WO2015194564A1 - 記憶学習機能及び／又は認知機能を増強するための組成物 - Google Patents

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enhancing
cognitive function
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泰久 阿野
登志子 沓掛
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Definitions

  • the present invention relates to a peptide having an activity of enhancing a memory learning function and / or a cognitive function, and relates to a composition, a food and a medicine containing the peptide.
  • Maintenance, improvement, and improvement of brain function are required by a wide range of generations from young to old. Maintenance, improvement, and improvement of memory and learning skills are important not only for students and adults studying for exams and qualification exams, but also for daily work and life. Moreover, since the decline in memory and cognitive function is related to the quality of life in the elderly, it is required to prevent, maintain, improve and improve the brain function.
  • Non-Patent Literature 1-3
  • Non-Patent Document 4 For example, according to an epidemiological survey in the age group of 39 to 65 years conducted in Australia, it has been obtained that daily intake of fermented dairy products enhances memory (Non-Patent Document 4). . In addition, in the United States, the result that the prevalence of cognitive dysfunction is reduced by ingestion of fermented milk products has been obtained (Non-patent Document 5). From these results, fermented dairy products are thought to contain substances that enhance memory learning and cognitive functions, but the results of the above research are limited to epidemiological studies, and the actual active ingredients and their mechanisms of action Is unknown.
  • components that enhance brain functions such as maintenance, improvement, and improvement of memory learning function and cognitive function can be identified among components of food that can be ingested on a daily basis, it will be useful in a wide range of generations.
  • fermented dairy products are thought to contain components that enhance memory learning and cognitive functions. It is possible to develop products that can be used in a wide range of layers.
  • microglia which exists as the only immune cell in the brain, have essential functions for maintaining homeostasis in the brain, such as phagocytosis of waste products and repair of damaged tissues in the brain. Is clear. Microglia removes waste products in the brain and promotes synapse formation contributes to the maintenance, enhancement, and improvement of cognitive function, while excessive activation of microglia causes an inflammatory state and causes cognitive decline It has also been reported that there is a possibility (Non-Patent Documents 6 to 9). Inflammatory cytokines such as TNF- ⁇ and chemokines produced by excessively activated microglia are reported to be closely related to the pathology of pain, depression and chronic fatigue (Non-Patent Documents 10 to 16). . Therefore, controlling the activity of microglia is important in preventing and treating various diseases related to the brain.
  • An object of the present invention is to find a peptide having an excellent effect of improving brain function, particularly memory learning function and / or cognitive function, and based on the findings, a composition for enhancing memory learning function and / or cognitive function To provide food, food and medicine.
  • the present inventors consider that a component that improves brain function is contained in fermented milk products shown epidemiologically, and in the Y-maze maze test of an amnesia model mouse Screening of milk protein-derived peptides was performed using the evaluation or the evaluation in the activity test of isolated brain microglia as an index. As a result, it has been found that a specific peptide derived from milk protein can enhance memory learning function and / or cognitive function, and can further enhance phagocytic activity and / or anti-inflammatory activity of microglia. It came to be completed.
  • the present invention is a composition for enhancing memory learning function and / or cognitive function, comprising a peptide comprising any one amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 16, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Alternatively, a solvate is contained.
  • amino acid sequence of the peptide is preferably any one of SEQ ID NOs: 1 to 16.
  • the food is preferably a food for enhancing the memory learning function and / or the cognitive function.
  • a medicine for enhancing the memory learning function and / or the cognitive function is preferably a medicine for enhancing the memory learning function and / or the cognitive function.
  • the peptide is generated by hydrolysis of a protein contained in a food or food material.
  • the peptide is preferably obtained by enzymatic treatment of milk protein or a food or food material containing the same with a microorganism-derived enzyme agent.
  • the milk protein or the food or food material containing the same is whey or casein or powdered milk, skimmed milk powder, or prepared milk powder containing them. From the viewpoint of production cost, whey is more preferable.
  • the enzyme agent is one or more selected from the group consisting of an enzyme derived from Asperugillus, an enzyme derived from Bacillus, and an enzyme derived from Rhizopus. It is preferable that the enzyme is included.
  • another aspect of the present invention is a composition for enhancing the phagocytic activity and / or anti-inflammatory activity of microglia, which is any one of SEQ ID NOs: 1, 6, 9, 12, 13, 14, and 17. It contains a peptide comprising one amino acid sequence, or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
  • amino acid sequence of the peptide is preferably any one of SEQ ID NOs: 1, 6, 9, 12, 13, 14, and 17.
  • a peptide excellent in the effect of improving brain function, particularly enhancing memory learning function and / or cognitive function, has been found, and a composition, food for enhancing memory learning function and / or cognitive function A pharmaceutical can be provided.
  • composition that is useful for improving memory and learning ability in young to middle age groups, and for preventing elderly people from improving cognitive function as well as improving memory and learning ability, Food and medicine can be provided.
  • compositions, foods, and medicines can be provided.
  • the present invention uses a peptide component contained in a food that can be ingested on a daily basis as an active ingredient, it is possible to provide a composition, a food, or a medicine with few side effects.
  • the figure which shows the memory learning function and the cognitive function enhancement effect by dipeptide WX The figure which shows the memory learning function and the cognitive function enhancement effect by a whey peptide extract and a reconstruction sample. The figure which shows the memory learning function and the cognitive function enhancement effect by the synthetic peptide of casein origin peptide.
  • the enhancement of the memory learning function includes maintenance, improvement and / or improvement of the memory learning function.
  • the maintenance of the memory learning function includes, for example, preventing a decrease in memory ability and learning ability caused by aging in the elderly and the like.
  • the improvement of the memory learning function includes, for example, improving the temporary memory learning function, promoting medium- and long-term memory fixation, and promoting brain development.
  • the improvement of the memory learning function includes, for example, recovering a function that has once decreased due to aging or other factors, or a function having a sign of decrease.
  • enhancement of cognitive function includes maintenance, improvement and / or improvement of cognitive function.
  • the maintenance of cognitive functions includes, for example, preventing intellectual functions such as understanding, judgment, and logic, that is, reducing cognitive ability.
  • the improvement of cognitive function includes, for example, enhancing cognitive ability from the current level.
  • the improvement of cognitive function includes, for example, the recovery of symptoms that have once been reduced and the signs of decline.
  • a memory learning function and / or a cognitive function enhancer comprising the peptide or a composition containing the peptide as an active ingredient, or the peptide or the composition containing the peptide as a human or animal
  • a method for enhancing the memory learning function and / or cognitive function to be ingested use of the peptide or the composition containing the peptide for enhancing the memory learning function and / or cognitive function, and the like.
  • the peptides used in the present invention may be those obtained by chemical synthesis, chemically or enzymatically from proteins or polypeptide raw materials derived from milk, soybeans, wheat, eggs, livestock meat, fish meat, seafood, etc. You may use what was obtained by decomposing
  • the peptide sequence used in the present invention includes at least milk whey casein, bovine serum albumin (BSA), soybean glycinin, wheat glutenin, egg yolk riboviterin, egg white ovalbumin, ovotransferrin , Lysozyme, chicken protein collagen, etc., and subjecting them or foods or food materials containing them to acid hydrolysis, enzyme treatment with proteases, or microbial fermentation, etc.
  • the preparation may be used as it is, or may be concentrated, or may be used as a dry powder by spray drying, freeze drying or the like. Further, it may be used after subjecting to any degree of purification such as removal of impurities, salts, enzymes, etc. as necessary.
  • the amino acid constituting the peptide used in the present invention may be composed only of L-type amino acids, may be composed only of D-type amino acids, or may be a peptide in which both are mixed. Also good. Moreover, it may be composed only of naturally occurring amino acids, or may be composed only of modified amino acids in which any functional group such as phosphorylation or glycosylation is bonded to amino acids, or a mixture of both. Any of peptides may be sufficient. When the peptide contains two or more asymmetric carbons, it may be an enantiomer, a diastereomer, or a peptide in which both are mixed.
  • the peptide used in the present invention may be a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
  • pharmaceutically acceptable acid addition salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate and phosphate, organic salts such as acetate, maleate, fumarate, citrate and methanesulfonate. Examples include acid salts.
  • pharmaceutically acceptable metal salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt, aluminum salt and zinc salt.
  • Examples of the pharmaceutically acceptable ammonium salt include ammonium and tetramethylammonium salts.
  • pharmaceutically acceptable organic amine addition salts include addition salts such as morpholine and piperidine.
  • the usage pattern of the present invention can be used as a medicine, an additive used for blending in the medicine, or a food, an additive used for blending in the food.
  • the form containing 0.00001 to 100% by mass of the peptide is preferable, and the form containing 0.0001 to 100% by mass is more preferable.
  • the most preferred form is 0.001 to 100% by mass.
  • the composition of the present invention may be contained together with one or more active ingredients in addition to the above peptides, or may be administered or ingested in combination.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • Ginkgo biloba extract etc.
  • an anti-amyloid beta antibody etc. are mentioned as a component which reduces amyloid beta.
  • a medicine for example, as a use form of the present invention, for example, it contains at least one of the above peptides as an active ingredient, and a pharmaceutical composition is prepared by mixing a carrier, an excipient, a binder, a diluent and the like.
  • a pharmaceutical composition is prepared by mixing a carrier, an excipient, a binder, a diluent and the like.
  • oral dosage forms include granules, powders, tablets, pills, capsules, syrups and the like
  • parenteral dosage forms include injections, instillations, nasal preparations, Examples include external preparations, but are not limited thereto.
  • the dosage varies depending on the dosage form, patient age, body weight, nature or severity of symptoms to be treated, etc., but normal oral administration and the preferred dosage range per day per adult
  • the first is 0.002 to 40 g of the peptide
  • the second is 0.002 to 20 g of the peptide
  • the third is 0.002 to 2 g of the peptide
  • the fourth is the peptide.
  • 0.02 to 40 g fifth is 0.02 to 20 g of the peptide
  • sixth is 0.02 to 2 g of the peptide
  • seventh is 0.2 to 40 g of the peptide
  • Eighth is 0.2-20 g of the peptide
  • ninth is 0.2-2 g of the peptide.
  • the preferable dosage range per day for an adult for normal intravenous administration is given.
  • the peptide is 0.0002 to 4 g.
  • the second is 0.0002 to 2 g of the peptide
  • the third is 0.0002 to 0.2 g of the peptide
  • the fourth is 0.002 to 4 g of the peptide
  • the fifth is the above.
  • sixth is 0.002 to 0.2 g of the peptide
  • seventh is 0.02 to 4 g of the peptide
  • eighth is 0.02 to 2 g of the peptide.
  • Ninth 0.02-0.2 g of the above peptide.
  • an optimal form may be appropriately selected according to various conditions.
  • food may be used, and the form is not particularly limited. It may be liquid, semi-liquid, or solid, and includes a beverage-like form.
  • health foods special health foods, nutritional functional foods, functional labeling foods
  • disease, etc. including so-called health foods, functional foods, dietary supplements and supplements, and foods with a disease risk reduction label.
  • Consumer food is also included. For example, it is good also as dairy products, such as yogurt and cheese which produced
  • dairy products such as yogurt and cheese which produced
  • supplements include tablet forms produced by tableting after adding excipients, binders, and the like to the dry powder of the peptide and kneading.
  • a beverage as a non-alcoholic beverage
  • a non-alcoholic beverage for example, mineral water, near water, sports drink, tea beverage, milk beverage, coffee beverage, fruit juice beverage, vegetable juice beverage, fruit juice and vegetable juice beverage
  • examples include carbonated drinks, but are not limited thereto.
  • It may be a beer beverage having an alcohol content of less than 1%, such as non-alcohol beer.
  • Mineral water includes both foaming and non-foaming mineral water.
  • the tea drink in the non-alcoholic drinks refers to drinks for decocting tea leaves (tea leaves) that are evergreen trees of the camellia family, or leaves or cereals of plants other than tea trees, such as fermented tea, semi-fermented tea, And non-fermented tea are both included.
  • tea beverages include Japanese tea (for example, green tea, barley tea), black tea, herbal tea (for example, jasmine tea), Chinese tea (for example, Chinese green tea, oolong tea), hoji tea, and the like.
  • Milk beverages refer to beverages made mainly from raw milk, milk, etc. or foods made from these raw materials. In addition to those made from milk itself, for example, nutrient-enriched milk, flavored milk, and sugar-decomposed milk And the like using processed milk as a raw material.
  • fruits used in beverages containing fruit juices and beverages containing fruit juices and vegetable juices include apples, mandarin oranges, grapes, bananas, pears, peaches, mangoes, acais, and blueberries.
  • vegetables used in vegetable juice-containing beverages, fruit juices, and vegetable juice-containing beverages include tomato, carrot, celery, pumpkin, celery, and cucumber.
  • the first is 0.002 to 40 g of the peptide
  • the second is 0.002 to the above peptide.
  • 20 g 3rd is 0.002 to 2 g of the peptide
  • 4th is 0.02 to 40 g of the peptide
  • 5th is 0.02 to 20 g of the peptide
  • 6th is The peptide is 0.02 to 2 g
  • the seventh is the peptide 0.2 to 40 g
  • the eighth is the peptide 0.2 to 20 g
  • the ninth is the peptide 0.2 to 2 g. is there.
  • the form containing 0.00001 to 100% by mass of the peptide is preferable, the form containing 0.0001 to 100% by mass is more preferable, and 0 More preferred is a form containing 0.001 to 100% by mass, still more preferred is a form containing 0.01 to 90% by mass, and most preferred is a form containing 0.1 to 80% by mass. .
  • the first is 0.002 to 40 g of the above peptide
  • 2 is 0.002 to 20 g of the peptide
  • 3rd is 0.002 to 2 g of the peptide
  • 4 is 0.02 to 40 g of the peptide
  • 5 is 0.02 of the peptide.
  • -20 g sixth is 0.02-2 g of the peptide
  • seventh is 0.2-40 g of the peptide
  • eighth is 0.2-20 g of the peptide
  • the peptide When used as a beverage, it is preferably in a form containing 0.00001 to 10% by mass of the peptide, more preferably in a form containing 0.0001 to 5% by mass, and 0.001 to 5% by mass. More preferably, it is a form containing 0.01 to 5% by mass, and still more preferably a form containing 0.1 to 1% by mass.
  • the peptide provided by the present invention since the peptide provided by the present invention has a relatively small molecular weight, it has excellent absorbability into the body and permeability through the brain barrier, and easily exerts its effect in the brain.
  • the whey peptide extract was prepared as follows. A 0.125% (w / v) food-added protease or peptidase was mixed in a 5% (w / v) whey (Daiichi Kasei) aqueous solution and reacted at 50 ° C. for 4 hours. The obtained enzyme reaction solution was filtered using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut-off of 10 KDa, and the filtrate (hereinafter also referred to as “whey peptide extract”) was collected and subjected to an experiment.
  • FIG. 1A shows an outline of a memory learning function / cognitive function evaluation method.
  • Six-week-old male CD-1 mice were forcibly orally administered into the stomach in an amount of 1 mg / kg when using peptide extracts and 0.1 to 3 ⁇ mol / kg when using synthetic peptides.
  • 0.80 mg / kg scopolamine hydrochloride was administered intraperitoneally to induce memory impairment after a minute.
  • a Y-maze test was performed to evaluate spontaneous alternation behavior 20 minutes after intraperitoneal administration of scopolamine.
  • the mouse originally has the property of selecting a route different from the route selected immediately before. Therefore, when a mouse is put into a Y-shaped maze having three arms having the same width, length, etc., it normally enters an arm different from the arm that has just entered.
  • the Y-shaped maze test is a test that uses the properties of mice to evaluate short-term memory.
  • the Y-maze test in which three arms with a length of one arm of 25 cm, a wall height of 20 cm, and a floor width of 5 cm are connected at an angle of 120 degrees, is used as an experimental device. used.
  • protease P “Amano” 3SD also abbreviated as Amano P. manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.
  • Protin SD-NY10 also abbreviated as Protin. Amano Enzyme Co., Ltd.
  • Manufactured and bromelain manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.
  • whey was treated, and the obtained whey peptide extract was orally administered to mice to evaluate brain function. The results are shown in FIGS. 1 (B) and (C).
  • Fig. 1 shows the voluntary alternation behavior variation rate (spontaneous alteration), and (C) shows the total number of entries (number of entries).
  • SCP scopolamine
  • FIG. 1C shows the total number of intrusions
  • control shows the mouse group which performed only scopolamine administration.
  • FIG. 1 (B) compared to the group administered only scopolamine (control), Amano P, a protease derived from Aspergillus, and a whey peptide extract treated with protin, a protease derived from Bacillus In the administration group, the effect of improving brain function was observed. However, improvement in brain function was not observed in the whey administration group that had not been treated with protease (untreated) and the bromeline-treated peptide extract treatment group that was a plant-derived protease.
  • whey was prepared using the 10 types of enzyme agents shown in Table 1 (all manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.), including Aspergillus and Bacillus-derived enzyme agents and Rhizopus-derived enzyme agents that showed an effect of improving brain function.
  • the memory learning function and cognitive function were evaluated using the scopolamine amnesia model in the same manner as described above (FIG. 2). Note that distilled water is used as the vehicle.
  • Fig. 2 (A) shows the voluntary alternation behavior rate (spontaneous alteration), and Fig. 2 (B) shows the total number of entries (number of entries).
  • Peptide extracts treated with either enzyme showed an improvement in brain function in the scopolamine amnesia model.
  • the enzyme protease P “Amano” 3SD (Amano P, 3 in FIG. 2) derived from Aspergillus sp.
  • the enzyme Samoaase C100 (10 in FIG. 2) derived from Bacillus sp. It was considered that the peptides that were highly effective in improving the brain function were contained in the peptides, and thus active peptides in whey treated with these enzymes were searched.
  • the obtained fraction was concentrated and further fractionated by preparative HPLC.
  • a C18 column (inner diameter 10 mm, length 250 mm, particle diameter 5 ⁇ m) was used as a separation column, and A phase: 5% methanol, B solution: 100% methanol was used as the mobile phase at a flow rate of 5 ml / min for 0 minute.
  • B solution 100% methanol was used as the mobile phase at a flow rate of 5 ml / min for 0 minute.
  • the eluate was divided into several fractions, and each was concentrated and dried. Each fraction was redissolved in a solution containing a small amount of methanol and then subjected to analytical HPLC for refractionation.
  • a C18 separation column (inner diameter 4.6 mm, length 250 mm, particle diameter 5 ⁇ m) was used, and the column temperature was 70 ° C.
  • the peak obtained by analysis was divided into several fractions and collected by repeated fractionation. Each obtained fraction was concentrated and dried to remove TFA, and redissolved in a solution containing a small amount of methanol.
  • the effect of enhancing the memory learning function and cognitive function of these fractions was evaluated, and the peptides contained in the fractions with high activation ability were further purified.
  • the purified peptide thus obtained was subjected to N-terminal amino acid sequence analysis to obtain an amino acid sequence.
  • FIG. 3 shows an HPLC profile of a peptide extract obtained by degrading whey with protease P “Amano” 3SD (Amano P) or Samoaase C100. Moreover, the amino acid sequence obtained by N-terminal amino acid sequence analysis of each peak is shown.
  • peptides were synthesized by a peptide solid phase synthesis method to obtain a synthetic peptide, and the effect of enhancing memory learning function and cognitive function was examined using the synthetic peptide.
  • a peptide was synthesized by a peptide solid phase synthesis method based on the obtained amino acid sequence information. Next, it was analyzed by the Y maze test whether the memory learning function and the cognitive function were enhanced by using the synthetic peptide. The results are shown in FIG.
  • GTWY is a major component obtained by treating whey with protease P “Amano” 3SD as shown in FIG.
  • the whey was treated with Bacillus-derived proteolytic enzyme Samoase C100, and the peptide sequence contained in the fraction having an activity of enhancing memory learning function and cognitive function was analyzed.
  • sequence information of four peptides TWY (SEQ ID NO: 11), TWYS (SEQ ID NO: 8), VAGTWYS (SEQ ID NO: 4), and VSLPEW (SEQ ID NO: 5) was obtained.
  • Synthetic peptides were obtained from the amino acid sequence information by the peptide solid phase synthesis method, and analyzed by the Y maze test whether the memory learning function and the cognitive function were enhanced using the synthetic peptides. The results are shown in FIG.
  • TWYS, TWYS, VAGTWYS, and VSLPEW are major components obtained by treating whey with Samoaise C100 as shown in FIG.
  • a WY sequence is included.
  • a peptide having a length of up to about 12 residues is considered to have an effect of enhancing memory learning function / cognitive function.
  • the dipeptide WY is considered to be the core sequence
  • the dipeptide containing tryptophan at the N-terminus may have an effect of enhancing brain function. Therefore, a dipeptide containing tryptophan at the N-terminus was synthesized, and a Y-maze test was conducted to examine its effect on brain function.
  • tryptophan-tyrosine (WY, SEQ ID NO: 13), tryptophan-methionine (WM, SEQ ID NO: 14), tryptophan-leucine (WL, SEQ ID NO: 15), tryptophan-valine (WV, sequence) contained in milk protein as sequences. It was revealed that the four dipeptides of No. 16) had an enhancing effect on the concentration-dependent memory learning function / cognitive function (FIG. 6).
  • tyrosine-tryptophan (YW) and methionine-tryptophan (MW), which are dipeptides having the same amino acid composition as SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, but different in sequence, have a memory learning function / cognitive function. No enhancement effect was seen. Further, tryptophan alone (W) was not effective.
  • dipeptides containing tryptophan at the N-terminal side such as WY, WM, WL and WV and having a hydrophobic amino acid bonded at the C-terminal side have an effect of enhancing memory learning function / cognitive function.
  • casein is contained as a protein other than whey contained in milk. Therefore, casein (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) may be abbreviated as protease M “Amano” SD (Amano M) which is an enzyme agent derived from Aspergillus sp. Among the enzyme agents shown in Table 1 above. ), And the peptide having the memory learning function / cognitive function enhancing activity was analyzed. In the same manner as in the case of whey, a peptide extract obtained by degrading casein with Amano M was fractionated by HPLC, and the amino acid sequence of the active fraction was determined.
  • KEMFPFPKYPVEP SEQ ID NO: 1
  • AVPYP SEQ ID NO: 6
  • SLPQ SEQ ID NO: 9
  • YPE SEQ ID NO: 12
  • WY SEQ ID NO: 13
  • WM SEQ ID NO: 14
  • the dipeptides WM and WY in the peptide extract obtained by treating casein with the enzyme Amano M derived from Aspergillus sp. Are dipeptides having the tryptophan examined above at the N-terminus.
  • the peptide KEMFPFPKYPVEP represented by SEQ ID NO: 1 obtained from the degradation product of casein is a peptide having a relatively long length of 12 amino acids
  • PVEP had an enhancement effect on the memory learning function equivalent to the original amino acid sequence, KEMFPFPKYPVEP. It is presumed that a peptide of about 12 residues having the amino acid sequence PVEP has an equivalent effect.
  • Table 3 summarizes the peptides that have an enhancing effect on the memory learning function and the cognitive function.
  • sequence information of a novel peptide having an effect of enhancing memory learning function and / or cognitive function could be obtained from whey and casein protein hydrolysates (SEQ ID NOs: 1 to 16). And the effect was able to be confirmed using the synthetic peptide.
  • Protease agents include: Neurase F3, Protease M “Amano” SD, Protease A “Amano” SD, Protease P “Amano” 3SD, Protin SD-NY10, Samoaase PC10F, Protin SD-AY10, Papain W-40, Bromelain F As a peptidase agent, Proteax and peptidase R (Amano Enzyme Inc.) were used.
  • the enzyme reaction solution obtained by treating sodium caseinate with the above enzyme was applied to a C18 solid phase extraction column. Elution was carried out stepwise with methanol 20, 40, 60, and 80% aqueous solution, and the obtained fraction was concentrated and subjected to preparative HPLC.
  • a C18 column (inner diameter: 10 mm, length: 250 mm, particle system: 5 ⁇ m) was used as the separation column, the mobile phase was A liquid: 5% methanol, B liquid: methanol, and the flow rate was 5 ml / min at 0 minutes. Elution with a gradient of 0% of the solution and 80% of the B solution in 40 minutes was performed. The eluate was divided into a plurality of fractions, and each was concentrated and dried.
  • Each fraction was redissolved in a solution containing a small amount of methanol and then subjected to analytical HPLC for subfractionation.
  • a C18 column (inner diameter: 4.6 mm, length: 250 mm, particle system: 5 ⁇ m) was used as a separation column, and A liquid: 0.1% TFA, B liquid; 0.1% TFA, acetonitrile was used as a mobile phase. Elution with a gradient of 5% B solution at 0 minutes, 20% solution B at 30 minutes, 20% solution at 40 minutes, 5% solution B at 0 minutes, 80% solution B at 30 minutes at a flow rate of 1 ml / min It was. Detection was performed at UV 220 nm. Multiple peaks obtained by analysis were collected by repeated fractionation. Each obtained fraction was concentrated and dried to remove TFA, and redissolved in a solution containing a small amount of methanol.
  • microglia's phagocytic activity and anti-inflammatory activity as indicators to obtain highly active enzyme-treated products.
  • the following methods are used to evaluate microglia isolation, phagocytic activity, and anti-inflammatory activity.
  • a brain tissue dispersion is obtained by treating the brain extracted from the mouse with papain. After stopping the enzyme reaction, the microglia was reacted with a CD11b antibody (manufactured by Miltenyi Biotec), which is a pan-microglia marker magnetically labeled with microbeads, and isolated by the MACS method.
  • a CD11b antibody manufactured by Miltenyi Biotec
  • the isolated microglia is cultured for 12 hours in a medium supplemented with various peptides. Thereafter, amyloid ⁇ 1-42 (manufactured by AnaSpec) labeled with the fluorescent dye fluorescein (FAM) was added to the medium at a concentration of 500 nM, the supernatant was removed after 5 hours of culture, and the extracellular fluorescence was quenched with trypan blue.
  • the enhancement of phagocytic activity was evaluated by measuring the amount of amyloid ⁇ incorporated into microglia with a microplate reader as the amount of fluorescence.
  • the isolated microglia is cultured for 12 hours in a medium supplemented with various peptides. Thereafter, 5 ng / ml lipopolysaccharide (LPS, SIGMA-ALDRICH) and 0.5 ng / ml interferon ⁇ (IFN- ⁇ , R & D systems) were added and cultured for 12 hours, and TNF contained in the culture supernatant - ⁇ was quantified by ELISA kit (eBiosceince).
  • the isolated microglia is pretreated for 12 hours in a medium supplemented with 0.1,25,2.5 ⁇ M synthetic peptide (KEMFPFPKYPVEP, SMKEGIHAQQ, AVPYP, SLPQ, YPE, WM, WY).
  • synthetic peptide KEMFPFPKYPVEP, SMKEGIHAQQ, AVPYP, SLPQ, YPE, WM, WY.
  • CM1 indicates the result of KEMFPFPKYPVEP
  • CM2 indicates the result of SMKEGIHAQQ
  • CM3 indicates the result of AVPYP
  • CM4 indicates the result of SLPQ
  • CM5 indicates YPE.
  • CM6 indicates the WM result
  • CM7 indicates the WY result.
  • [Anti-inflammatory activity by synthetic peptide] Peptides were synthesized based on the obtained amino acid sequences and evaluated for anti-inflammatory effects. Isolated microglia are pretreated for 12 hours in medium supplemented with 0, 25, 50, 100 ⁇ M synthetic peptides (KEMPFPKYPVEP, SMKEGIHAQQ, AVPYP, SLPQ, YPE, WM, WY). Thereafter, LPS and IFN- ⁇ were added to the medium and cultured for 12 hours in the same manner as described above, and TNF- ⁇ contained in the culture supernatant was measured by ELISA. The results are shown in FIG. In FIG.
  • CM1 indicates the result of KEMFPFPKYPVEP
  • CM2 indicates the result of SMKEGIHAQQ
  • CM3 indicates the result of AVPYP
  • CM4 indicates the result of SLPQ
  • CM5 indicates YPE
  • CM6 indicates the WM result
  • CM7 indicates the WY result.
  • sequence information of novel peptides having an effect of enhancing the phagocytic activity and / or anti-inflammatory activity of microglia could be obtained from the protein hydrolyzate of whey and casein (SEQ ID NOs: 1, 6, 9). , 12, 13, 14, 17). And the effect was able to be confirmed using the synthetic peptide.
  • the inflammatory signal is not limited to LPS, but is caused by endogenous inflammatory factors, exogenous virulence factors, etc. It was thought that alleviation of various inflammatory conditions could be expected.
  • Non-patent Document 16 inflammatory conditions in nerve tissue are not limited to dementia, but are closely related to depression, pain, and chronic fatigue.
  • the peptide according to the present invention enhances the phagocytic activity of microglia and also has an anti-inflammatory action, so that microglia removes waste products in the brain without causing inflammation in the brain. It is expected to contribute to the maintenance, improvement and improvement of cognitive function.
  • Tables 6 to 8 show the results of the presence or absence of the peptide sequence of the present invention in the amino acid sequences of proteins contained in various foods or food materials.
  • ⁇ -Casein and proteose peptone are degradation products of ⁇ -Casein, it is considered that dipeptides that have been confirmed to appear in ⁇ -Casein may also appear in ⁇ -Casein and proteose peptone. It is done.

Abstract

　記憶学習機能及び／又は認知機能を増強するための組成物、食品、医薬を提供する。　配列番号１～１６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分とすることにより、脳機能の向上、特に記憶学習機能及び／又は認知機能を増強するための組成物、食品、医薬を提供することが可能となる。

Description

記憶学習機能及び／又は認知機能を増強するための組成物
　本発明は、記憶学習機能及び／又は認知機能を増強する活性を有するペプチドに関し、該ペプチドを含有する組成物、食品及び医薬に関する。
　脳機能の維持、向上、改善は、若年層から老年層まで幅広い世代で求められている。記憶力や学習能力の維持、向上、改善は、受験、資格試験等に備えて勉強する学生や社会人だけではなく、日々の仕事や生活を行う上でも重要である。また、老年層では記憶力の低下、認知機能の低下は生活の質に関わるため、脳機能の低下を予防し、これを維持、向上、改善させることが求められている。
　さらに、老年期においては、老化に伴う脳機能の低下に起因する精神障害の増加が高齢者の増加とともに社会問題となっている。脳機能の低下に起因する疾患としては、アルツハイマー病に代表される認知症だけではなく、うつ病、せん妄等の精神疾患も脳機能の低下が原因であることが報告されている（非特許文献１～３）。
　脳機能の解明が進むにつれ、脳機能を増強させる物質の探索が盛んに行われている。特に、副作用を心配することがないことから、食品成分中に脳機能を向上させる物質が含まれていないか解析が行われている。
　例えば、オーストラリアで行われた３９歳～６５歳の年齢層での疫学調査によれば、発酵乳製品を日常的に摂取すると、記憶力を増強するという結果が得られている（非特許文献４）。また、アメリカ合衆国においても、発酵乳製品の摂取により認知機能障害の有病率が低下するという結果が得られている（非特許文献５）。それらの結果から、発酵乳製品には、記憶学習機能や認知機能を増強する物質が含まれていると考えられるが、前記研究成果は疫学調査にとどまり、実際の有効成分やその作用機序については不明である。
　記憶学習機能、認知機能の維持、向上、改善といった脳機能を増強する成分を、日常的に摂取し得る食品の成分中に特定することができれば、幅広い世代において有用なものとなる。上述のように発酵乳製品には、記憶学習機能や認知機能を増強する成分が含まれていると考えられることから、該成分を特定し、医薬、食品として利用することにより、若年層から老年層まで幅広い層で利用可能な製品を開発することができる。
　一方、脳内で唯一の免疫細胞として存在するミクログリアは、脳内における老廃物の貪食除去、損傷を受けた組織の修復等、脳内の恒常性の維持に不可欠な機能を有していることが明らかとなっている。ミクログリアによる脳内での老廃物除去、シナプス新生の促進は、認知機能の維持、向上、及び改善に貢献する一方、ミクログリアの過剰な活性化は、炎症状態を惹起し、認知機能の低下を引き起こす可能性があることも報告されている（非特許文献６～９）。過剰に活性化したミクログリアが産生するＴＮＦ-α等の炎症性サイトカイン、ケモカインは、疼痛、うつ病、慢性疲労の病態と密接に関係していると報告されている（非特許文献１０～１６）。そのため、ミクログリアの活性を制御することは、脳に関連する様々な疾患を予防、及び治療するうえで重要である。
西村　健（1996）日本老年医学会雑誌、第３３巻第１号、１～３頁 服部　英幸（2013)日本臨床、第７１巻第６号、９８１～９８７頁 田中　稔久、武田　雅俊（2011）日本臨床、増刊号、５２～５６頁 Crichton, G.E., et al., 2010 Asia. Pac. J. Clin. Nutr., Vol.19(2), pp.161-171 Rahman, A., et al., 2007, J. Nutr. Health Aging, Vol.11(1), pp.49-54 Wake, H., et al., 2009, J. Neurosci., Vol.29(13), pp.3974-3980 米山　雅紀、萩田　喜代一、2013年、日薬理誌、142巻、17-21頁 Welberg, L., 2014, Nat. Rev. Neurosci., Vol.15, pp.68-69 Brown, G.C. & Neher, J.J., 2014, Nat. Rev. Neurosci. Vol.15, pp.209-216 Berta, T., et al., 2014, J. Clin.Invest., Vol.124(3), pp.1173-1186 Riazi, K., et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.105(44), pp.17151-17156 Grinberg, Y.Y., et al., 2013, J. Neurochem., Vol.126(5), pp.662-672 Couch, Y., et al., 2013, Brain Behav. Immun., Vol.29, pp.139-146 Yasui, M., et al., 2014, Glia, doi: 10.1002/glia.22687 Nakatomi, Y., et al., 2014, J. Nucl. Med., Vol.55, pp.945-950 Perry, V.H., et al., 2010, Nat. Rev. Neurol. Vol.6, pp.193-201
　本発明の目的は、脳機能の向上、特に記憶学習機能及び／又は認知機能を増強する効果に優れたペプチドを見出し、その知見に基づき、記憶学習機能及び／又は認知機能を増強するための組成物、食品、医薬を提供することにある。
　上記目的を達成するため、本発明者らは、疫学的に示されている発酵乳製品の中に脳機能を向上させる成分が含まれていると考え、健忘モデルマウスのＹ字路迷路試験における評価、あるいは単離した脳内ミクログリアの活性試験における評価を指標として、乳タンパク質由来のペプチドのスクリーニングを行った。その結果、乳タンパク質由来の特定のペプチドが、記憶学習機能及び／又は認知機能を増強し得ること、更には、ミクログリアの貪食活性及び／又は抗炎症活性を増強し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、記憶学習機能及び／又は認知機能を増強するための組成物であって、配列番号１～１６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド、又はこれらの薬学上許容される塩もしくは溶媒和物を含有することを特徴とする。
　本発明においては、前記ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１～１６のいずれか一つのアミノ酸配列であることが好ましい。
　また、記憶学習機能及び／又は認知機能を増強するための食品であることが好ましい。
　また、記憶学習機能及び／又は認知機能を増強するための医薬であることが好ましい。
　また、前記ペプチドが、食品又は食品素材中に含まれるタンパク質の加水分解によって生成したものであることが好ましい。
　また、前記ペプチドが、乳タンパク質又はそれを含有する食品もしくは食品素材を微生物由来の酵素剤で酵素処理することによって得られたものであることが好ましい。
　また、前記乳タンパク質又はそれを含有する食品もしくは食品素材が、ホエイ若しくはカゼイン又はそれらを含有する粉乳、脱脂粉乳、調製粉乳であることが好ましい。製造コストの観点からはホエイがより好ましい。
　また、前記酵素剤が、アスペルギルス属（Asperugillus）菌由来の酵素、バチルス属（Bacillus）菌由来の酵素、及びリゾプス属（Rhizopus）菌由来の酵素からなる群から選ばれた１種又は２種以上の酵素を含むものであることが好ましい。
　一方、本発明の他の観点は、ミクログリアの貪食活性及び／又は抗炎症活性を増強するための組成物であって、配列番号１、６、９、１２、１３、１４、１７のいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド、又はこれらの薬学上許容される塩もしくは溶媒和物を含有することを特徴とする。
　上記発明においては、前記ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１、６、９、１２、１３、１４、１７のいずれか一つのアミノ酸配列であることが好ましい。
　本発明によれば、脳機能の向上、特に記憶学習機能及び／又は認知機能を増強する効果に優れたペプチドが見出され、記憶学習機能及び／又は認知機能を増強するための組成物、食品、医薬を提供することができる。
　より詳細には、例えば、若年層から壮年層では記憶力や学習能力の向上を図り、また、老年層では記憶力や学習能力の向上とともに、認知機能の低下を予防するのに有用な、組成物、食品、医薬を提供することができる。
　また、脳内における認知機能の低下に繋がる老廃物を、ミクログリアによって除去する活性を増強し、併せてミクログリアの有する抗炎症活性を増強することにより、認知機能を維持、向上、及び改善するのに有用な、組成物、食品、医薬を提供することができる。
　本発明は、日常的に摂取し得る食品に含まれるペプチド成分を有効成分とするので、副作用の少ない組成物、食品、医薬を提供することができる。
ホエイをタンパク質分解酵素で処理した組成物の記憶学習機能、認知機能の増強効果をＹ字迷路試験により検討した結果を示す図。 種々の酵素で処理したホエイペプチドエキスによる記憶学習機能、認知機能の増強効果を示す図。 プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ又はサモアーゼＣ１００で処理したホエイペプチドエキスのＨＰＬＣプロファイルを示す図。 ホエイ由来ペプチドの合成ペプチドによる記憶学習機能、認知機能の増強効果を示す図。 ホエイ由来ペプチドの合成ペプチドによる記憶学習機能、認知機能の増強効果を示す図。 ジペプチドＷＸによる記憶学習機能、認知機能の増強効果を示す図。 ホエイペプチドエキスおよび再構成サンプルによる記憶学習機能、認知機能の増強効果を示す図。 カゼイン由来ペプチドの合成ペプチドによる記憶学習機能、認知機能の増強効果を示す図。 ペプチドＫＥＭＰＦＰＫＹＰＶＥＰのコア配列解析を示す図。 ペプチドのミクログリアの貪食作用への効果を示す図。 ペプチドのミクログリアの抗炎症作用への効果を示す図。
　本発明で、記憶学習機能の増強とは記憶学習機能の維持、向上及び／又は改善を含む。記憶学習機能の維持とは、例えば、老年層等において、加齢に伴って生じる記憶力や学習能力の低下を防止することなどを含む。また、記憶学習機能の向上とは、例えば、一過的な記憶学習機能の向上や、中長期的な記憶の定着を促進、ひいては、脳の発育を促進させることなどを含む。さらに、記憶学習機能の改善とは、例えば、加齢その他の要因により一旦低下した機能や低下の兆しがある機能について回復することなどを含む。
　本発明で、認知機能の増強とは認知機能の維持、向上及び／又は改善を含む。認知機能の維持とは、例えば、理解、判断、論理などの知的機能、すなわち認知能力の低下を予防することなどを含む。また、認知機能の向上とは、例えば、認知能力を現状より高めることなどを含む。さらに、認知機能の改善とは、例えば、いったん低下した認知能力や低下の兆しがある症状が回復することなどを含む。
　本発明に用いるペプチドの作用機序については今後の研究の成果を待つことになるが、神経伝達物質の産生を促すなどの脳の仕組みを補強する結果として、認知機能を向上させる、記憶の定着を向上させる、加齢に伴う記憶の低下を抑制する等の記憶学習機能及び／又は認知機能の増強につながるものと考えられる。
　なお、本発明による知見によれば、上記ペプチド又は上記ペプチドを含む組成物を有効成分とする記憶学習機能及び／又は認知機能の増強剤や、上記ペプチド又は上記ペプチドを含む組成物をヒト又は動物に摂取させる記憶学習機能及び／又は認知機能を増強する方法や、記憶学習機能及び／又は認知機能を増強するための上記ペプチド又は上記ペプチドを含む組成物の用途なども提供される。
　本発明に用いるペプチドは、化学合成によって得られたものを用いてもよく、乳、大豆、小麦、卵、畜肉、魚肉、魚介などに由来するタンパク質やポリペプチド原料等から化学的もしくは酵素的に分解して得られたものを用いてもよい。具体的には、例えば、本発明に用いるペプチドの配列は、少なくとも、乳のホエイのカゼイン、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、大豆のグリシニン、小麦のグルテニン、卵黄のリボビテリン、卵白のオボアルブミン、オボトランスフェリン、リゾチウム、チキン蛋白のコラーゲンなどに含まれているから、それらや、それらを含有する食品もしくは食品素材を酸加水分解やプロテアーゼによる酵素処理、又は微生物発酵等に供して、上記ペプチドを生成させることができる。本発明の組成物としてはその調製物をそのまま用いてもよいし、濃縮したり、スプレードライや凍結乾燥等により乾燥粉末として用いてもよい。また、必要に応じて不純物、塩、酵素等の除去など、任意の程度の精製を施して用いてもよい。
　本発明に用いるペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ型のアミノ酸のみから構成されていてもよいし、Ｄ型のアミノ酸のみから構成されていてもよいし、あるいは両者が混在したペプチドのいずれであってもよい。また、天然に存在するアミノ酸のみから構成されていてもよいし、アミノ酸にリン酸化やグリコシル化等、任意の官能基が結合した修飾アミノ酸のみから構成されていてもよいし、あるいは両者が混在したペプチドのいずれであってもよい。また、ペプチドが２以上の不斉炭素を含む場合には、エナンチオマー、ジアステレオマー、あるいは両者が混在したペプチドのいずれであってもよい。
　さらに、本発明に用いるペプチドは、その薬学上許容される塩もしくは溶媒和物であってもよい。例えば、薬学上許容される酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩等の有機酸塩などが挙げられる。また、薬学上許容される金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩などが挙げられる。また、薬学上許容されるアンモニウム塩としては、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられる。また、薬学上許容される有機アミン付加塩としては、モルホリン、ピペリジン等の付加塩が挙げられる。
　本発明の使用形態については特に制限はない。例えば、医薬、その医薬に配合するために用いられる添加物、あるいは食品、その食品に配合するために用いられる添加物などとして使用することができる。また、ヒトだけでなくペットや家畜など動物に用いてもよい。ヒトや動物に上記ペプチドを有効に作用させるためには、上記ペプチドを０．００００１～１００質量％含有する形態であることが好ましく、０．０００１～１００質量％含有する形態であることがより好ましく、０．００１～１００質量％含有する形態であることが最も好ましい。また、本発明の組成物は、上記ペプチド以外に更に１種以上の有効成分と共に含有させたり、併用して投与もしくは摂取するようにしてもよい。例えば、認知機能の維持、向上等の効果を有することが既知である化合物又は組成物として、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）やイチョウ葉エキスなどが挙げられる。また、アミロイドβを減少させる成分として、抗アミロイドβ抗体などが挙げられる。
　本発明の一使用形態として例えば医薬である場合、例えば上記ペプチドのうち少なくともいずれか一つを有効成分として含み、担体、賦形剤、結合剤、希釈剤等を混合することにより、医薬用組成物を製造することができ、これを経口的又は非経口的に投与することが可能である。経口用の投与形態としては、顆粒剤、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、シロップ剤等が挙げられ、また、非経口用の投与形態としては、注射剤、点滴剤、経鼻投与製剤、外用剤等が挙げられるが、これらに限られるものではない。
　その投与量としては、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度等により異なるが、通常の経口投与の、成人１人１日当たりの好ましい投与量の範囲を挙げるならば、第１には上記ペプチド０．００２～４０ｇであり、第２には上記ペプチド０．００２～２０ｇであり、第３には上記ペプチド０．００２～２ｇであり、第４には上記ペプチド０．０２～４０ｇであり、第５には上記ペプチド０．０２～２０ｇであり、第６には上記ペプチド０．０２～２ｇであり、第７には上記ペプチド０．２～４０ｇであり、第８には上記ペプチド０．２～２０ｇであり、第９には上記ペプチド０．２～２ｇである。また、たとえば静脈内投与等の非経口投与の場合、通常の静脈内投与の、成人１人１日当たりの好ましい投与量の範囲を挙げるならば、第１には上記ペプチド０．０００２～４ｇであり、第２には上記ペプチド０．０００２～２ｇであり、第３には上記ペプチド０．０００２～０．２ｇであり、第４には上記ペプチド０．００２～４ｇであり、第５には上記ペプチド０．００２～２ｇであり、第６には上記ペプチド０．００２～０．２ｇであり、第７には上記ペプチド０．０２～４ｇであり、第８には上記ペプチド０．０２～２ｇであり、第９には上記ペプチド０．０２～０．２ｇである。なお、これら投与量に関しては、種々の条件により、適宜最適な形態を選択すればよいことは勿論である。
　本発明の一使用形態としては、例えば食品であってもよく、その形態に特に制限はない。液状、半液体状、固体状のいずれであってもよく、飲料のような形態も包含する。また、いわゆる健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメントを包含し、疾病リスク低減表示を付した食品などの保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能性食品、機能性表示食品）、病者用食品も包含される。例えば、乳や大豆等の食品素材を微生物発酵に供すことにより上記ペプチドを生成させたヨーグルト、チーズなどの乳製品、麹発酵食品としても良い。また、サプリメントとしては、上記ペプチドの乾燥粉末に賦形剤、結合剤等を加え練り合わせた後に打錠することにより製造された錠剤の形態などが挙げられる。
　本発明を飲料に適用する場合、非アルコール飲料として、例えば、ミネラルウォーター、ニア・ウォーター、スポーツドリンク、茶飲料、乳飲料、コーヒー飲料、果汁入り飲料、野菜汁入り飲料、果汁および野菜汁飲料、炭酸飲料などが挙げられるが、これらに限定はされない。ノンアルコールビール等、アルコール含有量が１％未満のビール飲料であってもよい。ミネラルウォーターは、発泡性および非発泡性のミネラルウォーターのいずれもが包含される。
　上記非アルコール飲料における茶飲料とは、ツバキ科の常緑樹である茶樹の葉（茶葉）、又は茶樹以外の植物の葉若しくは穀類等を煎じて飲むための飲料をいい、発酵茶、半発酵茶、及び不発酵茶のいずれもが包含される。茶飲料の具体例としては、日本茶（例えば、緑茶、麦茶）、紅茶、ハーブ茶（例えば、ジャスミン茶）、中国茶（例えば、中国緑茶、烏龍茶）、ほうじ茶等が挙げられる。乳飲料とは、生乳、牛乳等またはこれらを原料として製造した食品を主原料とした飲料をいい、牛乳等そのものを材料とするものの他に、例えば、栄養素強化乳、フレーバー添加乳、加糖分解乳等の加工乳を原料とするものも包含される。
　果汁入り飲料や果汁および野菜汁入り飲料に用いられる果物としては、例えば、リンゴ、ミカン、ブドウ、バナナ、ナシ、モモ、マンゴー、アサイー、ブルーベリーなどが挙げられる。また、野菜汁入り飲料や果汁および野菜汁入り飲料に用いられる野菜としては、例えば、トマト、ニンジン、セロリ、カボチャ、セロリ、キュウリなどが挙げられる。
　食品の場合の、通常の摂取形態における成人１人１日当たりの好ましい摂取量の範囲を挙げるならば、第１には上記ペプチド０．００２～４０ｇであり、第２には上記ペプチド０．００２～２０ｇであり、第３には上記ペプチド０．００２～２ｇであり、第４には上記ペプチド０．０２～４０ｇであり、第５には上記ペプチド０．０２～２０ｇであり、第６には上記ペプチド０．０２～２ｇであり、第７には上記ペプチド０．２～４０ｇであり、第８には上記ペプチド０．２～２０ｇであり、第９には上記ペプチド０．２～２ｇである。また、上記ペプチドを有効に作用させるためには、上記ペプチドを０．００００１～１００質量％含有する形態であることが好ましく、０．０００１～１００質量％含有する形態であることがより好ましく、０．００１～１００質量％含有する形態であることがさらに好ましく、０．０１～９０質量％含有する形態であることがなお一層好ましく、０．１～８０質量％含有する形態であることが最も好ましい。また、１食分ないしは１食分として小分けされた容器中に、上記ペプチドを含有せしめる場合、通常の配合形態における含量の範囲を挙げるならば、第１には上記ペプチド０．００２～４０ｇであり、第２には上記ペプチド０．００２～２０ｇであり、第３には上記ペプチド０．００２～２ｇであり、第４には上記ペプチド０．０２～４０ｇであり、第５には上記ペプチド０．０２～２０ｇであり、第６には上記ペプチド０．０２～２ｇであり、第７には上記ペプチド０．２～４０ｇであり、第８には上記ペプチド０．２～２０ｇであり、第９には上記ペプチド０．２～２ｇである。飲料として用いる場合には、上記ペプチドを０．００００１～１０質量％含有する形態であることが好ましく、０．０００１～５質量％含有する形態であることがより好ましく、０．００１～５質量％含有する形態であることがさらに好ましく、０．０１～５質量％含有する形態であることがなお一層好ましく、０．１～１質量％含有する形態であることが最も好ましい。
　なお、本発明により提供されるペプチドは、その分子量が比較的小さいことから、体内への吸収性や脳関門の通過性に優れ、脳内でその効果を発揮しやすい。
　本発明を以下の例によって詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　［ホエイペプチドエキスの調製］
　ホエイペプチドエキスは以下のようにして調製した。５％（ｗ/ｖ）のホエイ（第一化成社製）水溶液に０．１２５％（ｗ/ｖ）の食品添加プロテアーゼ、又はペプチダーゼを混合し、５０℃で４時間反応を行った。得られた酵素反応液を分画分子量（Molecular Weight Cut-off）１０ＫＤａの限外濾過膜を用い濾過し、濾液（以下、ホエイペプチドエキスともいう。）を回収し、実験に供した。
　［記憶学習機能・認知機能の評価方法］
　図１（Ａ）に記憶学習機能・認知機能の評価方法の概要を示す。６週齢雄のＣＤ－１マウスに、ペプチドエキスを用いた場合には、１ｍｇ/ｋｇ、合成ペプチドの場合には０．１～３μmol／ｋｇの量で胃内へ強制経口投与を行い、４０分後に記憶障害を誘発するために０．８０ｍｇ/ｋｇのスコポラミン塩酸塩を腹腔内投与した。スコポラミンの腹腔内投与２０分後に自発的交替行動を評価するＹ字迷路試験を実施した。
　マウスは本来、直前に選択したルートとは異なるルートを選択する性質がある。そのため、幅、長さ等が等価の３本のアームを持つＹ字迷路にマウスを入れた場合、通常は直前に進入したアームとは異なるアームに進入する。Ｙ字迷路試験は、マウスのその性質を利用し、短期記憶の評価に利用する試験である。
　Ｙ字迷路試験では、一本のアームの長さが２５ｃｍ、壁の高さが２０ｃｍ、床の幅が５ｃｍの３本のアームが各々１２０度の角度で接続されたＹ字迷路を実験装置として使用した。
　マウスをＹ字迷路のいずれかのアームの先端へ入れて自由に８分間探索させた際の移動したアームの順を記録した。３回連続で異なるアームを選択し、進入した場合を自発的交替行動と呼ぶ。時間内のアームへの総進入数及び、自発的交替行動数をカウントし、式（１）で自発的交替行動変動率（％）を算出した。
自発的交替行動変動率（％）＝自発的交替行動数／（総進入数－２）×１００
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・・式（１）
自発的交替行動変動率が高いほど、短期記憶が保持されていることを示す。なお、一群１０匹で実験を行い、平均、標準誤差を求めた。
　［酵素剤の検討］
　乳タンパク質が豊富なホエイ中に脳機能を増強させるペプチドが含まれているか解析するため、ホエイをアスペルギルス（Asperugillus）属菌、バチルス（Bacillus）属菌、植物由来の酵素剤で処理し、Ｙ字迷路試験を行い、脳機能を増強させる効果があるか検討した。
　具体的には、食品添加プロテアーゼであるプロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ（アマノＰと略記することもある。天野エンザイム株式会社製）、プロチンＳＤ－ＮＹ１０（プロチンと略記することもある。天野エンザイム株式会社製）、ブロメライン（天野エンザイム株式会社製）を用いてホエイを処理し、得られたホエイペプチドエキスをマウスに経口投与して、脳機能評価を行った。結果を図１（Ｂ）、（Ｃ）に示す。
　図１（Ｂ）は自発的交替行動変動率（spontaneous alteration）、（Ｃ）は総進入数（number of entries）を示す。スコポラミン（ＳＣＰ）投与では、総進入数（図１（Ｃ））に有意な変動は生じず、ホエイ、ホエイペプチドエキス投与によっても、行動量に変化はない。なお、コントロールはスコポラミン投与のみを行ったマウス群を示す。
　一方、図１（Ｂ）に示すように、スコポラミンのみを投与した群（コントロール）に比べて、アスペルギルス属菌由来のプロテアーゼであるアマノＰ、バチルス属菌由来のプロテアーゼであるプロチン処理したホエイペプチドエキス投与群では脳機能が改善する効果が見られた。しかしながら、プロテアーゼ処理していないホエイ投与群（未処理）や、植物由来のプロテアーゼであるブロメライン処理したペプチドエキス投与群では脳機能の改善は見られなかった。
　そこで、脳機能の改善の効果が見られたアスペルギルス及びバチルス由来酵素剤とリゾプス属菌由来酵素剤を含めた表１に示す１０種類の酵素剤（いずれも天野エンザイム株式会社製）を用いてホエイを処理し、上記と同様にスコポラミン健忘モデルを用いて、記憶学習機能・認知機能の評価を行った（図２）。なお、溶媒(vehicle)としては、蒸留水を用いている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図２（Ａ）は自発的交替行動変動率（spontaneous alteration）、（Ｂ）は総進入数（number of entries）を示す。いずれの酵素で処理したペプチドエキスもスコポラミン健忘モデルにおいて、脳機能改善効果を示した。
　特に、アスペルギルス属菌由来の酵素プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ(アマノＰ、図２の３)と、バチルス属菌由来の酵素サモアーゼＣ１００（図２の１０）で活性が強かったことから、これら酵素処理したペプチド中に、脳機能を改善する効果の高いペプチドが含まれていると考えられるので、これら酵素処理したホエイ中の活性ペプチドの探索を行った。
　［ペプチドの分画方法］
　脳機能改善効果の高い、アマノＰ、又はサモアーゼＣ１００で処理したホエイペプチドエキスは、Ｃ１８固相抽出カラムに供した後、水、メタノールを各２０、４０、６０、８０％含む水溶液で段階的に溶出を行った。
　得られた分画物は濃縮後、分取用ＨＰＬＣにてさらに分画を行った。分離カラムにはＣ１８カラム（内径１０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、粒子径５μｍ）を用い、移動相にはＡ液；５％メタノール、Ｂ液；１００％メタノールを用いて、流速５ｍｌ／ｍｉｎで、０分でＢ液０％、４０分でＢ液８０％のグラジエントによる溶出を行った。
　溶出液を幾つかの画分に分け、それぞれを濃縮、乾固した。各分画物を少量のメタノールを含む溶液に再溶解させた後、分析用ＨＰＬＣに供して、再分画を行った。Ｃ１８分離カラム（内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、粒子径５μｍ）を用い、カラム温度は７０℃とした。
　移動相にはＡ液；０．１％ＴＦＡ、Ｂ液；０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルを用い、流速１ｍｌ／ｍｉｎで、０分でＢ液５％、３０分でＢ液２０％、４０分でＢ液２０％、または０分でＢ液５％、３０分でＢ液８０％のグラジエントによる溶出を行った。検出はＵＶ２２０ｎｍで行った。
　分析によって得られたピークは幾つかの画分に分け、繰り返し分取を行い回収した。得られたそれぞれの画分は濃縮、乾固によってＴＦＡを除去し、少量のメタノールを含む溶液に再溶解させた。
　これらの分画物の記憶学習機能・認知機能の増強効果を評価し、活性化能の高い分画物中に含まれるペプチドをさらに精製した。得られた精製ペプチドについて、Ｎ末端アミノ酸配列分析を行い、アミノ酸配列を取得した。
　図３にホエイをプロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ（アマノＰ）又はサモアーゼＣ１００で分解したペプチドエキスのＨＰＬＣプロファイルを示す。また、各ピークのＮ末端アミノ酸配列分析により得られたアミノ酸配列を示す。
　得られたアミノ酸配列情報より、ペプチド固相合成法によりペプチドを合成し、合成ペプチドを得て、合成ペプチドを用いて記憶学習機能・認知機能の増強効果について調べた。
　［合成ペプチドによる記憶学習機能・認知機能の増強効果の検討］
　ホエイをAspergillus melleus由来のタンパク質分解酵素プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤで処理し、記憶学習機能・認知機能の増強活性のある分画中に含まれるペプチド配列を解析した結果、ＧＴＷＹ（配列番号７）、ＧＹＧＧＶＳＬＰ（配列番号３）、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩ（配列番号２）の３つのペプチドの配列情報が得られた（下記表２配列表参照）。
　そこで、得られたアミノ酸配列情報に基づいて、ペプチド固相合成法によってペプチドを合成した。次に、合成ペプチドを用いて記憶学習機能・認知機能が増強されるかＹ迷路試験により解析を行った。図４に結果を示す。
　ＧＴＷＹ、ＧＹＧＧＶＳＬＰ、ＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩいずれのペプチドにも、濃度依存的に記憶学習機能・認知機能の増強活性が見られた。特にＧＴＷＹは図３に示すように、ホエイをプロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤで処理することにより得られるメジャー成分である。
　次に、ホエイをバチルス由来のタンパク質分解酵素サモアーゼＣ１００で処理し、記憶学習機能・認知機能の増強活性のある分画中に含まれるペプチド配列を解析した。その結果、ＴＷＹ（配列番号１１）、ＴＷＹＳ（配列番号８）、ＶＡＧＴＷＹＳ（配列番号４）、ＶＳＬＰＥＷ（配列番号５）の４つのペプチドの配列情報が得られた。
　アミノ酸配列情報からペプチド固相合成法によって合成ペプチドを得て、合成ペプチドを用いて記憶学習機能・認知機能が増強されるかＹ迷路試験により解析を行った。結果を図５に示す。
　ＴＷＹ、ＴＷＹＳ、ＶＡＧＴＷＹＳ、ＶＳＬＰＥＷの４つのペプチドとも、濃度依存的に記憶学習機能・認知機能の増強活性が見られた。特に、ＴＷＹＳ、ＴＷＹ、ＶＳＬＰＥＷは図３に示すように、ホエイをサモアーゼＣ１００で処理することにより得られるメジャー成分である。
　［ジペプチドＷＸの記憶学習機能・認知機能に対する効果］
　上記解析から、脳機能の増強効果があることが明らかとなった７つのペプチドのうち４つのペプチド、ＶＡＧＴＷＹＳ（配列番号４）、ＧＴＷＹ（配列番号７）、ＴＷＹＳ（配列番号８）、ＴＷＹ（配列番号１１）にトリプトファン-チロシン（ＷＹ）の配列が含まれることが明らかとなった。ＷＹ配列が含まれる種々のペプチドで記憶学習機能・認知機能に対する効果が見られたことから、ジペプチドＷＹはコア配列として作用するものと考えられる。実際にＷＹを含む８アミノ酸からなるペプチドに記憶学習機能・認知機能を増強する効果が見られることを確認している。したがって、少なくともＷＹをコア配列として含む２から８アミノ酸の長さのペプチド、また、本発明で効果が得られている最長のペプチドが１２アミノ酸からなるペプチドであることを鑑みると、ＷＹ配列を含む１２残基程度までの長さのペプチドであれば、記憶学習機能・認知機能の増強効果があるものと考えられる。
　また、ＷＹというジペプチドがコア配列であると考えられることから、トリプトファンをＮ末に含むジペプチドに脳機能を増強する作用がある可能性がある。そこで、トリプトファンをＮ末に含むジペプチドを合成し、Ｙ字迷路試験を行い、脳機能への効果について調べた。
　その結果、乳タンパク質に配列として含まれるトリプトファン‐チロシン（ＷＹ、配列番号１３）、トリプトファン－メチオニン（ＷＭ、配列番号１４）、トリプトファン－ロイシン（ＷＬ、配列番号１５）、トリプトファン‐バリン（ＷＶ、配列番号１６）の４つのジペプチドで濃度依存的な記憶学習機能・認知機能に対し増強効果があることが明らかとなった（図６）。
　これに対し、配列番号１３、配列番号１４と同じアミノ酸組成であるものの、配列の異なるジペプチドであるチロシン-トリプトファン（ＹＷ）、メチオニン-トリプトファン（ＭＷ）には、記憶学習機能・認知機能に対して増強効果は見られなかった。また、トリプトファン単独（Ｗ）でも効果は見られなかった。
　したがって、ＷＹ、ＷＭ、ＷＬ、ＷＶといったＮ末側にトリプトファンを含みＣ末側に疎水性アミノ酸が結合したジペプチドに記憶学習機能・認知機能増強効果が見られるものと考えられる。
　ＷＹと同様に、合成ペプチドで記憶学習機能・認知機能増強効果が確認された他のジペプチドＷＭ、ＷＬ、ＷＶについてもＷＹ同様、コア配列として作用し、記憶学習機能・認知機能の増強効果があるものと考えられる。したがって、これらジペプチドを配列に含む２から１２アミノ酸の長さのペプチド、より典型的には２から８アミノ酸の長さのペプチドは、記憶学習機能・認知機能を増強するものと考えられる。
　なお、Genbank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）での検索によって、ホエイを構成するタンパク質中の上記ジペプチド配列の存在を確認したところ、β‐Lactoglobulin中にはＷＹ配列が１箇所、α‐Lactalbumin中にはＷＬ配列が２箇所、ＷＶ配列が１箇所存在し、ウシ、ヒツジ、ヤギの乳由来ホエイで共通であった。
　[ホエイペプチドエキス中での各種ペプチドの脳機能効果への寄与率]
　ホエイペプチドエキス中で各種ペプチドがどの程度効果発揮に寄与しているか以下の方法で確認した。
　まず、１０％（ｗ/ｖ）のホエイタンパク質(フォンテラ社WPC472)水溶液に０．２％（ｗ/ｖ）の酵素剤(プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ)を添加して消化処理（５０度、５時間）した後、８０℃で３０分間酵素失活して、ホエイペプチドエキスを調製した。また、このホエイペプチドエキス中に含まれる各種ペプチドの濃度を液体クロマトグラフ-タンデム型質量分析装置（LC/MS/MS）で定量し、得られた濃度の情報をもとに合成ペプチドを用いてエキス組成物を再構成した。具体的には、表２に示す各配列のペプチドについて、ホエイペプチドエキス中の濃度と同濃度となるようにそれぞれに対応する合成ペプチドを用い、それらを混合して、再構成エキス組成物を調製した。
　このホエイペプチドエキスのマウスへの経口投与を１０ｍｇ／ｋｇとした以外は上記と同様にして、記憶学習機能・認知機能が増強されるかＹ迷路試験により解析を行った（エキス区）。また、再構成エキス組成物について、同様にして、記憶学習機能・認知機能が増強されるかＹ迷路試験により解析を行った（再構成区）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　その結果、図７に示すように、再構成区の場合もエキス区と同程度の効果がみられた。よって、これらペプチドがホエイペプチドエキスにおける主要な有効成分であると考えられた。
　［カゼインペプチドエキスに含まれる記憶学習機能・認知機能の増強活性のあるペプチド］
　乳に含まれるホエイ以外のタンパク質として、カゼインが含まれることが良く知られている。そこで、カゼイン（和光純薬工業株式会社製）を、上記表１に示した酵素剤のうち、アスペルギルス属菌由来の酵素剤であるプロテアーゼＭ「アマノ」ＳＤ（アマノＭと略記することもある。）で消化し、記憶学習機能・認知機能増強活性を有するペプチドの解析を行った。ホエイの場合と同様にして、カゼインをアマノＭで分解したペプチドエキスを、ＨＰＬＣで分画し、活性のある分画のアミノ酸配列を決定した。その結果、記憶学習機能・認知機能増強活性のあるペプチドとして、ＫＥＭＰＦＰＫＹＰＶＥＰ（配列番号１）、ＡＶＰＹＰ（配列番号６）、ＳＬＰＱ（配列番号９）、ＹＰＥ（配列番号１２）、ＷＹ（配列番号１３）、ＷＭ（配列番号１４）の６つの配列情報を得ることができた。
　なお、カゼインをアスペルギルス属菌由来の酵素アマノＭで処理して得られるペプチドエキス中のジペプチドＷＭ、ＷＹは、上記で検討したトリプトファンをＮ末に有するジペプチドである。
　そこで、これら配列情報からペプチドを合成し、合成ペプチドを用いてＹ字迷路試験により、記憶学習機能・認知機能の評価を行った。結果を図８に示す。いずれのペプチドも記憶学習機能・認知機能に対し増強効果があることが示された。なお、２つのジペプチドＷＹ、ＷＭについては、すでに解析結果を図６に示している。
　次に、カゼイン分解産物より得られた配列番号１で表すペプチドＫＥＭＰＦＰＫＹＰＶＥＰは、１２アミノ酸と比較的長いペプチドであることから、さらにトリプシン、キモトリプシンで切断される配列であるＥＭＰＦ、ＰＫ、ＰＶＥＰの３つのペプチドを合成し、各ペプチドを１μmol／ｋｇの量でマウスに投与しＹ字迷路試験を行った。
　図９に示すように、ＥＭＰＦ、ＰＫ、ＰＶＥＰの３つのペプチドのうち、ＰＶＥＰに、もとのアミノ酸配列、ＫＥＭＰＦＰＫＹＰＶＥＰと同等の記憶学習機能に対する増強効果があったことから、ＰＶＥＰがコア配列であり、アミノ酸配列ＰＶＥＰを有する１２残基程度のペプチドは同等の効果を有すると推認される。以上、記憶学習機能・認知機能に増強効果のあるペプチドについて表３にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　以上のとおり、ホエイやカゼインのタンパク質加水分解物から、記憶学習機能及び／又は認知機能を増強する効果のある新規のペプチドの配列情報を得ることができた（配列番号１～１６）。そして、合成ペプチドを用いて、その効果を確認することができた。
　［ミクログリアの貪食活性および抗炎症活性を増強するペプチドのスクリーニング方法］
　以下の方法でミクログリアの貪食活性および抗炎症活性を増強するカゼインペプチドを単離同定した。
　《ペプチド単離方法》
　カゼインナトリウム（和光純薬工業社製）を食品添加プロテアーゼ、ペプチダーゼを用いて処理した。プロテアーゼ剤としては、ニューラーゼＦ３、プロテアーゼＭ「アマノ」ＳＤ、プロテアーゼＡ「アマノ」ＳＤ、プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ、プロチンＳＤ－ＮＹ１０，サモアーゼＰＣ１０Ｆ，プロチンＳＤ－ＡＹ１０、パパインＷ－４０、ブロメラインＦ、ペプチダーゼ剤としては、プロテアックス、ペプチダーゼＲ（天野エンザイム株式会社）を用いた。
　カゼインナトリウムを上記の酵素で処理して得られた酵素反応液をＣ１８固相抽出カラムに供した。メタノール２０、４０、６０、８０％水溶液で段階的に溶出を行い、得られた分画を濃縮後、分取用ＨＰＬＣに供した。分離カラムにはＣ１８カラム（内径１０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、粒子系５μｍ）を用い、移動相にはＡ液；５％メタノール、Ｂ液；メタノールを用いて、流速５ｍｌ/ｍｉｎで、０分でＢ液０％、４０分でＢ液８０％のグラジエントによる溶出を行った。溶出液を複数の画分に分け、それぞれを濃縮、乾固した。各分画を少量のメタノールを含む溶液に再溶解させた後、分析用ＨＰＬＣに供して、細分画を行った。分離カラムにはＣ１８カラム（内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、粒子系５μｍ）を用い、移動相にはＡ液；０．１％ＴＦＡ、Ｂ液；０．１％ＴＦＡ、アセトニトリルを用いて、流速１ｍｌ/ｍｉｎで、０分でＢ液５%、３０分でＢ液２０％、４０分で２０％、または０分でＢ液５％、３０分でＢ液８０％のグラジエントによる溶出を行った。検出はＵＶ２２０ｎｍで行った。分析によって得られた複数のピークを繰り返し分取することによって回収した。得られたそれぞれの画分は濃縮、乾固によってＴＦＡを除去し、少量のメタノールを含む溶液に再溶解させた。
　これらのサンプルを、ミクログリアの貪食活性、抗炎症活性を指標とした評価系へ供し、活性の高い酵素処理品を得た。ミクログリアの単離、貪食活性、抗炎症活性の評価方法は以下の方法による。
　《ミクログリアの単離》
　マウスより摘出した脳をパパイン処理することにより、脳組織分散液を得る。酵素反応を停止後、ミクログリアはマイクロビーズによって磁性標識された汎ミクログリアマーカーであるＣＤ１１ｂ抗体（Miltenyi Biotec社製）と反応させ、ＭＡＣＳ法によって単離した。
　《貪食活性の評価》
　単離したミクログリアを種々のペプチドを添加した培地で１２時間培養する。その後、蛍光色素フルオレセイン（ＦＡＭ）で標識したアミロイドβ１－４２（AnaSpec社製）を培地に５００ｎＭの濃度で添加し、５時間培養後に上清を除き、トリパンブルーで細胞外の蛍光を消光させ、マイクロプレートリーダーでミクログリア内に取り込まれたアミロイドβの量を蛍光量として測定し、貪食活性の増強を評価した。
　《抗炎症活性の評価》
　単離したミクログリアを種々のペプチドを添加した培地で１２時間培養する。その後、５ｎｇ／ｍｌリポポリサッカライド(ＬＰＳ、SIGMA-ALDRICH社)及び０．５ｎｇ／ｍｌインターフェロンγ(ＩＦＮ-γ、R&D systems社)を添加して１２時間培養し、培養上清中に含まれるＴＮＦ－αをELISAキット(eBiosceince社)により定量した。
　［ミクログリアの活性を増強するペプチドの単離、同定］
　上記方法によって、ミクログリアの貪食活性の増強作用、抗炎症活性の増強作用を有する７種のペプチドを得た。すべての精製ペプチドについて、Ｎ末端アミノ酸配列分析を行い、アミノ酸配列を取得した。表４に取得したペプチドのアミノ酸配列を１文字表記で示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　［合成ペプチドによるミクログリアのアミロイドβ貪食活性］
　次に、取得したアミノ酸配列に基づいてペプチドを合成し、ミクログリアの貪食活性を評価した。
　単離したミクログリアは、０，１．２５，２．５μＭの合成ペプチド（ＫＥＭＰＦＰＫＹＰＶＥＰ、ＳＭＫＥＧＩＨＡＱＱ、ＡＶＰＹＰ、ＳＬＰＱ、ＹＰＥ、ＷＭ、ＷＹ）を添加した培地で１２時間前処理する。
　上記と同様に前処理後、ＦＡＭで標識したアミロイドβ１－４２を培地に添加し細胞に取り込ませ、取り込まれたアミロイドβの量を蛍光量として測定し、貪食活性の増強を評価した。ミクログリアのアミロイドβ貪食を測定した結果を図１０に示す。なお、図１０では「ＣＭ１」がＫＥＭＰＦＰＫＹＰＶＥＰの結果を示し、「ＣＭ２」がＳＭＫＥＧＩＨＡＱＱの結果を示し、「ＣＭ３」がＡＶＰＹＰの結果を示し、「ＣＭ４」がＳＬＰＱの結果を示し、「ＣＭ５」がＹＰＥの結果を示し、「ＣＭ６」がＷＭの結果を示し、「ＣＭ７」がＷＹの結果を示す。
　図１０から明らかなように、いずれのペプチドも１．２５μＭから濃度依存的にミクログリアの貪食活性を増強することが示された。
　［合成ペプチドによる抗炎症活性］
　取得したアミノ酸配列に基づいてペプチドを合成し、抗炎症作用について評価した。単離したミクログリアを、０、２５、５０、１００μＭの合成ペプチド（ＫＥＭＰＦＰＫＹＰＶＥＰ、ＳＭＫＥＧＩＨＡＱＱ、ＡＶＰＹＰ、ＳＬＰＱ、ＹＰＥ、ＷＭ、ＷＹ）を添加した培地で１２時間前処理する。その後は上記と同様に、ＬＰＳ及びＩＦＮ-γを培地に添加して、１２時間培養し、培養上清中に含まれるＴＮＦ－αをＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１１に示す。なお、図１１では「ＣＭ１」がＫＥＭＰＦＰＫＹＰＶＥＰの結果を示し、「ＣＭ２」がＳＭＫＥＧＩＨＡＱＱの結果を示し、「ＣＭ３」がＡＶＰＹＰの結果を示し、「ＣＭ４」がＳＬＰＱの結果を示し、「ＣＭ５」がＹＰＥの結果を示し、「ＣＭ６」がＷＭの結果を示し、「ＣＭ７」がＷＹの結果を示す。
　図１１に示すようにいずれのペプチドも２５μＭから濃度依存的に炎症性サイトカインであるＴＮＦ－αの産生を抑制することが確認でき、抗炎症作用の増強が認められ、特に配列番号１３のペプチド（図１１中「ＣＭ７」）、ＷＹは抗炎症作用が高いことが示された。
　以上のとおり、ホエイやカゼインのタンパク質加水分解物から、ミクログリアの貪食活性及び／又は抗炎症活性を増強する効果のある新規のペプチドの配列情報を得ることができた（配列番号１、６、９、１２、１３、１４、１７）。そして、合成ペプチドを用いて、その効果を確認することができた。
　なお、以上の試験では、脳内での蓄積がアルツハイマー病の原因とされているアミロイドβに対するミクログリアの貪食活性の増強を示したが、ミクログリアによる貪食対象物質はアミロイドβに限られるものではなく、古くなったシナプスや死細胞等の除去により、シナプス新生を促すことによる、認知機能の改善も期待することができると考えられた。
　また、ＬＰＳ刺激に対する応答としてのミクログリアによるＴＮＦ-αの産生抑制を示したが、炎症シグナルはＬＰＳに限定されるものではなく、内因性の炎症性因子、外来性の病原性因子などに起因する様々な炎症状態の緩和が期待できると考えられた。
　加齢に伴い脳内でアミロイドβなどの老廃物が沈着すると、脳内ではミクログリアによって炎症状態が惹起される。炎症により産生された活性酸素種や炎症性サイトカインは神経細胞にとってストレス因子となるため、一般的に脳内で生じる炎症状態は認知機能の低下が伴うことが知られている（非特許文献１６）。また神経組織における炎症状態は、認知症に留まらず、うつ病、疼痛、慢性疲労とも密接に関連している。
　上記のように本発明によるペプチドは、ミクログリアの貪食活性を増強するとともに、抗炎症作用も備えていることから、脳内でミクログリアが炎症を惹起することなく、脳内の老廃物を除去して、認知機能の維持、向上及び改善に寄与することが期待される。
　[各種食品または食品素材に含まれるタンパク質のアミノ酸配列中での本発明ペプチド配列の有無]
　配列番号１２～１６のペプチド配列が各種食品または食品素材に含まれるタンパク質のアミノ酸配列中に存在するか調べた。具体的には、下記表５に示す３４種類のタンパク質のアミノ酸配列中にそれらペプチドの配列が現れるかを調べた。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表６～表８に、各種食品または食品素材に含まれるタンパク質のアミノ酸配列中での本発明ペプチド配列の出現有無の結果を示す。なお、γ-Ｃasein及びproteose peptoneはβ-Ｃaseinの分解産物であることから、β-Ｃaseinに出現が確認されたジペプチドについてはγ-Ｃasein及びproteose peptoneにおいても出現している可能性があると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　その結果、配列番号１２～１６のペプチド配列のうち少なくとも１種が、上記６種類の食品中に含まれるタンパク質のうち少なくとも１種に含まれることがわかり、それらタンパク質や、それらを含む食品や食品素材を酸加水分解やプロテアーゼによる酵素処理、又は微生物発酵等に供することで、上記ペプチドが生成することが確認された。
　[本発明の組成物を含有する飲料の製造]
　上記同様に調製したホエイペプチドエキスを用いてコーヒー飲料および果汁飲料を製造した。各飲料組成および製法は表９及び表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
  

Claims (10)

  1. 　記憶学習機能及び／又は認知機能を増強するための組成物であって、配列番号１～１６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド、又はこれらの薬学上許容される塩もしくは溶媒和物を含有することを特徴とする組成物。
  2. 　前記ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１～１６のいずれか一つのアミノ酸配列である請求項１記載の組成物。
  3. 　記憶学習機能及び／又は認知機能を増強するための食品である、請求項１又は２記載の組成物。
  4. 　記憶学習機能及び／又は認知機能を増強するための医薬である、請求項１又は２記載の組成物。
  5. 　前記ペプチドが、食品又は食品素材中に含まれるタンパク質の加水分解によって生成したものである、請求項１～４のいずれか１つに記載の組成物
  6. 　前記ペプチドが、乳タンパク質又はそれを含有する食品もしくは食品素材を微生物由来の酵素剤で酵素処理することによって得られたものである、請求項１～５のいずれか１つに記載の組成物。
  7. 　前記乳タンパク質又はそれを含有する食品もしくは食品素材が、ホエイ又はカゼインである請求項６記載の組成物。
  8. 　前記酵素剤が、アスペルギルス属菌由来の酵素、バチルス属菌由来の酵素、及びリゾプス属菌由来の酵素からなる群から選ばれた１種又は２種以上の酵素を含むものである請求項６又は７記載の組成物。
  9. 　ミクログリアの貪食活性及び／又は抗炎症活性を増強するための組成物であって、配列番号１、６、９、１２、１３、１４、１７のいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド、又はこれらの薬学上許容される塩もしくは溶媒和物を含有することを特徴とする組成物。
  10. 　前記ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１、６、９、１２、１３、１４、１７のいずれか一つのアミノ酸配列である請求項９記載の組成物。
     
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