KR101533308B1

KR101533308B1 - 안지오텐신-i 전환 효소 저해능을 나타내는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101533308B1
Application number: KR1020130100232A
Authority: KR
Inventors: 정세영; 최영준
Original assignee: 경희대학교 산학협력단; 경상대학교산학협력단
Priority date: 2012-08-24
Filing date: 2013-08-23
Publication date: 2015-07-03
Also published as: KR20140026295A; US20180170961A1; US10323062B2; CN104736552B; US20150175654A1; CN104736552A; US10308681B2

Abstract

본 발명은 굴 효소 가수분해물(oyster enzyme hydrate)의 분획물로부터 분리된 안지오텐신 전환 효소(angiotensin converting enzyme; ACE)에 대해 저해능을 나타내는 펩타이드 및 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 굴 효소 가수분해물의 분획물로부터 분리된 펩타이드는 ACE 활성을 유의적으로 저해하며, 효과적인 혈압 조절 효과 및 고혈압 예방 효과를 나타내므로, 상기 굴 효소 가수분해물의 분획물 또는 이로부터 분리한 펩타이드는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효 성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

안지오텐신-I 전환 효소 저해능을 나타내는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition containing Peptide with angiotensin-I Converting Enzyme inhibitory activity for preventing or treating cardiovascular disease}

본 발명은 굴 효소 가수분해물(oyster enzyme hydrate)의 분획물로부터 분리된 안지오텐신 전환 효소(angiotensin converting enzyme; ACE)에 대해 저해능을 나타내는 펩타이드 및 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

급속한 경제발전과 더불어 질병양상도 크게 변하여 동맥경화증, 고혈압, 협심증, 심근경색, 허혈성 심장질환, 심부전, 경혈관 동맥 성형술 후 발생하는 합병증, 뇌경색, 뇌출혈, 및 뇌졸중을 포함하는 심혈관계 질환이 증가하는 추세에 있다. 2010년 통계청에서 발표한 사망원인 통계에 따르면, 심혈관계 질환은 우리나라 사망원인의 2위로서, 악성 종양 다음으로 높은 순위를 차지하고 있으며, 남성은 55세 이상, 여성은 65세 이상에서 심혈관계 질환의 사망률이 크게 증가하는 것으로 보고되었다.

대표적인 심혈관계 질환인 고혈압은 성인병 비율의 15 내지 20%를 차지할 만큼 세계적인 문제로 대두되고 있으며, 비교적 증상은 없는 편이지만 고혈압 환자에게서 동맥 경화, 뇌졸중, 심근 경색 및 말기 신장병과 같은 다른 심혈관계 질환의 합병증의 위험도가 증가하는 것으로 알려져 있어 보다 적극적인 관리와 치료가 요구된다. 그러나, 고혈압은 만성 질환으로 평생 동안 치료가 필요하므로 사회적 및 경제적 손실 또한 막대하다.

고혈압의 원인은 대부분 밝혀진 바 없으나, 가족력, 인종, 염분의 섭취량, 인슐린 저항성 및 비만과 같은 유전적 인자 또는 과도한 음주 및 노화와 같은 환경적 인자의 복합적인 산물로서 발생하는 것으로 알려져 있으며, 혈압 상승의 다양한 요인 가운데 레닌-안지오텐신-알도스테론(renin-angiotensin-aldosterone) 고리가 생체 내에서 혈압 및 체액량을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Weiss, D. et. al (2001) Circulation 103: 448-454).

특히, 고혈압의 80%에 해당하는 본태성 고혈압의 원인으로 레닌-안지오텐신계(Renin-Angiotensin System, RAS)가 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있으며, 일반적인 생리활성으로 신장에서 혈류량, 나트륨 감소, 교감신경계 활성증가에 의해 레닌-안지오텐신계가 활성화되고, 신장동맥의 방사구체세포(juxtaglomerular cell)에서 분비된 레닌이 안지오텐신을 안지오텐신 Ⅰ으로 분해하며, 이는 다시 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme, ACE)에 의해 혈관 수축작용을 하는 안지오텐신 Ⅱ로 전환되어 결과적으로 안지오텐신 Ⅱ가 신경조절 및 알도스테론 합성 증가를 통하여 혈압을 조절한다. ACE는 또한 혈관이완작용을 나타내는 브래디키닌(bradykinin)을 분해하여 불활성화하는 역할을 한다.

따라서, 혈압의 상승에 큰 영향을 미치는 ACE를 저해하는 물질 또는 안지오텐신 전환효소 저해제(ACE inhibitor)는 고혈압, 심장병, 동맥경화 또는 뇌출혈 등의 심혈관계 질환 등을 치료 또는 예방할 수 있는 것으로 기대되어, 이에 대한 많은 연구가 진행되고 있어, 구체적으로 만성신장병, 동맥경화, 심장발작 및 이로 인한 사망 등을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인하기 위한 다양한 임상 연구 및 실험의 결과가 보고되고 있다.

현재 이러한 결과에 기초하여, 라미프릴(ramipril), 캐토프릴(captopril), 에날라프릴(enarapil), 리시노프릴(risinopril), 포시노프릴(fosinoril)이나 스피라프릴(spirapril) 등과 같은 화학적으로 합성된 안지오텐신 전환효소 저해제가 상업적인 고혈압 치료제로 사용되고 있다. 그러나 상기 화합물들은 약학적 투여 형태에서 쉽게 분해되므로 안정성이 떨어질 뿐만 아니라, 다른 세포에도 작용하여 전신에 힘이 빠지거나, 구토, 기침, 두통, 식욕부진 및 미각이상을 일으키는 등 부작용과 관련된 문제가 있는 것으로 보고되고 있다(Lim SD. et. al (2008) Korean J. Food Sci. Ani. Resour, 28(5): 587-595). 따라서, 안정성을 가지는 동시에, 인체에 부작용을 나타내지 않는 안전성 또한 가지는 천연 물질 유래의 ACE 저해제의 개발이 요구되고 있다.

굴은 바다의 우유라 할 만큼 몸에 좋은 건강식품으로 알려져 있으며, 날 것을 식용하지 않는 서양에서도 생굴은 널리 식용되고 있다. 영양 성분으로는 글리코겐, 타우린, 단백질 및 비타민은 물론 다양한 미네랄을 함유하고 있어 건강기능 식품의 소재로 널리 알려져 있다. 또한 심장 및 간장의 기능 강화 및, 콜레스테롤 감소에 의한 고혈압, 동맥경화 및 심장병 예방 등에 효과가 있으며, 셀레늄을 다량 함유하고 있어 중금속 해독 기능을 나타낼 뿐만 아니라, 심장, 간장, 췌장 등 장기의 기능을 높이는 강장 및 스테미너 식품으로 알려져 있다.

현재까지 알려진 천연 물질 유래의 ACE 저해제로서, 대한민국 공개특허 10-2012-0092735호에는 메생이 효소 처리 추출물을 유효성분으로 함유하는 ACE 저해용 또는 항고혈압 조성물에 대하여 개시하고 있으며, 대한민국 등록특허 제 10-1275766호에는 전복 내장 단백질 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 ACE 저해 또는 항고혈압 조성물에 대하고 개시하고 있다.

또한, 천연 물질의 효소 가수분해물로부터 ACE 저해 활성을 나타내는 펩타이드가 보고된 바 있다. 이 중 정어리 단백질 유래의 펩타이드인 발린-티로신(Valine-tyrosine)은 경중고혈압 환자에 대해 강압효과를 나타내는 것이 보고되어(Shimizu, M (1994) Melbourne Sept, 18), 현재 대한민국 제 1호의 개별 인정성 건강식품으로 인정받았으며, 대한민국 등록특허 10-1106303호에서는 효소처리를 통하여 굴로부터 제조한 펩타이드의 ACE 활성 저해능에 관하여 개시하고 있다. 그러나, 천연 물질 유래의 기능성 펩타이드의 개발에 대하여는 여전히 그 요구가 증가하고 있다.

따라서, 본 발명의 발명자들은 천연 물질의 효소 가수분해물로부터 ACE 활성 저해능을 나타내는 펩타이드를 개발하기 위해 노력한 결과, 굴 효소 가수분해물(oyster enzyme hydrate)로부터 추출, 분리 및 정제하여 ACE 활성 저해능을 나타내는 신규한 펩타이드를 수득하였고, 상기 펩타이드는 효과적인 혈압 조절 효과 및 고혈압 예방 효과를 나타내므로, 본 발명의 굴 효소 가수분해물로부터 분리한 펩타이드는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효 성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 12로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme; ACE)에 대하여 저해능을 갖는 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 굴 효소 가수분해물(oyster enzyme hydrate)의 분획물을 유효성분으로 함유하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 굴 효소 가수분해물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 심혈관계 질환 예방 또는 개선용 건강 식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 심혈관계 질환 예방 또는 개선용 건강 식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 12로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme; ACE)에 대하여 저해능을 갖는 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 굴 효소 가수분해물(oyster enzyme hydrate)의 분획물을 유효성분으로 함유하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 굴 효소 가수분해물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 심혈관계 질환 예방 또는 개선용 건강 식품을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 펩타이드 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 심혈관계 질환 예방 또는 개선용 건강 식품을 제공한다.

본 발명의 굴 효소 가수분해물(oyster enzyme hydrate)의 분획물로부터 분리된 안지오텐신 전환 효소(angiotensin converting enzyme; ACE)에 대해 저해능을 나타내는 펩타이드는 효과적인 혈압 조절 효과 및 고혈압 예방 효과를 나타내므로, 상기 굴 효소 가수분해물의 분획물 또는 이로부터 분리된 펩타이드는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효 성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 굴 효소 가수분해물을 정제하는 과정을 나타내는 도이다. A는 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography) 정제를 나타내며, B는 상기 음이온 교환 크로마토그래피의 분획 4의 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 정제를 나타내고, C는 역상 크로마토그래피(reaverse-phase chromatography) 정제를 나타내는 도이다.
도 2는 굴 효소 가수분해물로부터 분리한 펩타이드의 질량 및 아미노산 서열의 분석을 나타내는 도이다.
도 3은 굴 효소 가수분해물의 단회 투여에 의한 생체 내 혈압 조절 효과를 나타내는 도이다.
도 4은 기능성 펩타이드의 단회 투여에 의한 생체 내 혈압 조절 효과를 나타내는 도이다.
도 5은 굴 효소 가수분해물 및 기능성 펩타이드의 반복 투여에 의한 생체 내 혈압 조절 효과를 나타내는 도이다.
도 6는 굴 효소 가수분해물 및 기능성 펩타이드의 혈중 안지오텐신 전환 효소(Angiotensin converting enzyme; ACE) 농도 억제 효과를 나타내는 도이다.
도 7은 굴 효소 가수분해물 및 기능성 펩타이드의 혈중 안지오텐신-II(angiotensin-II) 농도 억제 효과를 나타내는 도이다.
도 8은 굴 효소 가수분해물 및 기능성 펩타이드의 생체 내 고혈압 예방 효과를 나타내는 도이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 12로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme; ACE)에 대하여 저해능을 갖는 펩타이드를 제공한다.

상기 펩타이드는 굴 효소 가수분해물로부터 분리된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 다른 물질로부터 유래한 것 또는 합성한 것 모두 사용할 수 있다.

상기 분리를 위한 방법으로 한외여과(ultrafiltration), 크로마토그래피(chromatography)와 같은 당업계의 통상적인 분리 방법을 사용하는 것이 바람직하며, 구체적으로는 크로마토그래피 방법을 사용하는 것이 보다 바람직하고, 더욱 구체적으로는 음이온교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography), 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 역상 크로마토그래피(reaverse-phase chromatography) 또는 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC) 방법을 사용하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 합성을 위한 방법으로 당업계의 통상적인 펩타이드의 화학적 합성 방법(W. H. Freeman and Co., Proteins; structures and molecular principles, 1983)으로 합성하는 것이 바람직하며, 구체적으로는 액상 펩타이드 합성법(Solution Phase Peptide synthesis), 고상 펩타이드 합성법(solid-phase peptide syntheses), 단편 응축법 및 F-moc 또는 T-BOC 화학법으로 합성하는 것이 보다 바람직하고, 더욱 구체적으로는 고상 펩타이드 합성법으로 합성하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 효소는 단백질 당업계의 통상적인 가수분해효소(protease)인 것이 바람직하고, 구체적으로 프로타멕스(protamex) 또는 뉴트라제(neutrase)인 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 효소의 첨가는 프로타멕스의 반응 후 불활성화한 다음 뉴트라제를 첨가하는 순차적 첨가인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 프로타멕스 및 뉴트라제를 동시에 첨가할 수 있다. 상기 효소의 첨가량은 굴 효소 가수분해물의 단백질 농도의 0.1 내지 10%인 것이 바람직하고, 효소의 불활성화는 20 내지 100℃에서 10 내지 120 분간 반응하여 불활성화하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 처리하는 효소의 종류에 의해 적절하게 조절될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 굴 효소 가수분해물을 제조하기 위하여 단백질 가수분해효소를 사용하여 굴 단백질을 가수분해하였으며, 상기 굴 효소 가수분해물로부터 ACE 활성 저해능을 가지는 기능성 펩타이드를 정제하기 위하여 크로마토그래피를 수행한 결과, ACE 활성 저해능을 나타내는 7 개의 시료를 선별하였다(도 1 및, 표 1 및 표 2 참조).

또한, 본 발명자들은 상기 시료에서 ACE 활성 저해능을 나타내는 기능성 펩타이드를 스크리닝하기 위하여 펩타이드의 질량 및 아미노산 서열을 확인한 결과, 서열번호 1 내지 12로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 선별하였으며(도 2 및 표 3 참조), 상기 펩타이드를 화학적으로 합성하여 ACE 활성 저해능 및 세포 독성을 확인한 결과, 본 발명의 펩타이드 모두가 세포에 대한 독성을 나타내지 않으면서 ACE 활성 저해능을 나타내는 것을 확인하였다(표 4 참조).

따라서, 본 발명의 펩타이드는 ACE에 대하여 세포 독성을 나타내지 않으면서 유의적인 활성 저해능을 나타내므로, ACE 활성 저해제로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 하기와 같은 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 제작할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예를 들면, Biosearch 또는 Applied iosystems사의 제품)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 상기 DNA 서열은 이에 작동가능하게 연결되어 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입하고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환한 다음, 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 회수한다. 상기 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., MolecularCloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.

본 발명의 펩타이드는 임상투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강(nasal), 흡입, 안구 및 피하와 같은 경구 이외의 투여경로를 통한 투여를 의미할 수 있다.

즉, 본 발명의 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트화제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

본 발명의 펩타이드의 유효용량은 0.01 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다.

본 발명의 펩타이드의 총 유효량은 볼루스(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 주입(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single does)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple does)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 신규한 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 12로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 포함하는 굴 효소 가수분해물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 분획물은 10 kD 이하인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 심혈관계 질환은 고혈압, 심장병, 뇌졸증, 혈전증, 협심증, 심부전, 심근경색, 죽상경화증 및 동맥경화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 생체 내에서 나타내는 혈압 조절 효과를 확인하기 위해 고혈압 쥐에 펩타이드를 단회 또는 수회 투여하여 혈압 조절 효과를 확인한 결과, 굴 효소 가수분해물 및 YA 펩타이드가 유의적인 혈압 강하효과를 나타내는 것을 확인하였으며(도 4 및 도 5 참조), 혈중 ACE 및 안지오텐신-II(angiotensin-II)의 농도가 현저하게 감소하는 것을 확인하였다(도 6 및 도 7 참조).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 생체 내에서 나타내는 고혈압 예방 효과를 확인하기 위해, 고혈압을 유발한 쥐에 본 발명의 펩타이드를 투여하고 혈압 상승 억제 효과를 확인한 결과, 쥐의 혈압 상승 효과를 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 8 참조).

따라서, 본 발명의 서열번호 1 내지 12로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 포함하는 굴 효소 가수분해물의 분획물은 효과적인 혈압 조절 효과 및 고혈압 예방 효과를 나타내므로, 상기 분획물은 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효 성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

보다 상세하게는 상기 약학 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 또한, 상기 담체, 부형제 또는 희석제는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀루로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다. 상기 성분들은 본 발명의 펩타이드에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.

더 나아가 본 발명의 약학 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 삼백초 추출물의 양을 기준으로 0.01 내지 1000 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 30 내지 500 ㎎/㎏이고, 더욱 바람직하게는 50 내지 300 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 12로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 펩타이드는 효과적인 혈압 조절 효과 및 고혈압 예방 효과를 나타내므로, 상기 펩타이드 중 어느 하나 이상는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효 성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 12로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 포함하는 굴 효소 가수분해물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 심혈관계 질환 예방 또는 개선용 건강 식품을 제공한다.

본 발명의 굴 효소 가수분해물의 분획물 또는 이로부터 분리된 펩타이드는 ACE에 대하여 유의적인 활성 저해능을 나타내며, 체내에서 효과적인 혈압 조절 효과 및 고혈압 예방 효과를 나타내므로, 상기 굴 효소 가수분해물의 분획물 및 이로부터 분리된 펩타이드는 심혈관계 질환의 예방 또는 개선용 건강 식품의 유효 성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 조제유류 또는 영유아식과 같은 특수영양식품, 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 건강보조식품, 간장, 된장, 고추장 또는 혼합장과 같은 조미식품, 소스류, 기타 가공식품, 김치 또는 장아찌와 같은 절임식품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

본 발명에서 “건강 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적 또는 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용 및 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체 방어 리듬 조절 또는 질병방지 및 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 바람직하게는 본 발명의 건강 식품은 심혈관계 질환의 예방 또는 개선에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현할 수 있는 식품을 의미한다. 상기 건강 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명의 굴 효소 가수분해물의 분획물 또는 이로부터 분리된 펩타이드는 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 분획물 또는 펩타이드의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 분획물 또는 펩타이드를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 굴 효소 가수분해물의 분획물 또는 이로부터 분리된 펩타이드는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 굴 효소 가수분해물의 분획물 또는 이로부터 분리된 펩타이드는 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 굴 효소 가수분해물의 분획물 또는 이로부터 분리된 펩타이드 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 굴 효소 가수분해물(oyster enzyme hydrate)의 제조

본 발명의 굴 효소 가수분해물을 제조하기 위하여, 효소를 이용하여 굴 단백질을 가수분해하였다.

구체적으로, 양식산 굴(통영시 소재 수하조합에서 구입) 3 ㎏을 끓는 물에서 3 분 동안 데치고, 채를 이용하여 물기를 제거한 다음, 굴 무게의 2 배에 해당하는 물을 첨가한 후 분쇄기(M-12S, 한국 후지 기계 주식회사)를 이용하여 3000 rpm에서 2 분간 마쇄(grinding)하였다. 그런 다음, 5 L 용량의 자 발효기(Jar fermenter; 한국 발효기 사, 한국)에 상기 마쇄한 굴 및 트랜스글루타미나제(Transglutaminase; TGase; 아지노모토 사, 일본)를 첨가하여 150 rpm으로 교반하면서 30℃에서 1 시간 동안 반응한 후 100℃에서 1 시간 동안 불활성화고, 바실러스(Bacillus) 유래의 단백질 가수분해효소(protase)인 프로타멕스(Protamex; 노보자임-코리아 사, 한국)를 추가로 첨가하여 40℃에서 1 시간 동안 반응해 1차 굴 효소 가수분해물을 제조하였다. 그런 다음, 상기 1차 굴 효소 가수분해물을 100℃에서 1 시간 동안 처리하여 프로타멕스를 불활성화한 뒤, 뉴트라제(Neutrase; 노보자임-코리아 사, 한국)를 첨가하여 50℃에서 1 시간 동안 반응하여 2차 굴 효소 가수분해물을 제조하고, 다시 100℃에서 1 시간 동안 처리하여 뉴트라제를 불활성화하였다. 그런 다음, 2차 굴 효소 가수분해물을 원심분리하여 상층액을 회수하였고, 4℃에서 최종 농도가 60%(v/v)가 되도록 에탄올을 첨가하여 1 시간 동안 반응하면서 에탄올 불용성 물질 및 잔여 단백질을 침전한 다음, 8000 xg에서 25 분간 원심분리하여 상층액 만을 수득하였다. 수득한 상층액은 0.45 ㎛의 막으로 여과하고, 40℃ 이하의 온도로 설정한 회전진공증발기(Rotary vacuum Evaporator; N-1 형, EYELA 사, 일본)에서 에탄올을 증발하여 굴 효소 가수분해물을 수득하였고, 동결건조 또는 분무건조하여 보관하였다.

< 실시예 2> 안지오텐신 -I 전환 효소( Angiotensin -I converting enzyme ; ACE ) 저해능을 가지는 기능성 펩타이드(peptide)의 정제

<2-1> 음이온교환 크로마토그래피( anion exchange chromatography ) 정제

굴 효소 가수분해물로부터 ACE 활성 저해능을 가지는 기능성 펩타이드를 정제하기 위하여, 음이온교환 크로마토그래피를 수행하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 제조한 굴 효소 가수분해물 0.5 g을 pH 7.5의 20 mM 트리스-염산(Tris-HCl) 완충용액 12 ㎖에 녹여 Q-세파로오즈 컬럼(Q-Sepharose column; 16×100 ㎜; GE 헬스케어 사, 한국)에 주입하여 하기 [표 1]의 조건으로 음이온교환 크로마토그래피를 수행한 후, 굴 효소 가수분해물의 분획(fraction)을 2 ㎖씩 나누어 수득하고, 검출된 펩타이드를 확인하였다.

그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 굴 효소 가수분해물로부터 분리된 펩타이드를 포함하는 분획을 수득하였다(도 1).

기능성 펩타이드 정제를 위한 크로마토그래피 조건

정제 과정 (chromatography)	사용 컬럼 (column)	용매 (solvent)	유속 (flow rate; ㎖/분)	검출 파장 (detection wavelegnth; ㎚)
음이온교환 크로마토그래피	Q-세파로오즈 컬럼 (16×100 ㎜)	A^*: 20 mM 트리스-염산 완충용액 (pH 7.5) B: 0.75 M 염화 나트륨 포함 20 mM 트리스-염산 완충용액 (pH7.5)	1	254
크기배제 크로마토그래피^a	슈퍼덱스 펩타이드 (superdex peptide) (10×300 ㎜)	20 mM 트리스-염산 완충용액 (pH 7.5)	0.5	216 및 254
역상 크로마토그래피^b	소스 5RPC ST (Source 5RPC ST) (4.6×150 ㎜)	A^**: 0.1% TFA^c 수용액 B: 0.09% TFA 및 60% ACN^d 수용액	1	216 및 254

a 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)

b 역상 크로마토그래피(reaverse-phase chromatography)

c TFA: 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid)

d ACN: 아세토니트릴(acetonitrile)

* 용매의 농도 구배를 위해 100 ㎖/100 분의 0 내지 100% B 용매 구배 조건에서 수행하였다.

** 용매의 농도 구배를 위해 90 ㎖/90 분의 구배 조건에서 선형 구배(linear gradation)을 수행하였다.

<2-2> ACE 활성 저해능 확인

상기 실시예 <2-1>에서 수득한 분획의 ACE 활성 저해능을 확인하기 위하여, Wu 등의 방법(Wu et al., 2002; J Chromatography A 950:125-130)을 응용하여 ACE의 활성을 측정하였다.

구체적으로, 0.3 M 염화 나트륨, 5 mM N-벤조일-글리신-히스티딘-류신(N-benzoyl-Gly-His-Leu, HHL; 시그마 사; 제품번호 H1635) 및 0.25 mUnit ACE(시그마 화학사, 미국)를 포함하는 0.1 M 붕산(borate) 완충용액(pH 8.3)을 반응 용액으로 제조하였다. 그런 다음, 상기 실시예 <2-1>에서 제조한 분획을 시료로 하여 40 ㎕를 상기 반응 용액 150 ㎕와 혼합하여 37℃ 항온 수조에서 30 분간 교반하면서 반응하였다. 반응 후, ACE 반응을 중지하기 위하여 1 M 염산(HCl) 150 ㎕를 가하고 10,000rpm에서 10 분 동안 원심분리(제품명 5415C; 에펜도르프 사, 함부르크, 독일)하여 상등액을 수득하였다. 그런 다음, 역상 컬럼(Watchers 120 ODS-AP, 4.6×250 ㎜, 5 ㎛; 다이소 사, 일본)을 장착한 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)에 상기 상등액 20 ㎕를 주입하여 HHL로부터 ACE에 의해 유리된 히푸르산(hippuric acid; HA)의 함량을 측정하였다. HPLC를 위해, A 용매로 0.1% TFA 수용액을 사용하였고 B 용매로 0.1% TFA를 포함하는 아세토니트릴을 사용하여, 5 내지 60% B 용매/20 분의 조건에서 선형 구배 하였고, 1 ㎖/분의 유속으로 용출하면서 228 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 그런 다음, 하기 [수학식 1]을 사용하여 ACE 저해 활성을 계산하고, 시료의 농도에 따른 ACE 저해 활성을 선형 회귀분석(JMP 통계 package ver. 7, SAS Institute, Cary, NC, USA)하여 ACE의 활성을 50% 저해하는 시료의 농도를 IC₅₀으로 정의하여 ACE 활성 저해능을 확인하였다. 음성 대조군으로는 시료를 대신하여 0.1% TFA 수용액 20 ㎕을 사용하여, 상기와 동일한 방법으로 ACE 활성 저해능을 확인하였다.

HAo: 음성 대조군의 HA 농도

HA: 시료의 HA 농도

그 결과, 하기 [표 2]에서 나타난 바와 같이 2, 3 및 4번 분획의 시료에서 ACE 활성 저해능을 나타내는 것을 확인하였다(표 2).

<2-3> 크기 배제 크로마토그래피 정제

굴 효소 가수분해물로부터 ACE 활성 저해능을 가지는 기능성 펩타이드를 정제하기 위하여, 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <2-2>에서 선별한 2, 3 및 4번 분획의 시료를 각각 미세-원심진공기(Speed Vacuum Concentrator; 스캔 스피드 40, 랩진 Aps, 덴마크)에서 농축한 후 수퍼덱스 펩티드 컬럼(superdex peptide column; 10×300 ㎜; GE 헬스케어 사, 한국)에 상기 농축한 시료 200 ㎕를 주입하여 상기 [표 1]의 조건으로 분자량에 따른 크기 배제 크로마토그래피를 수행한 후, 각각의 시료에 대한 분획을 수득하여 상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법을 수행하여 ACE 활성 저해능을 확인하였다.

그 결과, 도 1 및 하기 [표 2]에서 나타난 바와 같이 크기 배제 크로마토그래피를 통해 펩타이드를 포함하는 분획인 2-1, 2-2, 2-3, 3-1, 3-2, 4-1 및 4-2 분획을 선별하였으며(도 1), 상기 선별한 분획이 ACE 활성 저해능을 나타내는 것을 확인하였다(표 2).

<2-4> 역상 크로마토그래피 정제

굴 효소 가수분해물로부터 ACE 활성 저해능을 가지는 기능성 펩타이드를 정제하기 위하여, 역상 HPLC를 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <2-3>에서 선별한 2-1, 2-2, 2-3, 3-1, 3-2, 4-1 및 4-2 분획 시료를 각각 소스 5RPC ST 컬럼(source 5 RPC ST column; 4.6×150㎜; GE 헬스케어 사, 한국)에 상기 시료를 주입하여 상기 [표 1]의 조건으로 분자량에 따른 역상 크로마토그래피를 수행한 후, 각각의 시료에 대한 분획을 수득하여 상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법을 수행하여 ACE 활성 저해능을 확인하였다.

그 결과, 도 1 및 하기 [표 2]에서 나타난 바와 같이 역상 크로마토그래피를 통해 펩타이드를 포함하는 분획을 선별하였으며(도 1), 상기 선별한 분획이 ACE 활성 저해능을 나타내는 것을 확인하였다(표 2).

굴 효소 가수분해물의 정제 단계에 따른 분획명, 분획 번호, ACE 활성 저해능 및 펩타이드 서열

정제단계	분획명	분획 번호	ACE 저해활성,%	펩타이드
음이온교환 크로마토그래피	2	25,26,27	4.0
	3	29	4.9
	4	30,31	6.7
크기 배제 크로마토그래피	2-1	19,20	19.0
	2-2	21	17.0
	2-3	23	15.0
	3-1	20	15.7
	3-2	21	17.8
	4-1	20,	18.3
	4-2	21,22	18.6
역상 크로마토그래피	2-1-3	20,21	34.0	AFN, FYN
	2-2-2	21,21	27.7	TAY
	2-3-2	16,17	30.4	KY
	3-1-4	20,21	54.5	AFY
	3-2-2	14	44.3	VK
	4-1-1	18,19	34.4	PGN, GPN
	4-2-1	16	26.5	MC, PH, SF, YA

< 실시예 3> ACE 활성 저해능 을 가지는 기능성 펩타이드 질량 및 서열의 확인

굴 효소 가수분해물로부터 분리한 ACE 활성 저해능을 가지는 기능성 펩타이드를 스크리닝하기 위하여, 상기 펩타이드의 질량 및 아미노산 서열을 에드만(edman) 분해법 및 말디/토프(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization/ Time-Of-Flight Mass Spectroscopy; MALDI/TOF)를 수행하여 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <2-4>에서 선별한 ACE 저해 활성을 가지는 7 개의 시료를 각각 진공 농축 원심분리기에서 완전히 건조하고, 0.1% TFA 수용액 20㎕를 가하여 완전히 용해하였다. 그런 다음, 50% 아세토나이트릴로 활성화(activation)하고 0.1% TFA 수용액으로 평행한 집팁 C18 컬럼(ZipTip C18 column; 피어스 사, 제품번호: 87782)에 상기 용해한 시료를 로딩한 후, 0.1% TFA 수용액으로 2 내지 3 회 세척하고, 0.1% TFA을 포함하는 70% 아세토나이트릴을 사용하여 펩타이드는 용출하여 이외 염은 제거하였다. 상기 용출한 펩타이드 용액 10 ㎕를 바이오브렌(biobrene; AB 시스템 사, 미국)으로 전처리한 마이크로필터(micro-filter)에 로딩한 후, 아르곤(Argon) 가스를 사용하여 필터를 건조하였다. 건조가 끝난 필터는 카트리지에 장착하여 아미노산 자동 서열기인 ABI492 자동 단백질 서열기(ABI482 automated protein sequencer; 어플라이드 바이오시스템 사, 미국)를 사용하는 펄스분사된-액체(pulsed-liquid) 방법을 사용하여 기능성 펩타이드를 구성하는 아미노산의 서열을 확인하였다.

또한, 상기 실시예 <2-4>에서 선별한 ACE 저해 활성을 가지는 7 개의 시료를 전기분무 이온화(electrospray ionization; ESI) 방법을 이용하는 질량분석기인 Q-TOF2(마이크로매스 사, 영국)에서 나노-ESI 인터페이스(Nano-ESI-interface)로 결과 의존적 이중 질량분석법(data dependent MS/MS)을 사용하여 기능성 펩타이드의 질량을 확인하였다.

그 결과, 하기 [표 3] 및 도 2에서 나타난 바와 같이, 서열 번호 1 내지 12의 아미노산으로 구성되는 총 12 개의 펩타이드를 확인하였다(표 5).

ACE 활성 저해능을 나타내는 기능성 펩타이드의 아미노산 서열의 확인

펩타이드 명칭	분석 시료	아미노산 서열
TAY (서열번호: 1)	1-2-2	트레오닌-알라닌-티로신
VK (서열번호: 2)	2-2-2	발린-라이신
KY (서열번호: 3)	1-3-2	라이신-티로신
YA (서열번호: 4)	3-2-1	티로신-알라닌
FYN (서열번호: 5)	1-1-3	페닐알라닌-티로신-아스파라진
AFY (서열번호: 6)	2-1-4	알라닌-페닐알라닌-티로신
MC (서열번호: 7)	3-2-1	메티오닌-시스테인
GPN (서열번호: 8)	3-1-1	글리신-프롤린-아스파라진
AFN (서열번호: 9)	1-1-3	알라닌-페닐알라닌-아스파라진
PGN (서열번호: 10)	3-1-1	프롤린-글리신-아스파라진
PH (서열번호: 11)	3-2-1	프롤린-히스티딘
SF (서열번호: 12)	3-2-1	세린-페닐알라닌

< 실시예 4> ACE 활성 저해능을 나타내는 기능성 펩타이드의 합성 및 ACE 활성 저해능 확인

<4-1> 기능성 펩타이드 합성

굴 효소 가수분해물로부터 분리한 기능성 펩타이드가 실제로 ACE 활성 저해능을 나타내는지 확인하기 위하여, 플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드(Fluorenylmethyloxycarbonyl chloride; Fmoc)- 고상 펩타이드 합성법(Solid phase peptide syntheisis; SPPS)을 수행하여 합성 펩타이드를 제조하였다.

구체적으로, C-말단이 수지(resin)에 결합되어 있고, N-말단이 Fmoc에 보호되며, 잔기는 TFA로 제거할 수 있는 트리틸(trityl; Trt), t-부틸옥시카보닐(t-Butyloxycarbonyl; Boc) 또는 t-부틸(t-butyl; t-Bu)의 보호기로 보호되는 아미노산을 상기 <실시예 3>에서 확인한 펩타이드의 서열을 구성하는 아미노산 합성의 재료로서 준비하였다. 준비한 아미노산을 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3- 테트라메틸루로늄-헥사플루로포페이트)((2-(1H-Benzotirazloe-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophophate; HBTU), 하이드록시벤조트리아졸(Hydroxybenzotriazole; HOBt) 및 N-메틸모폴린(N-methylmorpholine; NMM)을 포함하는 커플링(couling) 시약에 첨가한 다음, 실온에서 자동합성기(ASP48S; 펩트론 사, 한국)를 사용하여 2 시간 동안 반응하고 20% 피페리딘(piperidine)을 포함하는 디메틸폼아마이드(dimethylformamide; DMF)를 첨가하여 실온에서 5 분간 반응하면서 Fmoc를 제거하여 펩타이드를 합성한 후, 상기 합성 과정을 반복하여 본 발명의 펩타이드를 합성하였다. 그런 다음, TFA, 1,2-에탄디티올(1,2-ethanedithiol; EDT), 티아니솔(Thioanisole), 트리이소프로필실란(Triisopropylsilane; TIS) 및 물을 각각 90%, 2.5%, 2.5%, 2.5%, 2.5%(v/v)의 비율로 혼합하고 상기 합성한 펩타이드에 첨가하여 C-말단의 수지 및 잔기의 보호기를 제거하였다. 제거 후, 비닥 에버레스트 C18 컬럼(Vydac Everest C18 column; 22×250 ㎜, 10 ㎛; 그레이스 사, 미국)을 사용하는 역상 HPLC를 0.1% TFA를 포함하는 40% 아세토니트릴 용액으로 선형 구배하는 조건으로 수행하여 펩타이드를 정제 및 분리하였다. 정제한 펩타이드는 애질런트 HP1100 시리즈(애질런트 사, 미국)을 사용하여 LC/MS로 확인하였다.

그 결과, 굴 효소 가수분해물로부터 분리한 기능성 펩타이드와 동일한 아미노산 서열로 구성되는 합성 펩타이드 12 개를 제조하였다.

<4-2> 합성 펩타이드의 ACE 활성 저해능 및 세포 독성( cell viability ) 확인

굴 효소 가수분해물로부터 분리한 기능성 펩타이드가 실제로 ACE 활성 저해능을 나타내는지 확인하기 위하여, 합성 펩타이드의 ACE 활성 저해능을 확인하였으며, 세포 독성을 확인하기 위해 MTT 분석을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <4-1>에서 합성한 펩타이드를 상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법을 수행하여 ACE 활성 저해능을 확인하였다. 또한, 세포 독성을 확인하기 위하여 간암세포인 HepG2 세포를 배지용 항생제 및 10% 우태아혈청(Fetal bovine serum; FBS)을 포함하는 MEM 배지에 접종하여, 37℃에서 5% CO₂가 유지되도록 배양하였다. 세포가 80% 정도 디쉬를 덮으면 인산염-완충 생리식염수-에틸렌디아민사아세트산(phosphated-buffered saline-ethylenediaminetetraacetic acid; PBS-EDTA)으로 세척한 후 트립신 처리하여 계대 배양하였으며, 배지는 48시간마다 교환하면서 세포를 배양한 후, 96웰-플레이트에 1×10⁵ 세포/㎖의 농도로 100 ㎕씩 분주하여 24 시간 동안 배양하면서 세포를 플레이트에 부착하고 배지를 제거하여 세포를 준비하였다. 그런 다음, 상기 실시예 <4-1>에서 합성한 펩타이드를 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ 또는 200 ㎍/㎖의 농도로 0.2% PBS를 포함하는 MEM배지에 녹여 시료를 제조한 후, 상기 준비한 세포에 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후, PBS 용액으로 2 회 세척하고 MTT 시약을 처리한 다음, 2 시간 동안 추가로 배양하여 490 ㎚에서 엘리사 플레이트 리더기(ELISA plate reader)로 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 하기 [표 4]에서 나타난 바와 같이, 12 개의 기능성 펩타이드는 모두 세포에 대한 독성을 나타내지 않으면서 ACE 활성 저해능을 나타내는 것을 확인하였다(표 4).

기능성 펩타이드의 ACE 활성 저해능 및 세포 독성 확인

펩타이드 명칭	ACE 활성 저해능		세포 독성 (%)
펩타이드 명칭	IC₅₀ (μM)	IC₅₀ (㎍/㎕)	세포 독성 (%)
TAY	16.7	2.18	101.2±6.1
VK	29.0	2.63	103.2±3.9
KY	51.5	5.90	105.4±5.7
YA	93.9	8.76	103.8±7.7
FYN	68.2	11.17	109.5±3.0
AFY	75.6	11.18	106.7±7.4
MC	153.8	14.36	100.6±4.6
GPN	208.5	22.09	108.3±1.0
AFN	222.9	28.89	108.1±4.4
PGN	371.9	39.39	103.9±6.2
PH	537.1	50.13	113.7±6.0
SF	646.3	60.33	99.0±1.2

< 실시예 5> 굴 효소 가수분해물 및 기능성 펩타이드의 생체 내( In vivo ) 혈압 조절 효과 확인

<5-1> 분자량에 따른 굴 효소 가수분해물의 분리

분자량에 따른 굴 효소 가수분해물의 생체 내 혈압 조절 효과를 확인하기 위하여, 굴 효소 가수분해물을 10 kD 이상 및 이하로 분리하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 제조한 굴 효소 가수분해물을 바이오백스 10(Biomax 10; 밀리포어 사, 미국) 한외여과막 및 펠리콘 XL(pellicon XL; 밀리포어 사, 미국) 한외여과막을 사용하여 한외여과기(랩스케일 TFF 시스템, 밀리포어 사, 미국)에서 여과하였다.

그 결과, 굴 효소 가수분해물 전체로부터 10 kD 이상 및 10 kD 이하 굴 효소 가수분해물을 수득하였다.

<5-2> 단회 투여에 의한 생체 내 혈압 조절 효과 확인

굴 효소 가수분해물로부터 분리한 기능성 펩타이드가 생체 내에서 나타내는 혈압 조절 효과를 확인하기 위하여, 고혈압 쥐에 상기 펩타이드를 단회 투여하고 혈압 조절 효과를 확인하였다.

구체적으로, 11 주령의 수컷 본태성 고혈압 쥐(Spontaneiusly Hypertensive Rat, SHR; 중앙실험동물) 및 위스터 래트(Wistar Rat; 중앙실험동물)을 구입하여 온도 22±3℃, 습도 50±5% 및 명암 주기 12 시간의 사육 환경에서 사료 및 식수를 자유롭게 섭취할 수 있도록 충분하게 공급하며 1 주간 안정화한 다음, 경희대학교 약학대학 실험동물윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 통한 동물실험 가이드라인(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Care International)에 따라 실험군 및 대조군으로 사용하였다. 상기 실험군 및 대조군은 하기 [표 5]의 조건으로 나누어 상기 <실시예 1>에서 제조한 굴 효소 가수분해물, 상기 실시예 <5-1>에서 제조한 10 kD 이상 및 이하 굴 효소 가수분해물, 상기 실시예 <4-1>에서 제조한 펩타이드 또는 캡토프릴(Captopril; (주)보령제약 제공)을 경구 또는 복강 투여한 다음, 투여 개시 후 0, 3, 6, 9, 12 및 24 시간에 42℃로 유지되는 래트 온도 조절 유닛(rat temperature control unit)에 20 분간 고정하여 충분히 꼬리 혈관을 확장한 후 수축기 혈압을 측정하여 항고혈압 활성을 확인하였다.

단회 투여에 의한 생체 내 혈압 조절 효과 확인을 위한 실험군 및 대조군의 조건

동물종				투여 용량^a
위스터 래트	정상 대조군	생리 식염수(saline)		2 ㎖
SHR	음성 대조군	생리 식염수		2 ㎖
	양성 대조군	캡토프릴(Captopril)		8 ㎎/㎏
	실험군	굴 효소 가수분해물	전체	100 ㎎/㎏
			10kD 이상
			10kD 이하
		기능성 펩타이드	TAY	50 ㎍/㎏
			VK
			KY
			YA
			FYN
			AFY
			MC

a 양성 대조군 및 실험군에 대한 투여 용량으로 ㎎/㎏에 해당하는 시료의 양을 생리 식염수 2 ㎖에 혼합하여 투여하였다.

그 결과, 도 3 및 도 4에서 나타난 바와 같이 통상적으로 사용되는 혈압강하제인 캡토프릴을 투여한 양성 대조군에서는 음성 대조군인 고혈압 쥐에 비하여 18 내지 19% 만의 혈압 강화 효과를 나타내는 것에 비해, 굴 효소 가수분해물을 투여하였을 때 음성 대조군에 비하여 33 내지 38%의 혈압 강화 효과를 나타내며, 특히 10 kD 이하 굴 효소 가수분해물의 경우 투여 12 시간까지 실험군의 혈압을 정상 대조군과 유사한 수준으로 감소시키는 유의적인 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 3).

또한, 본 발명의 기능성 펩타이드를 투여한 실험군에서도 음성 대조군의 고혈압 쥐에 비해 유의한 수준의 혈압 강화 효과를 확인하였으며, 특히 펩타이드 YA가 투여 후 6 시간 후에 33.9%의 혈압 강화 효과를 나타내어 가장 효과적인 것을 확인하였다(도 4).

<5-3> 반복 투여에 의한 생체 내 혈압 조절 효과 확인

굴 효소 가수분해물로부터 분리한 기능성 펩타이드가 생체 내에서 나타내는 혈압 조절 효과를 확인하기 위하여, 고혈압 쥐에 상기 펩타이드를 반복 투여하고 혈압 조절 효과를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <5-2>와 동일한 쥐를 구입하여 동일한 환경에서 사육하였고, 하기 [표 6]의 조건에 따라 실험군 및 대조군으로 나누어 상기 실시예 <5-1>에서 제조한 10 kD 이하 굴 효소 가수분해물, 상기 실시예 <4-1>에서 제조한 YA 펩타이드 또는 정어리 가수분해물로부터 분리한 혈압 강하 물질인 발린-타이로신(Val-Tyr)을 4 주 동안 매일 아침 10 시에 경구투여하였고, 0, 1, 2, 3 및 4 주차에 상기 실시예 <5-2>과 동일한 방법으로 수축기 혈압을 측정하였다. 또한, 투여 개시 4 주 후에 쥐를 희생하여 하대 정맥에서 혈액을 채취하였고, 채취한 혈액은 3,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 혈청을 수득하여 영하 80℃에서 보관하였다. 상기 보관한 혈청의 혈중 ACE 농도 및 안지오텐신-II(angiotensin-II)의 농도를 상업용 엘리사 키트(ELISA KIT; USCN 라이프 사이언스 사, 중국)의 제조사에 따른 프로토콜에 따라 확인하였다.

반복 투여에 의한 생체 내 혈압 조절 효과 확인을 위한 실험군 및 대조군의 조건

동물종				투여 용량^a
위스터 래트	정상 대조군	생리 식염수		2 ㎖
SHR	음성 대조군	생리 식염수		2 ㎖
	양성 대조군	발린-타이로신(Val-Tyr)		50 ㎍/㎏
	실험군	굴 효소 가수분해물	전체	100 ㎎/㎏
			10 kD 이하
		기능성 펩타이드	YA	50 ㎍/㎏

그 결과, 도 5 내지 도 7에서 나타난 바와 같이 모든 실험군에서 음성 대조군의 고혈압 쥐에 비해 유의한 수준의 혈압 강화 효과를 나타내어 전체 굴 효소 가수분해물 및 YA 펩타이드의 경우 투여 개시 후 2 주차까지 혈압이 상승하지 않았으며, 10 kD 이하 굴 효소 가수분해물의 경우 투여 개시 후 2 주차까지 혈압이 소폭 상승하나 3 부터 혈압 강하효과를 나타내어 유의적인 혈압 강하효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 5).

또한, 음성 대조군인 고혈압군에 비해 모든 실험군에서 혈중 ACE의 농도가 감소한 것을 확인하였으며(도 6), 혈중 안지오텐신-II 농도 역시 모든 실험군에서 음성 대조군에 비해 유의적으로 감소하여, 정어리 가수분해물로부터 분리된 혈압 강화 효과를 나타내는 기능성 펩타이드로 알려져 있는 발린-타이로신을 투여한 양성 대조군에 비하여 현저한 감소 효과를 나타내고, 특히 10 kD 이하 굴 효소 가수분해물의 경우에 정상 대조군과 비슷한 수준을 나타내는 것을 확인하였다(도 7).

< 실시예 6> 굴 효소 가수분해물 및 기능성 펩타이드의 생체 내 고혈압 예방 효과 확인

굴 효소 가수분해물로부터 분리한 기능성 펩타이드가 생체 내에서 나타내는 고혈압 예방 효과를 확인하기 위하여, 고혈압 쥐에 상기 펩타이드를 투여하고 혈압 상승 억제 효과를 확인하였다.

구체적으로, 12 내지 16 주령의 수컷 위스터 래트을 구입하여 온도 22±3℃, 습도 50±5% 및 명암 주기 12 시간의 사육 환경에서 사료 및 식수를 자유롭게 섭취할 수 있도록 충분하게 공급하며 1 주간 안정화한 다음, 무작위로 8 마리씩 하기 [표 7]의 조건에 따라 실험군 및 대조군으로 나누었다. 그런 다음, 실험군, 음성 대조군 및 양성 대조군에 고혈압을 유발하기 위해 쥐 몸무게 1 ㎏ 당 니트로-L-아르기닌 메틸-에스터(Nitro-L-arginine methyl ester, L-NAMA; 플루카 사) 40 ㎎씩 매일 정맥 주사하였고, 상기 <실시예 1>에서 제조한 굴 효소 가수분해물, 상기 실시예 <5-1>에서 제조한 10 kD 이하 굴 효소 가수분해물, 상기 실시예 <4-1>에서 제조한 YA 펩타이드, 캡토프릴 또는 발린-타이로신을 매일 경구 투여한 다음, 투여 개시 0, 1, 2, 3 및 4 주 후에 상기 실시예 <5-2>과 동일한 방법으로 수축기 혈압을 측정한 후, 각각의 대조군 및 실험군의 평균 수축기 혈압을 계산하였다.

굴 효소 가수분해물 및 기능성 펩타이드의 생체 내 고혈압 예방 효과 확인을 위한 실험군 및 대조군의 조건

동물종				투여 용량^a
위스터 래트	정상 대조군	생리 식염수		2 ㎖
	음성 대조군	생리 식염수		2 ㎖
	양성 대조군	캡토프릴		8 ㎎/㎏
		정어리 펩타이드		100 ㎎/㎏
		발린-타이로신		50 ㎍/㎏
	실험군	굴 효소 가수분해물	전체	100 ㎎/㎏
			10 kD 이하	100 ㎎/㎏
		기능성 펩타이드	YA	50 ㎍/㎏

그 결과, 도 8에서 나타난 바와 같이 정상 쥐에 L-NAME을 투여하여 고혈압을 유발하였으며, 양성 대조군에 비해 굴 효소 가수분해물 및 기능성 펩타이드이 쥐의 혈압 상승 효과를 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 8).

<110> University-Industry Cooperation Croup of Kyung Hee University University-Industry Cooperation Croup of Gyeongsang National University <120> Pharmaceutical composition containing Peptide with angiotensin-I Converting Enzyme inhibitory activity for preventing or treating cardiovascular disease <130> 13P-08-001 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> oyster <400> 1 Thr Ala Tyr 1 <210> 2 <211> 2 <212> PRT <213> oyster <400> 2 Val Lys 1 <210> 3 <211> 2 <212> PRT <213> oyster <400> 3 Lys Tyr 1 <210> 4 <211> 2 <212> PRT <213> oyster <400> 4 Tyr Ala 1 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> oyster <400> 5 Phe Tyr Asn 1 <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> oyster <400> 6 Ala Phe Tyr 1 <210> 7 <211> 2 <212> PRT <213> oyster <400> 7 Met Cys 1 <210> 8 <211> 3 <212> PRT <213> oyster <400> 8 Gly Pro Asn 1 <210> 9 <211> 3 <212> PRT <213> oyster <400> 9 Ala Phe Asn 1 <210> 10 <211> 3 <212> PRT <213> oyster <400> 10 Pro Gly Asn 1 <210> 11 <211> 2 <212> PRT <213> oyster <400> 11 Pro His 1 <210> 12 <211> 2 <212> PRT <213> oyster <400> 12 Ser Phe 1

Claims

서열번호 1 내지 12로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme; ACE)에 대하여 저해능을 갖는 펩타이드.
제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 굴 효소 가수분해물로부터 분리된 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 2항에 있어서, 상기 효소는 단백질 가수분해효소(protease)인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
서열번호 1 내지 3 및 5 내지 11로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드 중 어느 하나 이상을 포함하는 굴 효소 가수분해물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 고혈압 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 분획물은 10 kD 이하인 것을 특징으로 하는 고혈압 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
서열번호 1 내지 3 및 5 내지 11로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 고혈압 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
서열번호 1 내지 3 및 5 내지 11로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드 중 어느 하나 이상을 포함하는 굴 효소 가수분해물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 고혈압 예방 또는 개선용 건강 식품.
서열번호 1 내지 3 및 5 내지 11로 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 고혈압 예방 또는 개선용 건강 식품.