WO2021201263A1 - 腸内または口腔内の環境改善用組成物 - Google Patents

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WO2021201263A1
WO2021201263A1 PCT/JP2021/014271 JP2021014271W WO2021201263A1 WO 2021201263 A1 WO2021201263 A1 WO 2021201263A1 JP 2021014271 W JP2021014271 W JP 2021014271W WO 2021201263 A1 WO2021201263 A1 WO 2021201263A1
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intestinal
peptide
oral
ingestion
composition
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PCT/JP2021/014271
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泰久 阿野
怜奈 大屋
達宏 綾部
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キリンホールディングス株式会社
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
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    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic

Definitions

  • the present invention relates to a composition for improving the environment in the intestine and / or the oral cavity.
  • the present invention also comprises intestinal and / or oral flora improving compositions, intestinal and / or oral short chain fatty acid production promoting compositions, intestinal and / or oral immunomodulatory compositions, Also related to the composition for promoting mood improvement.
  • the human immune function depends on the state of the intestinal flora, and that the human immune function is related to the state of the oral flora. It has also been found that the immune function can be maintained in a normal state by maintaining an appropriate balance of the flora. That is, it is expected that by adjusting the environment in the intestine and / or the oral cavity, it is possible to maintain health and prevent various diseases such as lifestyle-related diseases.
  • Patent Document 1 discloses a composition for improving the intestinal environment containing a milk-derived glycopeptide.
  • An object of the present invention is to provide a novel composition for improving the environment in the intestine and / or the oral cavity and an agent for improving the environment in the intestine and / or the oral cavity.
  • the present invention also presents a novel intestinal and / or oral flora-improving composition and an intestinal and / or oral flora-improving agent, and a novel short-chain fatty acid production promotion in the intestine and / or oral cavity.
  • Compositions and short-chain fatty acid production promoters, novel intestinal and / or oral immunomodulatory compositions and intestinal and / or oral immunomodulators, and mood-improving compositions and mood-improving promotion The purpose is to provide the agent.
  • the present inventors have recently ingested a peptide having a specific sequence or a whey protein degradation product containing the peptide in a mouse or a human in a test using an animal model and a human test, and found that the bacteria in the intestine and the oral cavity. It was found that there is an effect of improving the environment in the intestine and the oral cavity, including an effect of improving the flora and an effect of promoting the production of short-chain fatty acids. The present inventors have also found that a peptide having a specific sequence and a whey proteolytic product containing the peptide have an immunomodulatory effect via immunity in the intestinal tract and the oral cavity, and an effect of promoting improvement of mood state. The present invention is based on these findings.
  • An intestinal and / or oral environment comprising a peptide having a GTWY (SEQ ID NO: 1) amino acid sequence and / or a whey protein enzymatic degradation product containing a peptide having a WY amino acid sequence as an active ingredient.
  • compositions for intestinal and / or oral immunomodulation, which comprises a peptide having the amino acid sequence of GTWY (SEQ ID NO: 1) and / or a whey protein enzymatic degradation product containing a peptide having the amino acid sequence of WY as an active ingredient.
  • Compositions as well as intestinal and / or oral immunomodulators.
  • a composition for promoting improvement of mood state which comprises a peptide having a GTWY (SEQ ID NO: 1) amino acid sequence and / or a whey protein enzymatic degradation product containing a peptide having a WY amino acid sequence as an active ingredient.
  • a mood improvement promoter As well as a mood improvement promoter.
  • content of WY (in terms of solid content) in the whey protein enzymatic decomposition product is 0.05 to 2 mg / g.
  • compositions comprising a peptide having a GTWY (SEQ ID NO: 1) amino acid sequence and / or a peptide having a WY amino acid sequence as an active ingredient, an intestinal and / or oral environment-improving composition.
  • compositions comprising a peptide having the amino acid sequence of GTWY (SEQ ID NO: 1) and / or a peptide having the amino acid sequence of WY as an active ingredient, and the intestinal and / / Or an intraoral immunomodulator.
  • a composition for promoting improvement of mood state and an agent for promoting improvement of mood state which comprises a peptide having an amino acid sequence of GTWY (SEQ ID NO: 1) and / or a peptide having an amino acid sequence of WY as an active ingredient.
  • GTWY SEQ ID NO: 1
  • WY is ingested at a rate of 0.001 to 500 mg (in terms of solid content) per day for humans.
  • the composition and agent according to any one of the above [1] to [12] which is a unit packaging form per meal.
  • compositions of the above [1], [2], [3], [7], [8] and [9] are referred to as "the composition of the present invention” in the present specification, and the above [1], [2],
  • the agents of [3], [7], [8] and [9] may be referred to as "the agents of the present invention” in the present specification, respectively.
  • the whey protein enzymatic degradation product which is the active ingredient of the present invention, is a component derived from a food material that has been ingested by humans for many years. Therefore, the compositions and preparations of the present invention are advantageous in that they can be used as functional foods that improve the environment in the intestine and / or the oral cavity, and can be used as functional foods that are safe for mammals including humans. ..
  • FIG. 4 shows the results of bacterial flora analysis (at the end of the ingestion period) in 6-month-old (at the start of ingestion) C57BL / 6J male mice using the WY peptide, and the ingestion period was 1.5 months (1.5 M, WY non-ingestion group).
  • CTL is the WY non-ingestion group
  • WY is the WY intake group
  • * is P ⁇ 0.05%
  • the error bar is the standard error.
  • CTL is the WY non-ingestion group
  • WY is the WY intake group
  • * is P ⁇ 0.05%
  • the error bar is the standard error.
  • CTL is the GTWY non-ingestion group
  • GTWY is the GTWY intake group
  • * is P ⁇ 0.05%
  • the error bar indicates the standard error.
  • FIG. 11 shows the results of bacterial flora analysis (at the end of the ingestion period) of 6.5-month-old (at the start of ingestion) Crl: CD1 (ICR) male mice using whey decomposition products (intake period: 3 months).
  • * is P ⁇ 0.05%
  • the error bar indicates the standard error.
  • FIG. 12 shows the results of bacterial flora analysis (at the end of the ingestion period) of 6.5-month-old (at the start of ingestion) Crl: CD1 (ICR) male mice using whey decomposition products (intake period: 3 months).
  • * is P ⁇ 0.05%
  • the error bar indicates the standard error.
  • FIG. 13 shows the results of quantification of short-chain fatty acids (at the end of the ingestion period) in 62-week-old (at the start of ingestion) C57BL / 6J male mice by whey decomposition products (intake period: 8.5 months).
  • * is P ⁇ 0.05%
  • composition and preparation of the present invention contain a whey protein enzymatic degradation product as an active ingredient.
  • whey is also referred to as whey, milk syrup, whey, etc., and means an aqueous solution obtained by removing milk fat, casein, etc. from milk.
  • Whey is composed of proteins such as ⁇ -lactoglobulin, ⁇ -lactalbumin, serum albumin and immunoglobulin.
  • the animals and plants from which the whey used in the present invention is derived may be used, but it is preferable to use whey derived from milk.
  • whey protein enzymatic degradation product (sometimes referred to simply as "whey degradation product” in the present specification) which is the active ingredient of the composition and the preparation of the present invention is not limited as long as it is a whey enzymatic degradation product.
  • the content (in terms of solid content) of the whey decomposition product in the composition and the preparation of the present invention can be arbitrarily determined according to the purpose, use, form, dosage form and the like, and the present invention is not limited thereto.
  • a liquid composition and a liquid preparation it is 0.001 to 100 mg / 100 mL (preferably 0.005 to 50 mg / 100 mL, more preferably 0.01 to 10 mg / 100 mL) with respect to the total amount.
  • the solid composition and the solid agent it is 0.1 to 90% by mass (preferably 0.5 to 80% by mass, more preferably 1 to 70% by mass) with respect to the total amount.
  • composition and preparation of the present invention may include a peptide having the amino acid sequence of GTWY (SEQ ID NO: 1) and a peptide having the amino acid sequence of WY as active ingredients (hereinafter, these may be referred to as "peptides of the present invention”. ), Or both, can be specified as containing at least. Therefore, as the whey decomposition product of the present invention, one containing either or both of a peptide having a GTWY amino acid sequence and a peptide having a WY amino acid sequence can be used.
  • the "peptide having an amino acid sequence” means a peptide whose sequence is specified by the amino acid sequence.
  • GTWY means a tetrapeptide consisting of four amino acids
  • WY means a dipeptide consisting of two amino acids.
  • the content of GTWY (in terms of solid content) in the whey decomposition product of the present invention is, for example, 0.01 to 1% by mass (preferably 0.05 to 0.5% by mass, based on the total amount of the whey decomposition product). It is preferably 0.1 to 0.2% by mass), and the WY content (in terms of solid content) is, for example, 0.005 to 0.5% by mass (preferably 0. 01 to 0.1% by mass, more preferably 0.03 to 0.09% by mass).
  • the peptide content of the present invention can be measured by using a known peptide content analysis method such as liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS / MS), fluorescence method or colorimetric method, for example, LC. -Using MS / MS, it can be carried out by the method described in Example 2 below.
  • LC-MS / MS liquid chromatography tandem mass spectrometry
  • a peptide having a purity for LC-MS / MS measurement can be used as a standard peptide at the time of measurement, and for example, AQUA peptide (SIGMA ALDRICH) can be used.
  • a method for producing a whey decomposition product of the present invention (particularly, a whey decomposition product containing the peptide of the present invention) is known, and can be produced, for example, in accordance with the description of International Publication No. 2017/086303.
  • a commercially available whey decomposition product for example, HW-3 (Snow Brand Megmilk Co., Ltd.), HWP-205 (Tatura), Thermax690 (Glanbia), Protherma (Glanbia), etc.
  • HW-3 Snow Brand Megmilk Co., Ltd.
  • HWP-205 Natural
  • Thermax690 Glanbia
  • Protherma Protherma
  • the whey degradation product containing the peptide of the present invention can be produced, for example, by allowing whey protein to act on an enzyme preparation containing whey degrading enzyme.
  • the concentration of whey protein to be subjected to the enzymatic reaction is not limited as long as the protein can be dissolved, but it is preferably 1 to 30 w / v% from the viewpoint of suppressing gelation and aggregation and saving the trouble of concentration. It is more preferably 1 to 20 w / v%, and even more preferably 5 to 15 w / v%.
  • Whey may be used as it is, or after being concentrated or diluted before being subjected to an enzymatic reaction, and the pH can be adjusted as necessary.
  • the whey protein as a raw material is a solid substance such as a powder, it may be dissolved in any aqueous solvent as long as the enzymatic reaction proceeds, but in consideration of its use as a food, water or food additive grade. It is preferable to dissolve it in the buffer solution of. It is preferable to use a buffer solution so that the pH of the reaction solution does not change due to the amino acids generated in the enzymatic reaction.
  • the type of buffer solution is arbitrary and may be determined in consideration of subsequent use, flavor, taste, amount of minerals, etc., but the pH of the reaction solution is 4 to 9, preferably 5 to 8, more preferably 7 to 7. A composition that can be maintained at 8 is preferable.
  • the buffer solution include sodium citrate buffer solution, sodium carbonate buffer solution, sodium acetate buffer solution, sodium phosphate buffer solution, potassium phosphate buffer solution and the like, and potassium phosphate buffer solution is preferable.
  • the concentration of the buffer solution is arbitrary as long as the buffering effect can be obtained, but considering the flavor, taste and mineral content, for example, 0.01 to 0.5 M can be mentioned, preferably 0.05 to 0. It is 2M, more preferably about 0.1M.
  • the enzyme to be subjected to the enzymatic reaction can be any composition, enzyme agent or enzyme preparation containing a proteolytic enzyme or a proteolytic enzyme, but is preferably an enzyme preparation containing a neutral protease, and one type or the like.
  • the above can be used in combination.
  • the enzyme preparation for example, those derived from microorganisms such as Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae, and Alpergillus meleus can be used, and among them, the enzyme preparation derived from Aspergillus oryzae or the enzyme preparation derived from Alpergillus meleus. Is preferable, and more preferably, it is an enzyme preparation derived from Alpergillus meleus.
  • a commercially available enzyme preparation can be used as the enzyme to be subjected to the enzyme reaction.
  • the enzyme preparation can be obtained from Amano Enzyme, Shin Nihon Kagaku Kogyo, DSM, Danisco, Novozyme, HBI, etc. Is.
  • the amount of the enzyme preparation added is arbitrary, but in consideration of an appropriate hydrolysis reaction rate, cost, etc., for example, 0.01 to 5 w / v%, preferably 0.05 to 4 w / v%, and more. It is preferably 0.1 to 0.5 w / v%.
  • the enzyme reaction temperature and enzyme reaction time can be set so that the raw material protein is sufficiently hydrolyzed and the quality of the enzymatic decomposition product is maintained.
  • the enzyme reaction temperature is, for example, 30 to 70 ° C, preferably 40 to 70 ° C, and more preferably 45 to 65 ° C.
  • the enzyme reaction time is, for example, 1 to 12 hours, preferably 2 to 10 hours, and more preferably 4 to 5 hours.
  • the enzyme reaction temperature and the enzyme reaction time can be appropriately adjusted while checking the amount of the peptide of the present invention produced.
  • the enzymatic reaction can also be performed while raising the temperature.
  • a method of reacting while raising the temperature from 30 ° C. to 75 ° C. over 4 to 10 hours can be mentioned.
  • a method of reacting while raising the temperature from 35 ° C. to 75 ° C. over 5 to 8 hours is preferable, and a method of reacting from 35 ° C. to 75 ° C. over 6 to 8 hours is more preferable.
  • the temperature rise speed and program are optional, but after the enzyme is added, the retention time between 45 ° C and 55 ° C is lengthened (for example, 5 to 7 hours), and then the temperature is quickly raised to 60 ° C and then 60 ° C.
  • a method of holding for a long time (for example, 1 to 3 hours) between the temperature and 75 ° C. is preferable.
  • the most preferable method is to add the enzyme at 50 ° C., hold it for 5 to 7 hours, raise the temperature at an arbitrary rate, and hold it at a target temperature of 60 to 65 ° C. or 65 to 75 ° C. for 1 to 3 hours. ..
  • the reaction solution it is preferable to stir the reaction solution from the viewpoint of reaction efficiency.
  • the liquid stirring speed should be high so that the substrate is in good contact with the enzyme, but if it is too fast, the reaction liquid may scatter. Therefore, for example, 100 to 500 rpm is preferable, and 200 to 400 rpm is more preferable. Is about 250 rpm.
  • the reaction solution containing the desired peptide is produced as a result of the enzymatic reaction, it is preferable to subject the reaction solution containing the desired peptide to the step of stopping the enzymatic reaction.
  • the enzyme reaction termination step a method of inactivating the enzyme by changing the chemical structure of the enzyme by high-temperature treatment of the reaction solution or addition of a chelating agent, or a method of removing the enzyme by membrane treatment can be adopted.
  • a preferred method is a deactivation treatment in which the reaction solution is treated at a high temperature.
  • the high temperature treatment method is, for example, a method of holding at 80 to 90 ° C. for 5 to 30 minutes, preferably a method of holding at 80 to 90 ° C. for 20 to 30 minutes. Further, when the temperature becomes high in the concentration step described later, the concentration step can also be performed.
  • the reaction solution (whey decomposition product) that has undergone the above-mentioned enzyme reaction step and enzyme reaction termination step may be further subjected to a sterilization step.
  • the sterilization step include a membrane treatment step or a heat sterilization step described later.
  • the heat sterilization step can also serve as the above-mentioned enzyme reaction termination step, which is advantageous in terms of simplification of the manufacturing step.
  • the reaction solution (whey decomposition product) that has undergone the enzyme reaction step and the enzyme reaction termination step may be further subjected to a purification step.
  • the purification step include a membrane treatment step using a membrane filtration method such as coarse filtration, precision filtration, ultrafiltration or reverse osmosis, and the preferred membrane treatment is ultrafiltration.
  • the molecular weight cut-off in ultrafiltration can be arbitrarily selected depending on the desired peptide and the enzyme used, but is preferably 3 to 100 kDa, more preferably 5 to 50 kDa.
  • the purification step is advantageous in that the flavor of the peptide composition can be improved as compared with the case where the purification step is not carried out.
  • the purification step can also serve as an enzyme reaction termination step and a sterilization step, which is advantageous in terms of simplification of the manufacturing step.
  • the reaction solution (whey decomposition product) that has undergone the enzyme reaction step and the enzyme reaction termination step may be further subjected to a concentration step from the viewpoint of storage and transportation.
  • a concentration step from the viewpoint of storage and transportation. Any method can be selected for the concentration step, but the method is preferably concentration under reduced pressure, freeze-drying, spray-drying (spray-drying), or concentration by membrane treatment (for example, a method using a reverse osmosis membrane), and more preferably freeze-drying. Dry or spray dry. Spray drying is particularly preferable from the viewpoint of performing concentration in a large amount and efficiently.
  • the whey decomposition product can be contained using the peptide of the present invention as an index.
  • GTWY per serving is 0.001 to 1000 mg (preferably 0. It can contain 01 to 500 mg, more preferably 0.05 to 5 mg) and WY 0.001 to 500 mg (preferably 0.01 to 100 mg, more preferably 0.05 to 3 mg).
  • GTWY may be contained in an amount of 0.001 to 1000 mg (preferably 0.01 to 500 mg, more preferably 0.05 to 5 mg) per serving. It can contain 0.001 to 500 mg (preferably 0.01 to 100 mg, more preferably 0.05 to 3 mg) of WY.
  • a peptide derived from a food material such as a whey protein enzymatic decomposition product
  • a synthetic product, a salt thereof or a solvate thereof can also be used because the peptide chain is short and it is easy to chemically synthesize. That is, the peptide of the present invention is advantageous in that it is easily available.
  • the compositions and preparations of the present invention can be used for the purpose of improving the environment in the intestine and / or the oral cavity.
  • "improvement of the environment in the intestine and / or the oral cavity” means short-chain fatty acids such as good bacteria (for example, lactic acid bacteria, acetic acid bacteria, propionic acid bacteria, butyric acid bacteria) existing in the lower gastrointestinal tract and / or the oral cavity.
  • Producing bacteria and bifidobacteria; in particular, bifidobacteria; relatively increasing, or bad bacteria (eg, Welsh, staphylococcus, Escherichia coli; in particular, Clostridium spp.) Are relatively decreased.
  • Relatively increasing means increasing the proportion of good bacteria in the intestinal and / or oral flora
  • relatively decreasing means increasing the proportion of bad bacteria in the intestinal and / or oral flora. It means to reduce the proportion of bacteria. That is, the improvement of the environment in the intestine and / or the oral cavity is used in the sense of including the improvement of the flora in the intestine and / or the oral cavity.
  • the compositions and preparations of the present invention can be used for the purpose of improving the bacterial flora in the intestine and / or the oral cavity.
  • "improvement of the bacterial flora in the intestine and / or the oral cavity” means increasing the ratio of good bacteria in the bacterial flora in the intestine and / or the oral cavity, or bacteria in the intestine and / or the oral cavity. It means to reduce the ratio of bad bacteria in the flora.
  • the proportion of various bacteria in the intestinal and / or oral flora is determined by, for example, collecting stool from the subject in the case of the intestine and saliva or the like from the subject in the case of the oral cavity.
  • Various bacteria can be evaluated by combining 16S rDNA or genome next-generation sequence amplicon analysis with database retrieval, or by analysis using FISH-flow cytometry.
  • the lower gastrointestinal tract includes the ileum, cecum, colon and rectum.
  • the production of short-chain fatty acids in the intestine and / or the oral cavity is increased by improving the environment in the intestine and / or the oral cavity of the present invention, or improving the flora in the intestine and / or the oral cavity.
  • the compositions and preparations of the present invention can be used for the purpose of promoting the production of short-chain fatty acids in the intestine and / or the oral cavity.
  • Short-chain fatty acids are typical intestinal and / or oral bacterial metabolites produced by fermentation of bacteria in the intestine and / or oral cavity using dietary fiber as a substrate. It is known that short-chain fatty acids play an important role not only as an energy source for the living body but also for the regulation of energy metabolism in the living body. It has been elucidated that it is effective in the prevention and improvement of metabolic diseases such as Jpn. J. Clin. Immunol., 2017, 40 (6), 408-415). ..
  • promotion of short-chain fatty acid production in the intestine is hypertension or chronic kidney disease (Journal of the Japan Renal Society 2017, 59 (4), 562-567), inflammatory bowel disease, atopic dermatitis or autoimmune disease ( Jpn. J. Clin. Immunol., 2017,40 (6), 408-415), mood disorders such as depressive disorder or bipolar disorder, or behavioral abnormalities or intracerebral changes (clinical psychopharmaceutical) caused by stress , 2019, 22, 1045-1052), etc. It is said to be effective for prevention and improvement.
  • compositions and preparations of the present invention are advantageous in that they can be expected to prevent and ameliorate the above-mentioned diseases.
  • the short-chain fatty acid is a fatty acid having 6 or less carbon atoms, preferably 2 to 6 carbon atoms, and is, for example, acetic acid, propionic acid, n-butyric acid, iso-butyric acid, n-valeric acid, iso-valeric acid or. Examples thereof include n-caproic acid.
  • the amount of short-chain fatty acid produced in the intestine and / or in the oral cavity is determined by, for example, collecting stool from the subject in the case of the intestine and saliva or the like from the subject in the case of the oral cavity, and performing gas chromatography or the like. By analyzing using an analyzer, it can be evaluated as the amount of production of the individual short-chain fatty acids in the sample or the total thereof.
  • improving the intestinal and / or oral environment of the present invention improving the intestinal and / or oral flora, or promoting the production of short-chain fatty acids in the intestine and / or the oral cavity, intestinal immunity and / Or it is expected that immunomodulation is performed via oral immunity.
  • the compositions and preparations of the present invention can be used for the purpose of intestinal and / or oral immunomodulation.
  • Short-chain fatty acids which are metabolites of bacteria in the intestine and / or oral cavity, promote the induction of differentiation of immune cells such as dendritic cells, B cells, T cells or regulatory T cells and / or suppress cell death of immune cells. It is known that the immune cells in the intestinal tract and / or the oral cavity are regulated, and that the immune cells are present in Peyer's patches, mesenteric lymph nodes, periodontal tissues, etc. (Jpn. J. Clin.
  • intestinal and / or oral immunomodulation means immunomodulation via intestinal and / or oral immunity, and the intestinal tract (particularly Peyer's patches and / or mesenteric lymph nodes) and / Or means regulation of the immune system via immune cells (eg, T cells or regulatory T cells) present in the oral cavity (particularly periodontal tissue). Regulation of the immune system via immune cells is achieved, for example, by promoting the induction of T cell or regulatory T cell differentiation and / or suppressing cell death of immune cells.
  • immune cells eg, T cells or regulatory T cells
  • the degree of intestinal and / or oral immunomodulation is assessed, for example, by collecting peripheral blood or saliva from the subject and measuring the concentration of immunomodulatory factors such as inflammatory cytokines, inhibitory cytokines or immunoglobulins. can. For example, if the concentration of inflammatory cytokines is high and the concentration of anti-inflammatory cytokines (anti-inflammatory cytokines) is low, it can be evaluated that the immune state is activated, and vice versa, the immune state is controlled or suppressed. Can be evaluated as. Further, if the concentration of immunoglobulin (Ig) A is high, it can be evaluated that the immune state is activated.
  • the degree of intestinal immunomodulation can also be assessed by analyzing lymphocytes collected from the subject.
  • the number of CD86-positive cells is increased, it can be evaluated that the immune system is sufficiently and appropriately activated, and if the number of T cells or regulatory T cells is increased, the excessive reaction of the immune system is suppressed. It can be evaluated that it was done.
  • the composition and the preparation of the present invention can be used for the purpose of promoting improvement of mood condition.
  • the mood state includes, for example, the following seven factors configured in the Profile of Mood States 2nd Edition (POMS2) known as a known method for measuring or evaluating a mood state.
  • POMS2 Profile of Mood States 2nd Edition
  • Anger-Hostility Anger or antipathy to others
  • Confusion-Embarrassment Embarrassment or low cognitive efficiency
  • Depression-Depression Depressed mood with loss of self-confidence
  • Fatigue-lethargy Fatigue, lethargy, and decreased vitality
  • Tension-anxiety Increased musculoskeletal tension
  • Vitality-Vitality Energetic, dynamic and energetic
  • Friendship To others Feeling positive emotions
  • the promotion of improvement may mean, for example, improving from a negative state to a standard or normal state as compared with a standard or normal state, or promoting from a standard or normal state to a positive state, for example.
  • Both phenomena are included. That is, as the promotion of improvement of the mood state in the present invention, for example, a state of apathy, a feeling of apathy, a state of depression, a feeling of depression, and a decrease in vitality in a subject who often feels anxiety or anxiety in daily life. Improvements such as decreased motivation, decreased motivation, anxious mood, anxiety, long-term anxiety, subjective stress, how to feel stress, sensory stress, daily stress or physical pain, etc.
  • the promotion of improvement of the mood state of a subject by the composition and the preparation of the present invention is a state before and after ingestion or administration of the composition and the preparation of the present invention to the subject by using a known method for measuring or evaluating the mood state. Can be measured or evaluated by comparing.
  • Known methods for measuring or evaluating mood states include, for example, POMS2, Beck Depression Inventory 2nd Edition (BDI-II), State-Characteristic Anxiety Test (STAI), Perceptual Stress Scale (PSS), Motivation Score, and Sukemune-Hiew ( SH formula) Resilience Test, Five Facet Mindfulness Questionnaire (FFMQ) or health-related QOL scales, or measurement or evaluation methods using a combination of these scales can be mentioned. Further, for example, a known comprehensive mood state measurement or evaluation method such as Total Mood Disturbance (TMD) or MOS 36-Item Short-Form Health Survey (SF-36 (registered trademark)) in POMS2 can be used. ..
  • compositions and agents of the present invention are used to improve the intestinal and / or oral environment, or to improve the intestinal and / or oral flora, short chains in the intestine and / or oral cavity. Since it can be used for the purpose of promoting fatty acid production, intestinal and / or oral immunomodulation, or promoting improvement of mood condition, the subject to ingest or administer the composition and preparation of the present invention is a subject having the above-mentioned disease. And healthy subjects are included, but healthy subjects (if the subject is a human, a healthy person) are preferred.
  • administration and ingestion may be used interchangeably.
  • the age of the subject to ingest the composition and the preparation of the present invention is not particularly limited, but the composition and the preparation of the present invention are preferably a middle-aged subject (if the subject is a human, for example, 50 years or older). It can be intended to be ingested by a person), and particularly preferably it can be ingested by an elderly subject (if the subject is a human, for example, a person aged 65 or over). That is, the composition and preparation of the present invention can preferably be ingested by middle-aged or elderly subjects.
  • the compositions and preparations of the present invention may also be intended to be ingested by a subject whose intestinal environment has changed due to reasons other than aging, such as diet, antibacterial agents or stress.
  • compositions and preparations of the present invention can be provided in the form of pharmaceuticals (for example, pharmaceutical compositions), quasi-drugs, foods (for example, food compositions), feeds (including pet food), etc. It can be carried out according to the description of.
  • the active ingredient of the present invention can be administered to humans and non-human animals, preferably orally.
  • a typical administration form is a drug or a non-pharmaceutical product, and the preparation containing the active ingredient of the present invention is not particularly limited as long as it is a dosage form suitable for oral administration, but for example, granules, powders, tablets. Examples include (including sugar-coated tablets), pills, capsules, syrups, emulsions or suspensions. These formulations can be formulated using a pharmaceutically acceptable carrier by a method usually used in the art.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, excipients, binders, diluents, additives, fragrances, buffers, thickeners, colorants, stabilizers, emulsifiers, dispersants, suspending agents or preservatives. Agents and the like can be mentioned.
  • Such a pharmaceutical product usually contains an active ingredient of the present invention in an effective amount.
  • the active ingredient of the present invention can be ingested for humans and non-human animals, and is preferably ingested orally.
  • oral ingestion the typical form of ingestion is food.
  • the active ingredient of the present invention is provided as a food, it can be contained in the food and provided.
  • the food provided in this way is a food containing an effective amount of the active ingredient of the present invention.
  • "containing an effective amount" of the active ingredient in the food of the present invention means that the active ingredient of the present invention is ingested within the range described later when the amount normally eaten in each food is ingested.
  • foods include, for example, health foods, functional foods, nutritional supplements, health functional foods (for example, foods for specified health use, nutritionally functional foods, foods with functional claims, etc.), special foods. It is used to include foods for use (for example, foods for infants, foods for pregnant women, foods for the sick, etc.) and supplements. Needless to say, when the active ingredient of the present invention is ingested by an animal other than human, the food of the present invention is used as a feed.
  • the active ingredient of the present invention has the above-mentioned effect of improving the intestinal and / or oral environment, it can be contained in daily foods or provided as a supplement. That is, the compositions and preparations of the present invention can be provided in the form of food.
  • the composition and the preparation of the present invention can be provided in a predetermined unit packaging form in an amount to be ingested per meal. Examples of the unit packaging form per meal include a form in which a fixed amount is specified in packs, packages, cans, bottles, and the like.
  • the intake amount per meal can be determined according to the daily intake amount of the active ingredient of the present invention, which will be described later.
  • the food product of the present invention may be provided with an explanation regarding the amount of intake displayed on the package or with a document or the like containing the explanation.
  • the predetermined intake per meal in the unit packaging form is the effective intake per day divided into two or more times (preferably two or three times). It may be the amount of intake. Therefore, the unit packaging form of the composition and the preparation of the present invention can contain the active ingredient of the present invention at the daily intake amount for humans described later, or 2 of the daily intake amount for humans described later. The active ingredient of the present invention can be contained in an amount of 1/20 to 1/20.
  • the compositions and preparations of the present invention are preferably provided in a "unit packaging form per meal" in which the intake per meal is the effective intake per day.
  • the form of the "food” is not particularly limited, and may be, for example, a beverage form, a semi-liquid or gel form, or a solid form or a powder form.
  • Examples of the "supplement” include tablets produced by adding excipients, binders and the like to the active ingredient of the present invention, kneading them, and then tableting them, and capsules encapsulated in capsules and the like.
  • the unit packaging form per day, per week or per month.
  • the food provided in the present invention is not particularly limited as long as it contains the active ingredient of the present invention.
  • Non-alcoholic beverages such as non-alcoholic beer-taste beverages; carbohydrate-containing foods and drinks such as rice, noodles, breads or pasta; natural cheeses such as Camambale cheese or cheese-containing foods such as processed cheeses; hard type or soft Types of yogurt, fresh cream made from livestock milk and other fats and oils, or dairy products such as ice cream; Western confectionery such as cookies, cakes or chocolates, Japanese confectionery such as buns or sheep, tablet confectionery such as ramune (cool confectionery), Various confectioneries such as candy, gums, cold confectionery such as jelly or pudding, rice confectionery such as ice cream and roasted rice cake or snack confectionery; Non-alcoholic beer with an alcohol content of 1% or less, sparkling
  • the tea beverages include fermented tea, semi-fermented tea and non-fermented tea, for example, tea, green tea, barley tea, brown rice tea, roasted tea, tamaro tea, roasted tea, oolong tea, corn tea, puer tea, and louis bostee. , Rose tea, Kiku tea, Ginkgo leaf tea or herb tea (specifically, mint tea or jasmine tea, etc.) and the like.
  • fruits used in beverages containing fruit juice or beverages containing fruit juice and vegetable juice include apples, oranges, grapes, bananas, pears, peaches, mangoes, acai, blueberries and ume.
  • vegetables used in beverages containing vegetable juice or beverages containing fruit juice and vegetable juice include tomatoes, carrots, celery, pumpkins, cucumbers and watermelons.
  • the intake (administration) amount of the active ingredient of the present invention depends on the sex, age and weight of the recipient, symptoms, intake (administration) timing, intake (administration) time, dosage form, intake (administration) route, drugs to be combined, and the like. Can be decided. Improvement of the intestinal and / or oral environment, improvement of intestinal and / or oral flora, promotion of short-chain fatty acid production in the intestine and / or oral cavity, immunomodulation in the intestinal tract and / or oral cavity, or mood status
  • the daily intake (solid content equivalent) of whey decomposition products for the purpose of promoting improvement is, for example, 1 to 50,000 mg (preferably 10 to 10000 mg, more preferably 100 to 5000 mg) for adults of GTWY.
  • the daily intake (in terms of solid content) is, for example, 0.001 to 1000 mg (preferably 0.01 to 500 mg, more preferably 0.05 to 5 mg), and the daily intake of WY for adults (solid).
  • the minute conversion is, for example, 0.001 to 500 mg (preferably 0.01 to 100 mg, more preferably 0.05 to 3 mg).
  • the above-mentioned intake amount of the active ingredient of the present invention and the following intake timing and intake period are applicable when the active ingredient of the present invention is used for both non-therapeutic and therapeutic purposes, and are ingested for therapeutic purposes. Can be read as administration.
  • the active ingredient of the present invention can also be ingested by mammals other than humans (for example, mice, rats, rabbits, dogs, cats, cows, horses, pigs, monkeys, dolphins, sea lions, etc.).
  • mammals other than humans for example, mice, rats, rabbits, dogs, cats, cows, horses, pigs, monkeys, dolphins, sea lions, etc.
  • the amount, ingestion timing and ingestion period can be determined with reference to the above-mentioned description regarding humans.
  • the active ingredient of the present invention is to improve the environment in the intestine and / or the oral cavity, improve the flora in the intestine and / or the oral cavity, promote the production of short-chain fatty acids in the intestine and / or the oral cavity, the intestinal tract and / or the oral cavity. It is preferable to continue the intake during the period when the effect of immunomodulation or promotion of improvement of mood condition is expected.
  • the ingestion period of the active ingredient of the present invention is, for example, at least 7 days (preferably at least 14 days, more preferably at least 42 days) ingestion of the above daily dose.
  • the daily intake can be once every three days, once every two days or once a day, and the daily intake can be taken. It can also be divided into 2 or more times (preferably 2 or 3 times) per day.
  • compositions, preparations and foods of the present invention include improvement of the intestinal and / or oral environment, improvement of the intestinal and / or oral flora, promotion of short-chain fatty acid production in the intestine and / or oral cavity.
  • it may be labeled as having an immunomodulatory effect in the intestinal tract and / or the oral cavity.
  • the compositions, preparations and foods of the present invention may be labeled in part or in whole as follows in order to make the labeling easy for consumers to understand.
  • compositions, the preparation and the food of the present invention may be labeled to have an effect of promoting improvement of mood condition.
  • the compositions, preparations and foods of the present invention may be labeled in part or in whole as follows in order to make the labeling easy for consumers to understand.
  • the "effect of promoting improvement of mood state" is used in the sense of including the following indications.
  • a whey protein enzymatic degradation product containing a peptide having the amino acid sequence of GTWY (SEQ ID NO: 1) and / or a peptide having the amino acid sequence of WY is ingested by a subject in need thereof.
  • Methods, methods of immunomodulating the intestinal tract and / or oral cavity, or methods of promoting improvement of mood status are provided.
  • the peptide having the amino acid sequence of GTWY (SEQ ID NO: 1) and / or the peptide having the amino acid sequence of WY is ingested or administered to a subject in need thereof.
  • a method of regulating the intestine within the body, or a method of promoting improvement of the mood state is provided.
  • the method of the present invention can be carried out according to the description regarding the composition and the preparation of the present invention.
  • an intestinal and / or oral environment improver an intestinal and / or oral flora improver, an intestinal and / or oral short chain fatty acid production promoter.
  • Intestinal and / or oral environmental improvers intestinal and / or oral flora improvers, for the production of intestinal and / or oral immunomodulators, or mood improvement promoters,
  • an immunomodulator in the intestinal tract and / or the oral cavity, or as a mood improvement promoter or to improve the intestinal and / or oral environment of the present invention.
  • an intestinal and / or oral environment improver an intestinal and / or oral flora improver, an intestinal and / or oral short chain fatty acid production promoter, Intestinal and / or oral environment improvers, intestinal and / or oral flora improvers, intestines for the production of intestinal and / or oral immunomodulators, or mood improvement promoters.
  • an intestinal and / or oral short-chain fatty acid production promoter an intestinal and / or oral immunomodulator, or a mood improvement promoter, or the method for improving the intestinal and / or oral environment of the present invention.
  • GTWY in a method for improving the bacterial flora in the intestine and / or the oral cavity, a method for promoting the production of short-chain fatty acids in the intestine and / or the oral cavity, a method for immunomodulating the intestinal tract and / or the oral cavity, or a method for promoting the improvement of mood condition.
  • the use of a peptide having the amino acid sequence of (SEQ ID NO: 1) and / or a peptide having the amino acid sequence of WY is provided. Use of the present invention can be carried out in accordance with the description of the compositions and agents of the present invention.
  • improvement of the intestinal and / or oral environment improvement of intestinal and / or oral flora, promotion of short-chain fatty acid production in the intestine and / or oral cavity, intestinal tract.
  • Whey protein enzymatic degradation containing a peptide having the amino acid sequence of GTWY (SEQ ID NO: 1) and / or a peptide having the amino acid sequence of WY for use in immunoregulation in the oral cavity or a method for promoting improvement of mood condition. Things are provided.
  • improvement of the intestinal and / or oral environment improvement of the intestinal and / or oral flora, promotion of short chain fatty acid production in the intestine and / or oral cavity, intestinal tract and / or.
  • a peptide having a GTWY (SEQ ID NO: 1) amino acid sequence and / or a peptide having a WY amino acid sequence for use in oral immunomodulation or promotion of improvement of mood state is provided.
  • the above whey protein enzymatic degradation products and the two peptides can be carried out according to the description of the compositions and preparations of the present invention, respectively.
  • non-therapeutic means does not include the act of surgery, treatment or diagnosis of a human (ie, medical practice for a human), specifically under the direction of a physician or physician. It means that a person does not include a method of performing surgery, treatment or diagnosis on a human.
  • Example 1 Improvement of intestinal environment by WY peptide (1)
  • an animal model was used to evaluate the effect of WY peptide on improving the intestinal environment.
  • human 20-30 years old is 3-6 months old (mature individual)
  • human 38-47 years old is 10-14 months old (middle-aged individual)
  • human 56- 69 years old is 18 to 24 months old (old individual) of this mouse.
  • Example 1 After training and breeding this mouse, 6-month-old individuals were divided into 15 WY-intake groups and 15 non-intake groups so that their weights would not be biased.
  • the WY ingestion group was allowed to freely feed a purified feed (AIN-93M, Oriental Yeast Co., Ltd.) containing 0.05% (w / w) of WY peptide in terms of dry mass.
  • the non-ingestion group was allowed to freely feed AIN-93M containing no WY peptide.
  • the amount of short-chain fatty acids was quantified by the gas chromatography (GC) method according to a conventional method. Specifically, 100 mg of the sampled sample was precisely weighed in a bead tube, a 9-fold amount of a 0.5% phosphoric acid solution was added, and the mixture was mixed and then heat-treated at 85 ° C. for 15 minutes. The sample was crushed and then cooled, the supernatant after centrifugation (14000 rpm, 10 minutes) was transferred to a new tube, an equal amount of ethyl acetate was added and mixed, and the sample was centrifuged again (14000 rpm, 10 minutes).
  • GC gas chromatography
  • the ethyl acetate layer was transferred to a vial, and an internal standard substance (4-methylpentanoate) was added to prepare a measurement sample.
  • the measurement was performed using the separation / detection system GC-FID (7890B, Agilent Technologies) under the conditions shown in Table 1, and the concentration conversion was performed by the absolute calibration curve method using a standard product.
  • PCR used 34lf-R806 and Dual-index (8-bp barcode) (Appl Environ Microbiol 1993; 59: 695-700, Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108 Suppl 1: 4516-4522.), Said Takahashi et al. It was done according to the conditions of. Sequencing was performed by next-generation sequence amplicon analysis. The next-generation sequence was performed using a MiSeq (Illumina) device and using the MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycles) (Illumina) under the protocol conditions attached to the device. FASTQ pair-end concatenation was set to fastq-join (default condition), and quality filtering was set to sequences in which 99% or more of the sequences satisfy Quality Value 20 or more.
  • Database search Microbial identification database DB-BA13.0 (TechnoSurugaLaboratory) and Metagenomic @ KIN (World Fusion) software were used to extract classification groups (kingdom-species) with a homology rate of 97% or more (Appl Environ Microbiol 1993; 59). : 695-700, Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108 Suppl 1: 4516-4522., Arch Microbiol 2015; 197: 19-934., BMC Gastroenterol 2015; 15: 100.).
  • Example 2 Improvement of intestinal environment by WY peptide (2)
  • 66-week-old C57BL / 6J male mice were used to evaluate the effect of WY peptide on improving the intestinal environment.
  • Example 3 Effect of WY peptide on intestinal immunity
  • the immune cells of the mesenteric lymph nodes of the test substance WY peptide were compared and examined between the test substance ingested mouse and the non-ingested mouse.
  • the excised mesenteric lymph nodes were treated with collagenase 4 (Roche) and filtered with a 70 ⁇ m cell strainer to collect lymphocytes. Then, the collected lymphocytes were analyzed by the method described in (a) below. In the following a, reagents for which the source is not listed were obtained from eBioscience.
  • B. Lymphocyte analysis Analysis of dendritic cells Collected lymphocytes were subjected to FITC-IA / IE, PE-PDL-1, PE-CD80, FITC-CD86, CD11b-APC-Cy7 (BD Pharminge), CD11c-PE according to a conventional method. -Stained with Cy7 and analyzed dendritic cells using a flow cytometer (BD CANTO2).
  • T cells Collected lymphocytes are treated with Leukocyte, Activation, Cocktail, with, BD, and GorgiPlug (BD Pharminge) for 4 and a half hours according to a conventional method, and CD4-APC, TNF- ⁇ using Cell Fixation / Permeavilation Kit.
  • the cells were stained with FITC and IFN- ⁇ -PE-Cy7 antibodies and analyzed with a flow cytometer.
  • Example 4 Improvement of intestinal environment by GTWY peptide
  • the effect of improving the intestinal environment by GTWY peptide was evaluated using C57BL / 6J male mice.
  • Example 5 Improvement of intestinal environment by whey decomposition products (1)
  • a male mouse of Crl: CD1 (ICR) (Charles River Laboratories, Japan) was used to evaluate the effect of improving the intestinal environment by a whey decomposition product (Megmilk Snow Brand, HW-3).
  • CD1 ICR male mice
  • 6.5-month-old individuals were divided into 7 whey decomposition product intake groups and 10 non-whey decomposition product intake groups so that their weights were not biased.
  • the whey decomposition product intake group includes a purified feed (AIN-93M, Oriental Yeast Co., Ltd.) containing 5% (w / w) of whey decomposition product in terms of dry mass, and the amount of protein is 14%. Adjustment) was fed freely.
  • the non-ingestion group was allowed to freely feed AIN-93M (casein amount 14%) containing no whey decomposition product.
  • the conditions and methods other than the above were the same as the conditions and methods described in Example 1 (1).
  • Bacterial flora analysis As shown in FIG. 10, the ratio of Bacteroidetes phylum to the total number of leads was significantly decreased and the ratio of Actinobacteria phylum was significantly increased in the whey decomposition product ingestion group as compared with the non-intake group. Further, as shown in FIG. 11, and the rate is significantly reduced in Bacteroides genus for whey hydrolyzate intake group total number of leads as compared to the non-intake group was reduced although not significant proportion of Romboutsia genus Bifidobacterium genus, The proportion of the genus Lactobacillus increased, though not significantly. Furthermore, as shown in FIG.
  • Example 6 Improvement of intestinal environment by whey decomposition products (2)
  • Example 6 62-week-old C57BL / 6J male mice were used to evaluate the effect of whey degradation products on improving the intestinal environment.
  • mice are converted into middle-aged humans at the start of ingestion of the test feed and into old-aged humans at the end of ingestion. Therefore, it was shown that ingestion of whey decomposition products increases the amount of short-chain fatty acids and improves the intestinal environment even in elderly subjects (humans 56 to 69 years old).
  • Example 7 Measurement of the contents of tetrapeptide GTWY and dipeptide WY in the whey decomposition product
  • (1) Preparation of analysis sample Add sterilized water to the whey decomposition product (HW-3, Megmilk Snow Brand), dilute and filter as appropriate, and measure. It was used as a sample.
  • the whey degradation product (HW-3) is a product obtained by allowing an enzyme preparation containing a proteolytic enzyme to act on a whey protein, then performing a membrane treatment to remove the undegraded product, and then drying the product, which will be described later. As described above, it contains tetrapeptide GTWY and dipeptide WY.
  • Example 8 Verification of mood state, health-related QOL, saliva immunity index, and intestinal environment improvement effect by whey decomposition products in humans
  • whey decomposition products Snow Brand Megmilk Co., Ltd.
  • HW-3 whey decomposition products in a clinical test in humans.
  • HW-3 whey decomposition products in a clinical test in humans.
  • HW-3 whey decomposition products in a clinical test in humans.
  • the mood state, health-related QOL (Quality of Life), saliva immunity index, and intestinal environment improving effect were examined.
  • Test foods During the test period (6 weeks), 6 test foods were ingested in the test food group and 6 control foods were ingested in the control food group once a day with water or lukewarm water every day.
  • test food As a test food, a whey decomposition product (HW-3, Snow Brand Megmilk Co., Ltd.), an excipient and a binder are mixed and kneaded, and then tableted to contain a whey decomposition product-containing tablet (300 mg / 300 mg /). Grains) were produced. The content of whey decomposition product in one tablet was 168 mg. As a control food, a whey decomposition product-free tablet containing 168 mg of maltodextrin instead of the whey decomposition product was used.
  • HW-3 Snow Brand Megmilk Co., Ltd.
  • Tetrapeptide GTWY is contained in 0.27 mg (0.090% by mass) and dipeptide WY is contained in 0.11 mg (0.036% by mass) in one tablet (300 mg) containing whey decomposition products. It was confirmed. It was confirmed that both the tetrapeptide GTWY and the dipeptide WY in the whey decomposition product-free tablet were below the detection limit.
  • Measurement items The measurement items are as follows.
  • Perceptual stress scale (sometimes referred to as “PSS” herein) ⁇ Motivation score
  • (ii) Health-related QOL -SF-36v2 Japanese version Acute version (sometimes referred to as “SF-36” in this specification)
  • (Iii) Saliva immunity index-Amount of immunoglobulin A in saliva in this specification, it may be referred to as "IgA”).
  • Mood state STAI, PSS and motivation scores were performed once (twice in total) before the start of test food intake (week 0) and at the time of the subject's visit 6 weeks after the start of test food intake.
  • Health-related QOL SF-36 was performed once (4 times in total) at the subject's home before the start of ingestion of the test food (week 0), and at the 2nd, 4th, and 6th weeks after the start of ingestion of the test food.
  • Saliva immunity index Saliva samples were collected once each (twice in total) at the time of the subject's visit before the start of ingestion of the test food (week 0) and 6 weeks after the start of ingestion of the test food.
  • the sample was taken at the 6th week of ingestion.
  • the supernatant separated by centrifugation after collection was stored frozen, and the 0-week sample and the 6-week sample were measured at the same time after the 6-week sample collection.
  • Intestinal environment Feces are collected once from 7 days before the scheduled start date of test food intake to the day before, and once from 7 days before the scheduled end date of test food intake to the day before (total 2 times), and each intake is 0.
  • the sample was taken at the week and the 6th week of ingestion.
  • the stool sample was collected in a cold state and stored frozen, and the 0-week sample and the 6-week sample were measured at the same time after the 6-week sample collection.
  • STAI is a questionnaire that evaluates anxiety by dividing it into state anxiety (anxiety felt at the time of answering, short-term anxiety) and characteristic anxiety (easiness to feel anxiety as a respondent's personality, long-term anxiety).
  • This is a questionnaire consisting of 20 items, which are state anxiety items, and 20 items, which are characteristic anxiety items. The higher the score, the higher the degree of anxiety (Reference: "Handbook for Evaluation of Mental and Psychological Function", pp. 238-239, Toshio Yamauchi, Haruo Kashima et al., Nakayama Shoten).
  • PSS is a questionnaire that evaluates subjective stress, and indicates that the higher the score, the higher the perception of subjective stress (Reference: "Reliance in the Japanese version of the Perceived Stress Scale”. Examination of Sex and Relevance ”, Health Psychology Research Vol. 19 (2006) No. 2, Katsunori Sumi).
  • the motivation score is a 14-item questionnaire used to determine apathy (decreased motivation). The higher the score, the lower the motivation (Reference: "Handbook for Evaluation of Mental and Psychological Function", pp. 462-463).
  • SF-36 Health-related QOL
  • two component summary scores (QOL of physical aspect and QOL of mental aspect) of the Japanese version were calculated from eight subscales. The higher the score, the higher the QOL (Reference: "Handbook for Evaluation of Mental and Psychological Function", pp. 205-206).
  • Saliva immunity index The subject gargled with water after visiting the hospital, rested in a sitting position for 15 minutes, and then collected saliva. Saliva was collected using Sarisoft (Sarstedt). The sponge attached to Sarisoft was contained in the mouth for 2 to 3 minutes, saliva was soaked into the sponge, and the sponge was returned to Sarisoft after 2 to 3 minutes. The obtained saliva was centrifuged (2,000 rpm, room temperature, 5 minutes), and the obtained saliva (about 1 g) was dispensed into a microtube and frozen at ⁇ 80 ° C. The frozen sample was thawed overnight at 4 ° C. and used for measurement. IgA in saliva was quantified using the Secretory Immunoglobulin A Salivary Immunoassay Kit (Salimetrics) according to the protocol attached to the kit.
  • Mood state STAI, PSS and motivation score are calculated after obtaining the measured values of each of the 0th week of ingestion and the 6th week of ingestion, and then the amount of change from the 0th week of ingestion at the 6th week of ingestion is calculated. bottom.
  • the motivation score was stratified by gender and evaluated for women.
  • the measured values and the amount of change of each endpoint at 6 weeks after ingestion were compared using the Mann-Whitney U test.
  • the measured values at the 0th week of ingestion and the 6th week of ingestion were compared using the Wilcoxon signed rank sum test in the test food group and the control food group, respectively.
  • the amount of change from the 0th week of ingestion at the 2nd week of ingestion, the 4th week of ingestion and the 6th week of ingestion was compared using a 2-sample t-test.
  • the measured values of the test food group and the control food group at the 2nd week of ingestion, the 4th week of ingestion, and the 6th week of ingestion were compared using a two-sample t-test.
  • the measured values at the 2nd week, the 4th week, and the 6th week of ingestion and the measured values at the 0th week of ingestion were compared using a 1-sample t-test.
  • Saliva immunity index The amount of IgA in saliva was changed from the 0th week of ingestion at the 6th week of ingestion after obtaining the measured values at the 0th week of ingestion and the 6th week of ingestion.
  • the measured values and the amount of change at 6 weeks of ingestion were evaluated using a two-sample t-test.
  • the measured values at the 0th week of ingestion and the 6th week of ingestion were compared in the test food group and the control food group, respectively, using the 1-sample t-test.
  • D. Intestinal environment Short-chain fatty acids were analyzed by stratified analysis of older subjects (median age 54.5 years or older). The amount of short-chain fatty acids in feces was calculated as the amount of change from the 0th week of ingestion at the 6th week of ingestion after obtaining the measured values at the 0th week of ingestion and the 6th week of ingestion. In the test food group and the control food group, the measured values and the amount of change at 6 weeks of ingestion were evaluated using a two-sample t-test. In addition, the measured values at the 0th week of ingestion and the 6th week of ingestion were compared in the test food group and the control food group, respectively, using the 1-sample t-test.
  • iso-butyric acid, n-valeric acid, iso-valeric acid and n-caproic acid have a value of less than the lower limit of quantification of 0.3 ⁇ mol / g at either the 0th week or the 6th week.
  • the relevant item was set as a missing value.
  • the results of the motivation score are shown in Table 5, and the results of the stratified analysis of the motivation score for women are shown in Table 6.
  • mental health summary score
  • Table 9 shows the measurement results of the amount of short-chain fatty acids in subjects of older age (median age or higher).
  • whey degradation products containing tetrapeptide GTWY or dipeptide WY improve mood conditions such as long-term anxiety or depression, subjective stress or decreased motivation, vitality or mental health. It has been shown to improve health-related QOL such as mental health, improve immune status using IgA as an index, and increase the amount of short-chain fatty acids in feces to improve the intestinal environment.

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Abstract

本発明は腸内または口腔内の環境改善用組成物、腸内または口腔内の菌叢改善用組成物、腸内または口腔内における短鎖脂肪酸産生促進用組成物、腸管または口腔内免疫調節用組成物および気分状態改善促進用組成物の提供を目的とする。本発明によれば、ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドおよび／またはＷＹのアミノ酸配列を有するペプチドを含有するホエイタンパク質酵素分解物を有効成分として含んでなる、腸内もしくは口腔内の環境改善、腸内もしくは口腔内の菌叢改善および／または腸内もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進用組成物、腸管もしくは口腔内免疫調節用組成物並びに気分状態改善促進用組成物が提供される。

Description

腸内または口腔内の環境改善用組成物 関連出願の参照
　本願は、先行する日本国出願である特願２０２０－６７８５５（出願日：２０２０年４月３日）の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。
　本発明は腸内および／または口腔内の環境改善用組成物に関する。本発明はまた、腸内および／または口腔内の菌叢改善用組成物、腸内および／または口腔内における短鎖脂肪酸産生促進用組成物、腸管および／または口腔内の免疫調節用組成物、並びに気分状態改善促進用組成物に関する。
　腸内には細菌が推定４０兆個ほど存在し、これら細菌群は腸内フローラ（腸内菌叢）と呼ばれている。また、腸内と同様、口腔内にも細菌が存在し、これらの細菌群は口腔内フローラ（口内フローラまたは口腔内菌叢）と呼ばれている。腸内または口腔内の菌叢を構成する細菌は個人個人で種類や量に違いがあることが知られているところ、これら腸内または口腔内の細菌は多様な働きを持ち、近年では腸内または口腔内の菌叢の状態が多くの疾患に関係していることが分かってきた。また、ヒトの免疫機能の多くが腸内菌叢の状態に依存し、またヒトの免疫機能と口腔内菌叢の状態に関連があることが明らかとなっており、腸内または口腔内の菌叢のバランスを適切に保つことにより免疫機能を正常な状態に維持できることも分かってきた。すなわち、腸内および／または口腔内の環境を整えることで健康を維持できるとともに生活習慣病をはじめとする様々な疾患の予防につながることが期待されている。
　このような背景のもと腸内および／または口腔内の環境の改善に有効な様々な成分ないし素材が開発されてきた。例えば、特許文献１には乳由来の糖ペプチドを含有する腸内環境改善用組成物が開示されている。
国際公開第２０１９／０４４９６０号
　本発明は新規な腸内および／または口腔内の環境改善用組成物および腸内および／または口腔内の環境改善剤の提供を目的とする。本発明はまた、新規な腸内および／または口腔内の菌叢改善用組成物および腸内および／または口腔内の菌叢改善剤、腸内および／または口腔内における新規な短鎖脂肪酸産生促進用組成物および短鎖脂肪酸産生促進剤、新規な腸管および／または口腔内の免疫調節用組成物および腸管および／または口腔内の免疫調節剤、並びに気分状態改善促進用組成物および気分状態改善促進剤の提供を目的とする。
　本発明者らは今般、動物モデルを用いた試験およびヒト試験において、マウスまたはヒトに特定配列を有するペプチドや該ペプチドを含有するホエイタンパク質分解物を摂取させたところ、腸内および口腔内の菌叢改善効果、並びに短鎖脂肪酸の産生促進効果をはじめとする腸内および口腔内の環境改善効果があることを見出した。本発明者らはまた、特定配列を有するペプチドや該ペプチドを含有するホエイタンパク質分解物に腸管および口腔内の免疫を介した免疫調節作用、並びに気分状態の改善促進作用があることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
　本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドおよび／またはＷＹのアミノ酸配列を有するペプチドを含有するホエイタンパク質酵素分解物を有効成分として含んでなる、腸内および／もしくは口腔内の環境改善用組成物、腸内および／もしくは口腔内の菌叢改善用組成物または腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進用組成物、並びに腸内および／もしくは口腔内の環境改善剤、腸内および／もしくは口腔内の菌叢改善剤または腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進剤。
［２］ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドおよび／またはＷＹのアミノ酸配列を有するペプチドを含有するホエイタンパク質酵素分解物を有効成分として含んでなる、腸管および／または口腔内免疫調節用組成物、並びに腸管および／または口腔内免疫調節剤。
［３］ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドおよび／またはＷＹのアミノ酸配列を有するペプチドを含有するホエイタンパク質酵素分解物を有効成分として含んでなる、気分状態の改善促進用組成物、並びに気分状態の改善促進剤。
［４］ホエイタンパク質酵素分解物中のＧＴＷＹの含有量（固形分換算）が０．５～５ｍｇ／ｇである、上記［１］～［３］に記載の組成物および用剤。
［５］ホエイタンパク質酵素分解物中のＷＹの含有量（固形分換算）が０．０５～２ｍｇ／ｇである、上記［１］～［４］のいずれかに記載の組成物および用剤。
［６］ホエイタンパク質酵素分解物をヒト１日当たり１～５００００ｍｇ（固形分換算）で摂取させる、上記［１］～［５］のいずれかに記載の組成物および用剤。
［７］ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドおよび／またはＷＹのアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含んでなる、腸内および／もしくは口腔内の環境改善用組成物、腸内および／もしくは口腔内の菌叢改善用組成物または腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進用組成物、並びに腸内および／もしくは口腔内の環境改善剤、腸内および／もしくは口腔内の菌叢改善剤または腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進剤。
［８］ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドおよび／またはＷＹのアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含んでなる、腸管および／もしくは口腔内の免疫調節用組成物、並びに腸管および／もしくは口腔内の免疫調節剤。
［９］ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドおよび／またはＷＹのアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含んでなる、気分状態の改善促進用組成物、並びに気分状態の改善促進剤。
［１０］ＧＴＷＹ（配列番号１）をヒト１日当たり０．００１～１０００ｍｇ（固形分換算）で摂取させる、上記［１］～［９］のいずれかに記載の組成物および用剤。
［１１］ＷＹをヒト１日当たり０．００１～５００ｍｇ（固形分換算）で摂取させる、上記［１］～［１０］のいずれかに記載の組成物および用剤。
［１２］食品組成物である、上記［１］～［１１］に記載の組成物および用剤。
［１３］１食当たりの単位包装形態である、上記［１］～［１２］のいずれかに記載の組成物および用剤。
［１５］健常人に摂取させるための、上記［１］～［１３］のいずれかに記載の組成物および用剤。
［１６］中高年者に摂取させるための、上記［１］～［１４］のいずれかに記載の組成物および用剤。
　上記［１］、［２］、［３］、［７］、［８］および［９］の組成物を本明細書において「本発明の組成物」と、上記［１］、［２］、［３］、［７］、［８］および［９］の用剤を本明細書において「本発明の用剤」と、それぞれいうことがある。
　本発明の有効成分であるホエイタンパク質酵素分解物は、ヒトが長年摂取してきた食品素材に由来する成分である。したがって、本発明の組成物および用剤は、腸内および／または口腔内の環境を改善する機能性食品として利用できるとともに、ヒトを含む哺乳類に安全な機能性食品として利用できる点で有利である。
図１は、ＷＹペプチドによる６月齢（摂取開始時）のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスにおける短鎖脂肪酸の定量結果（摂取期間終了時）を示す（摂取期間：１．５ヶ月、非摂取群：ｎ＝７、摂取群：ｎ＝７）。＊はＰ＜０．０５％、エラーバーは標準誤差を示す。 図２は、ＷＹペプチドによる６月齢（摂取開始時）のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスにおける短鎖脂肪酸の定量結果（摂取期間終了時）を示す（摂取期間：３ヶ月、非摂取群：ｎ＝８、摂取群：ｎ＝８）。＊はＰ＜０．０５％、エラーバーは標準誤差を示す。 図３は、ＷＹペプチドによる６月齢（摂取開始時）のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスにおける菌叢解析の結果（摂取期間終了時）を示す（摂取期間：３ヶ月、非摂取群：ｎ＝８、摂取群：ｎ＝８）。＊はＰ＜０．０５％を示す。 図４は、ＷＹペプチドによる６月齢（摂取開始時）のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスにおける菌叢解析の結果（摂取期間終了時）について、摂取期間を１．５ヶ月（１．５Ｍ、ＷＹ非摂取群：ｎ＝７、ＷＹ摂取群：ｎ＝７）と３ヶ月（３Ｍ、ＷＹ非摂取群：ｎ＝８、ＷＹ摂取群：ｎ＝８）とした場合のそれぞれを比較したものを示す。ＣＴＬはＷＹ非摂取群、ＷＹはＷＹ摂取群、＊はＰ＜０．０５％、エラーバーは標準誤差を示す。 図５は、ＷＹペプチドによる６月齢（摂取開始時）のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスにおける菌叢解析の結果（摂取期間終了時）について、摂取期間を１．５ヶ月（１．５Ｍ、非摂取群：ｎ＝７、摂取群：ｎ＝７）と３ヶ月（３Ｍ、非摂取群：ｎ＝８、摂取群：ｎ＝８）とした場合のそれぞれを比較したものを示す。ＣＴＬはＷＹ非摂取群、ＷＹはＷＹ摂取群、＊はＰ＜０．０５％、エラーバーは標準誤差を示す。 図６は、ＷＹペプチドによる６６週齢（摂取開始時）のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスにおける短鎖脂肪酸の定量結果（摂取期間終了時）を示す（摂取期間：４．５ヶ月、非摂取群：ｎ＝１０、摂取群：ｎ＝９）。ＣＴＬはＷＹ非摂取群、ＷＹはＷＹ摂取群、＊はＰ＜０．０５％、エラーバーは標準誤差を示す。 図７は、ＷＹペプチドによる３月齢（摂取開始時）のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスおけるリンパ球解析の結果（摂取期間終了時）を示す（摂取期間：３ヶ月、非摂取群：ｎ＝１０、摂取群：ｎ＝１０）。ＣＴＬはＷＹ非摂取群、ＷＹはＷＹ摂取群、＊はＰ＜０．０５％、エラーバーは標準誤差を示す。 図８は、ＧＴＷＹペプチドによる６２週齢（摂取開始時）のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスにおける短鎖脂肪酸の定量結果（摂取期間終了時）を示す（摂取期間：８．５ヶ月、非摂取群：ｎ＝１２、摂取群：ｎ＝８）。ＣＴＬはＧＴＷＹ非摂取群、ＧＴＷＹはＧＴＷＹ摂取群、＊はＰ＜０．０５％、エラーバーは標準誤差を示す。 図９は、ホエイ分解物による６．５月齢（摂取開始時）のＣｒｌ：ＣＤ１（ＩＣＲ）雄性マウスおける短鎖脂肪酸の定量結果（摂取期間終了時）を示す（摂取期間：３ヶ月、非摂取群：ｎ＝１０、摂取群：ｎ＝７）。＊はＰ＜０．０５％、エラーバーは標準誤差を示す。 図１０は、ホエイ分解物による６．５月齢（摂取開始時）のＣｒｌ：ＣＤ１（ＩＣＲ）雄性マウスにおける菌叢解析の結果（摂取期間終了時）を示す（摂取期間：３ヶ月、非摂取群：ｎ＝１０、摂取群：ｎ＝７）。＊はＰ＜０．０５％を示す。 図１１は、ホエイ分解物による６．５月齢（摂取開始時）のＣｒｌ：ＣＤ１（ＩＣＲ）雄性マウスにおける菌叢解析の結果（摂取期間終了時）を示す（摂取期間：３ヶ月）。ＣＴＬはホエイ分解物非摂取群（ｎ＝１０）、ＨＷ－３はホエイ分解物摂取群（ｎ＝７）、＊はＰ＜０．０５％、エラーバーは標準誤差を示す。 図１２は、ホエイ分解物による６．５月齢（摂取開始時）のＣｒｌ：ＣＤ１（ＩＣＲ）雄性マウスにおける菌叢解析の結果（摂取期間終了時）を示す（摂取期間：３ヶ月）。ＣＴＬはホエイ分解物非摂取群（ｎ＝１０）、ＨＷ－３はホエイ分解物摂取群（ｎ＝７）、＊はＰ＜０．０５％、エラーバーは標準誤差を示す。 図１３は、ホエイ分解物による６２週齢（摂取開始時）のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスにおける短鎖脂肪酸の定量結果（摂取期間終了時）を示す（摂取期間：８．５ヶ月）。ＣＴＬはホエイ分解物非摂取群（ｎ＝１２）、ＨＷ－３はホエイ分解物摂取群（ｎ＝１５）、＊はＰ＜０．０５％、エラーバーは標準誤差を示す。
発明の具体的説明
　本発明の組成物および用剤は有効成分としてホエイタンパク質酵素分解物を含んでなるものである。本発明において「ホエイ」とは、乳清、乳漿またはホエー等ともいい、乳から乳脂肪分およびカゼイン等を除いた水溶液を意味する。ホエイはβ－ラクトグロブリン、α－ラクトアルブミン、血清アルブミンおよび免疫グロブリン等のタンパク質から構成される。本発明で使用するホエイの由来動植物は問わないが、牛乳由来ホエイを用いることが好ましい。本発明の組成物および用剤の有効成分であるホエイタンパク質酵素分解物（本明細書において単に「ホエイ分解物」ということがある）は、ホエイの酵素分解物である限り限定されない。
　本発明の組成物および用剤におけるホエイ分解物の含有量（固形分換算）は、その目的、用途、形態または剤型等に応じて任意に定めることができ、本発明はこれに限定されないが、例えば、液体組成物および液剤の場合には、全体量に対して０．００１～１００ｍｇ／１００ｍＬ（好ましくは０．００５～５０ｍｇ／１００ｍＬ、より好ましくは０．０１～１０ｍｇ／１００ｍＬ）であり、固体組成物および固形剤の場合には、全体量に対して０．１～９０質量％（好ましくは０．５～８０質量％、より好ましくは１～７０質量％）である。
　また、本発明の組成物および用剤は、有効成分としてＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドおよびＷＹのアミノ酸配列を有するペプチド（以下、これらを「本発明のペプチド」ということがある）のいずれかまたは両方を、少なくとも含んでなるものとして特定することができる。したがって本発明のホエイ分解物は、ＧＴＷＹのアミノ酸配列を有するペプチドおよびＷＹのアミノ酸配列を有するペプチドのいずれかまたは両方を含有してなるものを使用することができる。ここで、「アミノ酸配列を有するペプチド」とは、前記アミノ酸配列により配列が特定されたペプチドを意味する。また、ＧＴＷＹは４つのアミノ酸からなるテトラペプチド、ＷＹは２つのアミノ酸からなるジペプチドをそれぞれ意味する。
　本発明のホエイ分解物中のＧＴＷＹの含有量（固形分換算）は、例えば、ホエイ分解物全体量に対して０．０１～１質量％（好ましくは０．０５～０．５質量％、より好ましくは０．１～０．２質量％）であり、ＷＹの含有量（固形分換算）は、例えば、ホエイ分解物全体量に対して０．００５～０．５質量％（好ましくは０．０１～０．１質量％、より好ましくは０．０３～０．０９質量％）である。
　本発明のペプチドの含有量の測定は、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）、蛍光法または比色法等の公知のペプチド含有量分析方法を用いて測定でき、例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用い、後記実施例２に記載の方法により実施できる。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いる場合において、測定の際には標準ペプチドとしてＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定用の純度を有するペプチドを使用し、例えば、ＡＱＵＡペプチド（ＳＩＧＭＡ　ＡＬＤＲＩＣＨ）を使用することができる。
　本発明のホエイ分解物（特に、本発明のペプチドを含有するホエイ分解物）の製造方法は公知であり、例えば、国際公開公報第２０１７／０８６３０３号の記載に従って製造することができる。また、市販されているホエイ分解物（例えば、ＨＷ－３（雪印メグミルク社）、ＨＷＰ－２０５（Ｔａｔｕａ）、Ｔｈｅｒｍａｘ６９０（Ｇｌａｎｂｉａ）またはＰｒｏｔｈｅｒｍａ（Ｇｌａｎｂｉａ）等）をホエイ分解物として用いてもよい。
　本発明のペプチドを含有するホエイ分解物は、例えば、ホエイタンパク質にホエイ分解酵素を含む酵素製剤を作用させることにより製造することができる。
　酵素反応に供されるホエイタンパク質の濃度は、タンパク質が溶解し得る限り限定されないが、ゲル化や凝集を抑制し、濃縮の手間を省く観点から、１～３０ｗ／ｖ％とすることが好ましく、より好ましくは１～２０ｗ／ｖ％であり、さらに好ましくは５～１５ｗ／ｖ％である。
　ホエイは、そのままで、または、濃縮もしくは希釈してから酵素反応に供すればよく、必要に応じｐＨ調整等をすることができる。また、原料となるホエイタンパク質が紛体等の固形物の場合、酵素反応が進行する限り、いずれの水系溶媒に溶解させてもかまわないが、食品としての利用を考慮し、水または食品添加物グレードの緩衝液に溶解させることが好ましい。酵素反応で生じたアミノ酸により反応液のｐＨが変化しないようにするため緩衝液を使用することが好ましい。緩衝液の種類は任意であり、その後の利用および風味・味覚・ミネラル量等を考慮して決定すればよいが、反応液のｐＨを４～９、好ましくは５～８、より好ましくは７～８に維持できるような組成が好ましい。緩衝液としては、例えば、クエン酸ナトリウム緩衝液、炭酸ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液またはリン酸カリウム緩衝液等が挙げられ、好ましくはリン酸カリウム緩衝液である。緩衝液の濃度は緩衝効果が得られる範囲であれば任意であるが、風味・味覚・ミネラル量を考慮すると、例えば、０．０１～０．５Ｍが挙げられ、好ましくは０．０５～０．２Ｍであり、より好ましくは約０．１Ｍである。
　酵素反応に供する酵素は、タンパク質分解酵素またはタンパク質分解酵素を含む組成物、酵素剤もしくは酵素製剤であればいずれも使用できるが、中性プロテアーゼを含む酵素製剤であることが好ましく、１種類またはそれ以上を組合せて使用することができる。酵素製剤は、例えば、バチルス・サブティリス、アスペルギルス・オリゼ、アルペルギルス・メレウス等の微生物を由来としたものを使用することができ、このうちアスペルギルス・オリゼ由来の酵素製剤またはアルペルギルス・メレウス由来の酵素製剤が好ましく、より好ましくはアルペルギルス・メレウス由来の酵素製剤である。
　また、酵素反応に供する酵素として、市販の酵素製剤を使用することができ、例えば、天野エンザイム社、新日本化学工業社、ＤＳＭ社、ダニスコ社、ノボザイム社またはＨＢＩ社等から酵素製剤を入手可能である。酵素製剤の添加量は任意であるが、適度な加水分解反応速度またはコスト等を考慮すると、例えば、０．０１～５ｗ／ｖ％が挙げられ、好ましくは０．０５～４ｗ／ｖ％、より好ましくは０．１～０．５ｗ／ｖ％である。
　酵素反応温度および酵素反応時間は原料タンパク質の加水分解が十分になされ、酵素分解物の品質が保たれるように設定することができる。酵素反応温度は、例えば、３０～７０℃が挙げられ、好ましくは４０～７０℃であり、より好ましくは４５～６５℃である。また、酵素反応時間は、例えば、１～１２時間であり、好ましくは２～１０時間であり、より好ましくは４～５時間である。なお、酵素反応温度および酵素反応時間は本発明のペプチドの生成量を確認しながら適宜調整することができる。
　酵素反応は温度を上昇させながら行うこともできる。例えば、３０℃から７５℃にまで４～１０時間かけて上昇させながら反応させる方法が挙げられる。好ましくは、３５℃から７５℃まで５～８時間かけて上昇させながら反応させる方法であり、より好ましくは３５℃から７５℃まで６～８時間かけて反応させる方法である。温度上昇スピードおよびプログラムは任意であるが、酵素投入後、４５℃から５５℃の間での保持時間を長めにし（例えば、５～７時間）、その後６０℃まですみやかに上昇させた後に６０℃から７５℃の間で長めの時間で（例えば、１～３時間）保持する方法が好ましい。最も好ましいのは、５０℃で酵素を投入し、５～７時間保持後、任意の速度で昇温させ、６０～６５℃または６５～７５℃の目標温度で１～３時間保持する方法である。
　酵素反応に際しては反応効率の観点から反応液を撹拌することが好ましい。基質が酵素とよく接するように、液撹拌速度は速い方がよいが、速すぎると反応液が飛び散る恐れがあるため、例えば、１００～５００ｒｐｍが挙げられ、好ましくは２００～４００ｒｐｍであり、より好ましくは約２５０ｒｐｍである。
　酵素反応の結果、所望のペプチドが生じた後、所望のペプチドを含む反応液を酵素反応の停止工程に付すことが好ましい。酵素反応停止工程としては、反応液の高温処理もしくはキレート剤添加により酵素の化学構造を変化させ、酵素を失活させる方法、または膜処理により酵素を除去する方法を採用できる。好ましい方法は、反応液を高温に処理する失活処理である。該高温処理方法は、例えば、８０～９０℃で５～３０分間保持する方法であり、好ましくは８０～９０℃で２０～３０分間保持する方法である。また、後述の濃縮工程で高温になる場合には、濃縮工程を兼ねて行うことができる。
　上述の酵素反応工程および酵素反応停止工程を経た反応液（ホエイ分解物）は、さらに殺菌工程に付してもよい。殺菌工程としては、例えば、後述の膜処理工程または加熱殺菌工程が挙げられる。加熱殺菌工程は上述の酵素反応停止工程を兼ねることもでき、製造工程の簡略化の点で有利である。
　酵素反応工程および酵素反応停止工程を経た反応液（ホエイ分解物）は、さらに精製工程に付してもよい。精製工程としては、例えば、粗ろ過、精密ろ過、限外ろ過または逆浸透等の膜ろ過方法を用いた膜処理工程が挙げられ、好ましい膜処理は限外ろ過である。限外ろ過における分画分子量は、所望のペプチドおよび用いた酵素等により任意に選択できるが、３～１００ｋＤａが好ましく、５～５０ｋＤａがより好ましい。精製工程は、該精製工程を実施しなかった場合と比較してペプチド組成物の風味を改善することができる点で有利である。また、精製工程は酵素反応停止工程および殺菌工程を兼ねることもでき、製造工程の簡略化の点でも有利である。
　酵素反応工程および酵素反応停止工程を経た反応液（ホエイ分解物）は、保管や運搬の観点からさらに濃縮工程に付してもよい。濃縮工程は任意の方法を選択できるが、好ましくは減圧濃縮、凍結乾燥、噴霧乾燥（スプレードライ）、または膜処理による濃縮（例えば、逆浸透膜を用いる方法）による方法であり、より好ましくは凍結乾燥または噴霧乾燥である。濃縮を大量かつ効率的に実施する観点から噴霧乾燥が特に好ましい。
　本発明の組成物および用剤にホエイ分解物を含有させる場合、本発明のペプチドを指標にホエイ分解物を含有させることができ、例えば、１食あたりＧＴＷＹを０．００１～１０００ｍｇ（好ましくは０．０１～５００ｍｇ、より好ましくは０．０５～５ｍｇ）およびＷＹを０．００１～５００ｍｇ（好ましくは０．０１～１００ｍｇ、より好ましくは０．０５～３ｍｇ）含有させることができる。
　本発明の組成物および用剤に本発明のペプチドを含有させる場合、１食あたりＧＴＷＹを０．００１～１０００ｍｇ（好ましくは０．０１～５００ｍｇ、より好ましくは０．０５～５ｍｇ）を含有させることができ、ＷＹを０．００１～５００ｍｇ（好ましくは０．０１～１００ｍｇ、より好ましくは０．０５～３ｍｇ）含有させることができる。
　本発明のペプチドは、ホエイタンパク質酵素分解物等の食品素材に由来するものを使用でき、また、ペプチド鎖が短く化学合成しやすいため合成品、それらの塩または溶媒和物も使用できる。すなわち本発明のペプチドは入手がしやすい点で有利である。
　本発明の第一の面によれば、本発明の組成物および用剤は、腸内および／または口腔内の環境改善を目的として使用できる。ここで、「腸内および／または口腔内の環境改善」とは、下部消化管および／または口腔内に存在する善玉菌（例えば、乳酸菌、酢酸菌、プロピオン酸菌、酪酸菌等の短鎖脂肪酸産生菌およびビフィズス菌；特に、ビフィズス菌）を相対的に増加させること、または悪玉菌（例えば、ウェルシュ菌、ブドウ球菌、大腸菌；特に、Clostridium属細菌）を相対的に低下させることをいう。相対的に増加させるとは腸内および／または口腔内の菌叢に占める善玉菌の割合を増加させることをいい、相対的に低下させるとは腸内および／または口腔内の菌叢に占める悪玉菌の割合を低下させることをいう。すなわち、腸内および／または口腔内の環境改善は腸内および／または口腔内の菌叢改善を含む意味で用いられる。
　このため本発明の第二の面によれば、本発明の組成物および用剤は腸内および／または口腔内の菌叢の改善を目的として使用できる。ここで、「腸内および／または口腔内の菌叢改善」とは、腸内および／もしくは口腔内の菌叢に占める善玉菌の割合を増加させること、または腸内および／もしくは口腔内の菌叢に占める悪玉菌の割合を低下させることをいう。腸内および／または口腔内の菌叢における各種細菌の割合は、例えば、腸内の場合には対象から大便等、口腔内の場合には対象から唾液等を検体としてそれぞれ採取し、検体中の各種細菌を１６ＳｒＤＮＡもしくはゲノムの次世代シーケンス・アンプリコン解析、およびデータベース検索を組み合わせる方法、またはＦＩＳＨ－フローサイトメトリーを用いて分析することで、評価できる。またここで、下部消化管には、回腸、盲腸、結腸および直腸が含まれる。なお、本発明の腸内および／もしくは口腔内の環境の改善、または腸内および／もしくは口腔内の菌叢の改善により腸内および／または口腔内における短鎖脂肪酸の産生が増加する。
　本発明の第三の面によれば、本発明の組成物および用剤は腸内および／または口腔内における短鎖脂肪酸産生促進を目的として使用できる。短鎖脂肪酸は、食物繊維を基質とし、腸内および／または口腔内の細菌の発酵によって生じる代表的な腸内および／または口腔内の細菌由来の代謝物である。短鎖脂肪酸は、生体の単なるエネルギー源としてだけではなく、生体のエネルギー代謝調節に重要な役割を果たしていることが知られており、近年では腸内での短鎖脂肪酸の産生促進が糖尿病、肥満等の代謝性疾患の予防および改善に有効であることが解明されている（日内会誌 2015,104,57-65、Jpn. J. Clin. Immunol., 2017,40(6),408-415）。また、腸内での短鎖脂肪酸の産生促進が、高血圧もしくは慢性腎臓病（日腎会誌 2017,59（4）,562-567）、炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎もしくは自己免疫性疾患（Jpn. J. Clin. Immunol.,2017,40(6),408-415）、うつ病性障害もしくは双極性障害等の気分障害、またはストレスによって引き起こされた行動異常もしくは脳内変化（臨床精神薬理,2019, 22,1045-1052）等の予防および改善に有効であると言われている。また、口腔内での短鎖脂肪酸の産生促進が歯周組織の恒常性または免疫応答の維持等に関与し、う蝕、歯周病または感染症等の予防および改善に有効であることが知られている（腸内細菌学雑誌, 2014, 28, 111-120）。このため、本発明の組成物および用剤は、上述の疾患の予防および改善を期待できる点で有利である。
　本発明において短鎖脂肪酸とは、炭素数が６以下、好ましくは２～６の脂肪酸であり、例えば、酢酸、プロピオン酸、ｎ－酪酸、ｉｓｏ－酪酸、ｎ－吉草酸、ｉｓｏ－吉草酸またはｎ－カプロン酸等が挙げられる。
　腸内および／または口腔内における短鎖脂肪酸産生量は、例えば、腸内の場合には対象から大便等、口腔内の場合には対象から唾液等を検体としてそれぞれ採取し、ガスクロマトグラフィー等の分析装置を用いて分析することで、検体中における上記個々の短鎖脂肪酸の産生量またはその合計として評価できる。なお、本発明の腸内および／もしくは口腔内の環境の改善、腸内および／もしくは口腔内の菌叢の改善、または腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸の産生促進により、腸管免疫および／もしくは口腔内免疫を介した免疫調節がなされることが期待される。
　本発明の第四の面によれば、本発明の組成物および用剤は腸管および／または口腔内免疫調節を目的として使用することができる。腸内および／または口腔内の細菌の代謝産物である短鎖脂肪酸が、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞または制御性Ｔ細胞等の免疫細胞の分化誘導促進および／または免疫細胞の細胞死抑制により、腸管および／または口腔内の免疫状態を調節すること、また、前記免疫細胞は腸管パイエル板、腸間膜リンパ節または歯周組織等に存在することが知られている（Jpn. J. Clin. Immunol., 2017, 40(6), 408-415、腸内細菌学雑誌, 2014, 28, 111-120）。すなわち、本発明において「腸管および／または口腔内免疫調節」とは、腸管および／または口腔内免疫を介した免疫調節を意味し、腸管（特に腸管パイエル板および／または腸間膜リンパ節）および／または口腔内（特に歯周組織）に存在する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞または制御性Ｔ細胞）を介した免疫系の調節を意味する。免疫細胞を介した免疫系の調節は、例えば、Ｔ細胞または制御性Ｔ細胞の分化誘導を促進することおよび／または免疫細胞の細胞死抑制によりなされる。
　腸管および／または口腔内免疫調節の程度は、例えば、対象から末梢血または唾液を採取し、炎症性サイトカイン、炎症抑制性サイトカインまたはイムノグロブリン等の免疫調節に関与する因子の濃度を測定し、評価できる。例えば、炎症性サイトカインの濃度が高く、炎症抑制性サイトカイン（抗炎症性サイトカイン）の濃度が低い状態であれば免疫状態を賦活化したと評価でき、この逆であれば免疫状態を制御ないし抑制したと評価できる。また、イムノグロブリン（Ｉｇ）Ａの濃度が高い状態であれば免疫状態が賦活化されたと評価できる。腸管免疫調節の程度はまた、対象から採取したリンパ球を解析することでも評価できる。例えば、ＣＤ８６陽性細胞数が増加していれば免疫系の必要十分で適正な賦活化がなされたと評価でき、Ｔ細胞または制御性Ｔ細胞数が増加していれば免疫系の過剰な反応が抑制されたと評価できる。
　本発明の第五の面によれば、本発明の組成物および用剤は気分状態の改善促進を目的として使用することができる。本発明において気分状態とは、例えば、公知の気分状態の測定または評価方法として知られるProfile of Mood States 2nd Edition（POMS2）において構成させる以下の７因子等が挙げられる。
（１）怒り－敵意：怒りまたは他者への反感の状態
（２）混乱－当惑：当惑または認知効率の低さ
（３）抑うつ－落ち込み：自信喪失感を伴う抑うつ気分
（４）疲労－無気力：疲労感、無気力、および活力低下
（５）緊張－不安：筋骨格系の緊張の高まり
（６）活気－活力：元気さ、躍動感および活力の高さ
（７）友好：他者に対してポジティブな感情を感じていること
　また、本発明において改善促進とは、例えば標準または通常の状態と比較してネガティブな状態から標準または通常の状態に改善することも、例えば標準または通常の状態からポジティブな状態に促進することも、いずれの現象も含まれる。すなわち、本発明における気分状態の改善促進としては、例えば、日常生活においていらいらを感じることの多いもしくは不安を感じることの多い対象における、無気力状態、無気力感、抑うつ状態、抑うつ感、活力の低下、意欲低下、やる気の低下、不安な気分、不安の感じやすさ、長期的な不安感、主観的ストレス、ストレスの感じ方、知覚ストレス、日常的なストレスもしくは体の痛み等の改善が挙げられ、また精神的に健康な対象における、気力、活力、やる気、不安への耐性もしくはストレス耐性等の増強が挙げられる。本発明の組成物および用剤による対象の気分状態の改善促進は、公知の気分状態の測定または評価方法を用いて、本発明の組成物および用剤の対象への摂取または投与の前後の状態を比較することで測定または評価することができる。公知の気分状態の測定または評価方法としては、例えば、POMS2、Beck Depression Inventory 2nd Edition（BDI-II）、状態－特性不安検査（STAI）、知覚ストレス尺度（PSS）、やる気スコア、Sukemune-Hiew（S-H式）Resilience Test、Five Facet Mindfulness Questionnaire（FFMQ）または健康関連QOL等の尺度またはこれらの尺度を組み合わせて用いた測定または評価方法が挙げられる。また、例えば、POMS2におけるTotal Mood Disturbance（TMD）またはMOS 36-Item Short-Form Health Survey（SF-36（登録商標））等、公知の総合的な気分状態の測定または評価方法を用いることができる。
　上述の通り、本発明の組成物および用剤は、腸内および／もしくは口腔内の環境の改善、または腸内および／もしくは口腔内の菌叢の改善、腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進、腸管および／もしくは口腔内免疫調節、または気分状態の改善促進を目的に使用できることから、本発明の組成物および用剤を摂取させるまたは投与する対象としては、上述の疾患を有する対象および健康な対象のいずれも含まれるが、健康な対象（対象がヒトの場合、健常人）が好ましい。以下、本明細書において、投与と摂取とを同じ意味として用いることがある。
　一般的に腸内および／または口腔内の環境は加齢（特に老化）に伴って変化する傾向にある（Odamaki et al. BMC Microbiology (2016) 16:90）。したがって本発明の組成物および用剤を摂取させる対象の年齢は特に限定されないが、本発明の組成物および用剤は、好ましくは中高年の対象（対象がヒトであれば、例えば、５０歳以上の者）に摂取させるためのものとすることができ、特に好ましくは高齢の対象（対象がヒトであれば、例えば、６５歳以上の者）に摂取させるためのものとすることができる。すなわち、本発明の組成物および用剤は、好ましくは中高年または高齢の対象を摂取対象とすることができる。本発明の組成物および用剤はまた、食事、抗菌薬またはストレス等の加齢以外の理由により腸内環境が変化した対象に摂取させるためのものとすることもできる。
　本発明の組成物および用剤は、医薬品（例えば、医薬組成物）、医薬部外品、食品（例えば、食品組成物）、飼料（ペットフード含む）等の形態で提供することができ、下記の記載に従って実施することができる。
　本発明の有効成分は、ヒトおよび非ヒト動物を対象として投与することができ、好ましくは経口投与することである。代表的な投与形態は医薬品または医薬部外品であり、本発明の有効成分を含有する製剤としては、経口投与に適切な剤形であれば特に限定されないが、例えば、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤または懸濁剤等が挙げられる。これらの製剤は、当該分野で通常行われている手法により、薬学上許容される担体を用いて製剤化することができる。薬学上許容される担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、希釈剤、添加剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤または防腐剤等が挙げられる。このような製剤化した製剤には、通常本発明の有効成分を有効量含有する。
　また、本発明の有効成分は、ヒトおよび非ヒト動物を対象として摂取させることができ、好ましくは経口摂取させることである。経口摂取において、代表的な摂取形態は食品である。本発明の有効成分を食品として提供する場合には、それを食品に含有させて提供することができる。このようにして提供された食品は本発明の有効成分を有効量含有した食品である。本明細書において、本発明の食品において有効成分を「有効量含有した」とは、個々の食品において通常喫食される量を摂取した場合に後述するような範囲で本発明の有効成分が摂取されるような含有量をいう。また「食品」とは、日常摂取する食品に加え、例えば、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、保健機能食品（例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等）、特別用途食品（例えば、幼児用食品、妊産婦用食品、病者用食品等）およびサプリメント等を含む意味で用いられる。なお、本発明の有効成分をヒト以外の動物に摂取させる場合には、本発明でいう食品が飼料として使用されることはいうまでもない。
　本発明の有効成分は、上記のような腸内および／または口腔内の環境の改善効果等を有するため、日常摂取する食品に含有させることができ、あるいは、サプリメントとして提供することができる。すなわち、本発明の組成物および用剤は食品の形態で提供することができる。この場合、本発明の組成物および用剤は１食当たりに摂取する量が予め定められた単位包装形態で提供することができる。１食当たりの単位包装形態としては、例えば、パック、包装、缶またはボトル等で一定量を規定する形態が挙げられる。本発明の組成物および用剤の各種作用をよりよく発揮させるためには、後述する、本発明の有効成分の１日当たりの摂取量に従って１食当たりの摂取量を決定できる。本発明の食品は、摂取量に関する説明事項が包装に表示されるか、または説明事項が記載された文書等と一緒に提供されてもよい。
　単位包装形態においてあらかじめ定められた１食当たりの摂取量は、１日当たりの有効摂取量であっても、１日当たりの有効摂取量を２回またはそれ以上（好ましくは２または３回）に分けた摂取量であってもよい。従って、本発明の組成物および用剤の単位包装形態には、後述のヒト１日当たりの摂取量で本発明の有効成分を含有させることができ、あるいは、後述のヒト１日当たりの摂取量の２分の１から２０分の１の量で本発明の有効成分を含有させることができる。本発明の組成物および用剤は、摂取の便宜上、１食当たりの摂取量が１日当たりの有効摂取量である、「１食当たりの単位包装形態」で提供することが好ましい。
　「食品」の形態は特に限定されるものではなく、例えば、飲料の形態であっても、半液体やゲル状の形態であっても、固形状や粉末状の形態であってもよい。また、「サプリメント」としては、本発明の有効成分に賦形剤、結合剤等を加え練り合わせた後に打錠することにより製造された錠剤や、カプセル等に封入されたカプセル剤が挙げられる。サプリメントとして提供するときは、上述の１食当たりの単位包装形態とするほか、１日当たり、１週間当たりまたは１月当たりの単位包装形態として提供することも好適である。
　本発明で提供される食品は、本発明の有効成分を含有する限り、特に限定されるものではないが、例えば、清涼飲料水、炭酸飲料、果汁入り飲料、野菜汁入り飲料、果汁および野菜汁入り飲料、牛乳等の畜乳、豆乳、乳飲料、ドリンクタイプのヨーグルト、ドリンクタイプもしくはスティックタイプのゼリー、コーヒー、ココア、茶飲料、栄養ドリンク、エナジー飲料、スポーツドリンク、ミネラルウォーター、ニア・ウォーターまたはノンアルコールのビールテイスト飲料等の非アルコール飲料；飯類、麺類、パン類またはパスタ類等の炭水化物含有飲食品；カマンベールチーズ等のナチュラルチーズ類またはプロセスチーズ類等のチーズ含有食品；ハードタイプもしくはソフトタイプのヨーグルト、畜乳その他の油脂原料による生クリーム、またはアイスクリーム等の乳製品；クッキー、ケーキもしくはチョコレート等の洋菓子類、饅頭もしくは羊羹等の和菓子類、ラムネ等のタブレット菓子（清涼菓子）、キャンディー類、ガム類、ゼリーもしくはプリン等の冷菓、氷菓、煎餅等の米菓またはスナック菓子等の各種菓子類；ウイスキー、バーボン、スピリッツ、リキュール、ワイン、果実酒、日本酒、中国酒、焼酎、ビール、アルコール度数１％以下のノンアルコールビール、発泡酒、その他雑酒または酎ハイ等のアルコール飲料；卵を用いた加工品、魚介類もしくは畜肉（レバー等の臓物を含む）の加工品（珍味を含む）、味噌汁等のスープ類等の加工食品；みそ、しょうゆ、ふりかけもしくはその他シーズニング調味料等の調味料；濃厚流動食等の流動食等が挙げられる。なお、ミネラルウォーターは、発泡性および非発泡性のミネラルウォーターのいずれもが包含される。また、本発明で提供される食品には、食品製造原料および食品添加物のいずれもが含まれる。
　茶飲料としては、発酵茶、半発酵茶および不発酵茶のいずれもが包含され、例えば、紅茶、緑茶、麦茶、玄米茶、煎茶、玉露茶、ほうじ茶、ウーロン茶、ウコン茶、プーアル茶、ルイボスティー、ローズ茶、キク茶、イチョウ葉茶またはハーブ茶（具体的には、ミント茶もしくはジャスミン茶等）等が挙げられる。
　果汁入り飲料、または果汁および野菜汁入り飲料に用いられる果物としては、例えば、リンゴ、ミカン、ブドウ、バナナ、ナシ、モモ、マンゴー、アサイー、ブルーベリーまたはウメ等が挙げられる。また、野菜汁入り飲料、または果汁および野菜汁入り飲料に用いられる野菜としては、例えば、トマト、ニンジン、セロリ、カボチャ、キュウリまたはスイカ等が挙げられる。
　本発明の有効成分の摂取（投与）量は、受容者の性別、年齢および体重、症状、摂取（投与）タイミング、摂取（投与）時間、剤形、摂取（投与）経路並びに組み合わせる薬剤等に依存して決定できる。腸内および／もしくは口腔内の環境改善、腸内および／もしくは口腔内の菌叢改善、腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進、腸管および／もしくは口腔内の免疫調節、または気分状態の改善促進を目的としたホエイ分解物のヒト成人１日当たりの摂取量（固形分換算）は、例えば、１～５００００ｍｇ（好ましくは１０～１００００ｍｇ、より好ましくは１００～５０００ｍｇ）であり、ＧＴＷＹの成人１日当たりの摂取量（固形分換算）は、例えば、０．００１～１０００ｍｇ（好ましくは０．０１～５００ｍｇ、より好ましくは０．０５～５ｍｇ）であり、ＷＹの成人１日当たりの摂取量（固形分換算）は、例えば、０．００１～５００ｍｇ（好ましくは０．０１～１００ｍｇ、より好ましくは０．０５～３ｍｇ）である。上記の本発明の有効成分の摂取量および下記摂取タイミングおよび摂取期間は、本発明の有効成分を非治療目的および治療目的のいずれで使用する場合にも適用があり、治療目的の場合には摂取は投与に読み替えることができる。なお、本発明の有効成分はヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル、イルカまたはアシカ等）に対しても摂取させることができ、摂取量、摂取タイミングおよび摂取期間は上述のヒトに関する記載を参考にして決定することができる。
　本発明の有効成分は、腸内および／もしくは口腔内の環境改善、腸内および／もしくは口腔内の菌叢改善、腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進、腸管および／もしくは口腔内の免疫調節、または気分状態の改善促進の効果が期待される期間内は摂取を継続することが好ましい。本発明の有効成分の摂取期間は、例えば、上記１日量での摂取を少なくとも７日間（好ましくは少なくとも１４日間、より好ましくは少なくとも４２日間）である。また、本発明の有効成分の摂取間隔として、例えば、上記１日量での摂取を３日に１回、２日に１回または１日１回とすることができ、１日量の摂取を１日当たり２回またはそれ以上（好ましくは２または３回）に分けることもできる。
　本発明の組成物および用剤並びに食品には、腸内および／もしくは口腔内の環境改善、腸内および／もしくは口腔内の菌叢改善、腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進、または腸管および／もしくは口腔内の免疫調節の効果を有する旨の表示が付されてもよい。この場合、消費者に理解しやすい表示とするため本発明の組成物および用剤並びに食品には以下の一部または全部の表示が付されてもよい。なお、本発明において「腸内および／もしくは口腔内の環境改善、腸内および／もしくは口腔内の菌叢改善、腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進、または腸管および／もしくは口腔内の免疫調節の効果」が以下の表示を含む意味で用いられることはいうまでもない。
・腸内フローラを改善したい方に
・おなかの調子を整えたい方に
・便通を改善したい方に
・口内フローラを改善したい方に
・口臭を予防、改善したい方に
・口内のねばつきを改善したい方に
　また本発明の組成物および用剤並びに食品には、気分状態の改善促進効果を有する旨の表示が付されてもよい。この場合、消費者に理解しやすい表示とするため本発明の組成物および用剤並びに食品には以下の一部または全部の表示が付されてもよい。なお、本発明において「気分状態の改善促進効果」が以下の表示を含む意味で用いられることはいうまでもない。
・いろいろなことが心配な方に
・やる気が落ちやすい方に
・意欲、モチベーションまたは気力の低下が気になる方に
・落ち込みやすい方に
・前向きでいたい方に
・抑うつ感を感じやすい方に
・ストレスを感じやすい方に
・不安を感じやすい方に
・いらいらすることが多い方に
　本発明の別の面によれば、ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドおよび／またはＷＹのアミノ酸配列を有するペプチドを含有するホエイタンパク質酵素分解物を、それを必要としている対象に摂取させるか、あるいは投与することを含んでなる、腸内および／もしくは口腔内の環境改善方法、腸内および／もしくは口腔内の菌叢改善方法、腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進方法、腸管および／もしくは口腔内の免疫調節方法、または気分状態の改善促進方法が提供される。本発明の別の面によればまた、ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドおよび／またはＷＹのアミノ酸配列を有するペプチドを、それを必要としている対象に摂取させるか、あるいは投与することを含んでなる、腸内および／もしくは口腔内の環境改善方法、腸内および／もしくは口腔内の菌叢改善方法、腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進方法、腸管および／もしくは口腔内の免疫調節方法、または気分状態の改善促進方法が提供される。本発明の方法は、本発明の組成物および用剤に関する記載に従って実施することができる。
　本発明のさらに別の面によれば、腸内および／もしくは口腔内の環境改善剤、腸内および／もしくは口腔内の菌叢改善剤、腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進剤、腸管および／もしくは口腔内の免疫調節剤、または気分状態の改善促進剤の製造のための、腸内および／もしくは口腔内の環境改善剤、腸内および／もしくは口腔内の菌叢改善剤、腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進剤、腸管および／もしくは口腔内の免疫調節剤、または気分状態の改善促進剤としての、あるいは本発明の腸内および／もしくは口腔内の環境改善方法、腸内および／もしくは口腔内の菌叢改善方法、腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進方法、腸管および／もしくは口腔内の免疫調節方法、または気分状態の改善促進方法における、ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドおよび／またはＷＹのアミノ酸配列を有するペプチドを含有するホエイタンパク質酵素分解物の使用が提供される。本発明の別の面によれば、腸内および／もしくは口腔内の環境改善剤、腸内および／もしくは口腔内の菌叢改善剤、腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進剤、腸管および／もしくは口腔内の免疫調節剤、または気分状態の改善促進剤の製造のための、腸内および／もしくは口腔内の環境改善剤、腸内および／もしくは口腔内の菌叢改善剤、腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進剤、腸管および／もしくは口腔内の免疫調節剤、または気分状態の改善促進剤としての、あるいは本発明の腸内および／もしくは口腔内の環境改善方法、腸内および／もしくは口腔内の菌叢改善方法、腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進方法、腸管および／もしくは口腔内の免疫調節方法、または気分状態の改善促進方法における、ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドおよび／またはＷＹのアミノ酸配列を有するペプチドの使用が提供される。本発明の使用は、本発明の組成物および用剤に関する記載に従って実施することができる。
　本発明のさらにまた別の面によれば、腸内および／もしくは口腔内の環境改善、腸内および／もしくは口腔内の菌叢改善、腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進、腸管および／もしくは口腔内の免疫調節、または気分状態の改善促進方法に用いるための、ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドおよび／またはＷＹのアミノ酸配列を有するペプチドを含有するホエイタンパク質酵素分解物が提供される。
　本発明の別の面によれば、腸内および／もしくは口腔内の環境改善、腸内および／もしくは口腔内の菌叢改善、腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進、腸管および／もしくは口腔内の免疫調節、または気分状態の改善促進に用いるための、ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドおよび／またはＷＹのアミノ酸配列を有するペプチドが提供される。上記のホエイタンパク質酵素分解物および２種のペプチドは、それぞれ本発明の組成物および用剤に関する記載に従って実施することができる。
　本発明の方法および本発明の使用はヒトを含む哺乳動物における使用であってもよく、治療的使用と非治療的使用のいずれもが意図される。本明細書において、「非治療的」とはヒトを手術、治療または診断する行為（すなわち、ヒトに対する医療行為）を含まないことを意味し、具体的には、医師または医師の指示を受けた者がヒトに対して手術、治療または診断を行う方法を含まないことを意味する。
　以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
例１：ＷＹペプチドによる腸内環境改善（１）
　例１では、動物モデルを使用してＷＹペプチドによる腸内環境改善の効果を評価した。
（１）方法
ア　実験手順
　動物モデルとしてＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（日本チャールス・リバー社、以下、単に「本マウス」ということがある）を使用した。日本チャールス・リバー社の資料によれば（https://www.crj.co.jp/cms/cmsrs/img/usr/top/B6-Aged.pdf）、本マウスはジャクソン研究所により開発され、加齢研究に広く使われているものであり、本マウス３２匹を観察した結果、１００週齢で死亡個体が発生し、１７０週齢までにすべての個体が死亡したことが公開されている（マウス・フェノーム・データベース（https://www.phenome.jax.org/）参照）。本マウスとヒトとの生涯の対応は、それぞれヒト２０～３０歳が本マウス３～６月齢（成熟個体）、ヒト３８～４７歳が本マウス１０～１４月齢（中年個体）、ヒト５６～６９歳が本マウス１８～２４月齢（老年個体）である。
　例１では、本マウスを訓化飼育した後、６月齢の個体をＷＹ摂取群１５匹、非摂取群１５匹にそれぞれ体重の偏りのないように分けた。ＷＹ摂取群にはＷＹペプチドを乾燥質量換算で０．０５％（ｗ／ｗ）を含む精製飼料（ＡＩＮ－９３Ｍ、オリエンタル酵母社）を自由摂食させた。非摂取群にはＷＹペプチドを含まないＡＩＮ－９３Ｍを自由摂食させた。３ヶ月の摂取期間終了後、盲腸内容物および糞便を採取し、盲腸内容物中の短鎖脂肪酸の定量および糞便中の菌叢解析をテクノスルガ・ラボ社にて下記イ、ウに記載の通り行った。また、摂取期間を１．５ヶ月とした場合についても同様の手順で短鎖脂肪酸の定量を行った。
イ　短鎖脂肪酸の定量
　短鎖脂肪酸量の定量は常法に従いガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法にて行った。具体的には、サンプリングした試料１００ｍｇをビーズチューブに精秤し、９倍量の０．５％リン酸溶液を加えて混合後に８５℃で１５分の熱処理をした。試料を破砕後に冷却し、遠心（１４０００ｒｐｍ、１０分）後の上清を新しいチューブに移し等量の酢酸エチルを加えて混合し、再度遠心（１４０００ｒｐｍ、１０分）した。酢酸エチル層をバイアルに移し、内部標準物質（４－メチル吉草酸）を加えて測定試料とした。測定は分離・検出システムＧＣ－ＦＩＤ（７８９０Ｂ、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して表１の条件下で行い、濃度換算は標準品による絶対検量線法により行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
ウ　菌叢解析
シーケンシング
　菌叢解析は、試料中に含まれる細菌について、次世代シーケンス・アンプリコン解析によって得られた検体由来の１６ＳｒＤＮＡ部分塩基配列を決定し、微生物同定データベースによる検索を行った。具体的には、サンプリングした試料について、Takahashiらの方法（PLoS One 2014;9:e105592.）により前処理、粗抽出操作を行い、ＤＮＡ自動分離装置（GENE PREP STAR　PI-480、倉敷紡績社）および組織ＤＮＡ分離用試薬キット（NR-201、倉敷紡績社）を使用してＤＮＡを精製した。ＤＮＡ濃度および純度が適切であると確認し、ＰＣＲ法にて１６ＳｒＤＮＡを増幅させた後、その配列を決定した。ＰＣＲは34lf-R806およびDual-index(8-bp barcode)を使用し（Appl Environ Microbiol 1993;59:695-700、Proc Natl Acad Sci USA 2011;108 Suppl 1:4516-4522.）、前記Takahashiらの条件に従って行った。配列決定は次世代シーケンス・アンプリコン解析により行った。次世代シーケンスはMiSeq（Illumina）装置を使い、該装置に付属するプロトコルの条件にて、MiSeq Reagent Kit v3（６００サイクル）（Illumina）を使用して行った。ｆａｓｔｑペアエンドの連結はｆａｓｔｑ―ｊｏｉｎ（デフォルトの条件）、クオリティーフィルタリングは配列の９９％以上がＱｕａｌｉｔｙ　Ｖａｌｕｅ２０以上を満たす配列とした。
データベース検索
　微生物同定データベースＤＢ－ＢＡ１３．０（TechnoSurugaLaboratory）およびＭｅｔａｇｅｎｏｍｅ＠ＫＩＮ（World Fusion）ソフトウェアを使用し、相同率９７％以上となる分類群（界～種）を抽出した（Appl Environ Microbiol 1993;59:695-700、Proc Natl Acad Sci USA 2011;108 Suppl 1:4516-4522.、Arch Microbiol 2015;197:19-934.、BMC Gastroenterol 2015;15:100.）。
エ　統計学的解析
　配列を決定した１６ＳｒＤＮＡの総数（総リード数）に対する特定の分類群に該当するリード数の割合（％）を求め、群ごとに平均値±標準誤差で記載した。群間の評価はＴ検定により行い、危険率Ｐ＜０．０５％であった場合に比較した両群間に有意差ありとした。
（２）結果
ア　短鎖脂肪酸の定量
　酢酸、プロピオン酸、ｎ－酪酸、ｉｓｏ―酪酸、ｎ－吉草酸、ｉｓｏ―吉草酸、ｎ－カプロン酸の７物質を分析対象の短鎖脂肪酸としたが、ｎ－カプロン酸はほとんどの検体で定量下限以下であったため評価対象外とした。図１に示す通り、ＷＹ摂取群（摂取期間：１．５ヶ月）は非摂取群と比較して酢酸および６種の短鎖脂肪酸合計量が有意に増加した。また、図２に示す通り、３ヵ月ＷＹ摂取群（摂取期間：３ヶ月）は、非摂取群と比較して酢酸、６種の短鎖脂肪酸合計量に加え、ｎ－酪酸も有意に増加した。
イ　菌叢解析
　図３に示す通り、ＷＹ摂取群（摂取期間：３ヶ月）は非摂取群と比較して総リード数に対するActinobacteria門の割合が有意に増加し、Firmicutes門の割合が有意に減少した。また、図４に示す通り、ＷＹ摂取群（摂取期間：３ヶ月）は非摂取群と比較して総リード数に対するBifidobacterium属の割合が有意に増加し、Clostridium属およびRomboutsia属の割合が有意に減少した。さらに、図５に示す通り、３ヵ月ＷＹ摂取群は非摂取群と比較して、総リード数に対するBifidbacterium pseudolongumの割合が有意に増加した。
ウ　小括
　これらの結果よりＷＹペプチドの投与は腸内菌叢を変化させ、短鎖脂肪酸量を増加させることが示された。
例２：ＷＹペプチドによる腸内環境改善（２）
　例２では、６６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスを使用してＷＹペプチドによる腸内環境改善の効果を評価した。
（１）方法
　６６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスを使用し、試験飼料摂取期間を４．５ヶ月とした。ＷＹ摂取群１２匹、非摂取群１３匹にそれぞれ体重の偏りのないように分け、飼育中に自然死した個体を除き、ＷＹ摂取群９匹、非摂取群１０匹について評価した。前記以外の条件や方法については、例１（１）に記載した条件や方法と同様の方法により行った。
（２）結果
　図６に示す通り、ＷＹ摂取群は、非摂取群と比較して酢酸および６種の短鎖脂肪酸合計量が有意に増加し、ｎ－酪酸も増加傾向を示した。ここで、マウスは試験飼料摂取開始時にヒト中年に、摂取終了時にはヒト老年に換算される。したがって、ＷＹの摂取は中高年者においても短鎖脂肪酸量を増加させ、腸内環境を改善することが示された。
例３：ＷＹペプチドによる腸内免疫に対する影響
　例３では、被験物質ＷＹペプチドについて、被験物質摂取マウスおよび非摂取マウスの腸間膜リンパ節の免疫細胞を比較検討した。
（１）方法
ア　実験手順
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスを馴化飼育した後、３月齢の個体を使用し、ＷＹ摂取群１０匹、非摂取群１０匹にそれぞれ体重の偏りのないように分けた。ＷＹ摂取群にはＷＹペプチドを乾燥質量換算で０．０５％（ｗ／ｗ）を含む精製飼料（ＡＩＮ－９３Ｍ、オリエンタル酵母社）を自由摂食させた。非摂取群にはＷＹペプチドを含まないＡＩＮ－９３Ｍを自由摂食させた。３ヶ月の摂取期間終了後、腸間膜リンパ節を摘出した。摘出した腸間膜リンパ節をコラゲナーゼ４（ロシュ社）で処理を行い、７０μｍのセルストレーナーで濾過し、リンパ球を回収した。その後、回収したリンパ球について、下記イに記載の方法により解析を行った。なお、下記イにおいて、供給元を記載しない試薬はeBioscience社から入手した。
イ　リンパ球解析
樹状細胞の解析
　回収したリンパ球を常法に従いＦＩＴＣ－Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ、ＰＥ－ＰＤＬ－１、ＰＥ－ＣＤ８０、ＦＩＴＣ－ＣＤ８６、ＣＤ１１ｂ－ＡＰＣ－Ｃｙ７（BD Pharminge）、ＣＤ１１ｃ－ＰＥ－Ｃｙ７で染色し、フローサイトメーター（BD CANTO2）を用いて樹状細胞を解析した。
Ｔ細胞の解析
　回収したリンパ球を常法に従いＬｅｕｋｏｃｙｔｅ、Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｃｏｃｋｔａｉｌ、ｗｉｔｈ、ＢＤ、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（BD Pharminge）で４時間半処理し、Ｃｅｌｌ　Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いてＣＤ４－ＡＰＣ、ＴＮＦ－α－ＦＩＴＣ、ＩＦＮ－γ－ＰＥ－Ｃｙ７抗体で染色し、フローサイトメーターで解析した。
制御性樹状細胞の解析
　回収したリンパ球を常法に従いＦｏｘｐ３　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｋｉｔを用いて、ＣＤ３ｅ－ＰｅｒＣＰ、ＣＤ４－ＡＰＣ、ＣＤ２５－ＡＰＣ－Ｃｙ７、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ－Ｃｙ７抗体で染色し、フローサイトメーターで解析した。
ウ　統計学的解析
　測定値は平均値±標準誤差で記載した。群間の評価はＴ検定で行い、危険率Ｐ＜０．０５％であった場合に比較した両群間に有意差ありとした。
（２）結果
　図７に示す通り、ＷＹ摂取群は非摂取群と比較して、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋ｍｙｅｌｏｉｄ樹状細胞のＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ、ＣＤ８６が有意に増加し、ＰＤＬ－１、ＣＤ８０も増加傾向を示した。また、ＣＤ３ｅ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＴＮＦ－α陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合に変化はなかったものの、ＩＦＮ－γ陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が増加傾向を示した。このことから、免疫系が必要十分かつ適正に賦活化されたといえる。一方で、ＣＤ３ｅ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の割合が有意に増加したことから、免疫系の過剰な反応が抑制されたといえる。これらの結果よりＷＹ摂取が腸管免疫を調節することが示された。
例４：ＧＴＷＹペプチドによる腸内環境改善
　例４では、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスを使用してＧＴＷＹペプチドによる腸内環境改善の効果を評価した。
（１）方法
　６２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスを使用し、試験飼料ＧＴＷＹペプチド（Bachem社）の摂取期間は８．５ヶ月とした。ＧＴＷＹ摂取群８匹、非摂取群１２匹をそれぞれ体重の偏りのないように分けた。前記以外の条件や方法については、例１（１）に記載した条件や方法と同様の方法により行った。
（２）結果
　図８に示す通り、ＧＴＷＹ摂取群は、非摂取群と比較してプロピオン酸、ｎ－酪酸およびｎ－吉草酸が有意に増加し、ｉｓｏ－酪酸も増加傾向を示した。これらの結果よりＧＴＷＹの投与は短鎖脂肪酸量を増加させることが示された。
例５：ホエイ分解物による腸内環境改善（１）
　例５では、Ｃｒｌ：ＣＤ１（ＩＣＲ）雄性マウス（日本チャールスリバー社）を使用してホエイ分解物（雪印メグミルク社、ＨＷ－３）による腸内環境改善の効果を評価した。
（１）方法
　Ｃｒｌ：ＣＤ１（ＩＣＲ）雄性マウスを訓化飼育した後、６．５月齢の個体をホエイ分解物摂取群７匹、非摂取群１０匹にそれぞれ体重の偏りのないように分けた。摂食期間を３ヶ月として、ホエイ分解物摂取群には、ホエイ分解物を乾燥質量換算で５％（ｗ／ｗ）を含む精製飼料（ＡＩＮ－９３Ｍ、オリエンタル酵母社、タンパク質量を１４％に調整）を自由摂食させた。非摂取群にはホエイ分解物を含まないＡＩＮ－９３Ｍ（カゼイン量１４％）を自由摂食させた。前記以外の条件や方法については、例１（１）に記載した条件や方法と同様の方法により行った。
（２）結果
ア　短鎖脂肪酸の定量
　図９に示す通り、ホエイ分解物摂取群は非摂取群と比較して酢酸、ｎ－酪酸および６種の短鎖脂肪酸合計量が有意に増加し、プロピオン酸も増加傾向を示した。これらの結果よりホエイ分解物の投与は短鎖脂肪酸量を増加させることが示された。
イ　菌叢解析
　図１０に示す通り、ホエイ分解物摂取群は非摂取群と比較して、総リード数に対するBacteroidetes門の割合が有意に減少し、Actinobacteria門の割合が有意ではないが増加した。また、図１１に示す通り、ホエイ分解物摂取群は非摂取群と比較して総リード数に対するBacteroides属の割合が有意に減少し、Romboutsia属の割合が有意ではないが減少し、Bifidobacterium属、Lactobacillus属の割合が有意ではないが増加した。さらに、図１２に示す通り、ホエイ分解物摂取群は非摂取群と比較して、総リード数に対するClostridium scindensの割合が有意に減少し、Romboustia ilealisの割合が有意ではないが減少し、Bifidbacterium pseudolongumの割合が有意ではないが増加した。
ウ　小括
　これらの結果からホエイ分解物の投与は腸内菌叢を変化させ、短鎖脂肪酸量を増加させることが示された。
例６：ホエイ分解物による腸内環境改善（２）
　例６では、６２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスを使用してホエイ分解物による腸内環境改善の効果を評価した。
（１）方法
　６２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスを使用し、試験試料としてホエイ分解物を用い摂食期間を８．５ヶ月とした。ホエイ分解物摂取群１５匹、非摂取群１２匹にそれぞれ体重の偏りのないように分けた。前記以外の条件や方法については、例１（１）および例５（１）に記載した条件や方法と同様の方法により行った。
（２）結果
　図１３に示す通り、ホエイ分解物摂取群、非摂取群と比較してプロピオン酸、ｎ－酪酸およびｎ－吉草酸が有意に増加し、ｉｓｏ－酪酸も増加傾向を示した。ここで、マウスは試験飼料摂取開始時にヒト中年に、摂取終了時にはヒト老年に換算される。したがって、ホエイ分解物の摂取は老年対象者（ヒト５６～６９歳）においても短鎖脂肪酸量を増加させ、腸内環境を改善することが示された。
例７：ホエイ分解物中のテトラペプチドＧＴＷＹおよびジペプチドＷＹの含有量の測定
（１）分析試料の調製
　ホエイ分解物（ＨＷ－３、雪印メグミルク社）に滅菌水を加え適宜希釈・ろ過して測定試料とした。上記ホエイ分解物（ＨＷ－３）は、ホエイタンパク質にタンパク質分解酵素を含む酵素製剤を作用させ、次いで膜処理を行って未分解物を除去し、乾燥させて得られた製品であり、後述のようにテトラペプチドＧＴＷＹおよびジペプチドＷＹを含有するものである。
（２）分析方法
　上記（１）で得られた測定試料中のテトラペプチドＧＴＷＹおよびジペプチドＷＹの濃度をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法により下記の分析条件で定量した。なお、ＡＱＵＡ　Ｐｅｐｔｉｄｅ（Sigma Aldrich）を標準試料とする検量線法により測定試料のＧＴＷＹ濃度、ＷＹ濃度を算出した。
＜分析条件＞
質量分析装置：４０００Ｑ　ＴＲＡＰ（エービー・サイエックス社）
ＨＰＬＣ装置：Ａｇｉｌｅｎｔ　１２００　Ｓｅｒｉｅｓ（アジレント・テクノロジー社）
カラム：ＴＳＫ　ｇｅｌ　ＯＤＳ－１００Ｖ　３μｍ　２．０ｍｍ　Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ（東ソー社）
カラム温度：７０℃
移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル溶液
グラジエント条件：表４に示すグラジエント条件を適用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
流量：０．２ｍＬ／分
試料注入量：２μＬ
イオン化法：ＥＳＩ（正イオン検出モード）
カーテンガス：４０ｐｓｉ
ネブライザーガス：５０ｐｓｉ
乾燥ガス：８０ｐｓｉ
乾燥ガス温度：６００℃
コリジョンガス：窒素
イオン化電圧：５０００Ｖ
＜テトラペプチドＧＴＷＹの分析条件＞
設定質量数（ｍ／ｚ）／コリジョンエネルギー（ｅＶ）：５２６．４→１５９．２／４７、５２６．４→３６８．３／２３
ＤＰ電圧（Ｖ）：３６
＜ジペプチドＷＹの分析条件＞
設定質量数（ｍ／ｚ）／コリジョンエネルギー（ｅＶ）：３６８．２→３５１．１／１９、３６８．２→１５９．２／３３
ＤＰ電圧（Ｖ）：５１
（３）分析結果
　ホエイ分解物（ＨＷ－３）１ｇ中にテトラペプチドＧＴＷＹは１．６２ｍｇ、ジペプチドＷＹは０．６０ｍｇ、それぞれ含まれていることが確認された。
例８：ヒトを対象としたホエイ分解物による気分状態、健康関連ＱＯＬ、唾液免疫指標および腸内環境改善効果の検証試験
　例８では、ヒトを対象とした臨床試験においてホエイ分解物（雪印メグミルク社、ＨＷ－３）による気分状態、健康関連ＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ）、唾液免疫指標および腸内環境改善効果を検証した。
（１）試験の概要
　本試験は、プラセボを対照としたランダム化二重盲検並行群間比較試験とした。試験期間は６週間とし、試験期間中は後述の試験食品または対象食品を摂取させた。具体的には、日常生活でいらいらを感じることが多い、もしくは不安を感じることが多い４５歳以上６４歳以下の健常な男女に試験食品として「ホエイ分解物含有タブレット」を、対照食品として「ホエイ分解物非含有タブレット」をそれぞれ摂取させて、ホエイ分解物の気分状態、健康関連ＱＯＬ、唾液免疫指標および腸内環境に及ぼす効果を検証した。
（２）被験者
　事前検査において心理的な健康度が低く、医師から健常と判断された者を試験食品群（３０名）と対照食品群（３０名）に無作為に割付した。解析対象者は、試験食品群では２８名（男性１９名、女性９名）、対照食品群では２８名（男性２０名、女性８名）であり、解析対象者の年齢（平均値±標準偏差）は試験食品群では５４．３±４．８歳、対照食品群では５３．６±５．５歳であった。被験者には試験期間中は試験期間前と同様の生活を継続させた。
（３）被験食品
　試験期間中（６週間）、試験食品群には６粒の試験食品を、対照食品群には６粒の対照食品を１日１回水またはぬるま湯とともに毎日摂取させた。
ア　被験食品の調製
　試験食品として、ホエイ分解物（ＨＷ－３、雪印メグミルク社）と、賦形剤および結合剤を混合して練り合わせた後、打錠することによりホエイ分解物含有タブレット（３００ｍｇ／粒）を製造した。タブレット１粒中のホエイ分解物の含有量は１６８ｍｇであった。対照食品は、ホエイ分解物に代えてマルトデキストリンを１６８ｍｇ配合したホエイ分解物非含有タブレットを用いた。
イ　被験食品の分析
　上記（ア）で調製したタブレット３０粒（９ｇ）を乳鉢でよくすりつぶし、滅菌水を用いて０．０１または０．０２％（ｗ／ｖ）溶液をそれぞれ調製した。溶液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、室温、３分）して得られた上清を限外ろ過し（０．２μｍフィルター）、ろ液を０．１％（ｗ／ｖ）ギ酸含有２０％アセトニトリルで５倍希釈して測定試料とした。測定試料中のテトラペプチドＧＴＷＹおよびジペプチドＷＹの量を、例７（２）に記載の分析方法を用いて測定した。
ウ　被験食品の分析結果
　ホエイ分解物含有タブレット１粒（３００ｍｇ）中に、テトラペプチドＧＴＷＹは０．２７ｍｇ（０．０９０質量％）、ジペプチドＷＹは０．１１ｍｇ（０．０３６質量％）それぞれ含まれることを確認した。ホエイ分解物非含有タブレット中のテトラペプチドＧＴＷＹ、ジペプチドＷＹはいずれも検出限界以下であることを確認した。
（４）測定
ア　測定項目
　測定項目は、以下の項目とした。
（ｉ）気分状態
・状態－特性不安検査（本明細書において、「ＳＴＡＩ」ということがある。）
・知覚ストレス尺度（本明細書において「ＰＳＳ」ということがある。）
・やる気スコア
（ｉｉ）健康関連ＱＯＬ
・ＳＦ－３６ｖ２日本語版アキュート版（本明細書において「ＳＦ－３６」ということがある。）
（ｉｉｉ）唾液免疫指標
・唾液中免疫グロブリンＡ量（本明細書において、「ＩｇＡ」ということがある。）
（ｉｖ）腸内環境
・糞便中短鎖脂肪酸量（酢酸、プロピオン酸、ｎ－酪酸、ｉｓｏ－酪酸、ｎ－吉草酸、ｉｓｏ－吉草酸、ｎ－カプロン酸）
イ　測定時期
（ｉ）気分状態
　ＳＴＡＩ、ＰＳＳおよびやる気スコアは試験食品摂取開始前（０週目）、試験食品摂取開始後６週目の被験者の来院時に各１回（合計２回）実施した。
（ｉｉ）健康関連ＱＯＬ
　ＳＦ－３６は、試験食品摂取開始前（０週目）、試験食品摂取開始後２週目、４週目、６週目に被験者の自宅にて各１回（合計４回）実施した。
（ｉｉｉ）唾液免疫指標
　唾液サンプルは試験食品摂取開始前（０週目）、試験食品摂取開始後６週目の被験者の来院時に各１回（合計２回）採取し、それぞれ摂取０週目、摂取６週目サンプルとした。採取後に遠心分離した上清を冷凍保管し、６週目サンプル回収後に０週目サンプルおよび６週目サンプルを同時に測定した。
（ｉｖ）腸内環境
　糞便回収は、試験食品摂取開始予定日７日前から前日までに１回、試験食品摂取終了予定日７日前から前日までに１回（合計２回）採取し、それぞれ摂取０週目、摂取６週目サンプルとした。糞便サンプルは保冷状態で回収、冷凍保管を行い、６週目サンプル回収後に０週目サンプルおよび６週目サンプルを同時に測定した。
ウ　測定方法
（ｉ）気分状態
　来院時において、被験者には、ＳＴＡＩ、ＰＳＳおよびやる気スコアの質問紙に回答を記入させた。ＳＴＡＩは、不安について状態不安（回答時に感じている不安、短期的な不安）および特性不安（回答者の性格としての不安の感じやすさ、長期的な不安）にわけて評価する質問紙であり、状態不安項目である２０項目および特性不安項目である２０項目からなる質問紙である。点数が高いほど不安度が高いことを示す（参考文献：『精神・心理機能評価ハンドブック』、２３８－２３９頁、山内俊雄、鹿島晴雄ほか、中山書店）。ＰＳＳは、主観的なストレスを評価する質問紙であり、点数が高いほど主観的ストレスの感じ方が高いことを示す（参考文献：『知覚されたストレス尺度（Ｐｅｒｃｅｉｖｅｄ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｓｃａｌｅ）日本語版における信頼性と妥当性の検討』、健康心理学研究１９ 巻（２００６）２号、鷲見克典）。やる気スコアはアパシー（意欲低下状態）を判定するために用いられる、１４項目からなる質問紙である。点数が高いほど意欲低下状態であることを示す（参考文献：『精神・心理機能評価ハンドブック』、４６２－４６３頁）。
（ｉｉ）健康関連ＱＯＬ
　被検者に自宅でＳＦ－３６ｖ２日本語版アキュート版に回答させた。ＳＦ－３６は国際的に広く使われる健康関連ＱＯＬの評価方法であり、身体機能、日常役割機能（身体）、体の痛み、全体的健康感、活力、社会生活機能、日常役割機能（精神）および心の健康の８つの健康概念を測定するための３６項目で構成されている。また、８つの下位尺度から日本語版の２つのコンポーネント・サマリースコア（身体的側面のＱＯＬ、精神的側面のＱＯＬ）を算出した。点数が高いほどＱＯＬが高いことを示す（参考文献：『精神・心理機能評価ハンドブック』、２０５－２０６頁）。
（ｉｉｉ）唾液免疫指標
　被験者は来院後に水でうがいをし、１５分間座位にて安静にした後、唾液の採取を行った。唾液採取はサリソフト（ザルスタット社）を用いて行った。サリソフト付属のスポンジを２～３分間口の中に含み、唾液をスポンジに染み込ませ、２～３分後にスポンジをサリソフトに戻した。得られたサリソフトを遠心分離（２，０００ｒｐｍ、室温、５分間）し、得られた唾液（約１ｇ程度）をマイクロチューブに分注し、－８０℃で凍結した。凍結サンプルは４℃、一晩で融解し測定に供した。唾液中ＩｇＡはＳｅｃｒｅｔｏｒｙ　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ａ　Ｓａｌｉｖａｒｙ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（サリメトリックス社）を用いて、キット付属のプロトコルに従い定量した。
（ｉｖ）腸内環境
　摂取０週目および摂取６週目の糞便サンプル中の短鎖脂肪酸の定量は、例１（１）に記載の分析方法と同様にガスクロマトグラフィーを用いて実施した。
（５）評価と解析
ア　気分状態
　ＳＴＡＩ、ＰＳＳおよびやる気スコアは摂取０週目、摂取６週目それぞれの実測値を取得した後、摂取６週目での摂取０週目からの変化量を算出した。やる気スコアについては性別による層別解析を行い、女性を対象として評価を実施した。被験食品群および対照食品群において、各評価項目の摂取６週目の実測値および変化量をＭａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を用いて比較した。また、被験食品群および対照食品群それぞれにおいて摂取０週目および摂取６週目の実測値をＷｉｌｃｏｘｏｎの符号付順位和検定を用いて比較した。
イ　健康関連ＱＯＬ
　被験食品群および対照食品群におけるＳＦ－３６について、摂取２週目、摂取４週目および摂取６週目における摂取０週目からの変化量を、２標本ｔ検定を用いて、比較した。また、被験食品群および対照食品群において摂取２週目、摂取４週目および摂取６週目の実測値を、２標本ｔ検定を用いて、比較した。また、各群それぞれにおいて摂取２週目、摂取４週目および摂取６週目の実測値と摂取０週目の実測値とを、１標本ｔ検定を用いて比較した。
ウ　唾液免疫指標
　唾液中ＩｇＡ量は、摂取０週目、摂取６週目それぞれの実測値を取得した後、摂取６週目での摂取０週目からの変化量を算出した。被験食品群および対照食品群において摂取６週目の実測値および変化量を、２標本ｔ検定を用いて、評価した。また、被験食品群および対照食品群それぞれにおいて摂取０週目および摂取６週目の実測値を、１標本ｔ検定を用いて、比較した。
エ　腸内環境
　短鎖脂肪酸の解析は、年齢が高い被験者（年齢の中央値である５４．５歳以上）を対象とした層別解析により実施した。糞便中短鎖脂肪酸量は、摂取０週目、摂取６週目それぞれの実測値を取得した後、摂取６週目での摂取０週目からの変化量を算出した。被験食品群および対照食品群において摂取６週目の実測値および変化量を、２標本ｔ検定を用いて、評価した。また、被験食品群および対照食品群それぞれにおいて摂取０週目および摂取６週目の実測値を、１標本ｔ検定を用いて、比較した。短鎖脂肪酸のうちｉｓｏ－酪酸、ｎ－吉草酸、ｉｓｏ－吉草酸およびｎ－カプロン酸において、０週目または６週目のどちらかの時点で定量下限値０．３μｍｏｌ／ｇ未満の値を示した被験者については、該当項目を欠損値とした。
（６）結果
ア　気分状態
　ＳＴＡＩの結果は表３に示される通りであった。ＳＴＡＩにおいて、被験食品群での特性不安の得点変化量が対照食品群と比較して統計学的に有意に低下（改善）した（ｐ＝０．０４６）。この結果から、ホエイ分解物は、特性不安（不安の感じやすさ、長期的な不安感）を改善することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＰＳＳの結果は表４に示される通りであった。ＰＳＳにおいて、被験食品群での得点変化量が対照食品群と比較して統計学的に有意に低下（改善）した（ｐ＝０．０４３）。この結果から、ホエイ分解物は、主観的ストレスを改善することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　やる気スコアの結果は表５に、女性を対象としたやる気スコアの層別解析結果は表６にそれぞれ示される通りであった。やる気スコアにおいて、摂取６週目での被験食品群の得点が０週目と比較して統計学的に有意に低下（改善）した（ｐ＝０．００４）。一方、摂取６週目での対照食品群の得点は０週目と比較して統計学的に有意な変化は認められなかった（ｐ＝０．７９６）。また、女性を対象としたやる気スコアにおいて、被験食品群での得点変化量が対照食品群と比較して統計学的に有意に低下（改善）した（ｐ＝０．０４７）。この結果から、ホエイ分解物は、意欲を改善することが示され、特に女性において顕著に意欲を改善することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
イ　健康関連ＱＯＬ
　ＳＦ－３６の結果は表７に示す通りであった。「体の痛み」において、摂取６週目での被験食品群の得点が０週目と比較して統計学的に有意に増加（改善）した（ｐ＝０．０４３）。一方、対照食品群の得点は統計学的に有意な変化は認められなかった（ｐ＝０．６７４）。また、被験食品群での６週目における変化量が対照食品群と比較して増加（改善）する傾向を示した（ｐ＝０．０６０）。「活力」において、摂取６週目での被験食品群の得点が０週目と比較して有意に増加（改善）した（ｐ＝０．０１１）。一方、対照食品群の得点は統計学的に有意な変化は認められなかった（ｐ＝０．１９４）。また、被験食品群での６週目における変化量が対照食品群と比較して統計学的に有意に増加（改善）した（ｐ＝０．０３３）。「心の健康」において、摂取４週目および６週目での被験食品群の得点が０週目と比較して統計学的に有意に増加（改善）した（それぞれｐ＝０．０３０、ｐ＝０．０１９）。一方、対照食品群の得点は統計学的に有意な変化は認められなかった（それぞれｐ＝０．４６１、ｐ＝０．９９８）。また、被験食品群での６週目における変化量が対照食品群と比較して増加（改善）する傾向を示した（ｐ＝０．０７９）。「精神的健康（サマリースコア）」において、摂取４週目および６週目での被験食品群の得点が０週目と比較して統計学的に有意に増加（改善）した（それぞれｐ＝０．０４５、ｐ＝０．０１３）。一方、対照食品群の得点は統計学的に有意な変化は認められなかった（それぞれｐ＝０．６０６、ｐ＝０．８５０）。被験食品群での６週目における変化量が対照食品群と比較して統計学的に有意に増加（改善）した（ｐ＝０．０３９）。これらの結果から、ホエイ分解物は「体の痛み」、「活力」、「心の健康」および「精神的健康」等の健康関連ＱＯＬを改善することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
ウ　唾液免疫指標
　唾液中ＩｇＡの測定結果は表８に示す通りであった。摂取６週目での対照食品群のＩｇＡ量が０週目と比較して統計学的に有意に低下（悪化）した（ｐ＝０．０１８）。一方、被験食品群のＩｇＡ量は有意な変化は認められなかった（ｐ＝０．９２７）。被験食品群での唾液中ＩｇＡの６週目における変化量の値は対照食品群と比較して有意に少ない変化量を示した（ｐ＝０．０４５）。この結果から、ホエイ分解物は唾液免疫指標を改善することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
エ　腸内環境
　年齢が高い被験者（年齢中央値以上）を対象とした短鎖脂肪酸量の測定結果は表９に示す通りであった。酢酸およびプロピオン酸について、摂取６週目での対照食品群の酢酸およびプロピオン酸量が０週目と比較して統計学的に有意に減少（悪化）した（それぞれｐ＜０．００１、ｐ＝０．０４５）。一方、被験食品群では統計学的に有意な変化は認められなかった（それぞれｐ＝０．９６４、ｐ＝０．３９２）。ｎ－酪酸およびｎ－吉草酸について、摂取６週目での被験食品群のｎ－酪酸およびｎ－吉草酸量が０週目と比較して統計学的に有意に増加（改善）した（それぞれｐ＝０．０２４、ｐ＝０．０３１）。一方、対照食品群では有意な変化は認められなかった（それぞれｐ＝０．４５９、ｐ＝０．３４８）。被験食品群での酢酸（ｐ＝０．０２７）、プロピオン酸（ｐ＝０．０２８）、ｉｓｏ－酪酸（ｐ＝０．０２６）、ｎ－吉草酸（ｐ＝０．０４５）およびｉｓｏ－吉草酸（ｐ＝０．０３０）の６週目における変化量が対照食品群と比較して有意に増加（改善）した。また、被験食品群でのｎ－酪酸の６週目における変化量が対照食品群と比較して増加傾向を示した（ｐ＝０．０９４）。これらの結果から、年齢が高い被験者においてホエイ分解物は糞便中の短鎖脂肪酸量を増加することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
（７）小括
　これらの結果より、テトラペプチドＧＴＷＹまたはジペプチドＷＹを含有するホエイ分解物は長期的な不安感もしくは抑うつ感、主観的ストレスまたは意欲低下等の気分状態を改善すること、活力または精神的健康等の健康関連ＱＯＬを改善すること、ＩｇＡを指標とする免疫状態を改善すること、および糞便中の短鎖脂肪酸量を増加させ、腸内環境を改善することが示された。

Claims (12)

  1. 　ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドおよび／またはＷＹのアミノ酸配列を有するペプチドを含有するホエイタンパク質酵素分解物を有効成分として含んでなる、腸内および／もしくは口腔内の環境改善、腸内および／もしくは口腔内の菌叢改善並びに／または腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進用組成物。
  2. 　ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドおよび／またはＷＹのアミノ酸配列を有するペプチドを含有するホエイタンパク質酵素分解物を有効成分として含んでなる、腸管および／または口腔内免疫調節用組成物。
  3. 　ホエイタンパク質酵素分解物中のＧＴＷＹの含有量（固形分換算）が０．５～５ｍｇ／ｇである、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 　ホエイタンパク質酵素分解物中のＷＹの含有量（固形分換算）が０．０５～２ｍｇ／ｇである、請求項１～３いずれか一項に記載の組成物。
  5. 　ホエイタンパク質酵素分解物をヒト１日当たり１～５００００ｍｇ（固形分換算）で摂取させる、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 　ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドおよび／またはＷＹのアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含んでなる、腸内および／もしくは口腔内の環境改善、腸内および／もしくは口腔内の菌叢改善並びに／または腸内および／もしくは口腔内における短鎖脂肪酸産生促進用組成物。
  7. 　ＧＴＷＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドおよび／またはＷＹのアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含んでなる、腸管および／または口腔内免疫調節用組成物。
  8. 　ＧＴＷＹ（配列番号１）をヒト１日当たり０．００１～１０００ｍｇ（固形分換算）で摂取させる、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 　ＷＹをヒト１日当たり０．００１～５００ｍｇ（固形分換算）で摂取させる、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 　食品組成物である、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 　１食当たりの単位包装形態である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 　中高年者に摂取させるための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
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