および改善作用を有するのは、これらの組成物に含まれるペプチドが神経伝達物質の産生を促すなどにより脳の仕組みを補強する結果として、脳機能の維持、向上および改善に繋がったものと考えられる。

本発明における本発明の第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの使用はヒトおよび非ヒト動物における使用であってもよく、治療的使用と非治療的使用のいずれもが意図される。本明細書において、「非治療的」とはヒトを手術、治療または診断する行為（すなわち、ヒトに対する医療行為）を含まないことを意味し、具体的には、医師または医師の指示を受けた者がヒトに対して手術、治療または診断を行う方法を含まないことを意味する。

本発明においては、また、本発明の第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部は脳機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状の治療、予防および／または改善のための組成物の有効成分として使用することができるとともに、脳機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状の治療方法、予防方法および改善方法に使用することができる。また、第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部は脳機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状の治療剤、予防剤および改善剤の有効成分として使用することができる。

すなわち、本発明によれば、有効量の本発明の第一のペプチド組成物、第二のペプチド組成物あるいは本発明の６種のペプチドの一部または全部を、ヒトまたは非ヒト動物に摂取させるか、あるいは投与することを含んでなる、脳機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状の治療方法、予防方法および改善方法が提供される。本発明の治療方法、予防方法および改善方法を実施する場合には治療、予防または改善を必要としているヒトを含む哺乳類に有効量の本発明の組成物または本発明のペプチドを投与することにより実施することができる。

本発明によればまた、脳機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状の治療用組成物、予防用組成物および改善用組成物の製造のための、本発明の第一のペプチド組成物、第二のペプチド組成物あるいは本発明の６種のペプチドの一部または全部の使用が提供される。これら組成物は好ましくは医薬組成物である。本発明によればさらに、脳機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状の治療剤、予防剤および改善剤の製造のための、本発明の第一のペプチド組成物、第二のペプチド組成物あるいは本発明の６種のペプチドの一部または全部の使用が提供される。本発明によればさらにまた、脳機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状の治療、予防および改善に用いるための本発明の第一のペプチド組成物、第二のペプチド組成物および本発明の６種のペプチドの一部または全部が提供される。

脳機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状としては、記憶学習機能および認知機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状が挙げられ、より具体的には記憶障害（記憶を思い出すことができない、新たなことを覚えることができないという症状）、見当識障害（時間・場所・人物の失見当）、認知機能障害（計算能力の低下・判断力低下失語・失認・失行・実行機能障害）などが挙げられる。

本発明の脳機能の維持、向上および／または改善のための組成物および本発明の脳機能の維持剤、向上剤および／または改善剤並びに本発明の脳機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状の治療用組成物、予防用組成物および改善用組成物および本発明の脳機能の改善がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状の治療剤、予防剤および改善剤は、医薬品、医薬部外品、飲食品、飼料などの形態で提供することができ、下記の記載に従って実施することができる。また本発明の脳機能の維持方法、脳機能の向上方法、脳機能の改善方法並びに本発明の治療方法および予防方法は下記の記載に従って実施することができる。

本発明の有効成分である本発明の第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部はヒトおよび非ヒト動物に経口投与または非経口投与することができ、好ましくは経口投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。非経口剤としては、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学上許容される担体を用いて製剤化することができる。薬学上許容される担体としては、賦形剤、結合剤、希釈剤、添加剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられ、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバターを担体として使用できる。

経口剤の製造方法は特に限定されずいずれの方法をも使用することができる。有効成分に賦形剤（例えば、乳糖、白糖、デンプン、マンニトール）、崩壊剤（例えば、炭酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム）、結合剤（例えば、α化デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース）、安定化剤および／または滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００）などの製剤用添加剤を配合して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため公知の方法でコーティングすることにより製造することができる。コーティング剤としては、例えば、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびオイドラギット（ローム社）などを用いることができる。カプセル剤は有効成分をそのまままたは有効成分にたとえば安定化剤、分散剤、着色剤および／または保存剤などの製剤用添加剤を配合して製造してもよい。また、カプセルはソフトカプセルでもハードカプセルでもよく、カプセルの素材は特に限定されずたとえばゼラチンや植物性繊維や澱粉などを用いることができ、付着防止措置を施してもよい。

非経口剤のうち注射剤は、有効成分を分散剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０（アトラスパウダー社））、保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、ソルビトール、ブドウ糖、転化糖）などの製剤用添加剤と共に水性溶剤（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リンゲル液）あるいは油性溶剤（例えば、オリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油などの植物油、プロピレングリコール）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造することができる。この際、所望により溶解補助剤（例えば、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン）等の添加物を添加してもよい。

本発明の有効成分である第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部を食品として提供する場合には、これらをそのまま食品として提供することができ、あるいはこれらを食品に含有させて提供することができる。このようにして提供された食品は第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部を有効量含有した食品である。本明細書において、第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部を「有効量含有した」とは、個々の食品において通常喫食される量を摂取した場合に後述するような範囲で第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部が摂取されるような含有量をいう。また「食品」とは、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、保健機能食品（例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品）、特別用途食品（例えば、幼児用食品、妊産婦用食品、病者用食品）を含む意味で用いられる。

第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部は脳機能の維持、向上および／または改善作用を有するため、日常摂取する食品、さらにはサプリメントとして摂取する食品に含有させて提供することができる。この場合、第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの一部または全部は１食当たりに摂取する量が予め定められた単位包装形態で提供することができる。１食当たりの単位包装形態としては、例えば、パック、包装、缶、ボトル等で一定量を規定する形態が挙げられる。第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物並びに本発明の６種のペプチドの各種作用をよりよく発揮させるためには、後述する、本発明の６種のペプチドの１回当たりの摂取量に従って１食当たりの摂取量を決定できる。本発明の食品は、摂取量に関する説明事項が包装に表示されるか、あるいは説明事項が記載された文書等と一緒に提供されてもよい。

本発明の食品には脳機能の維持、向上および／または改善作用を有する旨の表示が付されてもよい。この場合、消費者に理解しやすい表示とするため本発明の食品には以下の一部または全部の表示が付されてもよい。なお、本発明において「脳機能の維持、向上および／または改善」が以下の表示を含む意味で用いられることはいうまでもない。
・記憶力を向上させる
・記憶力を増強する
・記憶力をサポートする
・認知機能を向上させる
・認知機能を増強する
・認知機能をサポートする
・記憶力の維持に役立つ
・うっかりを防止する
・記憶の定着を向上させる
・加齢に伴う記憶の低下を抑制する

「食品」の形態は特に限定されるものではなく、例えば、飲料の形態であっても、半液体やゲル状の形態であってもよい。例えば、乳、ヨーグルト、チーズ等の乳素材に前述の酵素製剤を作用させ、本発明の６種のペプチドの一部または全部を生成させた乳製品も本発明の食品の範囲内である。また、サプリメントとしては、本発明の６種のペプチドの一部または全部の乾燥粉末に賦形剤、結合剤等を加え練り合わせた後に打錠することにより製造された錠剤や、カプセルになどに封入されたカプセル剤が挙げられる。

また、本発明の食品には通常の食品の製造に使用される食品上許容される添加剤を配合できることはいうまでもないが、本発明のペプチド組成物の劣化防止および酸化防止の観点からこれらの効果が期待される成分を本発明の食品に配合してもよい。このような成分としてはペプチドの劣化防止作用や抗酸化作用を有するフレーバー製剤が挙げられ、天然物由来の組成物を好ましくは用いることができる。

本発明で提供される食品としては、飯類、麺類、パン類およびパスタ類等炭水化物含有飲食品；クッキーやケーキなどの洋菓子類、饅頭や羊羹等の和菓子類、キャンディー類、ガム類、ヨーグルトやプリンなどの冷菓や氷菓などの各種菓子類；ウイスキー、バーボン、スピリッツ、リキュール、ワイン、果実酒、日本酒、中国酒、焼酎、ビール、アルコール度数１％以下のノンアルコールビール、発泡酒、その他雑酒、酎ハイなどのアルコール飲料；果汁入り飲料、野菜汁入り飲料、果汁および野菜汁入り飲料、清涼飲料水、炭酸飲料、牛乳、豆乳、乳飲料、ドリンクタイプのヨーグルト、ドリンクタイプのゼリー、コーヒー、ココア、茶飲料、栄養ドリンク、スポーツドリンク、ミネラルウォーター、ニア・ウォーターなどの非アルコール飲料；卵を用いた加工品、魚介類や畜肉（レバー等の臓物を含む）の加工品（珍味を含む）などを例示することができるが、これらに限定されるものではない。なお、ミネラルウォーターは、発泡性および非発泡性のミネラルウォーターのいずれもが包含される。

茶飲料としては、発酵茶、半発酵茶および不発酵茶のいずれもが包含され、例えば、紅茶、緑茶、麦茶、玄米茶、煎茶、玉露茶、ほうじ茶、ウーロン茶、ウコン茶、プーアル茶、ルイボスティー、ローズ茶、キク茶、ハーブ茶（例えば、ミント茶、ジャスミン茶）が挙げられる。

果汁入り飲料や果汁および野菜汁入り飲料に用いられる果物としては、例えば、リンゴ、ミカン、ブドウ、バナナ、ナシ、モモ、マンゴー、アサイー、ブルーベリーおよびウメが挙げられる。また、野菜汁入り飲料や果汁および野菜汁入り飲料に用いられる野菜としては、例えば、トマト、ニンジン、セロリ、カボチャ、キュウリおよびスイカが挙げられる。

本発明の医薬品および食品はヒトが食品として長年摂取してきた乳由来の酵素分解物を利用することから、毒性も低く、それを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）に対し安全に用いることができる。本発明の６種のペプチドの摂取量または投与量は、受容者の性別、年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与経路並びに組み合わせる薬剤等に依存して決定できる。本発明の６種のペプチドの成人（５０ｋｇ）１回当たりの摂取量および投与量を例示すると以下の通りであるが、対象者によっては数回に分けて摂取させ、あるいは投与してもよい。
ＷＹ：１６０～４２００μｇ（好ましくは５００～３６００μｇ）
ＷＶ：１００～３６００μｇ（好ましくは１６０～３３００μｇ）
ＷＬ：１００～３６００μｇ（好ましくは１６０～３３００μｇ）
ＧＴＷＹ：５０～２４００μｇ（好ましくは１００～１８００μｇ）
ＧＹＧＧＶＳＬＰ：５０～３０００μｇ（好ましくは１６０～２４００μｇ）
ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ：１６０～４２００μｇ（好ましくは２７０～３６００μｇ）

なお、本発明の第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物は本発明の６種のペプチドの一部または全部を含むものであることから、各ペプチドの１回当たりの摂取量および投与量に従って第一のペプチド組成物および第二のペプチド組成物の組成と摂取量または投与量を決定することができる。例えば、上記のような各ペプチドの１回当たりの摂取量および投与量を有するように、単位摂取形態または単位投与形態の第一のペプチド組成物や単位摂取形態または単位投与形態の第二のペプチド組成物を調製することができる。

実施例１：ホエイ分解物製造の条件の検討
（１）原料タンパクの選択
各種ホエイタンパク質を、タンパク質分解酵素を含む酵素製剤（アマノエンザイム社製プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤまたはサモアーゼＣ１００）でそれぞれ酵素処理し、生成される脳機能活性ペプチドについて検討を行った。

具体的には、各ホエイタンパク質を０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液に５ｗ／ｖ％となるように溶解させた溶解液に、各タンパク質分解酵素製剤の終濃度が０．１２５ｗ／ｖ％となるように酵素製剤を添加した。得られた溶液をｐＨ７．０、５０℃にて４時間反応させた後、９０℃で２０分保持して酵素を失活させ、酵素処理サンプルを得た。なお、酵素製剤を添加する以外は同様の処理をして得られたサンプルを対照サンプルとした。

得られたサンプルについて目視により観察した結果を以下の表１に示す。

また、得られたサンプルを遠心分離し、上清を限外ろ過（１０ｋＤａ）して得られた分析サンプルを適宜希釈し、以下の分析条件でＬＣ／ＭＳ／ＭＳにてペプチドの定量を行った。濃度換算は最少濃度を０．００１ｐｐｍとする検量線法によった。

表１および２の結果から、酵素反応や酵素失活などの熱処理によって、一部のホエイタンパク質（分離ホエイタンパクＷＰ１８８５５）においては凝集が生じたが（表１）、それ以外については沈殿が生じながらもペプチドは得られ、その収量はホエイタンパク質の違いによる大きな差は見られなかった（ペプチド収量のデータは省略）。

したがって、本発明のホエイ分解物の製造にあたっては、ほとんどすべてのホエイタンパク質を原料として使用できることがわかった。なかでも、検討した２種の酵素製剤に対して沈殿が少なかったフォンテラ社製ＷＰＣ４７２が総合的に適していることがわかった。

（２）酵素製剤の検討
ホエイタンパク質（フォンテラ社製ＷＰＣ４７２）を５ｗ／ｖ％含有する０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液に、表３に示す各種酵素製剤をタンパク質分解酵素製剤の終濃度が０．１２５ｗ／ｖ％となるように添加した。ｐＨ７．０、５０℃にて４時間反応させた後、９０℃で２０分保持して酵素を失活させ、酵素処理サンプルを得た。なお、酵素製剤を添加する以外は同様の処理をして得られたサンプルを対照サンプルとした。

得られたサンプルを限外ろ過して得た分析サンプルを適宜希釈し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにてペプチドの定量を行った。このとき、市販のホエイ加水分解物についても１０ｗ／ｖ％濃度となるよう水に溶解させ上記サンプルと同様の処理をしてペプチドの定量を行った。なお、分析条件は実施例１に示す条件に従った。その結果を以下の表４に示す。数値は、酵素製剤番号３５（アスペルギルス・メレウス由来タンパク質分解酵素製剤）により得られた反応液中のＷＹ濃度を１００としたときの比で表示した（表示の値＝実測濃度（ｐｐｍ）／酵素製剤番号３５により得られた反応液中のＷＹ濃度（ｐｐｍ）×１００）。

表４の結果から、アスペルギルス・オリゼ、バチルス・サブティリスまたはアスペルギルス・メレウス由来のタンパク質分解酵素を含む酵素製剤の使用により、脳機能活性ペプチドの収量が多くなる傾向があり、なかでもアスペルギルス・メレウス由来のタンパク質分解酵素を含む酵素製剤の使用によりＧＴＷＹなどの収量が多くなることが分かった。また、本発明のホエイ分解物は、市販のホエイ加水分解物と比較して本発明の６種のペプチド濃度が極めて高いことが分かった。

（３）酵素反応条件の検討
本発明者らは、各種ホエイタンパク質を５～２０ｗ／ｖ％を含有する０．０５～０．２Ｍ濃度の緩衝液に、プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤをタンパク質分解酵素製剤の終濃度が０．１～０．５ｗ／ｖ％となるように添加し、得られた溶液をｐＨ７．０、５０℃にて１～８時間反応させた後、８０℃、３０分で酵素を失活させる条件において、所望のペプチドが生成されることを確認した（データ省略）。また、２５０ｒｐｍで撹拌した場合に反応が適切に進行することも確認した（データ省略）。さらに、ホエイタンパク質（フォンテラ社製ＷＰＣ４７２）を１０ｗ／ｖ％含有する０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液に、プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤをタンパク質分解酵素製剤の終濃度が０．２ｗ／ｖ％となるように添加し、得られた溶液をｐＨ７．０、５０℃にて５～８時間維持し、その後８０℃で３０分維持して酵素を失活させる方法が好ましいことも確認した（データ省略）。

そこで、さらにホエイ分解物に含まれる特定ペプチドの収量を増加させることを目的として酵素反応条件についてさらに検討を行った。具体的には、ホエイタンパク質（フォンテラ社製ＷＰＣ４７２）を１０ｗ／ｖ％含有する０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液に、プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤをタンパク質分解酵素製剤の終濃度が０．２ｗ／ｖ％となるように添加し、反応条件を検討した。

５０℃で６～８時間反応させた場合に得られたホエイ分解物のペプチド濃度を、５０℃で６時間反応させたときのＷＹ濃度を１００としたときの比（表示の値＝実測濃度（ｐｐｍ）／５０℃で６時間反応させたときのＷＹ濃度（ｐｐｍ）×１００）として以下の表５に示す。

表５の結果から、反応時間が７時間まではペプチド濃度が増加傾向にあるものの、８時間ではペプチド濃度が低減することが分かった。

次に、反応６時間目以降に温度を変更して維持した場合の結果を、５０℃で５時間反応させたときのＷＹ濃度を１００としたときの比（表示の値＝実測濃度（ｐｐｍ）／５０℃で５時間反応させたときのＷＹ濃度（ｐｐｍ）×１００）として以下の表６に示す。

表６の結果から、５０℃で一定時間反応を行った後、６０℃でさらに一定時間反応させ、その後８０℃で酵素を失活させることにより、得られるペプチドの量が増加することが分かった。特に、ＷＹについては、５０℃で５時間反応させた後、６０℃で１～３時間反応させることにより、ペプチド濃度が増加することが分かった。さらに、５０℃から６０℃へ反応温度を昇温させた場合は、総反応時間が８時間の場合であっても、ペプチドの合計量が維持されることが分かった。

実施例２：ペプチド分解物の製造
ホエイタンパク質（フォンテラ社製ＷＰＣ４７２）を１０ｗ／ｖ％含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にプロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤをタンパク質分解酵素製剤の終濃度が０．２ｗ／ｖ％となるように添加し、５０℃で５時間維持し反応させた。その後、８０℃にて３０分間維持し酵素を失活させた。

得られたホエイ分解物含有反応液および該ホエイ分解物をＥＹＥＬＡ社製凍結乾燥機 ＦＤＵ‐２１００を使用し反応液の入ったフラスコ外側を室温とした凍結乾燥を行った。粉末化したホエイ分解物粉末中のペプチド濃度を以下の表７および８に示す。

本試験ではホエイ５００ｇを原料とし、約２ｇの粉末化したペプチド分解物が得られているところ、該ペプチド分解物のほとんどはペプチドであると考えられた。

なお、粉末化したホエイ分解物中のペプチドの含有比率は、表７に記載したホエイ分解物含有水溶液（反応液中のペプチド含有比率）に等しいとみなしている。

実施例３：記憶学習機能・認知機能に対するホエイ分解物摂取の効果
（１）記憶学習機能・認知機能の評価方法（Ｙ字迷路試験）
マウスは本来、直前に選択したルートとは異なるルートを選択する性質がある。そのため、幅、長さ等が等価の３本のアームを持つＹ字迷路にマウスを入れた場合、通常は直前に進入したアームとは異なるアームに進入する。Ｙ字迷路試験は、マウスのその性質を短期記憶の評価に利用する試験である。

本試験では、一本のアームの長さが２５ｃｍ、壁の高さが２０ｃｍ、床の幅が５ｃｍの３本のアームが各々１２０度の角度で接続されたＹ字迷路をＹ字迷路試験のための装置として使用した。

マウスをＹ字迷路のいずれかのアームの先端へ入れて自由に８分間探索させた際の移動したアームの順を記録した。ここで、３回連続で異なるアームを選択し、進入した場合を自発的交替行動と呼ぶ。時間内のアームへの総進入数および自発的交替行動数をカウントし、下記式（１）を用いて自発的交替行動変動率（％）を算出した。

自発的交替行動変動率が高いほど、短期記憶が保持されていることを示す。

（２）ホエイ分解物摂取の効果
６週齢雄のＣＤ－１マウス（日本ＳＬＣ社より入手）に、実施例２で得られたホエイ分解物粉末を０．３～３ｍｇ／ｋｇ体重の量で胃内へ強制経口投与し、その４０分後、記憶障害を誘発するために０．８０ｍｇ／ｋｇ体重のスコポラミン塩酸塩（ＳＩＧＭＡ社製）を腹腔内投与した。スコポラミンの腹腔内投与２０分後、Ｙ字迷路試験を実施した（図１）。なお、各群１０匹で実験を行い、平均、標準誤差を求めた。その結果を図２に示す。

図２の結果から、ホエイ分解物投与による総進入数の変動は認められず、すなわち、ホエイ分解物投与は行動量には影響を与えないが（図２Ｂ）、ホエイ分解物投与は摂取量依存的に自発的交替行動変動率を高めることが分かった（図２Ａ）。このことは、ホエイ分解物により短期記憶が保持されることを意味する。

実施例４：記憶学習機能・認知機能に対する合成ペプチド摂取の効果
６週齢雄のＣＤ－１マウス（日本ＳＬＣ社より入手）に、６種の合成ペプチド：ＧＴＷＹ、ＧＹＧＧＶＳＬＰ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ、ＷＬ、ＷＶ、ＷＹを０．１～３μｍｏｌ／ｋｇ体重の量で胃内へ強制経口投与し、その４０分後、記憶障害を誘発するために０．８０ｍｇ／ｋｇのスコポラミン塩酸塩を腹腔内投与した。スコポラミンの腹腔内投与２０分後、実施例３（１）に記載されるＹ字迷路試験を実施した。なお、各群１０匹で実験を行い、平均、標準誤差を求めた。その結果を図３～７に示す。

図３～６の結果から、ＧＴＷＹを摂取させたマウスは、摂取量０．１～１μｍｏｌ／ｋｇ体重の範囲で非摂取群と比較して自発的交替行動変動率が高くなり、短期記憶が保持されたことがわかった。同様に、ＧＹＧＧＶＳＬＰ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩでも摂取量０．１～１μｍｏｌ／ｋｇ体重の範囲で非摂取群と比較して自発的交替行動変動率が高くなり、短期記憶が保持されたことがわかった。特に、ＧＴＷＹ、ＧＹＧＧＶＳＬＰ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩによる自発的交替行動変動率の上昇はペプチド摂取量に依存する傾向が認められた。

図７の結果から、ＷＬ、ＷＶ、ＷＹを摂取させたマウスでは、摂取量０．３～３μｍｏｌ／ｋｇ体重の範囲で非摂取群と比較して摂取量に依存して自発的交替行動変動率が高くなり、短期記憶が保持されたことがわかった。

実施例５：ホエイ分解物を添加した飲料の評価
高甘味度甘味料であるアセスルファムカリウムやスクラロースはショ糖などと比較すると甘味に後引きが感じられることが知られている。そこで、高甘味度甘味料に起因する甘さの後引きに対するホエイ分解物の効果について検討した。

（１）サンプル飲料の調製
イオン交換水に高甘味度甘味料としてアセスルファムカリウム（ＭＣフードスペシャリティーズ社製）またはスクラロース（三栄源エフエフアイ社製）を表９に示す含有量となるように添加した水溶液に、実施例２で得られたホエイ分解物粉末を表９に示す含有量となるように添加したものをサンプル飲料とした。

（２）官能評価
各サンプル飲料を官能評価に供した。具体的には、高甘味度甘味料に起因する甘さの後引きを改善できるか否かについて、以下の評価基準に従って評価を行った。
４：甘さが極めてすっきりする
３：甘さがすっきりする
２：少し甘さがすっきりする
１：無添加のものと同じ甘さ
官能評価は訓練されたパネラー６名により実施した。各パネラーは０．５点刻みのスコアで評価し、パネラー６名の評価スコアの平均値を計算し、２．５以上を効果ありと判断した。

（３）評価結果
官能評価の結果を表９に示す。

表９の結果から、アセスルファムＫ水溶液、スクラロース水溶液のいずれにおいても、ホエイ分解物濃度を１ｗ／ｖ％としたときに甘さの後引きが最も改善された。しかし、本サンプル飲料は高甘味度甘味料とホエイ分解物以外の原料を含有しないため、この濃度ではホエイ分解物由来の苦み・えぐみも感じられるようになることから、総合的な呈味は１ｗ／ｖ％よりも低い濃度のサンプル飲料の方が優れていた。

実施例７：風味が改善されたホエイ分解物の調製
本実施例では限外ろ過膜処理によるペプチド組成物の風味改善について検討した。

（１）サンプル飲料の調製
実施例２で得られたホエイ分解物粉末１ｇを５００ｍＬの蒸留水に溶解したサンプル飲料（サンプル水１）と、サンプル水１を限外ろ過膜（分画分子量１０ｋＤａ、メルクミリポア社製）でろ過処理して得られたサンプル飲料（サンプル水２）を調製し、官能評価に供した。

（２）官能評価
各サンプル飲料を常温で官能評価に供した。具体的には、５つの評価項目：清澄度、渋味、苦味、異臭および嗜好度を改善できるか否かについて、それぞれ５段階で評価を行った。清澄度については清澄度が最も低い場合を１とし、最も高い場合を５とした。渋味については渋味が最も弱い場合を１とし、最も強い場合を５とした。苦味については苦味が最も弱い場合を１とし、最も強い場合を５とした。異臭については異臭が最も弱い場合を１とし、最も強い場合を５とした。嗜好度については嗜好度が最も低い場合を１とし、最も高い場合を５とした。

官能評価は訓練されたパネラー４名により実施した。各パネラーは１刻みのスコアで評価し、パネラー４名の評価スコアの平均値を計算した。

（３）評価結果
官能評価の結果を表１０に示す。

表１０の結果から、ろ過膜処理を施すことにより、ホエイ分解物溶液の清澄度、渋味、苦味、異臭および嗜好度が改善できることが確認された。すなわち、ろ過膜処理により風味が改善されたペプチド組成物を調製できることが示された。

実施例８：保存安定性が改善されたホエイ分解物含有飲料の調製
本実施例ではホエイ分解物含有飲料の保存安定性について検討した。

（１）サンプル飲料の調製および保存
市販のスポーツドリンク飲料に、実施例２で得られたホエイ分解物粉末を濃度が２ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、さらにペプチドの劣化防止作用を有するフレーバー組成物として各種天然物由来組成物を表１１に示す含有量となるように添加混合したものをサンプル飲料とした。調製した各サンプル飲料は１９５ｍＬ容ＰＥＴボトルに充填し１週間保存のうえ評価に供した。保存条件は、表１１に示す温度および照度の条件（保存条件Ａおよび保存条件Ｂ）とした。なお、表中の照射とは、保存中の照度が３０００ルクス（ＬＸ）であったことを指す。

（２）ペプチドの含有量評価
上記（１）で調製し保存されたサンプル飲料中のペプチド濃度を実施例１に記載した方法に従って測定した。保存条件Ａのサンプルについての測定結果を表１２に、保存条件Ｂのサンプルについての測定結果を表１３に示す。ペプチド濃度は、サンプル飲料１（フレーバー組成物非添加、暗所にて保存）の値を１００としたときの比（表示の値＝実測濃度（ｐｐｍ）／サンプル飲料１の各ペプチド濃度（ｐｐｍ）×１００）として示した。

表１２の結果から、フレーバー組成物を含有する飲料（サンプル飲料３、４、５、６、７）ではペプチドの光による減耗が抑制されることが確認された。また、表１３の結果から、フレーバー組成物を含有する飲料（サンプル飲料３、４、５、６、７）ではペプチドの熱による減耗が抑制されることが確認された。すなわち、フレーバー組成物の添加により保存安定性が改善されたホエイ分解物含有飲料を調製できることが示された。

Claims (5)

1. 全ペプチド含有量に対して０．００００１～０．２質量％のＷＹ、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．１質量％のＷＬ、全ペプチド含有量に対して０．０００００１～０．１質量％のＷＶおよび全ペプチド含有量に対して０．０００００５～０．２質量％のＧＴＷＹ（配列番号１）を含んでなる、脳機能の維持、向上および／または改善に用いるためのペプチド組成物であって、
   前記組成物が、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ（配列番号２）および／またはＧＹＧＧＶＳＬＰ（配列番号３）をさらに含んでなり、かつ、前記組成物において、全ペプチド含有量に対してＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ含有量が０．０００００１～０．０５質量％であり、全ペプチド含有量に対してＧＹＧＧＶＳＬＰ含有量が０．０００００５～０．２質量％であり、
   前記脳機能が、記憶学習機能および／または認知機能である、ペプチド組成物。
2. 全ペプチド含有量に対して、ＷＹ、ＷＬ、ＷＶ、ＧＴＷＹ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩおよびＧＹＧＧＶＳＬＰの合計含有量が０．３～０．６質量％である、請求項１に記載のペプチド組成物。
3. 食品の形態である、請求項１または２に記載のペプチド組成物。
4. 食品が飲料である、請求項３に記載の組成物。
5. 機能性表示食品の機能性関与成分である、請求項１または２に記載のペプチド組成物。

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