TWI773739B

TWI773739B - 用以促進體內ｂｄｎｆ量增加之組成物

Info

Publication number: TWI773739B
Application number: TW107108071A
Authority: TW
Inventors: 東誠一郎; 齋藤佳絵; 山地健人
Original assignee: 日商明治股份有限公司
Priority date: 2017-03-10
Filing date: 2018-03-09
Publication date: 2022-08-11
Also published as: JPWO2018164254A1; TW201842924A; WO2018164254A1; JP6435079B1; JP7108521B2; CN110381965A; JP2019043956A

Abstract

本發明提供用以促進體內，特別是肌肉內腦衍生神經滋養因子(BDNF)量增加之組成物。本發明之組成物為以乳清蛋白質水解物為有效成分之用以促進體內BDNF量增加之組成物，且該乳清蛋白質水解物的特徵為含有選自由Ile-Leu、Leu-Leu及Val-Leu所成群之至少一個雙肽。

Description

用以促進體內ＢＤＮＦ量增加之組成物

本發明與一種具有促進體內腦衍生神經滋養因子(Brain Derived Neurotrophic Factor：BDNF)(以下，本發明中簡稱為「BDNF」)量增加之作用的組成物有關。更詳細地說，本發明與一種無論有無運動，皆可促進體內，特別是肌肉內BDNF量增加之組成物有關。

現在，在日本，憂鬱和失智症(包含阿茲海默型失智症和血管性失智症等)等精神疾病的增加成為社會問題。老年失智症患者數從2002年的149萬人起，於10年內倍增，而在2012年達到300萬人以上。此外根據日本厚生勞動省研究班的報告(2012)，推估作為失智症的發病可能患病者而受到矚目的輕度失智症老年人有約400萬人，經計算65歲以上4人中有1人會成為失智症或失智症可能患病者。現況是，失智症一旦發病，即使進行治療也只能抑制病情發展而無法根治。因此，失智症一旦發病，不僅患者的人生大幅改變，也會對照護的家人造成過大的負擔而不得不以照護為由而被迫離職等，人生計劃的改變無法避免。這種因離職而造成之勞動世代的勞動力損失對國家經濟的影響是絕對無法忽視的。

因此，僅行預防控制不使失智症發病不僅對個人來說是緊要的課題，對現代社會來說也是緊要的課題。

傳統上認為攝取牛乳和乳製品對於這種失智症的預防是有用的。具體來說，有報告或推論指出牛乳和乳製品中富含的鈣和鎂對於失智症有預防效果(非專利文獻1)，而且牛乳和乳製品中所包含的乳清改善作為阿茲海默型失智症危險因子的胰島素抗性(非專利文獻2)。

另一方面，已知一旦運動，則作為參與神經細胞產生、成長、維持或再生的神經滋養因子之一的BDNF即會明顯增加，而且記憶和學習等的表現也會同時提高(非專利文獻3)。此外，根據許多流行病學研究和實驗，已知可透過運動抑制老年人認知功能的退化(非專利文獻4~6)。此外，最近經由動物實驗確認，海馬BDNF因經由暫時性電刺激的強制運動負荷而增加(非專利文獻7)。此外，有報告指出腦中BDNF的表現量在憂鬱症和阿茲海默型失智症患者中減少(非專利文獻8、非專利文獻9)。

因此，暗示因運動而增加的BDNF對於預防憂鬱症和失智症等的精神疾病是有效的。

此外，也有報告指出透過對腦室內、皮下或腹腔內投予BDNF，體重的增加獲得抑制，並改善糖代謝(非專利文獻10)。 [先前技術文獻] [非專利文獻]

[非專利文獻1]J Am Geriatr Soc. 2012, 60(8)：1515-1520. 　　[非專利文獻2]Nutrition. 2014, 30(9)：1076-1080 　　[非專利文獻3]Neeper SA et al. Brain Res, 726：49-56(1996) 　　[非專利文獻4]Trends Neurosci. 2002, 25(6)：295-301. 　　[非專利文獻5]Nature.1999, 29; 400(6743)：418-419. 　　[非專利文獻6]Cell Mol Neurobiol. 2010, 30(4)：493-503. 　　[非專利文獻7]日本第31回補助年輕研究員健康科學研究成果報告書 2014年度,pp.104-109 　　[非專利文獻8]Chen B et al, Biolpsychiatry. 50：260-265(2001). 　　[非專利文獻9]Phillips HS et al. Neuron. 7：695-702(1991). 　　[非專利文獻10]Nakagawa T et al, Diabetes, 49：436-444(2000)

[發明所欲解決之課題]

如前述，運動與認知功能的相關研究蓬勃發展，且有結果暗示BDNF和運動帶來的改善認知功能有關，然而關於攝取飲食物對BDNF的影響，尤其是運動與攝取飲食物的組合帶來的效果仍有許多尚不明瞭的部分。因此，本發明為著眼於攝取飲食物對BDNF的效果，尤其是運動與攝取飲食物帶來的效果者。具體來說，本發明為以藉由飲食物攝取或並用運動與飲食物攝取，有效率地增大參與認知功能和糖代謝的改善之BDNF的量為課題，而開發完成者。

即，本發明以提供被用以促進體內，特別是肌肉內之BDNF量增加之組成物，換言之以提供用以促進體內，特別是肌肉內BDNF量增加之組成物為目的。此外，本發明以提供用以促進體內，特別是肌肉內BDNF量增加之方法為目的。 [用以解決課題之手段]

本發明者群為解決上述課題進行潛心研究後發現，藉由攝取包含選自由Ile-Leu、Leu-Leu及Val-Leu所成群之至少一個雙肽的乳清蛋白質水解物，肌肉內BDNF量會顯著增加。因為沒有在水解前的乳清蛋白質明顯觀察到這種效果，所以推測此效果來自不含於乳清蛋白質中之作為乳清蛋白質水解物固有成分的雙肽的貢獻。如前所述，有報告暗示BDNF對於憂鬱症或失智症等精神疾病的預防還有認知功能改善是有效的，並指出對於體重增加的抑制和糖代謝降低的改善也是有效的。因此，推測前述含雙肽之乳清蛋白質水解物對於憂鬱症或失智症等精神疾病的預防、認知功能改善、體重增加的抑制或/及糖代謝降低的改善是有用的。

本發明為基於這些發現而完成，且具有下述之實施型態者。再者，以下，於本說明書，將乳清蛋白質水解物(Whey protein Hydrolysate)簡稱為「WPH」。而且雙肽為使用胺基酸的三個字母符號將構成該雙肽之胺基酸序列記載為「Xxx-Yyy」。

(I)用以促進體內BDNF量增加之組成物　　(I-1)一種用以促進BDNF量增加之組成物，其為以WPH為有效成分之用以促進體內，以肌肉內為佳之BDNF量增加之組成物，　　且該WPH為含有選自由Ile-Leu(異白胺醯基-白胺酸)、Leu-Leu(白胺醯基-白胺酸)及Val-Leu(纈胺醯基-白胺酸)所成群之至少一個雙肽者。　　(I-2)如(I-1)之用以促進BDNF量增加之組成物，其中上述WPH為含有Ile-Leu、Leu-Leu及Val-Leu者。　　(I-3)如(I-1)或(I-2)之用以促進BDNF量增加之組成物，其中上述WPH為進一步含有選自由Ile-Val(異白胺醯基-纈胺酸)、Ile-Ile(異白胺醯基-異白胺酸)、Leu-Val(白胺醯基-纈胺酸)及Leu-Ile(白胺醯基-異白胺酸)所成群之至少一個雙肽者。　　(I-4)如(I-1)或(I-2)之用以促進BDNF量增加之組成物，其中上述WPH為進一步含有由Ile-Val、Ile-Ile、Leu-Val及Leu-Ile所構成之雙肽者。　　(I-5)如(I-1)~(I-4)中任一項之用以促進BDNF量增加之組成物，其為對運動前或運動中之包含人類的哺乳動物口服投予或使之攝取者。　　(I-6)如(I-5)之用以促進BDNF量增加之組成物，其為用以促進運動中或運動後的肌肉內BDNF量增加之組成物。　　(I-7)如(I-1)~(I-4)中任一項之用以促進BDNF量增加之組成物，其為對非運動狀態之包含人類的哺乳動物口服投予或使之攝取者。　　(I-8)如(I-1)~(I-7)中任一項之用以促進BDNF量增加之組成物，其為對認知功能退化者或其可能患病者口服投予或使之攝取者。　　(I-9)如(I-8)之用以促進BDNF量增加之組成物，其為用以抑制或改善認知功能退化之組成物。　　(I-10)如(I-1)~(I-7)中任一項之用以促進BDNF量增加之組成物，其為對肥胖者或/及糖代謝降低者，或此等的可能患病者口服投予或使之攝取者。　　(I-11)如(I-10)之用以促進BDNF量增加之組成物，其為用以抑制或改善肥胖，或/及為用以抑制或改善糖代謝降低之組成物。　　(I-12)如(I-1)~(I-11)中任一項之用以促進BDNF量增加之組成物，其由每一次投予(攝取)的單位包裝型態所構成，且在該單位包裝型態中包含作為一次投予量(攝取量)以總蛋白質換算為0.1~40g之上述WPH。　　(I-13)如(I-1)~(I-12)中任一項之用以促進BDNF量增加之組成物，其為飲食物。　　(I-14)如(I-13)之用以促進BDNF量增加之組成物，其為健康食品、功能性食品、營養補助食品、功能性表示食品、特定保健用食品、病患用食品、嬰幼兒用調製奶粉、懷孕婦女或哺乳婦女用奶粉，或者是附有用以促進運動增加體內BDNF量的聲明之飲食物。

(II)體內BDNF量之增加方法　　(II-1)一種增加受驗者體內，以肌肉內為佳之BDNF量之方法，其對該受驗者投予或使之攝取包含含有選自由Ile-Leu、Leu-Leu及Val-Leu所成群之至少一個雙肽之WPH的組成物。　　(II-2)如(II-1)之方法，其中上述WPH為含有Ile-Leu、Leu-Leu及Val-Leu者。　　(II-3)如(II-1)或(II-2)之方法，其中上述WPH為進一步含有選自由Ile-Val、Ile-Ile、Leu-Val及Leu-Ile所成群之至少一個雙肽者。　　(II-4)如(II-1)或(II-2)之方法，其中上述WPH為進一步含有由Ile-Val、Ile-Ile、Leu-Val及Leu-Ile所構成之雙肽者。　　(II-5)如(II-1)~(II-4)中任一項之方法，其中前述受驗者為運動前或運動中之包含人類的哺乳動物。　　(II-6)如(II-5)之方法，其為增加運動中或運動後的肌肉內BDNF量之方法。　　(II-7)如(II-1)~(II-4)中任一項之方法，其中前述受驗者為非運動狀態之包含人類的哺乳動物。　　(II-8)如(II-1)~(II-7)中任一項之方法，其中前述受驗者為認知功能退化者或其可能患病者。　　(II-9)如(II-8)之方法，其為抑制或改善前述受驗者認知功能退化之方法。　　(II-10)如(II-1)~(II-8)中任一項之方法，其為增進包含人類的哺乳動物之記憶或學習的表現之方法。　　(II-11)如(II-1)~(II-7)中任一項之方法，其中前述受驗者為肥胖者或/及糖代謝降低者，或此等的可能患病者。　　(II-12)如(II-11)之方法，其為抑制或改善前述受驗者的肥胖，或/及抑制或改善糖代謝降低之方法。　　(II-13)如(II-1)~(II-12)中任一項之方法，其中前述組成物由每一次投予(攝取)的單位包裝型態所構成，且為在該單位包裝型態中包含作為一次投予量(攝取量)以總蛋白質換算為0.1~40g之WPH者。　　(II-14)如(II-1)~(II-13)中任一項之方法，其中前述組成物為飲食品，以健康食品、功能性食品、營養補助食品、功能性表示食品、特定保健用食品、病患用食品、嬰幼兒用調製奶粉、懷孕婦女或哺乳婦女用奶粉，或者是附有用以促進運動增加體內BDNF量的聲明之飲食物為佳。

(III)被用以促進體內BDNF量增加之WPH 　　(III-1)一種組成物，其為被用以促進受驗者體內，以肌肉內為佳之BDNF量增加之組成物，　　且該組成物為以含有選自由Ile-Leu、Leu-Leu及Val-Leu所成群之至少一個雙肽之WPH為有效成分者。　　(III-2)如(III-1)之組成物，其中上述WPH為含有Ile-Leu、Leu-Leu及Val-Leu者。　　(III-3)如(III-1)或(III-2)之組成物，其中上述WPH為進一步含有選自由Ile-Val、Ile-Ile、Leu-Val及Leu-Ile所成群之至少一個雙肽者。　　(III-4)如(III-1)或(III-2)之組成物，其中上述WPH為進一步含有由Ile-Val、Ile-Ile、Leu-Val及Leu-Ile所構成之雙肽者。　　(III-5)如(III-1)~(III-4)中任一項之組成物，其中前述受驗者為運動前或運動中之包含人類的哺乳動物。　　(III-6)如(III-5)之組成物，其為被用以促進運動中或運動後的肌肉內BDNF量增加。　　(III-7)如(III-1)~(III-4)中任一項之組成物，其中前述受驗者為非運動狀態之包含人類的哺乳動物。　　(III-8)如(III-1)~(III-7)中任一項之組成物，其中前述受驗者為認知功能退化者或其可能患病者。　　(III-9)如(III-8)之組成物，其為被用以抑制或改善認知功能退化。　　(III-10)如(III-1)~(III-7)中任一項之組成物，其中前述受驗者為肥胖者或/及糖代謝降低者，或此等的可能患病者。　　(III-11)如(III-10)之組成物，其為被用以抑制或改善肥胖，或/及抑制或改善糖代謝降低。　　(III-12)如(III-1)~(III-11)中任一項之組成物，其由每一次投予(攝取)的單位包裝型態所構成，且為在該單位包裝型態中包含作為一次投予量(攝取量)以總蛋白質換算為0.1~40g之上述WPH之組成物。　　(III-13)如(III-1)~(III-12)中任一項之組成物，其為飲食品，以健康食品、功能性食品、營養補助食品、功能性表示食品、特定保健用食品、病患用食品、嬰幼兒用調製奶粉、懷孕婦女或哺乳婦女用奶粉，或者是附有用以促進運動增加體內BDNF量的聲明之飲食物為佳。

(IV)用以製造用以促進體內BDNF量增加之組成物之WPH的使用　　(IV-1)一種使用，其為用以製造用以促進受驗者體內，以肌肉內為佳之BDNF量增加之組成物之WPH的使用，且該WPH為含有選自由Ile-Leu、Leu-Leu及Val-Leu所成群之至少一個雙肽者。　　(IV-2)如(IV-1)之使用，其中上述WPH為含有Ile-Leu、Leu-Leu及Val-Leu者。　　(IV-3)如(IV-1)或(IV-2)之使用，其中上述WPH為進一步含有選自由Ile-Val、Ile-Ile、Leu-Val及Leu-Ile所成群之至少一個雙肽者。　　(IV-4)如(IV-1)或(IV-2)之使用，其中上述WPH為進一步含有由Ile-Val、Ile-Ile、Leu-Val及Leu-Ile所構成之雙肽者。　　(IV-5)如(IV-1)~(IV-4)中任一項之使用，其中前述受驗者為運動前或運動中之包含人類的哺乳動物。　　(IV-6)如(IV-5)之使用，其中前述組成物為用以促進受驗者運動中或運動後的肌肉內BDNF量增加者。　　(IV-7)如(IV-1)~(IV-4)中任一項之使用，其中前述受驗者為非運動狀態之包含人類的哺乳動物。　　(IV-8)如(IV-1)~(IV-7)中任一項之使用，其中前述受驗者為認知功能退化者或其可能患病者。　　(IV-9)如(IV-8)之使用，其中前述組成物為用以抑制或改善認知功能退化者。　　(IV-10)如(IV-1)~(IV-7)中任一項之使用，其中前述受驗者為肥胖者或/及糖代謝降低者，或此等的可能患病者。　　(IV-11)如(IV-10)之使用，其為用以抑制或改善肥胖，或/及抑制或改善糖代謝降低者。　　(IV-12)如(IV-1)~(IV-11)中任一項之使用，其中前述組成物由每一次投予(攝取)的單位包裝型態所構成，且為在該單位包裝型態中包含作為一次投予量(攝取量)以總蛋白質換算為0.1~40g之上述WPH之組成物。　　(IV-13)如(IV-1)~(IV-12)中任一項之使用，其中前述組成物為飲食品，以健康食品、功能性食品、營養補助食品、功能性表示食品、特定保健用食品、病患用食品、嬰幼兒用調製奶粉、懷孕婦女或哺乳婦女用奶粉，或者是附有用以促進運動增加體內BDNF量的聲明之飲食物為佳。 [發明之效果]

藉由本發明，提供一種以WPH為有效成分之用以促進體內，特別是肌肉內BDNF量增加之組成物(以下，有時簡稱為「本發明之組成物」)。

藉由在攝取本發明之組成物後運動，或是在運動中攝取本發明之組成物，可促進運動增加體內，特別是肌肉內BDNF量，其結果為可有效地增加肌肉內的BDNF量(參照試驗例1)。如前所述，以往已知可透過運動抑制老年人認知功能的退化，而且BDNF會提高記憶和學習等的表現，並暗示對於憂鬱症和失智症等精神疾病的預防也是有效的。因此，藉由在運動時攝取本發明之組成物而進一步提高上述效果是可能的。

此外，BDNF的增加不僅止於攝取WPH並運動的情況，在不運動的情況下也顯著增加(參照試驗例2)。由此推測BDNF的增加與運動的有無無關，而是透過攝取WPH而得到的特有效果。此外，因為這樣的效果在水解前的WPH並不顯著，所以推測此效果來自不含於乳清蛋白質中(即使有也是微量)之作為乳清蛋白質水解物固有成分的雙肽的貢獻。

此外有報告指出BDNF具有體重增加的抑制作用和糖代謝的改善作用。因此，藉由本發明，可期待藉由攝取本發明之組成物而得到該效果。

再者，本發明之組成物中所含之WPH為利用長久以來被使用作為食品原料之乳蛋白質者。因此，本發明之組成物即使長期連續服用也不用擔心副作用，在安全性高的這一點上是有利的。此外，於天然乳酪的製造過程中，乳清蛋白質通常是在原料乳的凝乳過程之後被排出廢棄而成為產業廢棄物者。作為有效成分而被包含於本發明之組成物的WPH，因為可再利用此產業廢棄物乳清作為原料，所以本發明在環境面和經濟面也可說是有用的。

本發明中作為對象之用以促進體內BDNF量增加之組成物(本發明之組成物)的特徵為，包含以含有選自由Ile-Leu、Leu-Leu及Val-Leu所成群之至少一個雙肽之WPH(以下，有時稱為「本發明之WPH」)作為有效成分。

一般來說，WPH為以乳清蛋白質為原料將其全部或部分水解後所得到者，亦被稱為乳清肽。

乳清蛋白質是作為去除乳中的酪蛋白和脂肪後之液體部分的乳清(乳清)中所包含之球狀蛋白質的混合物，包含α-乳白蛋白(α-La)、β-乳球蛋白(β-Lg)、免疫球蛋白、乳鐵蛋白、牛血清白蛋白等的蛋白質。於本發明，被使用作為調製WPH中的原料之乳清蛋白質可為精製自乳或乳清之乳清蛋白質，或者亦可為分離自乳或乳清之粗精製乳清蛋白質(乳清蛋白質含有物)。此外亦可使用包含乳清蛋白質之飲食品和其原料(例如，含有乳蛋白質以外之其他成分的組成物等)。該飲食品和其原料亦可為除了乳清蛋白質以外還包含酪蛋白者。

作為上述精製乳清蛋白質，可舉出α-乳白蛋白(α-La)、β-乳球蛋白(β-Lg)、免疫球蛋白、乳鐵蛋白以及包含此等之中至少一個的蛋白質混合物，還有乳清蛋白質精製物(WPI)等。而且作為上述精製乳清蛋白質(乳清蛋白質含有物)，可舉出調製自牛乳之例如乳清原液(甜乳清、酸乳清等)、其濃縮物、其乾燥物(乳清粉等)、其冷凍物及此等的還原物等。此外，此等中可包含脫鹽乳清、乳清蛋白質濃縮物(WPC)及此等的還原物。此外，作為包含乳清蛋白質之飲食品或其原料，例如可舉出生乳、殺菌乳(牛乳等)、脫脂乳、成分調整牛乳、加工乳、乳製品(濃縮乳、奶粉、煉乳、發酵乳(優酪乳等)、乳酸菌飲料、再製起司類、冰淇淋類、乳脂類)及乳蛋白質濃縮物(MPC)、還有此等的濃縮物、此等的乾燥物、此等的冷凍物等。此時，前述包含乳清蛋白質之原料和飲食品，可取得市售品並使用，亦可自行調製並使用。

本發明之WPH，可經由將上述乳清蛋白質水解一次以上來調製。其手段及/或方法並無特殊限制。例如，可在從乳或乳清分離或精製乳清蛋白質的步驟中，部分水解乳清蛋白質，其後亦可更進一步進行額外的水解來調製。水解，可按照為公眾所知的水解方法實施，但以使用蛋白質分解酵素的水解方法為佳。

蛋白質分解酵素，只要是可水解乳清蛋白質並生成發揮本發明之效果的WPH者，即無特殊限制。例如可參考國際公開第2007/123200號等的記載，任意地設定其種類和反應條件等。例如可舉出來自屬於芽孢桿菌屬(Bacillus)或麴菌屬(Aspergillus)之微生物的蛋白質分解酵素；來自木瓜的木瓜酵素、來自鳳梨的鳳梨酵素、來自奇異果的奇異果蛋白酶等來自植物的蛋白質分解酵素；胰酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等來自動物的蛋白質分解酵素。此等可單獨使用1種，或者任意地組合2種以上使用。此外，此等蛋白質分解酵素可使用市售品。市售品之蛋白質分解酵素例如有蛋白酶M天野(天野酶公司)、蛋白酶N天野(天野酶公司)、蛋白酶P天野(天野酶公司)、蛋白酶A天野(天野酶公司)、胰蛋白酶(Novo公司)、胃蛋白酶(和光純藥公司)、Umamizyme(天野酶公司)、Flavourzyme(Novo公司)等，但並不限定於此等。根據本發明之理想態樣，被用以水解乳清蛋白質之蛋白質分解酵素選自由來自芽孢桿菌屬之蛋白質分解酵素、來自麴菌屬之蛋白質分解酵素、胰蛋白酶、胃蛋白酶及Flavourzyme (Novo公司)所成群之一種或兩種以上。

本發明之WPH經由使用水解乳清蛋白質之蛋白質分解酵素，而可調製富含選自由Ile-Leu、Leu-Leu及Val-Leu所成群之至少一個雙肽之水解物。例如，對於水解乳清蛋白質以生成Ile-Leu之雙肽而言，以組合來自芽孢桿菌屬之蛋白酶及來自麴菌屬之蛋白酶以水解乳清蛋白質為佳。而且，對於水解乳清蛋白質以生成Leu-Leu之雙肽而言，以使乳清蛋白質與胃蛋白酶反應後，再與來自麴菌屬之蛋白酶反應為佳。此外，以該方法水解乳清蛋白質有時也會生成Leu-Val和Gly-Leu之雙肽。再者，對於水解乳清蛋白質以生成Val-Leu之雙肽而言，以使用來自麴菌屬之蛋白酶以水解乳清蛋白質為佳。以該方法水解乳清蛋白質有時也會生成Ile-Val、Ile-Ile及Leu-Ile之雙肽。而且除此之外，對於水解乳清蛋白質以生成Ala-Leu之雙肽而言，以使乳清蛋白質與胰蛋白酶反應後，再與來自芽孢桿菌屬之蛋白酶反應為佳。

以蛋白質分解酵素水解乳清蛋白質而生成所期望之雙肽所需的反應溫度以20~80℃為佳，以25~75℃為較佳，以30~70℃為更佳，以35~65℃為更佳，以40~60℃為更佳，以45~55℃為特佳。若反應溫度在20℃以上，即可有效率地藉由蛋白質分解酵素水解乳清蛋白質。而且，若反應溫度在80℃以下，則可抑制蛋白質分解酵素因變性而失活。該反應溫度可視所使用之蛋白質水解酵素的最適溫度設定在一定的溫度(一階段)，亦可設定在兩個以上的不同溫度(兩階段以上)。在設定兩階段以上之反應溫度的情況下，其順序是任意的。

以蛋白質分解酵素水解乳清蛋白質而生成所期望之雙肽所需的反應時間雖無限制，但以2~48小時為佳，以2~36小時為較佳，以2~24小時為更佳，以2~18小時為更佳，以2~14小時為更佳，以4~12小時為更佳，以6~10小時為更佳，以7~9小時為特佳。藉由將蛋白質分解酵素的反應時間設為2小時以上，可水解較多的乳清蛋白質。為了有效率地水解乳清蛋白質，以將反應時間控制在48小時以內為佳。此外，在將反應時間設定為兩階段以上的情況下，可在該反應時間的範圍內任意設定兩階段以上的反應溫度。

以蛋白質分解酵素水解乳清蛋白質而生成所期望之雙肽所需的蛋白質分解酵素添加量，只要是能生成發揮本發明之效果的WPH即無特殊限制。例如，相對於乳清蛋白質100g，以0.5~10g為佳，以0.7~5g為較佳，以0.8~4g為更佳，以1~2g為特佳。

以蛋白質分解酵素水解乳清蛋白質而生成所期望之雙肽所需的反應pH，可舉出以所使用之蛋白質分解酵素進行反應之pH範圍為佳，以其最適pH或其附近pH更為適合。例如，在合併使用來自芽孢桿菌屬之蛋白質分解酵素及來自麴菌屬之蛋白質分解酵素的情況下，以pH5~9為佳，以pH5.5~8.5為較佳，以pH6~8為更佳，以pH6.5~7.5為特佳。

該反應pH可視所使用之蛋白質水解酵素的最適pH設定為一定的pH條件(一階段)，亦可設定為兩個以上的不同pH條件(兩階段以上)。在設定兩階段以上之pH條件的情況下，其順序是任意的。

如前所述，本發明之WPH的特徵為包含選自由Ile-Leu、Leu-Leu及Val-Leu所成群之至少一種雙肽。以包含2種以上此等雙肽者為佳，以包含3種此等雙肽者為較佳。作為包含2種以上時的組合態樣，可舉出Ile-Leu與Leu-Leu、Ile-Leu與Val-Leu、Leu-Leu與Val-Leu或Ile-Leu與Leu-Leu與Val-Leu為例。本發明之WPH能以含包含上述特定雙肽為作為指標。

本發明之WPH中所含之此等雙肽可透過LC/MS和LC/MS/MS測定。具體來說，可藉後述之製造例1中所記載的方法測定。除了如前述之水解反應條件，包含此等雙肽之本發明之WPH以可透過參照後述製造例1~11中所記載之例來製造。

此等雙肽在每1gWPH中的含有量(mg)可設定如下。　　Ile-Leu：0.1~25mg/gWPH，以0.5~15mg/gWPH為佳，以1~10mg/gWPH為較佳。　　Leu-Leu：0.5~50mg/gWPH，以1~25mg/gWPH為佳，以2~10mg/gWPH為較佳。　　Val-Leu：0.5~50mg/gWPH，以1~25mg/gWPH為佳，以2~10mg/gWPH為較佳。

本發明之WPH，亦可為以下述每1gWPH的蛋白質含量的比例包含上述雙肽之至少一種者。　　Ile-Leu：0.09~22.5mg/g蛋白質，以0.45~13.5mg/g蛋白質為佳，以0.9~9mg/g蛋白質為較佳。　　Leu-Leu：0.45~45mg/g蛋白質，以0.9~22.5mg/g蛋白質為佳，以1.8~9mg/g蛋白質為較佳。　　Val-Leu：0.45~45mg/g蛋白質，以0.9~22.5mg/g蛋白質為佳，以1.8~9mg/g蛋白質為較佳。

於此，所謂「WPH的蛋白質含量」代表WPH中所包含之胺基酸，還有構成WPH中所包含之蛋白質以及肽之胺基酸的總量。此蛋白質含量可透過凱氏定氮法測定而算出。實際上，在凱氏定氮法的情況下，可測定作為對象之WPH中所包含之氮，然後將該值乘以氮-蛋白質換算係數(通常為6.25)而算出。例如，由於本發明之WPH為經由水解乳清蛋白質而得到者，所以透過上述方法算出之WPH的蛋白質含量，在理論上與水解前之乳清蛋白質的蛋白質含量是一樣的。

此外本發明之WPH除了前述之包含選自由Ile-Leu、Leu-Leu及Val-Leu所成群之至少1種雙肽，以包含2種以上雙肽為佳，以包含3種以上雙肽為較佳以外，亦可為進一步包含選自由Ile-Val、Ile-Ile、Leu-Val及Leu-Ile所成群之至少1種雙肽者。以包含2種以上之此等雙肽者為佳，以包含3種以上此等雙肽者為較佳，以包含4種此等雙肽者為更佳。作為包含2種以上時的組合態樣，可舉出Ile-Val與Ile-Ile、Ile-Val與Leu-Val、Ile-Val與Leu-Ile、Ile-Ile與Leu-Val、Ile-Ile與Leu-Ile、Leu-Val與Leu-Ile、Ile-Val與Ile-Ile與Leu-Val、Ile-Val與Ile-Ile與Leu-Val、Ile-Ile與Leu-Val與Lue-Ile、Ile-Val與Ile-Ile與Leu-Val與Leu-Ile。此本發明之WPH能以含包含上述特定雙肽為作為指標。

本發明之WPH中所含之此等雙肽亦可透過LC/MS和LC/MS/MS測定。此等雙肽之每WPH之含有量可設定如下。　　Ile-Val：0.1~10mg/gWPH，以0.2~5mg/gWPH為佳，以0.5~1.5mg/gWPH為較佳，　　Ile-Ile：0.05~10mg/gWPH，以0.1~5mg/gWPH為佳，以0.2~1mg/gWPH為較佳　　Leu-Val：0.1~10mg/gWPH，以0.2~5mg/gWPH為佳，以0.5~1.5mg/gWPH為較佳　　Leu-Ile：0.01~10mg/gWPH，以0.02~5mg/gWPH為佳，以0.05~0.2mg/gWPH為較佳。

本發明之WPH，亦可為以下述每1gWPH的蛋白質含量的比例包含上述雙肽之至少一種者。「WPH的蛋白質含量」的意義如前所述。　　Ile-Val：0.09~9mg/g蛋白質，以0.18~4.5mg/g蛋白質為佳，以0.45~1.35mg/g蛋白質為較佳　　Ile-Ile：0.045~9mg/g蛋白質，以0.09~4.5mg/g蛋白質為佳，以0.18~0.9mg/g蛋白質為較佳　　Leu-Val：0.09~9mg/g蛋白質，以0.18~4.5mg/g蛋白質為佳，以0.45~1.35mg/g蛋白質為較佳　　Leu-Ile：0.009~9mg/g蛋白質，以0.018~4.5mg/g蛋白質為佳，以0.045~0.2mg/g蛋白質為較佳。

作為本發明之WPH，可舉出作為Ile-Leu、Leu-Leu及Val-Leu之雙肽的總量，在每1gWPH中以1.1~125mg/gWPH，以2.5~65mg/gWPH為佳，以5~30mg/gWPH為較佳的比例包含者。該WPH中所包含之此等雙肽的總量，換算成每1gWPH的蛋白質含量為0.99 ~112.5mg/g蛋白質，可以2.25~58.5mg/g蛋白質為佳，以4.5~27mg/g蛋白質為較佳。

此外本發明之WPH，可舉出作為Ile-Val、Ile-Ile、Leu-Val及Leu-Ile之雙肽的總量，在每1gWPH中以0.26~40mg/gWPH，以0.52~20mg/gWPH為佳，以1.25~4.2mg/gWPH為較佳的比例包含者。該WPH中所包含之此等雙肽，換算成每1gWPH的蛋白質含量為0.234~36mg/g蛋白質，可以0.468~18mg/g蛋白質為佳，以1.125~3.8mg/g蛋白質為較佳。

本發明之WPH在剛調製好時為液狀，但為了提高其保存性可進行冷凍保存、乾燥(噴霧乾燥、冷凍乾燥)、濃縮、加熱殺菌(板式加熱殺菌、管式加熱殺菌、間歇式加熱殺菌、通電加熱殺菌、微波加熱殺菌、蒸煮加熱等的間接加熱殺菌、蒸氣注入、蒸氣灌注等的直接加熱殺菌)、或是非加熱殺菌(光照射殺菌、放射線照射殺菌、高電壓脈衝殺菌)。其中，從保存安定性與處理的容易度來看，以調製後乾燥處理(噴霧乾燥、冷凍乾燥)WPH，並製備為乾燥固體型態為佳。

如後述試驗例1及2所示，含有WPH之本發明的組成物可藉由對哺乳動物(包含人類及非人類動物)投予或使之攝取並給與運動負荷而使體內，特別是肌肉內BDNF量增加(參照圖1及2)。而且該增加量比在不對哺乳動物投予或不使攝取本發明之組成物但給與運動負荷的情況下所增加之體內，特別是肌肉內BDNF量更高。因此，該包含WPH之本發明的組成物，作為用以促進體內，特別是肌肉內BDNF量增加之組成物(用以促進體內，特別是肌肉內BDNF量增加之組成物)是有用的。再者，該用以促進BDNF量增加之組成物，以藉由在哺乳動物運動前或運動中對該哺乳動物投予或使之攝取，而可用以提高運動後之體內，特別是肌肉內BDNF量為佳。於此，「促進BDNF量的增加」代表在哺乳動物運動前或運動中對該哺乳動物投予(攝取)本發明之組成物的情況下之運動後之體內，特別是肌肉內BDNF量，和在不投予(攝取)本發明之組成物的情況下之該量相比較高。於此「在不投予(攝取)本發明之組成物的情況」包含在不投予(攝取)本發明之組成物也不給與運動負荷的情況，與在不投予(攝取)本發明之組成物但給與運動負荷的情況兩者。更具體來說，代表藉由在運動前或運動中投予(攝取)本發明之組成物，而促進在不投予(攝取)本發明之組成物但給與運動負荷的情況下之肌肉內BDNF量的增加，並且使肌肉內BDNF量比在不投予(攝取)本發明之組成物但給與運動負荷的情況下的增加量更多。

再者，本發明中所謂「運動」只要是因骨骼肌的收縮而伴隨比休息時消耗更多的能量者，即對肌肉造成負擔者即可。只要在此範圍內即無特殊限制，但具體來說可舉出用以維持增進體力而進行者，如步行、快步走、慢跑、快跑、跳舞、水中運動、滑雪、騎腳踏車、體操、瑜珈、伸展運動、重量訓練、加壓訓練、游泳、登山、攀岩、各種運動(例如球類運動、羽毛球、芭蕾等)為例。

此外如後述試驗例2所示，即使在不給予運動負荷的情況下，含有WPH之本發明之組成物仍可藉由對哺乳動物投予或使之攝取而使體內，特別是肌肉內BDNF量增加(參照圖3)。在此情況下所謂「BDNF量增加」代表在不給予運動負荷但對哺乳動物投予(攝取)本發明之組成物的情況下之體內，特別是肌肉內BDNF量，和不給予運動負荷且不投予(攝取)本發明之組成物的情況下之該量相比較高。因此，即使是在不給予運動負荷的情況下，該包含WPH之本發明的組成物僅藉由攝取至體內，作為促進體內，特別是肌肉內BDNF量增加之組成物也是有用的。

於此，「投予或攝取」只要是置入哺乳動物(包含人類及非人類動物)體內的方法即可，並無限制，但可舉例以口服投予或攝取、經腸投予及胃瘻等在腸內消化吸收之態樣為佳，並可根據做為對象之哺乳動物的狀態和用途適當選擇。以口服攝取為佳。因此，本發明之組成物具有口服投予用或攝取用的型態、經腸投予用的型態及胃瘻用的型態，並且可調製為該形態。

如前述，已知BDNF為參與神經細胞產生和成長、維持和再生的神經滋養因子之一，且會提高記憶和學習的表現(非專利文獻3)。因此，本發明之組成物可做為用以輔助記憶或學習表現提升之組成物，讓需要提高記憶力、學習能力或學習效率者(例如考生、對記憶力•學習能力•學習效率下降在意者等)攝取或對其投予。

此外已知憂鬱症和阿茲海默型失智症患者腦中的BDNF表現量減少(非專利文獻8及9)。因此本發明之組成物可做為用以改善認知功能、用以抑制認知功能退化或者用以提升認知功能之組成物，使失智症，特別是阿茲海默型失智症患者或其可能患病者攝取或對其投予。於此，所謂「認知功能」代表正確理解事物並適當地實行所需之功能，包含記憶力、言語能力、判斷力(包含定向、注意力)、計算力及/或執行力。而且失智症的可能患病者亦包括輕度認知障礙者。此外65歲以上之老年人被認為每4人中有1人有失智症或輕度認知障礙，因此本發明中也可將65歲以上之老年人包含在失智症的可能患病者中。此外本發明之組成物，可做為用以改善憂鬱症之組成物，使憂鬱症(包含新型憂鬱症)患者或有憂鬱狀態或有憂鬱傾向之可能患病者攝取或對其投予。

此外，有報告指出透過對腦室內、皮下或腹腔內投予BDNF，體重的增加獲得抑制，糖代謝獲得改善(非專利文獻10)。因此，本發明之組成物可做為用以抑制或改善肥胖之組成物，讓肥胖者、有肥胖傾向者或其可能患病者攝取或對其投予。而且，本發明之組成物可做為用以抑制糖代謝下降或用以改善糖代謝之組成物，讓糖尿病患者、境界型糖尿病患者或其可能患病者攝取或對其投予。

本發明之組成物，以可發揮本發明之效果為限，除了本發明之WPH以外亦可添加其他食品原料及/或食品添加物原料。例如，為了賦予本發明之組成物嗜好性，可添加甜味料(砂糖類、液糖類、果糖、麥芽糖、三溫糖等)、糖醇(赤藻糖醇等)、高感度甜味劑(甜菊、阿斯巴甜、蔗糖素、醋磺內酯鉀等)、酸味料、香料、果汁、蔬菜汁、增黏多醣類、乳化劑、調味劑、矯臭劑等。此外，亦能以賦予本發明之組成物追加功能(營養功能、生理功能)為目的，添加礦物質類(鈣、鐵、錳、鎂、鋅等)、維生素類、功能性材料、益生菌乳酸菌等，以製成本發明之組成物。

本發明之組成物，以在市場上提供為目的而可製成容器裝的形態。做為容器裝的形態，可舉出將本發明之組成物調製為固體狀再充填至容器的態樣。做為此固體狀之形態，可舉出粉末及顆粒。做為在此情況下之容器，可使用紙、袋、盒、罐、瓶等為公眾所知者。此時的容器內容量並無特殊限制，例如為1~5000g、2~4000g、3~3000g、4~2000g、4~1000g、4~500g、4~250g、4~200g、4~100g、4~50g、4~30g。其中，在家庭裝(多人服用)的情況下為300~5000g、300~4000g、300~3000g、300~2000g、300~1500g、300~1400g、300~1300g、300~1200g、300~1100g，在個人裝(個別服用)的情況下為1~500g、2~250g、3~200g、4~100g、4~50g、4~40g、4~30g、5~30g、10~30g、15~30g。

而且本發明之組成物，以在市場上提供為目的而可製成容器裝飲料的形態。於此，容器只要是可在飲料充填後直接飲用之容器即可，可使用紙容器、軟袋、寶特瓶、罐、瓶等為公眾所知者。該飲料可將上述粉末或顆粒分散溶解於飲用水中以調製。容器內容量並無特殊限制，例如為1~5000g、2~4000g、3~3000g、4~2000g、5~1000g、6~800g、7~1300g、80~1200g、90~1100g。其中，在家庭裝(多人飲用)的情況下例如為300~5000g、300~4000g、300~3000g、300~2000g、300~1500g、300~1400g、300~1300g、300~1200g、300~1100g，在個人裝(個別飲用)的情況下為10~500g、20~500g、30~500g、40~500g、50~500g、60~500g、70~500g、80~500g、90~500g。

根據本發明之其中一個實施態樣，本發明之組成物亦能以每一次投予(攝取)時WPH的總蛋白質含量達到0.1g以上(以1g以上為佳)的方式攝取(投予)為佳。能以每一次投予(攝取)時的總蛋白質含量達到0.1~40g的方式為佳，以達到0.1~30g的方式為較佳，以達到1~30g的方式為更佳攝取(投予)。

所謂「一次投予(攝取)」代表促進體內BDNF量增加所需之狀態的每一次的量。例如，在1天的預定時間內進行一連串運動的情況下，代表在該運動前或該運動中投予或攝取的總量，在不一口(一口氣)攝取而分成數次攝取的情況下，以此分成數次投予(攝取)之量加總當作「一次投予(攝取)」。

從促進運動增加BDNF量的觀點來看，將本發明之組成物投予(使攝取)至需要增加體內，特別是肌肉內BDNF量之受驗者(哺乳動物)的時期為運動前或運動中。能以運動前15~240分鐘為佳，以運動前30~180分鐘為較佳，以運動前45~135分鐘為更佳。此外在不運動的情況下，雖可在任意的時期投予(使攝取)，但因為在飯前或兩餐之間等較為空腹的時候投予(攝取)比較容易吸收，所以可得到較高的效果。

根據本發明之其他實施態樣，例如，本發明之組成物亦能以每一次投予(攝取)的單位包裝形態提供。具有該單位包裝形態之本發明之組成物，以在該單位中做為一次投予(攝取)量換算成總蛋白質含量為0.1g以上(以1g以上為佳)的方式調製前述WPH者為佳，而且以做為一次投予(攝取)量換算成總蛋白質含量為40g以下(以30g以下為佳)的方式調製前述WPH者為佳。即，每單位包裝中本發明之WPH的含有量，做為一次投予(攝取)量換算成總蛋白質含量可為0.1~40g，以0.1~30g為佳，以1~30g為較佳。於此，所謂「每一次投予(攝取)的單位包裝形態」構成，代表每一次投予(攝取)量為預先設定好的形態者，例如，做為可口服攝取特定量之飲食品，不僅代表一般食品的形態，還代表飲料(飲劑等)、健康補助食品、保健功能食品、營養補充品等的形態。「每一次投予(攝取)的單位包裝形態」，例如，在液狀的飲料、凝膠狀•糊狀•膏狀的膠凍、粉末狀•顆粒狀•膠囊狀•塊狀的固體狀食品等的情況下，可舉出能以金屬罐、玻璃瓶(瓶等)、塑膠容器(寶特瓶等)、包裝、袋、薄膜容器、紙盒等的包裝容器規定特定量(用量)之形態，或者是能將每一次投予(攝取)量示於包裝容器或網頁等，以規定特定量之形態。由於本發明之組成物使用WPH做為有效成分，所以與乳清蛋白質相比因加熱而凝膠化的情況少，因此，在飲料、膠凍等的製造步驟中可維持適當的物性。此外，由於本發明之組成物即使攝取少量也可發揮本發明之效果，所以無論是一口大小的塊狀、或可一飲而盡攝取的迷你罐裝飲料等，所有形態皆容易攝取•嚥下，對小孩和老年人來說可提升便利性。

本發明之組成物能以摻合複數成分之組成物的形態提供。只要是發揮本發明之效果，本發明之組成物的形態即無特殊限制，但例如可為固體狀(粉末狀、顆粒狀、膠囊狀、塊狀等)、液體、凝膠狀、糊狀、膏狀等的形態，以粉末狀為佳。組成物包含食品組成物及醫藥組成物。

根據本發明之理想態樣，提供一種用以促進BDNF量增加之飲食品，其包含WPH做為有效成分。於本發明，只要食品的形態為溶液、懸浮液、乳濁液、粉末、固體成形物等能夠口服攝取之形態即無特殊限制。具體來說，例如泡麵、殺菌釜食品、罐頭、微波食品、速食湯．味增湯類、冷凍乾燥食品等之速食食品類；清涼飲料、果汁飲料、蔬菜飲料、豆漿飲料、咖啡飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、酒精飲料等之飲料類；麵包、義大利麵、麵、蛋糕混料粉、麵包粉等之麵粉製品；糖果、牛奶糖、口香糖、巧克力、甜餅乾、餅乾、蛋糕、派、零食、鹹餅乾、日式點心、甜點點心等點心類；醬料、番茄加工調味料、風味調味料、調理混料粉、沾醬類、沙拉醬類、鰹魚醬油類、咖哩•燉菜之調味料類等之調味料；加工油脂、奶油、人造奶油、美乃滋等之油脂類；乳飲料、優格類、乳酸菌飲料、冰淇淋類、乳脂類等之乳製品；農產罐頭、果醬•果皮醬類、穀類等之農產加工品；冷凍食品等。飲食品以乳製品為佳，以乳飲料、乳酸菌飲料為較佳。

此外，飲食品中亦包含分類為健康食品、功能性食品、營養補助食品、功能性表示食品、特定保健用食品、病患用食品、嬰幼兒用調製奶粉、懷孕婦女或哺乳婦女用奶粉者。

本發明之飲食品亦可附有關於「增加體內BDNF量」、「促進體內BDNF量增加」、「幫助體內BDNF量增加」等聲明。再者，上述所謂「體內」的用詞亦包含「肌肉內」的意義。

根據本發明的另一面向，提供一種促進體內，特別是肌肉內BDNF量增加之方法，其包含使哺乳動物(包含人類或非人類動物)攝取或對其投予WPH而成。本發明之促進BDNF量增加之方法可依照有關本發明之組成物的記載內容實施。

於此，本發明之促進BDNF量增加之方法中，可使用在哺乳動物以及來自此等之樣品(肌肉組織、肌肉細胞)中，且目的無論是治療性使用或非治療性使用皆可。於此，所謂「非治療性」代表不包含對人類進行手術、治療或診斷行為(即，對人類進行醫療行為)，具體來說，不包含醫師或受到醫師指示的人對人類進行手術、治療或診斷的方法。 [實施例]

以下，舉出製造例及實驗例以更詳細地說明本發明。惟，此等製造例及實驗例為用於使本發明容易理解之說明的部分例子，本發明不受此等的任何限制。再者，只要沒有特別聲明，下述製造例及實驗例在室溫(25±5℃)及大氣壓的條件下進行。此外，受驗樣品中所包含之蛋白質含量使用凱氏定氮法測定。

製造例1 (1)乳清蛋白質水解物(乾燥粉末物)之製造　　將50g市售乳清蛋白質濃縮物(以下簡稱為「WPC」)溶解於1L水以調製WPC水溶液，並以pH調整劑將其調整至pH7。將500mg來自芽孢桿菌屬之蛋白酶(蛋白酶M天野，天野酶公司)及500mg來自麴菌屬之蛋白酶(蛋白酶N天野，天野酶公司)加入其中，進行50℃下8小時的處理，藉此水解乳清蛋白質。將之加熱使蛋白酶失活後，進行冷凍乾燥處理並粉末化，將此當作乳清蛋白質水解物(WPH)(乾燥粉末物)。

(2)成分分析　　以濃度0.1(w/w)%之三氟乙酸水溶液將於上述得到之乳清蛋白質水解物(乾燥粉末物)稀釋溶解至1000倍(體積比)，供試於下述條件之 LC/MS/MS，以測定WPH中所包含之雙肽(Ile-Leu、Leu-Leu、Val-Leu、Ile-Asn、Leu-Ala、Leu-Glu、Ala-Leu及Lys-Ile)之量(單位mg/g蛋白質：以固體物換算，以下皆同)。

[LC/MS/MS的分析條件] 管柱：ACQUITY UPLC BEHC18 Column，130Å，1.7mm，2.1´50mm (Waters) 　　移動相：A液：含有0.1(w/w)%三氟乙酸之水溶液　　 B液：含有0.1(w/w)%三氟乙酸之乙腈溶液　　移動相中A液及B液的比例　　移動相流通開始→0分：A液100v/v%(B液0v/v%) 　　0分→9分：A液100v/v%→A液60v/v%-B液40v/v% 　　9分→10分：A液60v/v%-B液40v/v%→A液20v/v%-B液80v/v% 　　10分→11分：A液20v/v%-B液80v/v%→A液100v/v%(B液0v/v%) 　　管柱溫度：40℃ 　　流速：0.3mL/分。

[MS/MS條件]ESI正離子模式　　毛細管電壓：3000V 　　來源溫度：120℃ 　　去溶劑溫度：400℃ 　　去溶劑氣體流速：850L/小時　　錐氣體流速：50L/小時　　錐電壓：25V 　　碰撞電壓：15mV。

上述製造例1中調製之WPH(乾燥粉末物)中所含雙肽的含有量示於表1。

製造例2 　　將50g市售WPC(與製造例1中使用的WPC相同)溶解於1L水以調製WPC水溶液，並以pH調整劑將其調整至pH7。將500mg來自芽孢桿菌屬之蛋白酶(蛋白酶M天野，天野酶公司)加入其中，進行50℃下8小時的處理，以水解WPC水溶液中的乳清蛋白質。接著將之加熱使蛋白酶失活後，進行冷凍乾燥處理並粉末化，將此當作製造例2的WPH(乾燥粉末物)。

按照製造例1之(2)項中記載之分析方法，測定於上述調製之WPH(乾燥粉末物)中所含雙肽的量。結果記載於表2。

製造例3 　　將50g市售WPC(與製造例1中使用的WPC相同)溶解於1L水以調製WPC水溶液，並以pH調整劑將其調整至pH7。將500mg來自麴菌屬之蛋白酶(蛋白酶N天野，天野酶公司)加入其中，進行50℃下8小時的處理，以水解WPC水溶液中的乳清蛋白質。接著將之加熱使蛋白酶失活後，進行冷凍乾燥處理並粉末化，將此當作製造例3的WPH(乾燥粉末物)。

按照製造例1之(2)項中記載之分析方法，測定於上述調製之WPH(乾燥粉末物)中所含雙肽的量。結果記載於表3。

製造例4 　　將50g市售WPC(與製造例1中使用的WPC相同)溶解於1L水以調製WPC水溶液，並以pH調整劑將其調整至pH7。將500mg胰蛋白酶(Novo公司)加入其中，在37℃下反應4小時後，添加500mg來自芽孢桿菌屬之蛋白酶(蛋白酶M天野，天野酶公司)，進一步在50℃下反應4小時，以水解WPC水溶液中的乳清蛋白質。接著將之加熱使蛋白酶失活後，進行冷凍乾燥處理並粉末化，將此當作製造例4的WPH(乾燥粉末物)。

按照製造例1之(2)項中記載之分析方法，測定於上述調製之WPH(乾燥粉末物)中所含雙肽的量。結果記載於表4。

製造例5 　　將50g市售WPC(與製造例1中使用的WPC相同)溶解於1L水以調製WPC水溶液，並以pH調整劑將其調整至pH7。將500mg胰蛋白酶(Novo公司)加入其中，在37℃下反應4小時後，添加500mg來自麴菌屬之蛋白酶(蛋白酶N天野，天野酶公司)，進一步在50℃下反應4小時，以水解WPC水溶液中的乳清蛋白質。接著將之加熱使蛋白酶失活後，進行冷凍乾燥處理並粉末化，將此當作製造例5的WPH(乾燥粉末物)。

按照製造例1之(2)項中記載之分析方法，測定於上述調製之WPH(乾燥粉末物)中所含雙肽的量。結果記載於表5。

製造例6 　　將50g市售WPC(與製造例1中使用的WPC相同)溶解於1L水以調製WPC水溶液，並以pH調整劑將其調整至pH7。將500mg胃蛋白酶(和光純藥公司)加入其中，在37℃下反應4小時後，添加500mg來自芽孢桿菌屬之蛋白酶(蛋白酶M天野，天野酶公司)，進一步在50℃下反應4小時，以水解WPC水溶液中的乳清蛋白質。接著將之加熱使蛋白酶失活後，進行冷凍乾燥處理並粉末化，將此當作製造例6的WPH(乾燥粉末物)。

按照製造例1之(2)項中記載之分析方法，測定於上述調製之WPH(乾燥粉末物)中所含雙肽的量。結果記載於表6。

製造例7 　　將50g市售WPC(與製造例1中使用的WPC相同)溶解於1L水以調製WPC水溶液，並以pH調整劑將其調整至pH7。將500mg胃蛋白酶(和光純藥公司)加入其中，在37℃下反應4小時後，添加500mg來自麴菌屬之蛋白酶(蛋白酶N天野，天野酶公司)，進一步在50℃下反應4小時，以水解乳清蛋白質水溶液中的乳清蛋白質。接著將之加熱使蛋白酶失活後，進行冷凍乾燥處理並粉末化，將此當作製造例7的WPH(乾燥粉末物)。

按照製造例1之(2)項中記載之分析方法，測定於上述調製之WPH(乾燥粉末物)中所含雙肽的量。結果記載於表7。

製造例8 　　將50g市售WPC(與製造例1中使用的WPC相同)溶解於1L水以調製WPC水溶液，並以pH調整劑將其調整至pH7。將500mgFlavourzyme(Novo公司)加入其中，在50℃下反應6小時，以水解乳清蛋白質水溶液中的乳清蛋白質。接著將之加熱使蛋白酶失活後，進行冷凍乾燥處理並粉末化，將此當作製造例8的WPH(乾燥粉末物)。

按照製造例1之(2)項中記載之分析方法，測定於上述調製之WPH(乾燥粉末物)中所含雙肽的量。結果記載於表8。

製造例9 　　將50g市售WPC(與製造例1中使用的WPC相同)溶解於1L水以調製WPC水溶液，並以pH調整劑將其調整至pH7。將500mg來自麴菌屬之蛋白酶(Umamizyme，天野酶公司)加入其中，在50℃下反應6小時，以水解WPC水溶液中的乳清蛋白質。接著將之加熱使蛋白酶失活後，進行冷凍乾燥處理並粉末化，將此當作製造例9的WPH(乾燥粉末物)。

按照製造例1之(2)項中記載之分析方法，測定於上述調製之WPH(乾燥粉末物)中所含雙肽的量。結果記載於表9。

製造例10 　　將50g市售WPC(與製造例1中使用的WPC相同)溶解於1L水以調製WPC水溶液，並以pH調整劑將其調整至pH7。將500mg來自麴菌屬之蛋白酶(蛋白酶A天野，天野酶公司)加入其中，在50℃下反應6小時，以水解WPC水溶液中的乳清蛋白質。接著將之加熱使蛋白酶失活後，進行冷凍乾燥處理並粉末化，將此當作製造例10的WPH(乾燥粉末物)。

按照製造例1之(2)項中記載之分析方法，測定於上述調製之WPH(乾燥粉末物)中所含雙肽的量。結果記載於表10。

製造例11 　　將50g市售WPC(與製造例1中使用的WPC相同)溶解於1L水以調製WPC水溶液，並以pH調整劑將其調整至pH7。將500mg來自麴菌屬之蛋白酶(蛋白酶P天野，天野酶公司)加入其中，在50℃下反應6小時，以水解乳清蛋白質水溶液中的乳清蛋白質。接著將之加熱使蛋白酶失活後，進行冷凍乾燥處理並粉末化，將此當作製造例11的WPH(乾燥粉末物)。

按照製造例1之(2)項中記載之分析方法，測定於上述調製之WPH(乾燥粉末物)中所含雙肽的量。結果記載於表11。

試驗例1 　　本試驗是為了以肌肉中BDNF濃度為指標，評價做為乳材料之乳清蛋白質水解物的攝取與運動之組合對認知功能造成的影響而進行。試驗使用大鼠，測定並比較在使之攝取乳清蛋白質水解物並給予運動負荷的情況下、不使之攝取WPH但給予運動負荷的情況下以及不使之攝取乳清蛋白質水解物也不給與運動負荷的情況下之骨骼肌內所含BDNF濃度。

(1)試驗方法 (1-1)受驗樣品(試驗食)的調製　　試驗例1的試驗食中使用以蛋白酶水解市售之WPC(與製造例1中使用的WPC相同)而得到之WPH(乾燥粉末物)。再者，該WPH中每100質量%固形物包含約89.3質量%之蛋白質。以固形物濃度達到10w/v%的方式將該WPH溶解於蒸餾水中，並以此為受驗樣品(試驗食)。

按照製造例1之(2)項中記載之分析方法，測定於上述調製之WPH(乾燥粉末物)中所含雙肽的量(mg/gWPH，mg/g蛋白質)。結果記載於表12。

(1-2)受驗動物的調製　　使用8週大的雄性SD大鼠做為受驗動物。預先進行4~5日的預備飼養，預備飼養結束後，最晚於試驗前一天在異氟烷麻醉下將右下腿部除毛。此外於試驗前一天開始進行16小時的禁食。

試驗當天，以體重均等(約290~320g)的方式按照下述進行分群。 [試驗群(共3群)] 　　(a)「雙肽不投予/不運動群」(n=6)：不給與運動負荷，受驗樣品不投予　　(b)「雙肽不投予/運動群」(n=6)：運動負荷50次，受驗樣品不投予　　(c)「雙肽投予/運動群」(n=3)：運動負荷50次，受驗樣品投予。

(1-3)試驗　　在上述各群受驗動物之中，對「雙肽投予/運動群」的受驗動物單次口服投予10ml/kg體重(含有雙肽之WPH1.0g/kg體重)之於上述調製之受驗樣品(試驗食)。自投予算起30分鐘後，在異氟烷麻醉下以電刺激強制性地給予右後肢運動負荷(詳細內容後述)。而且，以蒸餾水取代受驗樣品(試驗食)，以10ml/kg體重的比例對「雙肽不投予/運動群」的受驗動物進行單次口服投予，並且自投予算起30分鐘後，以和上述同樣的方法在異氟烷麻醉下以電刺激強制性地給予右後肢運動負荷。此外，以蒸餾水取代受驗樣品(試驗食)，以10ml/kg體重的比例對「雙肽不投予/不運動群」的受驗動物進行單次口服投予，然後在異氟烷麻醉下使其休息。

「雙肽投予/運動群」及「雙肽不投予/運動群」的受驗動物在運動負荷結束3小時之後，而且「雙肽不投予/不運動群」的受驗動物在投予蒸餾水3小時30分鐘之後，在異氟烷麻醉下由腹部下腔大靜脈進行全採血以屠殺。

其後，迅速採取下肢骨骼肌並秤重。使用採取到的骨骼肌測定做為認知功能評價指標之BDNF濃度(ng/g)。

[運動負荷方法] 　　在異氟烷麻醉下將大鼠以俯臥的方式固定在以電刺激給予運動負荷之設備的專用固定台上。壓迫固定右後肢的膝蓋，並將腳踝固定於腳踏板上。將皮膚電極貼在小腿肚上，透過電刺激強制性地使其運動。強制性運動負荷為以每8秒一次電刺激的步調，重複5次做為一組，運動群進行10組(共計50次的電刺激)。再者，運動負荷的樣式設定為等長收縮負荷(ISO)。

(2)結果　　結果示於圖1。由圖1中(b)「雙肽不投予/運動群」與(a)「雙肽不投予/不運動群」的比較確認了肌肉中BDNF濃度因運動而上升。而且由(b)「雙肽不投予/運動群」與(c)「雙肽投予/運動群」的比較確認了肌肉中BDNF濃度因運動再加上攝取受驗樣品(WPH)而比在只有運動的情況下上升更多。此外，由(a)「雙肽不投予/不運動群」與(c)「雙肽投予/運動群」的比較確認了肌肉中BDNF濃度因攝取受驗樣品並且運動而比在不攝取也不運動的情況下顯著升高(Student的t檢定：P＜0.05)。

由此顯示做為本發明之對象的含有雙肽之WPH，藉由組合內服與運動而發揮促進骨骼肌中BDNF產生的效果。此外，已知BDNF會通過血腦屏障(PardridgeWM et al.pharm Res.11(5)：738-46(1994)。因此推測在肌肉內產生之BDNF會通過血腦屏障轉移至腦內，而有助於認知功能退化的抑制。即，藉由攝取本發明之乳清蛋白質水解物並且運動，可期待得到可抑制認知功能退化之效果。

試驗例2 　　本試驗是為了以肌肉中BDNF濃度為指標，評價WPH的攝取對認知功能造成的影響而進行。試驗使用大鼠，測定並比較在使之攝取WPH的情況下、以水或水解前之乳清蛋白質取代乳清蛋白質水解物並使之攝取的情況下之骨骼肌中所含BDNF濃度。此外，同樣測定並比較在使之攝取WPH並且給予運動負荷的情況下、以水或水解前之乳清蛋白質取代WPH並使之攝取並且給予運動負荷的情況下之骨骼肌中所含BDNF濃度，以確認與運動並用的影響。

(1)試驗方法 (1-1)受驗樣品(試驗食、比較試驗食)的調製　　試驗例2的試驗食中，與試驗例1相同，使用以蛋白酶水解市售之WPC(與製造例1中使用的WPC相同)而得到之WPH(乾燥粉末物)(參照表12)。以固形物濃度達到10w/v%的方式將該WPH溶解於蒸餾水中，並以此為受驗樣品(試驗食)。另一方面，使用水解前之乳清蛋白質(市售之WPC、與製造例1中使用的WPC相同)。再者，無論試驗食(WPH)或比較試驗食(乳清蛋白質)，皆以換算成蛋白質含量之投予量達到1.0g蛋白質/體重kg的方式統一投予量。

試驗當天，以體重均等(約290~310g)的方式按照下述進行分群。 [試驗群(共6群)] ＜運動群＞　　(1)「水投予/運動群」(n=5)：運動負荷50次，水投予　　(2)「WPC投予/運動群」(n=5)：運動負荷50次，投予1.0gprotein/體重kg之比較試驗食(乳清蛋白質) 　　(3)「WPH投予/運動群」(n=5)：運動負荷50次，投予1.0gprotein/體重kg之試驗食(WPH)。＜不運動群＞　　(i)「水投予/不運動群」(n=5)：無運動負荷，水投予　　(ii)「WPC投予/不運動群」(n=5)：無運動負荷，投予1.0gprotein/體重kg之比較試驗食(乳清蛋白質) 　　(iii)「WPH投予/不運動群」(n=5)：無運動負荷，投予1.0gprotein/體重kg之試驗食(WPH)。

(1-3)試驗　　對上述運動群的受驗動物單次口服投予水或受驗樣品，15分鐘之後在異氟烷麻醉下以電刺激強制性地給予右下肢運動負荷。運動負荷方法如試驗例1中所記載。對上述不運動群的受驗動物單次口服投予水或受驗樣品，15分鐘之後與前述運動群同時施以異氟烷麻醉。運動群在運動負荷結束180分鐘之後，不運動群在麻醉結束180分鐘之後，在異氟烷麻醉下由腹部下腔大靜脈進行全採血以屠殺。其後，迅速採取下肢骨骼肌並秤重。使用採取到的骨骼肌測定做為認知功能評價指標之BDNF濃度(ng/g)。

(2)結果　　運動群及不運動群的結果分別示於圖2及3。如圖2所示，(2)「WPC投予/運動群」受驗動物和(1)「水投予/運動群」受驗動物相比，其肌中BDNF濃度雖然略為上升，但無明顯差異。相對地，確認了(3)「WPH投予/運動群」受驗動物和(1)「水投予/運動群」受驗動物相比，其肌中BDNF濃度顯著上升。此外，如圖3所示，不運動群也有同樣情形，(ii)「WPC投予/不運動群」受驗動物和(i)「水投予/不運動群」受驗動物相比，其肌中BDNF濃度雖然略為上升，但無明顯差異，但相對地，確認了(iii)「WPH投予/不運動群」受驗動物和(i)「水投予/不運動群」受驗動物相比，其肌中BDNF濃度顯著上升。

由以上試驗例1及2的結果，確認了攝取受驗樣品(含有雙肽之WPH)所帶來的肌中BDNF濃度顯著上升是無論有無運動皆會發生。這種顯著的效果只有在攝取含有雙肽(Ile-Leu、Leu-Leu、Val-Leu、Ile-Val、Ile-Ile、Leu-Val、Leu-Ile、Ile-Asn、Leu-Ala、Leu-Glu、Ala-Leu或/及Lys-Ile)之WPH時觀察到，攝取不含此等雙肽之乳清蛋白質時沒有觀察到這種顯著的效果。即，確認了藉由組合運動而攝取本發明之含有雙肽之WPH(例如在運動前或運動中攝取)，或是不與運動並用但攝取本發明之含有雙肽之WPH(在不運動下之攝取)，可促進骨骼肌內BDNF產生，而且BDNF的體內含有量增加。如前所述，有報告暗示BDNF對於抑制認知功能退化、提高記憶和學習的表現、抑制肥胖或抑制糖代謝降低等是有效的。因此認為本發明之含有雙肽之WPH透過促進體內BDNF產生的作用，而得到抑制認知功能退化、提高記憶和學習的表現、抑制肥胖或抑制糖代謝降低的效果。

[圖1]圖示將受驗動物(雄性SD大鼠)分為(a)「雙肽不投予/不運動群」、(b)「雙肽不投予/運動群」及(c)「雙肽投予/運動群」，並比較(a)在不使之攝取WPH也不給與運動負荷的情況下之肌肉中BDNF量(ng/g)(平均值±標準誤差，以下相同)、(b)在不使之攝取WPH但給與運動負荷的情況下之同BDNF量及(c)使之攝取WPH並給與運動負荷後之同BDNF量的結果。圖中，＊代表根據Dunnett檢定，相對於(a)有p＜0.05的顯著差異。　　[圖2]分別圖示將受驗動物(雄性SD大鼠)分為(1)「投予水/運動群」、(2)「投予WPC/運動群」及(3)「投予WPH/運動群」，並測定(1)使之攝取水並給與運動負荷後之肌肉中BDNF量(ng/g)(平均值±標準誤差，以下相同)、(2)使之攝取WPC(乳清蛋白質濃縮物)並給與運動負荷後之同BDNF量及(3)使之攝取WPH並給與運動負荷後之同BDNF量的結果。圖中，＊代表根據Dunnett檢定，相對於(1)有p＜0.05的顯著差異。　　[圖3]分別圖示將受驗動物(雄性SD大鼠)分為(i)「投予水/不運動群」、(ii)「投予WPC/不運動群」及(iii)「投予WPH/不運動群」，全部不給與運動負荷，並測定(i)使之攝取水後之BDNF量(ng/g)(平均值±標準誤差，以下相同)、(ii)使之攝取WPC後之同BDNF量及(iii)使之攝取WPH後之同BDNF量的結果。圖中，＊代表根據Dunnett檢定，相對於(i)有p＜0.05的顯著差異。

Claims

一種用以製造用以促進受驗者體內之腦衍生神經滋養因子(BDNF)量增加之組成物之乳清蛋白質水解物的用途，且該乳清蛋白質水解物為含有Ile-Leu、Leu-Leu、Val-Leu、Ile-Val、Ile-Ile、Leu-Val及Leu-Ile之雙肽者。
如請求項1之用途，其中前述受驗者為運動前或運動中之包含人類的哺乳動物。
如請求項1之用途，其中前述組成物為用以促進受驗者運動中或運動後的肌肉內BDNF量增加者。
如請求項1之用途，其中前述受驗者為非運動狀態之包含人類的哺乳動物。
如請求項1~4中任一項之用途，其中前述受驗者為認知功能退化者或其可能患病者。
如請求項5之用途，其中前述組成物為用以抑制或改善認知功能退化者。
如請求項1~4中任一項之用途，其中前述受驗者為肥胖者或/及糖代謝降低者，或此等的可能患病者。
如請求項7之用途，其中前述組成物為用以抑制或改善肥胖，或/及為用以抑制或改善糖代謝降低者。
如請求項1~4中任一項之用途，其中前述組成物由每一次投予(攝取)的單位包裝型態所構成，且為在該單位包裝型態中包含作為一次投予量(攝取量)以總蛋白質換算為0.1~40g之上述乳清蛋白質水解物之組成物。
如請求項1~4項中任一項之用途，其中前述組成物為飲食物。
如請求項1~4項中任一項之用途，其中前述組成物為健康食品、功能性食品、營養補助食品、功能性表示食品、特定保健用食品、病患用食品、嬰幼兒用調製奶粉、懷孕婦女或哺乳婦女用奶粉，或者是附有用以促進運動增加體內BDNF量的聲明之飲食物。