KR20230075184A - 흰점박이 꽃무지 유충 가수분해물 유래의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항고혈압 식품 조성물 - Google Patents

흰점박이 꽃무지 유충 가수분해물 유래의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항고혈압 식품 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 흰점박이 꽃무지 유충 가수분해물에서 분리된 펩타이드를 유효성분으로 포함하여 고혈압을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 조성물로써, 독성이 없으며, 고혈압에 대한 개선, 예방 또는 치료 효과가 매우 뛰어나 경쟁력 있는 식품 조성물 및 의약 조성물을 제공할 수 있다.

Description

흰점박이 꽃무지 유충 가수분해물 유래의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항고혈압 식품 조성물{A Composition for Anti-hypertension Using Peptides Derived From Enzymatic Hydrolysates of Protaetia brevitarsis}
본 발명은 흰점박이 꽃무지 유충 가수분해물에서 분리된 펩타이드를 유효성분으로 포함하여 고혈압을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
고혈압(hypertension)은 여러번 측정한 혈압평균치가 수축기 혈압이 140 mmHg 이상, 확장기 혈압이 90 mmHg 이상인 경우를 말하며 인간의 생리적 활동 중 인공적으로 혈압이 상승하는 것으로 현대인의 건강에 중요한 문제로 대두되고 있다.
한 가지 이유에 의해 발생되는 것보다는 다양한 원인에 의해 비정상적으로 혈압이 상승하는 것을 일차성 고혈압(primary hypertension) 혹은 본태성 고혈압(essential hypertension)이라 부른다. 그리고 주변 환경에 의해 고혈압이 발생하기도 하지만, 유전적인 원인에 의해 혈압이 상승하기도 하는데 이것을 이차성 고혈압(secondary hypertension)이라고 부른다.
생체 중에 존재하고 있는 불활성화 안지오텐신 I(Angiotensin I)은 안지오텐신 I 전환 효소(Angiotensin I converting Enzyme, ACE)에 의하여 C-말단 His-Leu가 떨어져 나감으로써 혈관벽 수축 작용을 가지는 안지오텐신 II(Angiotensin II)로 전환되어 혈관을 수축하고, 신장에서 알도스테론의 분비를 증가시켜 체액량을 증가시킴으로써 혈압을 상승시키는 작용을 한다. 따라서 ACE의 활성을 억제시킴으로써 혈압상승의 원인이 되는 안지오텐신 II 생성 저하를 통해 혈압을 억제할 수 있다.
고혈압을 개선하기 위한 목적으로 에넬라프릴(enelapril)이나 라미프릴(Ramipril) 등의 ACE 저해제가 개발되어 상용되고 있으나, 미각이상, 백혈구감소, 간기능 이상, 가려움(itching), 두통(headache), 심계 항진(tachycardia), 흉통(chest pain), 허약(weakness)과 같은 부작용 현상이 보고되고 있다. 이에 부작용이 없는 새로운 안지오텐신 전환효소 억제제들이 절실하게 요구되고 있는 실정이다.
종래 화학 합성 방법 등을 통하여 제조되었던 고혈압 제제들이 부작용 등의 문제가 발생됨에 따라, 최근 세계 각국에서는 천연 물질로부터 항고혈압 효과를 갖는 물질을 얻기 위한 노력이 지속되고 있다.
한편, 식용곤충은 육류에 비해 단백질 함유량이 평균 2배 이상 높으며 무기질, 필수 및 비필수 아미노산, 비타민 등이 풍부하며 지방의 대부분이 수용성 지방으로 이루어져 있어 곤충이 함유하고 있는 영양성분이 인체에 쉽게 흡수될 수 있어 축산물에서 얻어지는 단백질의 대체식품으로 각광받고 있다.
인간이 곤충을 먹기 시작한 것은 인류가 탄생한 시기와 같은 것으로 추정되고 있으며, 중국, 태국, 일본, 남아프리카 공화국, 멕시코, 잠비아 등 전 세계 20억 명에 달하는 인구가 대략 1900여종의 식용곤충을 음식으로 섭취한다고 알려져 있다. 2003년 이후 유엔농업식량기구(FAO)는 전세계 국가와 긴밀하게 협의하여 식용곤충식의 확대와 개발 필요성에 대해 끊임없이 홍보하고 있으며, 네덜란드, 영국, 미국, 일본 등 많은 나라들이 식용곤충 식 활성화에 참여하고 있으며, 특히 CNN, TIME지 등의 보도매체를 통해 그간 식용곤충에 부정적이었던 서구권에서도 식용곤충의 식용화에 눈을 돌리고 있다.
따라서 식용곤충을 이용하여 고혈압에 효과적인 소재의 개발이 요구되고 있다.
특허문헌 1. 대한민국 등록특허공보 제10-2003934호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 응용하고자 하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 개선용 사료 조성물에 응용하고자 하는 것이다.
상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드를 유효성분을 제공한다.
상기 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물은 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 추출물을 플라보르자임(Flavourzyme), 알칼라아제(Alcalase), 프로테아제(Protease), 뉴트라아제(Neutrase) 또는 이들의 혼합효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 가수분해효소로 가수분해한 것일 수 있다.
상기 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 하에서 추출된 것일 수 있다.
상기 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물은 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물의 상등액을 분자량에 따라 분획하였을 때, 5 kDa 미만의 분자량을 갖는 1차 분획물일 수 있다.
상기 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물은 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물의 상등액을 분자량에 따라 분획하였을 때, 5 kDa 미만의 분자량을 갖는 1차 분획물을 분자량 분배 크로마토 그래피(Sephadex G-10)으로 1.5 ml/min의 유속으로 30 분 내지 200 분 사이에 분획된 2차 분획물일 수 있다.
상기 올리고 펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드일 수 있다.
상기 올리고 펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 11 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 식품 조성물은 건강기능식품일 수 있다.
상기한 바와 같은 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물은 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 추출물을 플라보르자임(Flavourzyme), 알칼라아제(Alcalase), 프로테아제(Protease), 뉴트라아제(Neutrase) 또는 이들의 혼합효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 가수분해효소로 가수분해한 것일 수 있다.
상기 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 하에서 추출된 것일 수 있다.
상기 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물은 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물의 상등액을 분자량에 따라 분획하였을 때, 5 kDa 미만의 분자량을 갖는 1차 분획물일 수 있다.
상기 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물은 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물의 상등액을 분자량에 따라 분획하였을 때, 5 kDa 미만의 분자량을 갖는 1차 분획물을 겔 여과 크로마토그래피에 로딩하여 분획물을 분자량 분배 크로마토 그래피(Sephadex G-10)으로 1.5 ml/min의 유속으로 30 분 내지 200 분 사이에 분획된 2차 분획물일 수 있고, 바람직하게는 40 분 내지 100 분 사이에 분획된 2차 분획물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 40 분 내지 60 분 사이에 분획된 2차 분획물일 수 있으며, 가장 바람직하게는 40 분 내지 55 분 사이에 분획된 2차 분획물일 수 있다.
상기 올리고 펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드일 수 있다.
상기 올리고 펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 11 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기한 바와 같은 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물으로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물의 각 분자량별 분획물과 상기 분획물로부터 분리된 올리고 펩타이드들을 유효성분으로 함유하는 고혈압의 개선, 예방 또는 치료용 조성물은 독성이 없으며, 고혈압에 대한 개선, 예방 또는 치료 효과가 매우 뛰어나 경쟁력 있는 식품 조성물 및 의약 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 올리고 펩타이드들은 독성이 없으므로 사료 조성물로도 사용할 수 있다.
도 1은 시험예 1에서 제조된 흰점박이 꽃무지 유충 물 추출물과 주정 추출물의 BMCMC에 대한 세포 독성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 시험예 1에서 제조된 흰점박이 꽃무지 유충 물 추출물과 주정 추출물의 BMCMC에 대한 β-hexosaminidase 방출 억제 효과를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 1 내지 3의 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물 농도별 ACE 저해활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여, 실시예 6의 분획물(< 5 kDa)에서 분자량에 따라 5종의 분획물(fraction)을 분리한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 실시예 7(F1), 8(F2), 9(F3), 10(F4), 11(F5)에 대한 ACE(Angiotensin I converting Enzyme) 저해 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물로부터 분리된 올리고 펩타이드(서열번호 1-11)에 대한 ACE(Angiotensin I converting Enzyme) 저해 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물로부터 분리된 올리고 펩타이드(서열번호 1-11)를 제조하는 과정을 개략적으로 도시한 도면이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명은 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드를 유효성분으로 포함하여 고혈압을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 고혈압을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 조성물은 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드를 유효성분으로 포함한다.
상기 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물은 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 추출물을 플라보르자임(Flavourzyme), 알칼라아제(Alcalase), 프로테아제(Protease), 뉴트라아제(Neutrase) 또는 이들의 혼합효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 가수분해효소로 가수분해한 것일 수 있고, 바람직하게는 플라보르자임(Flavourzyme), 알칼라아제(Alcalase) 또는 뉴트라아제(Neutrase)의 단백질 가수분해효소로 가수분해한 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 플라보르자임(Flavourzyme)으로 가수분해한 것일 수 있다.
상기 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 하에서 추출한 것일 수 있고, 구체적으로 식용곤충과 추출용매가 1 : 5 내지 25의 중량비, 바람직하게는 1 : 10 내지 20의 중량비로 혼합되어, 20 내지 85 ℃, 바람직하게는 60 내지 80 ℃하에서 5 내지 30분, 바람직하게는 20 내지 30분 동안 처리된다.
상기 흰점박이 꽃무지 유충과 추출용매의 중량비가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 추출물에 흰점박이 꽃무지 유충의 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있다.
추출온도 및 추출시간이 상기 하한치 미만인 경우에는 고혈압에 대한 효능이 저하될 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 독성물질이 발생할 수 있다.
상기 추출물을 추출하는 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 에틸렌글리콜, 에틸에테르 또는 이들의 혼합용매이다. 상기 저급알코올로는 20 내지 99 부피%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올 수용액을 들 수 있으며, 바람직하게는 우수한 저장기간 및 관능성을 위하여 물을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물은 상기 흰점박이 꽃무지 유충 추출물을 플라보르자임(Flavourzyme), 알칼라아제(Alcalase), 프로테아제(Protease), 뉴트라아제(Neutrase) 또는 이들의 혼합효소로 이루어진 군에서 선택된 효소로 30 내지 80 ℃, 바람직하게는 30 내지 50 ℃하에서 10 내지 30시간, 바람직하게는 20 내지 25시간 동안 가수분해하여 얻어진 효소 처리물이다.
상기 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물은 그대로 또는 원심분리 후 상등액을 취하여 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 식용곤충 단백가수분해물은 상기 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물의 물이나 유기용매에 의한 추출물을 극성이 서로 다른 유기용매를 사용하여 얻어진 분획물, 분자량에 따라 분획하여 얻어진 분획물 또는 이들 분획물의 겔 여과 분획물을 모두 포함하는 것일 수 있다.
상기 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물의 분획물만을 지칭하기 위해 별도로 '분획물'이라 명명할 수 있고, 그 분획과정에 따라 1차 또는 2차 분획물로 명명할 수 있다.
상기 유기용매는 에탄올을 포함한 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있으며, 겔 여과시 용출 용매는 물 또는 상기 유기용매를 사용할 수 있다.
바람직하게 본 발명의 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물은 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물의 상등액을 분자량에 따라 분획하여 얻어진 것으로, 5 kDa 미만의 분자량을 갖는 1차 분획물일 수 있으며, 분자량은 특별히 제한되지 않으나, 보다 바람직하게 분자량이 5 kDa 미만인 것이 고혈압의 개선, 예방 또는 치료 효과가 우수하다.
상기 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물은 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물의 상등액을 분자량에 따라 분획하였을 때, 5 kDa 미만의 분자량을 갖는 1차 분획물을 분획물을 분자량 분배 크로마토 그래피(Sephadex G-10)으로 1.5 ml/min의 유속으로 30 분 내지 200 분 사이에 분획된 2차 분획물일 수 있으며, 상기 조건으로 분획한 제2 분획물로부터 수득한 펩타이드는 고혈압의 개선, 예방 또는 치료 효과가 우수하다(도 7).
상기 겔 여과 크로마토그래피는 당업계에서 널리 사용되고 있는 것들이라면 특별히 제한되지 않으나, 구체적으로 SP-Sephadex C-25, Sephadex G-10, Sephadex G-50 및 Sephadex G-25으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 Sephadex G-10일 수 있다.
본 발명의 실험예에 따르면, ACE 저해 효능이 가장 높았던 5 kDa 미만의 1차 분획물로 겔 여과 크로마토그래피를 실시하여 5종의 fractions을 얻었으며(F1, F2, F3, F4, F5), 상기 5개의 fractions의 아미노산 서열을 확인하기 위하여 펩타이드들의 분자량 및 아미노산 서열을 Q-TOF mass spectrometer (Micromass, Altrincham, UK) electrospray ionization (ESI)을 사용하여 측정한 결과, 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드를 확인하였다.
상기 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드의 ACE 저해 효능을 평가한 결과, 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드 모두 ACE 저해 효능을 갖는 것을 확인하였으며, 바람직하게는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드는 500 ㎍/ml의 고농도에서 50% 이상의 ACE 저해 활성을 갖는 것을 확인하였으며, 보다 바람직하게는 상기 흰점박이 꽃무지 유충 가수분해물은 서열번호 1, 서열번호 11 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나는 50 ㎍/ml의 낮은 농도에서 60% 이상의 높은 ACE(Angiotensin I converting enzyme) 저해 효과를 확인하였으며, 서열번호 11의 올리고 펩타이드는 모든 농도에서 90% 이상의 ACE 억제활성을 나타내므로 가장 바람직하다.
본 발명에서 흰점박이 꽃무지 유충은 풍뎅이과 꽃무지아과의 곤충의 유충을 일컫는 것으로, 일반적으로 굼벵이로 불린다. 흰점박이 꽃무지 유충은 예로부터 한방에서는 간암, 간경화, 간염, 유방암 등의 치료와, 중풍 등 성인병의 치료에 탁월한 효과가 있는 것으로 알려지고 있다. 또한, 동의보감을 인용한 농업과학기술원 곤충자원관 자료에 의하면 흰점박이 꽃무지 유충은 간에서 비롯되는 질병 즉, 간암, 간경화, 간염, 누적된 피로의 해소 등을 포함하여 월경불순, 시력감퇴, 백내장, 금창(金瘡), 산후풍(産後風), 악성종기, 구내염(口內炎), 파상풍, 중풍 등의 성인병을 치료하는데 효과가 있다고 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 '추출물'은 상기 용매를 이용하여 흰점박이 꽃무지 유충에 포함된 성분을 추출한 추출물, 이들로부터 분획한 분획물, 이들 추출물 또는 분획물을 추가적으로 농축한 농축물, 이를 정제 또는 분리한 정제물도 포함하고, 상기 추출물, 분획물, 농축물 또는 정제물을 건조한 건조물 또는 그를 분쇄한 분말을 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명의 용어 "고혈압(hypertension)"과 관련하여, 세계건강보건기구 (WHO)에서는 최고 혈압이 160 mmHg 이상이고 최저 혈압이 95 mmHg 이상인 경우를 고혈압으로 규정하고 있으며, 고혈압 질환의 종류로는 크게 원인이 불분명한 본태성 고혈압과 원인 질병에 의한 속발성 고혈압으로 구분되는데 이 중 90% 이상이 본태성 고혈압에 속하는 것으로 알려져 있다.
본 발명은 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 "예방"이란, 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하여 고혈압의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 "개선"이란, 본 발명에 따른 조성물을 이용하여 예방 또는 치료되는 고혈압과 같은 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 "식품 조성물"이란 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드 유효성분 외에, 식품 제조에 통상적으로 사용되는 식품의 기준 및 규격('식품공전')에 기재된 식품으로 사용가능한 식품 원료, 식품첨가물 공전에 기재된 식품첨가물을 포함한다.
특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상기 탄수화물은 단당류, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 이당류, 예를 들어 말토스, 설탕, 유당 등; 올리고당 또는 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 물엿, 사이클로덱스트린 등; 당알코올, 예를 들어 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등을 사용할 수 있다. 상기 향미제는 천연 향미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
상기 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드를 유효성분으로 식품 조성물을 제조하는 경우, 유효성분은 고혈압을 예방 또는 치료할 수 있는 함량이면 특별히 한정할 필요는 없으나, 예를 들어 0.1 내지 99 중량%, 0.5 내지 95 중량%, 1 내지 90 중량%, 2 내지 80 중량%, 3 내지 70 중량%, 4 내지 60 중량%, 5 내지 50 중량%로 포함될 수 있다.
상기 식품 조성물에서 유효성분인 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드는 섭취자의 상태, 체중, 질병의 유무나 정도 및 기간에 따라 다르지만, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예들 들어 1일 투여량을 기준으로 1 내지 5,000 mg, 바람직하게는 5 내지 2,000 mg, 더욱 바람직하게는 10 내지 1,000 mg, 더더욱 바람직하게는 20 내지 800 mg, 가장 바람직하게는 50 내지 500 mg일 수 있고, 투여 횟수는 특별히 한정할 필요는 없으나 1일 3회 내지 1주일에 1회의 범위 내에서 통상의 기술자가 조절할 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다.
상기 식품 조성물은 특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 엑스제, 젤리 제형, 티백 제형 또는 음료 제형일 수 있다.
또한 일반 식품에 고혈압의 예방 또는 개선의 기능성을 부여하기 위하여 상기 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드를 첨가할 수 있으며, 첨가가 가능한 식품은, 특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어 식품위생법 제7조에 따른 식품의 기준 및 규격('식품공전')에 예시된 과자류, 빵 또는 떡류, 코코아가공품류 또는 초콜릿류, 식육 또는 알가공품, 어육가공품, 두부류 또는 묵류, 면류, 다류, 커피, 음료류, 특수용도식품, 장류, 조미식품, 드레싱류, 김치류, 젓갈류, 절임식품, 조림식품, 주류, 건포류, 기타 식품류 등에 첨가될 수 있다. 또한 축산물위생관리법 제4조에 따른 축산물의 가공기준 및 성분규격('축산물공전')에 예시된 유가공품, 식육가공품 및 포장육, 알가공품에 첨가될 수 있다.
한편, 상기 흰점박이 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드를 유효성분으로 하는 식품 조성물은 단독으로 "고혈압의 예방 또는 개선용 건강기능식품"으로 이용될 수 있다.
상기 '건강기능식품'은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 법적 기준에 따라 제조(가공을 포함)한 식품(건강기능식품에 관한 법률 제3조 제1호)을 말한다. 상기 '건강기능식품'은 국가마다 용어나 범위에 차이가 있을 수 있으나, 미국의 '식이 보충제(Dietary Supplement)', 유럽의 '식품 보충제(Food Supplemnet)', 일본의 '보건기능식품' 또는 '특정보건용식품(Food for Special Health Use, FoSHU)', 중국의 '보건식품' 등에 해당할 수 있다.
상기 식품 조성물 또는 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 식품첨가물로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 '식품첨가물공전'의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 따른다.
또한 상기 건강기능식품에는 상기 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드와 함께 "고혈압의 예방 또는 개선용 건강기능식품"에 사용되는 '기능성 원료'로 고시된 원료 또는 개별인정된 원료로서, 정어리펩타이드, 가쯔오부시올리고펩타이드, 카제인가수분해물, 올리브잎 추출물, 연어 펩타이드 등의 혈압과 관련된 건강기능식품 소재를 복합하여 고혈압의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제조할 수 있다.
본 발명은 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 개선용 사료 조성물에 관한 것이다.
상기 '사료 조성물'은 유효성분으로 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드 이외에, 식품의 기준 및 규격('식품공전')에 기재된 식품으로 사용가능한 식품 원료, 식품첨가물 공전에 기재된 식품첨가물을 사용할 수 있고, 식품으로 사용가능한 식품 원료 또는 식품첨가물이 아니더라도 '사료 등의 기준 및 규격' 별표 1의 단미사료의 범위에 해당하는 원료, 별표 2의 보조사료의 범위에 해당하는 원료를 사용할 수 있다.
상기 '사료 조성물'은 '사료 등의 기준 및 규격'에 따른 보조사료 중 추출제일 수 있고, 상기 보조사료를 포함하는 배합사료일 수 있다.
상기 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드를 유효성분으로 사료 조성물을 제조하는 경우 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드는 고혈압의 예방 또는 개선을 나타내는 함량이면 특별히 한정할 필요는 없으나, 예를 들어 0.1 내지 99 중량%, 0.5 내지 95 중량%, 1 내지 90 중량%, 2 내지 80 중량%, 3 내지 70 중량%, 4 내지 60 중량%, 5 내지 50 중량%로 포함될 수 있다.
상기 사료 조성물에서 유효성분인 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드는 섭취 동물의 상태, 체중, 질병의 유무나 정도 및 기간에 따라 다르지만, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예들 들어 1일 투여량을 기준으로 1 내지 5,000 mg, 바람직하게는 5 내지 2,000 mg, 더욱 바람직하게는 10 내지 1,000 mg, 더더욱 바람직하게는 20 내지 800 mg, 가장 바람직하게는 50 내지 500 mg일 수 있고, 투여 횟수는 특별히 한정할 필요는 없으나 1일 3회 내지 1주일에 1회의 범위 내에서 통상의 기술자가 조절할 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명은 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 치료용 동물용 약학 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 인간, 또는 인간을 제외한 동물에게 상기 조성물을 투여하는 고혈압의 치료방법을 제공한다.
또한 본 발명은 고혈압의 예방 또는 치료용 의약, 또는 동물용 의약 제조를 위한 얼레지 추출물의 신규 용도를 제공한다.
상기 '약학 조성물', '의약', '동물용 약학 조성물' 또는 '동물용 의약'은 유효성분으로 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드 이외에, 약학 조성물 등의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 '담체'는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물이다. 상기 '희석제'는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물이다.
상기 담체, 부형제 및 희석제로는 특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어, 유당, 포도당, 설탕, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
상기 약학 조성물, 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약의 사용량은 환자 또는 치료대상 동물의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 무엇보다도, 치료대상 개체의 상태, 치료 대상 질환의 특정한 카테고리 또는 종류, 투여 경로, 사용되는 치료제의 속성에 의존적일 것이다.
상기 약학 조성물, 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약은 체내에서 활성성분의 흡수도, 배설속도, 환자 또는 치료대상 동물의 연령 및 체중, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 1일 0.1 내지 1,000 mg/kg, 바람직하게는 1 내지 500 mg/kg, 더욱 바람직하게는 5 내지 250 mg/kg, 가장 바람직하게는 10 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 바람직하다. 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 일정시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.
상기 약학 조성물, 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약은 개별적으로 예방제 또는 치료제로서 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
상기 약학조성물, 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 트로키제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형으로 제형화하여 사용될 수 있다. 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 설탕 또는 유당, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 고혈압의 치료방법은 인간, 또는 인간을 제외한 동물, 특히 포유동물에게 상기 조성물을 투여 하는 것으로, 예를 들어 고혈압을 가진 치료대상 개체에게 상기 조성물을 투여하는 것이다.
상기 고혈압을 가진 치료대상 개체 여부는, 고혈압을 가지고 있는 경우일 수 있다.
상기 치료를 위한 투여량, 투여 방법 및 투여 횟수는 상기 약학 조성물, 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약의 투여량, 투여 방법 및 투여 횟수를 참고할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1. 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물-알칼라아제
흰점박이 꽃무지 유충 추출물
흰점박이 꽃무지 유충과 물을 1 : 20의 중량비로 혼합하여 70 ℃ 하에서 30분 동안 추출한 다음 추출물을 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 회수함으로써 흰점박이 꽃무지 유충 추출물을 수득하였다.
흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물
상기 흰점박이 꽃무지 유충 추출물에 알칼레이즈(Alcalase 2.4L FG, Novozyme Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)의 최적 활성 조건(pH 8.0, 50 ℃)에서 1%(w/w)의 기질 대 효소비로 24시간 동안 효소 가수분해를 수행하였다. 가수분해 반응 후 효소 불활성화를 위해 100 ℃에서 10분간 끓이고, 원심분리(3,500 rpm, 10분) 및 감압여과를 수행하여 상층액을 분리한 후 이를 동결건조하여 흰점박이꽃무지 가수분해물을 제조하였다.
실시예 2. 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물-플라보르자임
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 흰점박이꽃무지 유충 단백가수분해물을 제조 시 알칼레이즈 대신 플라보르자임(최적 활성 조건: pH 7.0, 50 ℃)을 사용하여 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물을 제조하였다.
실시예 3. 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물-뉴트라아제
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 흰점박이꽃무지 유충 단백가수분해물을 제조 시 알칼레이즈 대신 뉴트라아제(최적 활성 조건: pH 6.0, 40 ℃)을 사용하여 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물을 제조하였다.
실시예 4 내지 6. 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물의 1차 분획물
상기 실시예 2에서 제조된 흰점박이꽃무지 유충 단백가수분해물을 이용하여 분획 분자량(molecular weight cut-off, MWCO)이 >10 kDa(10 kDa 초과), 5-10 내지 kDa, <5 kDa(5 kDa 미만)인 한외여과막으로 4 ℃에서 각각 분획을 수행하여 분자량이 >10 kDa(10 kDa 초과), 5-10 내지 kDa, <5 kDa(5 kDa 미만)인 분획물(순서대로 실시예 4, 5, 6)을 제조하였다.
실시예 7 내지 11. 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물의 2차 분획물
ACE 저해 효능이 가장 좋았던 실시예 6의 분획물로 겔 여과 크로마토그래피(Sephadex G-10)를 이용하여 총 5개의 fractions을 얻었다.
구체적으로 5 kDa 이하 분획물을 증류수에 재현탁하여 Sephadex G-25 컬럼 (2.5 × 100 cm)을 사용하여 겔 여과로 분리하였다. 유속은 1.5 ml/min 용출액 분획 10 ml을 UV/VIS 분광광도계로 220 nm에서 흡광도를 측정하여 24분부터 10분마다 2차 분획물을 수확하여 총 5개의 fractions(각각 순서대로 실시예 7(F1), 8(F2), 9(F3), 10(F4), 11(F5))을 얻었다(도 4).
<시험예>
통계처리
실험결과는 3번 이상의 독립적인 실험의 데이터를 mean ± standard error (SE) 값으로 나타내었다. 실험군 사이의 통계적 유의성 검정은 Duncan test 분석방법을 사용하였다.
시험예 1. 식용곤충 추출물의 ACE 저해활성 평가
식용곤충 물 추출물
흰점박이꽃무지 유충, 장수풍뎅이 유충 또는 밀웜 유충을 준비하고, 이를 각각 물과 1 : 20의 중량비로 혼합하여 70 ℃ 하에서 30분 동안 추출한 다음 추출물을 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 회수함으로써 물 추출물을 수득하였다.
식용곤충 주정 추출물
흰점박이꽃무지 유충, 장수풍뎅이 유충 또는 밀웜 유충을 준비하고, 이를 각각 주정과 1 : 20의 중량비로 혼합하여 70 ℃ 하에서 30분 동안 추출한 다음 추출물을 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 회수함으로써 주정 추출물을 수득하였다.
ACE 저해활성
ACE kit-WST (Dojindo Inc., Japan)를 사용하였으며, 제조사의 프로토콜에 따라 시료 용액 50 μL에 ACE 조효소액 50 μL를 가한 다음 37 ℃에서 5분간 예비반응을 시킨 후, 기질 50 μL를 가하고 다시 37 ℃에서 1시간 반응시켰다. 다음 1 N HCl 150 μL를 가하여 반응을 정지시키고 750 μL의 ethyl acetate를 가한 후, 1분간 교반하고 원심분리(4 ℃, 5,000 rpm, 10 min)한 다음 500 μL의 상등액을 얻었다. 이 상등액을 120 ℃에서 30분간 완전히 건조시켜 2 mL의 methanol을 넣은 후 228 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 정어리 물 추출물을 사용하였다.
[수학식 1]
ACE inhibition(%)＝[1－ (CAbs－SAbs)/(CAbs－BAbs) ] × 100
CAbs: 대조구 흡광도, SAbs: 시료 흡광도, BAbs: 시료 무첨가구의 흡광도
구분 ACE 억제 활성(%)
20 ug/ml
대조군 84.2
흰점박이 꽃무지 유충 물 추출물 31.1
장수풍뎅이 유충 물 추출물 12.3
밀웜 유충 물 추출물 5.1
흰점박이 꽃무지 유충 주정 추출물 51.5
장수풍뎅이 유충 주정 추출물 21.4
밀웜 유충 주정 추출물 16.8
위 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 흰점박이 꽃무지 유충은 종래 다른 식용곤충 추출물에 비하여 낮은 농도에서 유의적으로 높은 ACE 제해활성을 가지므로, 고혈압에 우수한 효과가 있는 것을 확인하였다.
특히, 밀웜 유충과 장수풍뎅이 유충을 이용한 물 또는 주정 추출물은 흰점박이 꽃무지 유충을 이용한 물 또는 주정 추출물에 비하여 ACE 제해활성이 현저히 낮은 것을 확인하였다.
시험예 2. 흰점박이 꽃무지 유충 추출물의 항알러지 효능
골수유래 비만세포(BMCMC) 분리 및 배양
6~8주령의 C57/BL6 마우스를 경추탈골로 희생시킨 뒤, 대퇴부를 절단하여 골수세포를 분리하였다. 분리된 세포의 생존율을 확인하였고, 95% 이상의 생존율을 보이는 골수 세포는 10% PWM-SCM(pokeweed mitogen-stimulated spleen cell-conditioned medium) 및 0.2% 2-ME(mercaptoethanol, sigma, USA)가 첨가 된 α-MEM 배지(10% FBS, 1% penicillin-streptomycin)에서 배양되었다. 4~5주 동안 주 1회 계대배양하였고, 비만세포(bone marrow cultured mast cells, BMCMCs)가 90% 이상으로 분화된 후, 실험에 사용하였다.
골수유래 비만세포(BMCMC)에 대한 흰점박이 꽃무지 유충 추출물의 독성 평가
BMCMC의 독성에 대한 흰점박이 꽃무지 유충 추출물이 미치는 영향을 확인하기 위해, 96 well plate에 각 well당 2×104 cells을 동일하게 분주하고 24시간 동안 배양하여 부착시킨 뒤, 시험예 1에서 제조된 흰점박이 꽃무지 유충 물/주정 추출물을 농도별(15.6 ㎍/ml, 31.3 ㎍/ml 및 62.5 ㎍/ml)로 처리하여 24시간 동안 배양한 후, 15 μl의 MTT(5 mg/ml)를 각 well에 첨가하였다. 그 후, 4시간 배양하고 난 뒤, 상층액을 제거하고 100 ul의 DMSO(50% DMSO, 10% SDS, pH 7.4)를 처리하여 형성된 formazan 침전물을 용해시키고 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) reader기를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생존율은 하기 수학식 2에 의해 계산하였다.
[수학식 2]
생존율(%) = 살아있는 세포 수/(살아있는 세포 수+죽어있는 세포 수)×100
골수유래 비만세포(BMCMC)에 대한 β-hexosaminidase 분비 억제 효과 검증
BMCMC의 탈과립에 대한 흰점박이 꽃무지 유충 추출물의 억제 효과를 확인하기 위해, β-hexosaminidase의 분비를 측정하였다. BMCMCs 세포(2 × 104 cells)는 다양한 농도의 시험예 1에서 제조된 흰점박이 꽃무지 유충 물/주정 추출물과 함께 2시간 동안 37 ℃에서 미리 배양한 후, anti-DNP-IgE(1 μg/ml)에 의해 1시간 동안 감작되었다. 여기에 0.1% BSA-Tyroide's buffer 500 μl를 가하여 반응시킨 후 상층액을 분리하였고, 세포에 0.5% triton 100-Tyroide's buffer 50 μl를 처리하여 반응액을 분리하였다. 상층액과 반응액을 각각 β-hexosaminidase의 기질인 substrate buffer(4-p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide 1.3 mg/ml, 0.1 M sodium citrate, pH 4.5)와 혼합하여 37 ℃에서 40분 동안 반응시켰고 각 well당 0.2 M glycine(pH 10.7)을 처리하여 반응을 종결시킨 뒤, ELISA reader기를 이용하여 405 nm의 파장으로 흡광도를 측정하였다.
[수학식 3]
β-hexosaminidase % = [상층액의 흡광도 / (상층액의 흡광도 + 세포의 흡광도)] × 100.
도 1은 시험예 1에서 제조된 흰점박이 꽃무지 유충 물 추출물과 주정 추출물의 BMCMC에 대한 세포 독성을 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 2는 시험예 1에서 제조된 흰점박이 꽃무지 유충 물 추출물과 주정 추출물의 BMCMC에 대한 β-hexosaminidase 방출 억제 효과를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 1에 나타난 바와 같이, 흰점박이 꽃무지 유충 물 추출물과 주정 추출물을 15.6, 31.3과 62.5 μg/ml의 농도로 BMCMC에 처리한 경우, 아무것도 처리하지 않은 대조군(-/-)의 세포 생존율과 유의적으로 별다른 차이를 나타내지 않는 것을 확인하였다. 따라서 흰점박이 꽃무지 유충 물 추출물과 주정 추출물은 BMCMC에 대한 독성이 없음을 알 수 있다.
도 2에 나타난 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 대조군(-/-)보다 anti-DNP-IgE와 DNP-BSA를 처리한 군(+/+)에서 β-hexosaminidase 방출량이 현저히 증가한다는 것을 확인할 수 있다. 그러나 흰점박이 꽃무지 유충 물 추출물과 주정 추출물을 15.6, 31.3, 62.5μg/ml의 농도로 처리한 경우, β-hexosaminidase 방출량이 농도의존적으로 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있다. 이를 통하여 흰점박이 꽃무지 유충 물 추출물과 주정 추출물이 비만세포로부터 β-hexosaminidase 방출량을 감소시킴으로써, 비만세포의 탈과립현상을 효과적으로 억제한다는 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 흰점박이 꽃무지 유충은 세포 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라 세포에서 β-헥소사미니다아제(βhexosaminidase)의 분비를 억제하는 안정한 소재임을 알 수 있다.
시험예 3. 흰점박이 꽃무지 단백가수분해물의 수율 및 ACE 저해활성 평가
실시예 1 내지 3의 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물(순서대로 'Alcalase', 'Flavourzyme', 'Neutrase'로 표기함) 에 대한 단백질 함량과 ACE 저해활성을 시험예 1에 따라 평가하였다. 비교군으로 흰점박이 꽃무지 물 추출물(DW)을 사용하였다. 대조군으로는 정어리 물 추출물(정어리)을 사용하였다. 단백질 함량은 브래드퍼드(Bradford Protein Assay)으로 측정하였다.
도 3은 실시예 1 내지 3의 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물 농도별 ACE 저해활성을 측정하여 나타낸 그래프로, 이에 따르면 본 발명의 실시예 1 내지 3에 따라 제조된 흰점박이 꽃무지 단백가수분해물은 농도 의존적으로 ACE 제해활성이 우수하므로 고혈압에 우수한 효과가 있는 것을 확인하였다.
특히, 대조군인 흰점박이 꽃무지 유충 물 추출물은 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물을 이용한 실시예 1 내지 3과 동일한 효과를 얻기 위해서는 2 배 이상의 용량이 필요하다는 것을 확인할 수 있는 바, 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물이 일반 물 추출물보다 유의적으로 현저히 우수한 ACE 저해활성을 갖는 것을 알 수 있다.
시험예 4. 분자량 별 흰점박이 꽃무지 단백가수분해물의 ACE 저해활성 평가
실시예 2에서 제조된 흰점박이 꽃무지 단백가수분해물 중에서 ACE 저해 효과를 가지는 펩타이드를 함유하는 분획물을 분리하고자 하였다. 이에 한외여과막을 이용하여 실시에 2에서 제조된 흰점박이 꽃무지 단백가수분해물을 >10 kDa(10 kDa 초과), 5-10 내지 kDa, <5 kDa(5 kDa 미만) 분자량별로 분리하였다.
표 2는 실시예 2의 흰점박이 꽃무지 단백가수분해물의 분자량별 분획물(fraction)에 따른 ACE(Angiotensin I converting Enzyme) 저해 효능을 평가하여 항고혈압 활성을 측정한 결과이다.
구분 ACE억제 활성(%)
20 ㎍/ml 40 ㎍/ml
실시예 2 31±1.50 64±0.01
실시예 4
> 10 kDa		 26±1.92 59±1.09
실시예 5
5-10 kDa 		28±1.89 62±1.05
실시예 6
< 5 kDa		 43±1.01 78±1.33
표 2에 나타난 바와 같이, < 5 kDa(5 kDa 미만)의 fraction(실시예 6)에서 ACE(Angiotensin I converting Enzyme) 저해 활성이 가장 우수한 것을 확인하였다.
시험예 5. 2차 분획물에 대한 ACE 저해활성 평가
ACE 저해 효능이 가장 좋았던 실시예 6의 분획물로 겔 여과 크로마토그래피(Sephadex G-10)를 이용하여 총 5개의 fractions(각각 순서대로 실시예 7(F1), 8(F2), 9(F3), 10(F4), 11(F5))을 얻었으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 각 fraction에 대한 ACE(Angiotensin I converting Enzyme) 저해 활성을 측정하여 도 5에 나타내었다.
도 4는 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여, 실시예 6의 분획물(< 5 kDa)에서 분자량에 따라 5종의 분획물(fraction)을 분리한 결과를 나타내고, 도 5는 실시예 7(F1), 8(F2), 9(F3), 10(F4), 11(F5)에 대한 ACE(Angiotensin I converting Enzyme) 저해 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 5종의 분획물(fraction) 중에서 ACE(Angiotensin I converting Enzyme) 저해 활성이 3번째 분획물(실시예 9, F3)이 가장 우수한 것을 확인하였다.
시험예 6. 항고혈압 활성의 펩티드 분리 및 ACE 저해 효능 분석
실시예 7 내지 11로부터 제조된 2차 분획물 중에서 ACE 저해 효능이 가장 좋았던 실시예 9의 2차 분획물의 아미노산 서열을 확인하기 위해 펩타이드들의 분자량 및 아미노산 서열을 Q-TOF mass spectrometer (Micromass, Altrincham, UK) electrospray ionization (ESI)을 사용하여 측정하고 그 결과를 표 3과 도 6에 나타내었다.
서열번호 펩타이드의
아미노산 서열		 m/z
1 SY 269.113
2 GY 239.103
3 PY 279.134
4 YP 279.134
5 GF 223.107
6 IP 229.155
7 LP 229.155
8 PF 263.139
9 YPY 442.197
10 WI 318.181
11 WL 318.181
상기 표 3을 참조하면, 본 발명의 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물로부터 ACE 저해 효능을 갖는 펩타이드들을 확인하였다. 이들은 모두 아미노산 2-3개를 갖는 올리고 펩타이드들인 것으로 확인되었으며, 분자량은 각각 250 내지 450 Da인 것으로 확인되었다.
도 6은 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물로부터 분리된 올리고 펩타이드(서열번호 1-11)에 대한 ACE(Angiotensin I converting Enzyme) 저해 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6에 나타난 바와 같이, 서열번호 1 내지 11의 올리고 펩타이드 모두 ACE 저해활성을 갖는 것을 확인할 수 있다. 다만 500 ㎍/ml의 고농도에서는 서열번호 5 및 8의 올리고 펩타이드를 제외하고 모두 50% 이상의 ACE 저해 활성을 갖는 것을 확인하였다. 따라서 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11의 올리고 펩타이드가 고농도에서 우수한 ACE 저해 활성을 갖는 것을 확인하였다.
또한 서열번호 1(SY)로 표시되는 올리고 펩타이드와 서열번호 11(WI)로 표시되는 올리고 펩타이드는 50 ㎍/ml의 낮은 농도에서 60% 이상의 높은 ACE(Angiotensin I converting enzyme) 저해 효과를 확인하였다.
또한, 서열번호 11(WI)로 표시되는 올리고 펩타이드의 경우, 50 ㎍/ml에서 90% 이상의 ACE(Angiotensin I converting Enzyme) 저해 활성을 보이므로, 서열번호 11(WI)로 표시되는 올리고 펩타이드가 ACE 저해효능이 가장 높음을 확인하였다.
<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> A Composition for Anti-hypertension Using Peptides Derived From Enzymatic Hydrolysates of Protaetia brevitarsis <130> HPC10055 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptides Derived From Enzymatic Hydrolysates of Protaetia brevitarsis <400> 1 Ser Tyr 1 <210> 2 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptides Derived From Enzymatic Hydrolysates of Protaetia brevitarsis <400> 2 Gly Tyr 1 <210> 3 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptides Derived From Enzymatic Hydrolysates of Protaetia brevitarsis <400> 3 Pro Tyr 1 <210> 4 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptides Derived From Enzymatic Hydrolysates of Protaetia brevitarsis <400> 4 Tyr Pro 1 <210> 5 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptides Derived From Enzymatic Hydrolysates of Protaetia brevitarsis <400> 5 Gly Phe 1 <210> 6 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptides Derived From Enzymatic Hydrolysates of Protaetia brevitarsis <400> 6 Ile Pro 1 <210> 7 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptides Derived From Enzymatic Hydrolysates of Protaetia brevitarsis <400> 7 Leu Pro 1 <210> 8 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptides Derived From Enzymatic Hydrolysates of Protaetia brevitarsis <400> 8 Pro Phe 1 <210> 9 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptides Derived From Enzymatic Hydrolysates of Protaetia brevitarsis <400> 9 Tyr Pro Tyr 1 <210> 10 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptides Derived From Enzymatic Hydrolysates of Protaetia brevitarsis <400> 10 Trp Ile 1 <210> 11 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptides Derived From Enzymatic Hydrolysates of Protaetia brevitarsis <400> 11 Trp Leu 1

Claims (16)

  1. 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물은 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 추출물을 플라보르자임(Flavourzyme), 알칼라아제(Alcalase), 프로테아제(Protease), 뉴트라아제(Neutrase) 또는 이들의 혼합효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 가수분해효소로 가수분해한 것을 특징으로 하는 고혈압의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 하에서 추출된 것을 특징으로 하는 고혈압의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물은 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물의 상등액을 분자량에 따라 분획하였을 때, 5 kDa 미만의 분자량을 갖는 1차 분획물인 것을 특징으로 하는 고혈압의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물은 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물의 상등액을 분자량에 따라 분획하였을 때, 5 kDa 미만의 분자량을 갖는 1차 분획물을 겔 여과 크로마토그래피에 로딩하여 분자량 분배 크로마토 그래피(Sephadex G-10)으로 1.5 ml/min의 유속으로 30 분 내지 200 분 사이에 분획된 2차 분획물일수 있으며, 수득한 펩타이드는 분획된 2차 분획물인 것을 특징으로 하는 고혈압의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 올리고 펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드인 것을 특징으로 하는 고혈압의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 올리고 펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 11 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 고혈압의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 식품 조성물은 건강기능식품인 것을 특징으로 하는 고혈압의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  9. 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물은 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 추출물을 플라보르자임(Flavourzyme), 알칼라아제(Alcalase), 프로테아제(Protease), 뉴트라아제(Neutrase) 또는 이들의 혼합효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 가수분해효소로 가수분해한 것을 특징으로 하는 고혈압의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 하에서 추출된 것을 특징으로 하는 고혈압의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물은 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물의 상등액을 분자량에 따라 분획하였을 때, 5 kDa 미만의 분자량을 갖는 1차 분획물인 것을 특징으로 하는 고혈압의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물은 흰점박이 꽃무지 유충 단백가수분해물의 상등액을 분자량에 따라 분획하였을 때, 5 kDa 미만의 분자량을 갖는 1차 분획물을 겔 여과 크로마토그래피에 로딩하여 분자량 분배 크로마토 그래피(Sephadex G-10)으로 1.5 ml/min의 유속으로 30 분 내지 200 분 사이에 분획된 2차 분획물인 것을 특징으로 하는 고혈압의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 올리고 펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드인 것을 특징으로 하는 고혈압의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 제9항에 있어서,
    상기 올리고 펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 11 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 고혈압의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  16. 흰점박이 꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충 단백가수분해물으로부터 분리된 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
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