KR101710009B1 - 어육 유래의 펩타이드를 포함하는 항알츠하이머 활성의 약학 조성물 및 건강기능식품 - Google Patents

어육 유래의 펩타이드를 포함하는 항알츠하이머 활성의 약학 조성물 및 건강기능식품 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 어육을 이루는 단백질의 가수분해산물 및 그 일부분인 올리고펩타이드(oligo-peptide)를 유효 성분으로 함유하는 항알츠하이머 약학 조성물 및 건강기능식품을 개시한다. 본 발명에 따른 펩타이드는 알츠하이머 질환을 야기하는 베타-세크레타아제의 활성을 억제하는데, 작게는 디-펩타이드로 구성되어 있기 때문에, 경구 투여 시에도 생체내의 가수분해효소에 의한 분해가 일어나지 않을 뿐만 아니라 생체 내에서의 쉽게 흡수, 소화되기 때문에 생리적 활성 효과가 양호할 것으로 기대된다. 특히, 생체에서 유래한 성분이기 때문에 부작용의 우려가 없어 안전성도 양호할 수 있다.

Description

어육 유래의 펩타이드를 포함하는 항알츠하이머 활성의 약학 조성물 및 건강기능식품{Pharmaceutical Composition and Functional Food Having Anti-Alzheimer Activity Containing Peptides from Fish Meat}
본 발명은 어육 유래의 펩타이드를 포함하는 항알츠하이머 활성의 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
삼면이 바다로 둘러싸인 대한민국의 경우, 바다에서 서식하고 있는 생물들에 함유되어 있는 물질을 활용하여 의약품, 건강기능식품 또는 화장품과 같은 기능성 제품의 활성 성분으로의 가능성에 대하여 연구와 개발을 집중할 필요성이 있다. 특히, 종래의 화학합성법에 따른 새로운 의약품 개발의 지연이나 이들 의약품이 지닌 부작용을 고려해 볼 때, 바다에 널리 서식하고 있는 해양 생물에 포함되어 있는 각종 생리 활성 성분을 활용하여 새로운 항생물질은 물론이고 항암제, 당뇨병 치료제와 같은 난치병의 치료 및 예방을 위한 유효성분으로의 가능성에 대해서 현재보다 훨씬 많은 연구와 개발이 수행되어야 한다.
최근에는 해양 생물에서 유래된 단백질 가수분해산물을 이용하여, 다양한 산업분야에 응용하고자 하는 연구도 많이 이루어지고 있다. 특히, 해양 생물에서 유래한 단백질 가수분해산물의 경우, 항산화성, 항고혈압성, 항암성 및 항염증 등 다양한 약리학적 효과가 있다는 연구 결과가 보고되고 있어서 이러한 가수분해산물은 유용한 생리활성물질 자원으로서의 가치가 새롭게 부각되고 있다.
본 발명자들은 본 발명에 앞서 어류 껍질 유래된 단백질 가수분해 산물을 이용한 항알츠하이머 활성을 밝힌 바 있다[특허문헌 1].
하지만 해양성 어류의 근육을 이용한 항알츠하이머성 소재에 관한 내용은 전무한 실정이며, 본 발명에서 처음 시도하였다.
대한민국 등록특허 제1297339호
이에, 본 발명자들은 해양성 어류의 근육으로부터 항알츠하이머성 소재에 관한 연구가 전무한 실정이므로, 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 어육에 함유되어 있는 단백질 유래의 펩타이드를 분리 정제하고, 상기 펩타이드의 항알츠하이머 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 어육 유래의 단백질을 가수분해하여 얻어지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항알츠하이머 활성의 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은 어류의 근육 유래의 단백질을 가수분해하여 얻어지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 5의 펩타이드 중에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에서는 고등어 또는 가자미의 근육 유래 단백질의 가수분해 산물인 펩타이드 성분이 대표적인 퇴행성 뇌질환인 알츠하이머 질환과 밀접하게 관련된 베타-세크레타아제의 활성을 크게 억제할 수 있다는 것을 확인하였다. 이에 따라, 어육으로부터 추출된 베타-세크레타아제의 활성을 억제하는 활성 성분인 펩타이드를 유효성분으로 사용하는 경우, 해당 활성 물질의 순도에 따라 약리학적 조성물과 같은 의약품은 물론이고, 건강 보조식품 등으로 활용할 수 있어서, 건강 기능성 식품을 포함한 식품 산업 및 의약 산업에 응용될 경우 그 가치가 매우 높을 것으로 기대된다.
특히, 본 발명에 따라 생리적 활성이 확인된 펩타이드는 구성 아미노산이 10개 안팎의 올리고펩타이드 또는 그 보다 적은 디펩타이드/ 테트라펩타이드/펜타펩타이드와 같은 저분자 펩타이드로서, 경구 투여 시에 체내 가수분해 효소에 의하여 분해되지 않고, 안전성이 뛰어나며 체내 흡수율이나 소화율이 높을 것이기 때문에 의약품이나 건강기능식품 중의 유효성분으로 응용이 용이할 것으로 예측된다.
도 1은 고등어 육 가수분해물로부터 베타-시크리타아제 저해 펩타이드 분리 정제 과정을 나타낸 것이다[(I) 세파덱스 G-25 컬럼 크로마토그래피를 이용한 분리정제, (II, III, IV) HPLC를 이용한 분리정제].
도 2는 가자미 육 가수분해물로부터 베타-시크리타아제 저해 펩타이드 분리 정제 과정을 나타낸 것이다[(I) 세파덱스 G-25 컬럼 크로마토그래피를 이용한 분리정제, (II, III, IV) HPLC를 이용한 분리정제].
도 3은 고등어 육 유래의 가수분해산물 분획 성분을 대상으로 MS/MS 분석 결과를 도시한 그래프이다.
도 4는 가자미 육 유래의 가수분해산물 분획 성분을 대상으로 MS/MS 분석 결과를 도시한 그래프 이다.
본 발명자들은 어육에서 유래된 펩타이드, 아미노산이 대략 10개인 올리고펩타이드, 특히 바람직하게는 2개 내지 6개 정도의 아미노산으로 구성되는 디펩타이드, 트리펩타이드, 테트라펩타이드, 펜타펩타이드, 헥사펩타이드 성분이 알츠하이머 질환과 밀접한 관련이 있는 베타-세크레타아제 활성을 억제한다는 점을 규명한 것에 있다.
파킨슨병, 알츠하이머 질환, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 등과 같은 퇴행성 뇌질환은 현대 의학에서도 해결하고 있지 못하는 난치병들이다. 그 중에서도 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease)은 노인성 치매(senile dementia)의 주요 원인으로서, 주로 65세 이상의 노인들에게 발병하지만, 드물게는 그보다 훨씬 이른 연령에서도 조발성 알츠하이머 질환(early-onset Alzheimer) 역시 보고되고 있다.
알츠하이머 질환을 앓고 있는 환자는, 초기에는 단기간의 기억 상실에서부터 감정의 기복, 언어 능력의 상실 및 장기간 기억 손상을 거쳐 최종적으로는 사망에 이르게 된다. 현재까지 알츠하이머 질환을 치료하기 위한 효율적인 방법은 알려져 있지 않으며, 운동이나 균형 있는 식습관 등을 통하여 알츠하이머 질환을 어느 정도 예방할 수 있는 정도이다. 특히, 급속한 노령화가 진행되고 있는 국내의 추세를 고려해 볼 때, 노인성 치매의 주원인인
알츠하이머 질환을 비롯한 퇴행성 뇌질환을 효율적으로 예방, 치료할 수 있는 제제를 신속하게 개발할 필요성이 제기된다.
알츠하이머 질환의 원인과 관련해서는 크게 ⅰ) 신경전달물질인 아세틸콜린(acetylcholine)의 합성이 저하되기 때에 야기된다는 가설(아세틸콜린 가설, cholinergic hypothesis), ⅱ) 뇌에서 아밀로이드 펩타이드가 축적되는 것이 원이이라는 가설(아밀로이드 가설, amyloid hypothesis), ⅲ) 과도하게 인산화된 타우 단백질(tauprotein)의 이상으로 알츠하이머 질환이 개시된다는 가설(tau hypothesis)이 제기되고 있고, 그 중에서도 아밀로이드 가설이 폭넓게 지지를 받고 있다.
아밀로이드 가설에 따르면, 알츠하이머 질환의 가장 중요한 원인으로서 40~42개의 아미노산으로 구성되는 베타-아밀로이드(amyloid β peptide, Aβ)가 뇌세포에 축적되고 이로 인하여 신경 세포를 구성하는 뉴런의 산화적 손상이 야기되어 최종적으로 치매에 이르는 것으로 여겨지고 있다. 베타-아밀로이드는 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP)의 단백질 분해에 의하여 생성된다. 아밀로이드 전구체 단백질의 분해와 관련해서 3개의 단백질 분해효소(proteolytic enzyme), 즉 알파-세크레타아제(α-secretase), 베타-세크레타아제(β-secretase) 및 감마-세크레타아제(γ-세크레타아제)가 관여한다.
이를 보다 구체적으로 설명하면, 아밀로이드 전구체 단백질(APP)은 단일한 막관통 단백질(trans-membrane protein)로서, 590~680개의 아미노산으로 이루어진 세포외 아미노말단 도메인(extracellular N-terminal-domain)과 세포내 신호 전달 서열(intracellular signal transduction sequence)을 포함하는 약 55개의 아미노산으로 구성된 세포질 테일(cytoplasmic tail)로 구성된다. 이와 같은 아밀로이드 전구체 단백질 유전자의 전사RNA(mRNA)는 선택적 스플라이싱(alternative splicing)을 통하여 8개의 동소체(isoform)를 형성하며, 그 중에서 3개의 동소체가 뇌에 주로 존재한다.
아밀로이드 전구체 단백질(APP)은 크게 2개의 경로를 거쳐 단백질 분해 프로세싱(processing)을 거친다. 우선 알파-세크레타아제는 아밀로이드 전구체 단백질의 베타-아밀로이드 도메인의 17번째 아미노산을 절단하여 상대적으로 큰 수용성 N-말단 단편(APPsα)과 대략 10 KDa의 비-아밀로이드형 C-말단 단편(C83)을 형성하고, 이들 단편이 감마-세크레타아제에 의하여 추가적으로 분해되어 비-아밀로이드형 펩타이드(P3)를 생성한다. 또 하나의 선택적 경로로서, 베타-세크레타아제는 아밀로이드 전구체 단백질의 베타-아밀로이드 도메인 내에서 이 전구체 단백질을 절단하여, 대략 100-KDa의 짧은 수용성 N-말단 단편(APPsβ)과 아밀로이드 생성형의 대략 12-KDa의 C-말단 단편(C99)을 생성하고, 감마-세크레타아제에 의하여 C99 단편을 추가로 절단함으로써 베타-아밀로이드가 생성되는데, 감마-세크레타아제에 의하여 절단되는 부위에 따라 40개의 아미노산으로 구성되는 베타-아밀로이드(Aβ40)와 42개의 아미노산으로 구성되는 베타-아밀로이드(Aβ42)가 생성된다.
따라서 대표적인 퇴행성 뇌질환인 알츠하이머 질환을 야기하는 것으로 알려진 베타-아밀로이드(Aβ)의 뇌세포 내에서의 축적을 방지하기 위해서는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)이 아밀로이드 생성형의 C-단편(C99)로 절단되도록 유도하는 베타-세크레타아제의 활성을 억제할 필요가 있다.
베타-세크레타아제는 또한 BACE1(β-site APP-cleaving enzyme 1) 또는 메맙신 2(memapsin 2)로도 불린다. 현재까지의 일부 연구에 따르면, 막관통 아스파르트산 단백질 분해효소인 BACE1의 과-발현에 의하여 베타-세크레타아제의 활성이 증가하며, BACE1의 과-발현에 의하여 APP가 베타-세크레타아제의 절단 부위에서 정확하게 절단되며, BACE antisense 올리고뉴클레오티드에 의하여 베타-세크레타아제의 활성이 억제되며, 정제된 BACE가 APP를 정확하게 절단하여 베타-세크레타아제의 특성을 보인다는 연구(Robert Vassar et al., β-Secretase Cleavage of Alzheimer's Amyloid Precursor Protein by the Transmembrane Aspartic Protease BACE, Science, 286, 735-741 (1999))와 막-결합 단백질인 아스파르트산 단백질 분해효소 역시 베타-세크레타아제가 베타-아밀로이드의 생성을 억제하기 위한 표적 물질이라는 연구(Riqiang Yan et al, Membrane-anchored aspartyl protease with Alzheimer's disease β-secretase activity, Nature, 402, 533-537 (1999))가 보고되고 있다.
특히, 베타-세크레타아제는 베타-아밀로이드 생성을 개시하는 효소로서 베타-세크레타아제의 활성을 억제함으로써 베타-아밀로이드의 감소는 물론이고 그 이후의 해로운 모든 단계를 또한 방지할 수 있다는 점, 베타-세크레타아제를 코딩하는 유전자를 변형시키더라도 심각한 문제가 없으므로 임상적으로도 안전하다는 점에서 알츠하이머 질환의 치료를 위한 표적으로서 많은 이점을 가지고 있다. 베타-세크레타아제의 억제제와 관련해서 펩티드결합을 가지는 히드록시에틸렌 계열의 물질나 N-말단을 페닐아세틸기로 치환한 화합물이 알려져 있으나, 치료적 활성을 갖는 효소 억제제는 700 Da 미만의 크기를 가져야만 체내의 대사과정에서 안정적으로 효과를 발휘할 수 있기 때문에 지속적인 연구가 필요하다. 아울러, 생체 유래의 물질로서 키토산 유도체라든가, 카테킨(catechins), 식물 유래의 페놀 화합물 등이 베타-세크레타아제의 억제제로서 보고되었지만, 아직까지 임상적 가능성까지는 이르지 못하고 있는 실정이다.
이에, 본 발명에서는 어육에 다량으로 함유된 단백질 및 콜라겐을 효율적으로 이용하기 위하여 효소 가수분해를 통한 단백질 가수분해물을 제조하였으며, 그 가수분해물로부터 항알츠하이머 활성의 펩타이드를 분리 정제하여 아미노산 서열을 확인하고, 이들 분리 정제된 펩타이드를 디-펩타이드 내지 헥사-펩타이드와 같은 저분자량의 펩타이드로 합성한 상태에서 항알츠하이머 활성의 지표라고 할 수 있는 베타-세크레타아제 저해 정도를 확인하였다.
본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다. 본 발명에 따라 사용된 어육은 고등어 또는 가자미의 근육이다.
우선, 고등어 또는 가자미의 근육을 각각 마쇄한 뒤에 어육에 다량 함유되어 있는 단백질을 가수분해하기 위해서 다양한 단백질 분해효소(proteolytic enzyme)를 사용하는 방법으로 펩타이드 상태의 가수분해 산물을 얻었다. 일반적으로 생물의 체성분 중에서 단백질만을 분리하는 방법으로 황산암모늄을 이용한 단백질 침전법이 알려져 있으나, 이 경우에 단백질 침지 반응 시간 및 탈염을 위한 추가적인 과정이 추가되어 비효율적일 수 있다. 이에 따라, 본 발명에서는 어육으로부터 활성 물질을 추출하는 방법으로 효소적 가수분해방법을 이용하였다.
본 발명의 실시예에 따라 사용되는 단백질 분해효소로는 알카라제(Alcalase), α-키모트립신(α-Chymotrypsin)과 같은 키모트립신, 뉴트라제(Neutrase), 파파인(papain), 펩신(pepsin), 트립신(trypsin)을 사용하였으나, 그 외의 다른 단백질 가수분해효소, 예를 들어, 프로타막스(Protomax), 플라보자임(flavourzyme)과 같이 다른 저렴한 단백질 가수분해효소가 사용될 수 있음은 물론이다.
이때, 사용되는 단백질 가수분해의 활성을 위해서 각 효소의 최대 활성 pH, 활성 온도 등을 조절할 필요가 있는데, 각각의 단백질 분해효소의 체내에서의 최적 반응 조건과 동일한 조건을 적용할 수 있다. 이러한 가수분해효소에 대한 최대 활성 pH 등의 조건은 잘 알려져 있으므로 상세한 설명은 생략한다.
이어서, 어육 유래의 단백질 가수분해 산물을 대상으로 알츠하이머 질환의 주요한 원인인 베타-아밀로이드의 합성을 개시하는 베타-세크레타아제 활성 억제 정도를 분석하였다. 전술한 것처럼, 알츠하이머 질환의 원인과 관련해서 가장 폭넓게 지지되고 있는 '아밀로이드 가설'에 따르면 아밀로이드 전구체 단백질(Amyloid precursor protein, APP)이 베타-세크레타아제에 의하여 특정 위치에서 절단된 뒤, 감마-세크레타아제에 의하여 다른 위치에서 절단되어 생성된 베타-아밀로이드가 뇌세포 또는 신경세포 등에 축적됨으로써 알츠하이머 질환이 야기된다. 이에, 본 발명에서는 어육의 체성분 중의 단백질에 대한 각각의 효소를 사용한 가수분해 산물이 알츠하이머 질환의 치료, 예방 등의 효과를 알아보기 위해서 각각의 단백질 분해효소에 의한 가수분해 산물이 베타-세크레타아제의 활성을 억제하는 정도를 우선 분석하였다. 베타-세크레타아제 활성 억제와 관련해서, 고등어 육 유래의 단백질 가수분해 산물 중에서는 트립신에 의한 가수분해 산물이, 가자미 육 유래의 단백질 가수분해 산물 중에는 뉴트라제에 의한 가수분해 산물이 각각 양호하였다.
계속해서, 본 발명자들은 항알츠하이머 활성을 보이는 펩타이드 성분을 얻기 위하여 베타-세크레타아제 활성이 양호한 효소적 가수분해 산물을 분리, 정제하여 베타-세크레타아제 활성 억제가 양호한 펩타이드 성분과 그 아미노산 서열을 확인하였다. 구체적으로, 본 발명의 실시예에서는 어육 유래의 조추출물인 단백질 가수분해 산물을 분리하기 위한 방법으로서 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 1차 분획 성분을 분리하고, 그 중에서 베타-세크레타아제 억제 활성이 양호한 1차 분획 성분을 대상으로 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 2차 분획 성분을 분리 정제할 수 있다. 마지막으로 MS/MS 분석을 통하여 베타-세크레타아제 활성 억제 효과를 갖는 펩타이드의 아미노산 서열 및 분자량을 확인하였다. 물론, 펩타이드 형태의 조추출물을 분리, 정제할 수 있는 임의의 다른 방법을 사용할 수 있음은 물론이다.
이어서, 본 발명자들은 MS/MS 기기를 사용하여 최종적으로 항알츠하이머 활성을 갖는 분획분에 포함되어 있는 아미노산 서열을 분석하였다. 고등어 육 유래의 펩타이드는 MEQL(Met-Glu-Gln-Leu, 서열번호 1), 가자미 육 유래의 펩타이드는 LTQDW(Leu-Thr-Gln-Asp-Trp, 서열번호 3)로 2종의 정제된 펩타이드의 C-말단에는 류신이 공통적으로 결합되어 있었다.
이어서 본 발명자들은 전술한 서열번호 1및 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드가 생체 내에서의 가수분해에 의한 분해를 방지하고 흡수율 및 안전성을 향상시키기 위해서 해당 서열의 아미노산 중 일부만으로 구성되는 펩타이드를 합성하였다.
구체적으로, 고등어 육 유래의 펩타이드(서열번호 1)와 관련해서는 ME(Met-Glu, 서열번호 4), QL (Gln-Leu, 서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 합성하였다. 가자미 육 유래의 펩타이드(서열번호 3)와 관련해서는 LTQ (Leu-Thr-Gln, 서열번호 6), LT(Leu-Thr, 서열번호 5), QDW(Gln-Asp-Trp, 서열번호 7), DW(Asp-Trp, 서열번호 8)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 합성하였다.
서열번호 1에서 서열번호 8까지의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 사용하여 베타-세크레타아제 억제 활성을 측정한 결과, 특히 서열번호 1내지 5의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드의 활성이 양호하였다.
이러한 결과에 비추어 볼 때, 본 발명에 따라 어육에서 유래한 전술한 펩타이드는 항알츠하이머 활성을 가지기 때문에, 약품이나 건강기능식품 중의 유효 성분으로 활용될 수 있다.
따라서 본 발명은 전술한 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 펩타이드의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 본 발명과 관련한 알츠하이머 질환의 예방 및/또는 치료용 조성물은 어육 유래의 전술한 펩타이드를 유효성분으로 단독으로 포함할 수 있고, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 추가성분 즉, 약제학적으로 허용되거나 영양학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 어육 유래의 펩타이드를 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 어육 유래의 펩타이드는 임상 투여 시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제와 같은 희석제 또는 부형제 등을 더욱 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구 모두 사용할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 약리적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용 가능하다. 상기 유효성분인 펩타이드에는 상기 성분들이 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 펩타이드에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 및 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여시 피하주사, 정맥 주사 또는 근육내 주사를 통할 수 있다.
또한, 본 발명의 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 구체적인 제형의 예로는 경고제, 과립제, 로션제, 리니멘트제, 리모나데제, 산제, 시럽제, 안연고제, 액제, 에어로솔제, 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제, 연고제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 전제, 침제, 점안제, 정제, 좌제, 주사제, 주정제, 캅셀제, 크림제, 환제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등이 있다.
더 나아가 본 발명의 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 당해 기술분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.
아울러, 본 발명에 따른 알츠하이머 질환 예방 또는 치료용 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다.
상기 알츠하이머 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 본 발명에 따른 어육 유래의 펩타이드를 0.001 ~ 10.0 ㎎/㎖의 농도로 포함할 수 있다. 하지만, 본 발명의 알츠하이머 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 알츠하이머 질환 예방 또는 치료용 조성물 및 항균 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용될 수 있다. 상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하며, 소화나 배설 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하고, 바람직하게는 척추동물, 더욱 바람직하게는 포유류일 수 있다. 구체적으로는 상기 포유류는 인간, 돼지, 소 또는 염소 등일 수 있다.
본 발명에 따른 어육 유래의 펩타이드는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 펩타이드를 포함하는 알츠하이머 질환 예방 또는 치료용 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질환의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 어육 유래의 펩타이드는 0.001 ~ 10.0 ㎎/㎖, 바람직하게는 0.005 ~ 5.0 ㎎/㎖, 더욱 바람직하게는 0.01 ~ 5.0 ㎎/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따라 베타-세크레타아제 활성을 억제하는 어육 유래의 펩타이드는, 이 펩타이드 성분을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품과 같은 식품 조성물에 활용될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물의 예로는 식품, 식품첨가제, 음료 또는 음료첨가제를 들 수 있다. 본 명세서에서 식품이란 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 의도이며, 바람직하게는 껌 또는 캔디일 수 있다.
따라서 본 발명은 전술한 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드를 첨가할 수 있는 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 캔디, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있으며 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 구체적으로, 본 발명의 펩타이드가 활용될 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸컬릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육 가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등), 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 명세서에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 바람직하게 는 본 발명의 기능성 식품은 구강질환의 예방 또는 개선에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현할 수 있는 식품을 의미한다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함하는 의도이다. 본 발명에서 기능성 음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.
본 발명에 따른 어육 유래의 펩타이드를 식품 첨가물로 사용할 경우, 이 펩타이드를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 그 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
또한, 알츠하이머 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 펩타이드의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다. 본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 펩타이드를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물과 같은 식품 보조 첨가제 성분을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등과 같은 디사카라이드; 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드 등과 같은 통상적인 당은 물론이고, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제 또는 감미제로서 타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진)과 같은 천연 향미제/감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 향미제/감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 10g이다. 상기 천연탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02~0.03 g 이다.
상기 외에 본 발명의 펩타이드는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그밖에 본 발명에 따른 식품공학적 조성물 중에는 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 펩타이드 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부, 바람직하게는 0.01 ~ 1.0 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 어육 유래의 효소적 단백질 가수분해물 제조
어류의 단백질 및 콜라겐을 이용하기 위하여 단백질 가수분해 효소를 이용하여 가수분해를 실시한 후, 가수분해도를 측정하였다. 단백질 가수분해 효소는 Alcalase, α-chymotrypsin, Neutrase, papain, pepsin 및 trypsin을 사용하였다. 어류의 근육 1.0g를 100ml의 buffer에 넣고 pH와 온도를 각 효소의 최적 조건에 맞추어 1시간 반응시킨 후 효소 대 기질을 1:100 비율로 효소를 넣어준 후 12시간 반응시켰다. 가수분해 효소별 조건은 하기 표 1에 나타내었다. 12시간 반응 후, 원심분리하여 상등액을 수거하고, 수거된 상등액은 동결건조하여 β-secretase 활성 측정에 사용하였다.
각 가수분해물의 가수분해도를 측정한 결과, 고등어 및 가자미 가수분해물에서 각각 trypsin 가수분해물 및 Neutrase 가수분해물의 가수분해도가 높게 나타났다(표 2).
효소적 단백질 가수분해 조건
Enzyme Buffer pH Temperature (?)
Alcalase 50mM sodium phosphate 7.0 50
α-chymotrypsin 50mM sodium phosphate 8.0 37
Neutrase 50mM sodium phosphate 8.0 50
Papain 50mM sodium phosphate 6.0 37
Pepsin 20mM glycine-HCl 2.0 37
Trypsin 50mM sodium phosphate 8.0 37
어육 단백질 가수분해물의 가수분해도
　
　		 가수분해도 (%)
고등어 가자미
Alcalase 36.91 41.71
α-chymotrypsin 40.15 44.52
Neutrase 38.22 46.76
Papain 37.65 43.31
Pepsin 35.34 39.64
Trypsin 45.97 42.44
실시예 2: 어육 가수분해물의 β- secretase 저해활성
β-secretase inhibitory activity assay를 이용하여 각 가수분해물 중 β-secretase 저해 활성이 높은 펩타이드가 다량 함유되어 있는 효소 가수분해물을 선정하였다. β-secretase inhibitory activity은 β-secretase assay kit에서 제시한 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 70 ㎕ buffer (50mM sodium acetate, pH 4.5), 10 ㎕ β-secretase (1.0 Unit/ml), 10 ㎕ substrate (10mM MCA-[ASN670, LEU671]-AMYLOID BETA/A4 PRECURSOR PROTEIN 77, 50mM sodium acetate buffer, pH 4.5)를 10 ㎕의 시료액과 혼합 후 25 ℃에서 60분간 암 조건에서 반응시켰다. 형광 reader(Bio-Rad)는 excitation 360 nm로 하고, emission 405 nm로 하여 측정하였다. 저해율은 하기 수학식 1과 같다.
[수학식 1]
Inhibition (%) = [1-{(S-S0)/(C-C0)}]×100
C:　시료액을 첨가하지 않은 실험군(Enzyme + buffer + substrate)의 반응 시작 60분 후의 형광도값
C0: 시료액을 첨가하지 않은 실험군(Enzyme+buffer+substrate)의 반응 직전(zero time)의 형광도값
S: 시료액을 첨가하는 실험군(Enzyme + sample + substrate)의 반응 시작 60분 후의 형광도값
S0: 시료액을 첨가하는 실험군(Enzyme+sample+substrate)의 반응 직전(zero time)의 형광도값
고등어 및 가자미 유래의 각 가수분해물의 β-secretase 저해활성은 IC50 값으로 측정하여 하기 표 3에 나타내었다. 고등어 가수분해물 중에서 β-secretase 저해활성은 trypsin 가수분해물의 IC50 값이 1.06 mg/ml로 다른 가수분해물에 비해 높게 나타났다. 한편, 가자미 가수분해물 중에서 β-secretase 저해활성은 Alcalase 가수분해물의 IC50 값이 1.79 mg/ml로 다른 가수분해물에 비해 높게 나타났다.
어육 단백질 가수분해물의 베타-시크리타아제 억제 활성
　
　		 IC50 value, mg/ml
고등어 가자미
Alcalase 2.46 1.79
α-chymotrypsin 2.01 2.51
Neutrase 1.88 2.36
Papain 2.51 2.72
Pepsin 3.02 2.88
Trypsin 1.06 2.29
실험예 3: 고등어 가수분해물 유래의 β- secretase 저해 펩타이드의 분리 정제
고등어 가수분해물 중에서 β-secretase 저해활성이 가장 우수한 trypsin 가수분해물로부터 β-secretase 저해 펩타이드를 분리정제하였다. Trypsin으로 분해된 고등어 가수분해물을 100 mg/ml 농도로 탈이온수에 녹인 후 Sephadex G-25를 충진시킨 컬럼(2.5 × 75 cm)에 주입하였다. 분리용매는 탈이온수를 이용하여 1.5 ml/min 유속으로 분리하였으며, 흡광도 215 nm에서 결과를 측정하여 각 획분으로 분리하였다. 분리 결과, 3개의 획분(A,B,C)을 얻었으며, 3개의 분획물 중에서 β-secretase 저해 활성은 획분 A가 IC50 값이 0.28 mg/ml으로 가장 높게 나타났다. β-secretase 저해 활성이 가장 높은 획분 A는 ODS 컬럼(5 ㎛, 10 × 250 mm, YMC, lnc. Japan)를 사용하여 Agilent 1000 HPLC에서 분리 정제하였다, 분리 용매는 acetonitrile(0.1% trichloroacetic acid)를 50분간 0%에서 50%로 농도 구배를 하여 2.0 ml/min의 유속으로 분리하였다. 분리 결과는 흡광도 215 nm에서 측정하여 그래프로 나타냈다. 분리 결과는 8개의 획분(A~H)으로 분리되었다. 각 획분의 β-secretase 저해활성은 획분 A의 IC50 값이 0.53 mg/ml로 가장 높게 나타났다. β-secretase 저해활성이 가장 높은 획분 A는 다시 HPLC에서 분석용 컬럼(particle size 5 ㎛; 4.6×250 mm)를 사용하여 유속 0.5 ml/min의 조건으로 분리하였다. 분리 결과는 흡광도 215 nm에서 측정하여 그래프로 나타냈었다. 재 분리 정제 결과, A-1 획분의 단일 펩타이드로 분리되었다[도 1].
실시예 4: 가자미 가수분해물 유래의 β- secretase 저해 펩타이드의 분리 정제
가자미 가수분해물 중에서 β-secretase 저해 활성이 가장 우수한 Alcalase 가수분해물로부터 β-secretase 저해 펩타이드를 분리 정제하였다. Alcalase로 분해된 가자미 가수분해물을 100 mg/ml 농도로 탈이온수에 녹인 후 Sephadex G-25를 충진시킨 컬럼(2.5 × 75 cm)에 주입하였다. 분리 용매는 탈이온수를 이용하여 1.5ml/min 유속으로 분리하였으며, 흡광도 215 nm에서 결과를 측정하여 각 획분으로 분리하였다. 분리 결과, 6개의 획분(A~F)을 얻었으며, 6개의 분획물 중에서 β-secretase 저해 활성은 획분 E가 IC50 값이 0.33 mg/ml으로 가장 높게 나타났다. β-secretase 저해 활성이 가장 높은 획분 A는 ODS 컬럼(5 ㎛, 10 × 250 mm, YMC, lnc. Japan)를 사용하여 Agilent 1000 HPLC에서 분리 정제하였다, 분리 용매는 acetonitrile(0.1% trichloroacetic acid)를 40분간 0%에서 100%로 농도 구배를 하여 2.0 ml/min의 유속으로 분리하였다. 분리 결과는 흡광도 215 nm에서 측정하여 그래프로 나타냈다. 분리 결과는 3개의 획분(F1~F3)으로 분리되었다. 각 획분의 β-secretase 저해활성은 획분 F1의 IC50 값이 98.1 ㎍/ml로 가장 높게 나타났다. β-secretase 저해 활성이 가장 높은 획분 F1는 다시 HPLC에서 분석용 컬럼(particle size 5 ㎛; 4.6×250 mm)를 사용하여 유속 0.5 ml/min의 조건으로 분리하였다. 분리결과는 흡광도 215 nm에서 측정하여 그래프로 나타냈었다. 재 분리정제 결과, F-1 획분의 단일 펩타이드로 분리되었다[도 2].
실시예 5: β- secretase 저해 펩타이드의 분자량 및 아미노산 서열
아미노산 서열 분석은 순차적으로 nano Ultra Performance Liquid Chromatography(nanoUPLC, Waters Corporation, Milford, MA)와 연결된 nano-전자분부(ESI) 사극 자(quadrupole) 이온 비행 시간차 분석기(TOF) 질량분석기(Q-TOF Premier, Waters Corporation, Manchester, UK)에 의하여 분석이 이루어졌다. 모든 분석은 양이온 모드로 분석하였다. 이때 scan은 0.6초 간격으로, MS spectra는 m/z 100에서 m/z 1,600의 범위에서 분석하였다. 이때, 초당 이온 검출 강도 20 이상인 이온 중, 가장 높은 강도를 보이는 3개를 선택하여 이온 비행 시간차 분석기를 통해 m/z 50에서 m/z 1,990 범위에서 1.2초 동안 MS/MS spectra를 받았다. 데이터 수집은 초당 이온 검출 강도 20 이상인 이온을 선택하여 분석하였다. 분석한 결과(도 3, 도 4), 고등어 가수분해물로부터 분리된 활성 펩타이디는 Met-Glu-Gln-Leu (525 Da)의 4개의 아미노산 잔기를 가지고 있으며, β-secretase 저해 활성 펩타이드의 IC50값은 161.05 μM이였다. 가자미 가수분해물로부터 분리된 활성 펩타이드는 Leu-Thr-Gln-Asp-Trp (662.7 Da)의 5개의 아미노산 잔기를 가지고 있으며, β-secretase 저해 활성 펩타이드의 IC50 값은 126.93 μM이였다.
어류 2종의 단백질 가수분해물로부터 분리 정제된 항알츠하이머성 펩타이드는 상기에서와 같이 펩타이드의 N-, 및 C-말단 아미노산 서열이 류신으로 구성되어 있는 공통적인 특징을 확인할 수 있었다(표 4).
어육 단백질 가수분해 펩타이드의 베타-시크리타아제 억제 활성
구분 아미노산 서열 분자량 (Da) IC50 값(μM)
고등어 Met-Glu-Gln-Leu 525 161.05
가자미 Leu-Thr-Gln-Asp-Trp 662.7 126.93
실시예 6: 항알츠하이머성 펩타이드의 아미노산 합성 및 항알츠하이머 활성
어류 유래의 항알츠하이머성 펩타이드의 합성은 2종의 정제된 펩타이드의 아미노산 서열을 기반을 합성을 실시하였다. 항알츠하이머 활성을 펩타이드의 아미노산 서열을 토대로 N-말단 및 C-말단의 아미노산 서열을 조합하여 di-, tri- 및 tetra-펩타이드로 새로운 펩타이드를 디자인하였다. 3종의 정제된 펩타이드와 그와 유사한 구조를 가지는 펩타이드의 합성은 펩타이드 자동합성기를 이용하여 SPPS(Solid Phase Peptide Synthesis) 기법으로 합성하였다.
펩타이드 합성의 방법은 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)를 아미노산의 N-아미노 그룹의 보호기(protecting group)로 사용하는 고상법 (solid phase method)을 적용한 펩타이드 자동합성기(PeptrEx)에서 합성하였다. 구체적으로, 카르복실 말단이 -NH2 형태인 펩타이드는 Rink Amide MBHA Resin을 최초 물질로 사용하였으며, 카르복실 말단이 -OH 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산-Wang Resin을 최초 물질로 사용하였다. Fmoc-아미노산의 커플링(coupling)에 의한 펩타이드 사슬의 연장(elongation)은 Nhydroxybenzo-triazole(HOBt)-dicyclo-hexylcar-bodiimide(DCC)법에 의하였다. 각 펩타이드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산을 커플링시킨 후, 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈(NMP) 용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 디클로로메탄(DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 말렸다. 여기에 TFA(trifluoroacetic acid)-phenolthioanisole-H2O-triisop-ropylsilane(85: 5: 5: 2.5: 2.5, v/v) 용액을 가하고 3시간 동안 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 다음, 디에틸에테르로 펩타이드를 침전시켰다. 침전된 펩타이드는 0.1% TFA가 포함된 acetonitrile 농도 구배로 하여 reverse phase-HPLC에서 C18 컬럼(Delta Pak, C18 300Å 15 ㎛, 19.0㎜×30㎝, Waters)을 이용하여 정제하였다.
합성된 펩타이드의 아미노산 서열을 바탕으로 분자량을 계산하였고, MALDI 질량 분석법(matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometer)을 이용하여 정확한 분자량을 측정하였다.
고등어로부터 정제된 “MEQL”의 아미노산 합성 서열은 N-말단으로부터 ME를 C-말단으로부터 QL로 하였다. 가자미로부터 정제된“LTQDW”의 아미노산 합성 서열은 LTQ, LT, QDW, DW로 합성하였다(표 5).
각 합성된 펩타이드의 β-secretase 저해활성을 측정한 결과, QL, ME 및 LT의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 활성이 각각 28.45 μM, 80.54 μM 및 88.65μM으로 높은 저해활성을 나타냈다.
아미노산 서열 IC50 값 (μM)
Met-Glu-Gln-Leu(서열번호 1) 161.90
Met-Glu (서열번호 4) 80.54
Gln-Leu(서열번호 2) 28.45
Leu-Thr-Gln-Asp-Trp(서열번호 3) 131.25
Leu-Thr-Gln(서열번호 6) 101.52
Leu-Thr(서열번호 5) 88.65
Gln-Asp-Trp(서열번호 7) 222.54
Asp-Trp(서열번호 8) 180.85
<110> GANGNEUNG-WONJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION GROUP <120> Pharmaceutical Composition and Functional Food Having Anti-Alzheimer Activity Containing Peptides from Fish Meat <130> P15U12C0547 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Scomber japonicus <400> 1 Met Glu Gln Leu 1 <210> 2 <211> 2 <212> PRT <213> Scomber japonicus <400> 2 Gln Leu 1 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Verasper moseri <400> 3 Leu Thr Gln Asp Trp 1 5 <210> 4 <211> 2 <212> PRT <213> Scomber japonicus <400> 4 Met Glu 1 <210> 5 <211> 2 <212> PRT <213> Verasper moseri <400> 5 Leu Thr 1 <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Verasper moseri <400> 6 Leu Thr Gln 1 <210> 7 <211> 3 <212> PRT <213> Verasper moseri <400> 7 Gln Asp Trp 1 <210> 8 <211> 2 <212> PRT <213> Verasper moseri <400> 8 Asp Trp 1

Claims (7)

  1. 서열번호 1 내지 5의 펩타이드 중에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    베타-시크레타제(β-secretase) 억제 활성을 갖는 약학 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 유효성분은 0.001 ~ 10.0 ㎎/㎖의 농도로 포함되는 약학 조성물.
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 아미노산 N-말단 또는 C-말단에 류신(Leucine)이 결합된 약학 조성물.
  7. 서열번호 1 내지 5의 펩타이드 중에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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