WO2011016220A1 - ジペプチジルペプチダーゼ－４阻害剤 - Google Patents

ジペプチジルペプチダーゼ－４阻害剤 Download PDF

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WO2011016220A1
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beans
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雄仁 富永
真一 横田
田中　穂積
岸田　秀之
雅康 北川
博 舘
太田　徹
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株式会社カネカ
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Definitions

  • the present invention relates to a dipeptidyl peptidase-4 inhibitor and a method for producing the same. Furthermore, the present invention relates to a preventive and / or ameliorating agent for diabetes containing the dipeptidyl peptidase-4 inhibitor.
  • Dipeptidyl peptidase-4 (Dipeptidyl Peptidase-4, hereinafter referred to as “DPP-4”) is one of serine proteases and is an enzyme that recognizes and cleaves the second proline or alanine from the N-terminus of a peptide. is there. DPP-4 is widely distributed in mammalian tissues and is known to be present particularly in kidney, liver, intestinal epithelium, placenta and plasma. The role of DPP-4 in mammals has not been fully clarified, but it plays an important role in neuropeptide metabolism, T cell activation, cancer cell adhesion to endothelial cells, and HIV entry into cells. It is thought that he plays.
  • glucagon-like peptide-1 Glucagon-Like Peptide-1: hereinafter referred to as “GLP-1”
  • GLP-1 glucagon-Like Peptide-1
  • Glucose— DPP-4 has been attracting attention as an enzyme that inactivates dependent Insulotropic Peptide
  • GLP-1 physiological effects include glucagon secretion-inhibiting, pancreatic ⁇ -cell protection and proliferation, gastric excretion, liver Glycogen synthase promoting action. Furthermore, in the center, it acts on the satiety center in the hypothalamus to cause a decrease in food intake (Non-patent Document 2).
  • DPP-4 is also involved in the metabolism of neuropeptides such as neuropeptide Y, endomorphin 1, endomorphin 2, and substance P. Therefore, a compound that inhibits DPP-4 can also be expected as a therapeutic agent or analgesic for schizophrenia, depression, anxiety, epilepsy, and stress diseases by suppressing the degradation of these physiologically active peptides. Furthermore, DPP-4 is known to be involved in the metabolism of various cytokines and chemokines, activation of T cells that are immunocompetent cells, adhesion of cancer cells to endothelium, proliferation of blood cells, and the like.
  • compounds that inhibit DPP-4 through these actions are not only diabetes, but also rheumatoid arthritis, autoimmune diseases, allergic diseases such as asthma and food allergy, cancer, cancer metastasis, HIV infection, anemia It is considered useful for prevention and / or improvement of thrombocytopenia and the like.
  • DPP-4 inhibitors Many compounds obtained by chemical synthesis have been reported as DPP-4 inhibitors (Patent Documents 1, 2, 3, and 4). Some of these have already been put to practical use as antidiabetic drugs.
  • natural product-derived DPP-4 inhibitors include gelatin-derived peptides (Patent Document 5), milk casein-derived peptides (Patent Document 6), hydrolyzed tannins (Patent Document 7), paprika and other plant extracts.
  • Patent Document 8 A thing (patent document 8) etc. are known.
  • a product obtained by hydrolyzing a protein by a known method can be used to prevent and / or treat symptoms mediated by DPP-4 (Patent Document 9).
  • the present invention relates to a DPP-4 inhibitor and a DPP-4 inhibitor that are suitable for oral consumption from the viewpoint of not only DPP-4 inhibitory activity but also taste and absorbability, using natural products with food experience as raw materials It is an object of the present invention to provide compositions (such as foods and drinks, functional foods, pharmaceuticals, enteral nutrients, feeds, etc.) that prevent and / or improve diabetes containing glycine.
  • a peptide bond of a protein in a specific bean can be obtained by hydrolysis with a microorganism or a proteolytic enzyme derived from a microorganism. It has been found that it has an effect and is excellent in taste, and has completed the present invention.
  • the present invention relates to a DPP-4 inhibitor obtained by treating red beans or kidney beans with a microorganism or a proteolytic enzyme produced by the microorganism.
  • the microorganism is preferably one or more selected from the group consisting of koji molds, lactic acid bacteria and natto bacteria
  • the proteolytic enzyme is derived from one or more microorganisms selected from the group consisting of koji molds, lactic acid bacteria and natto bacteria.
  • the preferred embodiment is an enzyme.
  • the present invention also relates to a DPP-4 inhibitor obtained by treating soybean with a koji mold or a protease derived from koji mold.
  • the present invention relates to a method for producing a DPP-4 inhibitor, characterized by treating red beans or kidney beans with a microorganism or a proteolytic enzyme produced by the microorganism.
  • a specific bean having a dietary experience is treated with a microorganism or a microorganism-derived enzyme that has been commonly used in foods, so that a DPP-4 inhibitor having excellent DPP-4 inhibitory activity, , Foods and drinks, functional foods, pharmaceuticals, feeds and the like containing the same as an active ingredient are provided.
  • the DPP-4 inhibitor of the present invention is not only superior in terms of safety from the above points, but is also particularly suitable for oral ingestion in terms of taste and absorbability.
  • the DPP-4 inhibitor of the present invention is useful as an active ingredient of a composition for preventing and / or improving diabetes.
  • the DPP-4 inhibitor of the present invention is obtained by treating red beans or kidney beans with a microorganism or a proteolytic enzyme produced by the microorganism. That is, the present invention is also a method for producing a DPP-4 inhibitor, which comprises treating red beans or kidney beans with a microorganism or a proteolytic enzyme produced by the microorganism.
  • the peptide bond of the protein in the beans described above is hydrolyzed and fragmented (lower molecular weight) is considered to be involved as an active ingredient of the DPP-4 inhibitor.
  • a DPP-4 inhibitor comprising a protein hydrolyzate derived from red beans or kidney beans as an active ingredient is also included in the present invention.
  • the microorganism used for treating red beans or kidney beans is not particularly limited, but a microorganism producing a proteolytic enzyme is preferred, and a microorganism used for food production is preferred from the viewpoint of safety.
  • Specific examples of such microorganisms include koji molds, lactic acid bacteria, and natto bacteria. Of these, koji mold is particularly preferable.
  • the proteolytic enzyme used for treating red beans or kidney beans is not particularly limited as long as it is a proteolytic enzyme derived from a microorganism capable of hydrolyzing peptide bonds.
  • a proteolytic enzyme derived from the bacterium is preferred, and a proteolytic enzyme derived from Aspergillus is more preferred.
  • a soybean obtained by treating soybean with a koji mold or a protease derived from koji mold can also be used as a DPP-4 inhibitor.
  • the koji mold used in the present invention or the origin of the enzyme used is not particularly limited as long as it is related to food production at home and abroad and is safe, such as soy sauce, miso, and sake. You can use what is used for production.
  • Aspergillus include Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus kawachii, Aspergillus asparis, Aspergillus asparis -In addition to the genus Aspergillus, such as Aspergillus glaucus, red koji molds and the like can be mentioned.
  • a koji mold for soy sauce in terms of high protease activity, more preferably Aspergillus oryzae or Aspergillus sojae, and particularly preferably Aspergillus oryzae.
  • the lactic acid bacterium used in the present invention or derived from the enzyme to be used is not particularly limited as long as it is a bacterium that produces lactic acid by metabolism, and specifically, Lactobacillus genus, bifido Examples include Bifidobacterium genus, Enterococcus genus, Lactococcus genus, Pediococcus genus, Leuconostoc genus and the like.
  • Bacillus subtilis natto Bacillus subtilis var. Natto
  • examples of Bacillus subtilis natto can be given as examples of Bacillus subtilis natto used in the present invention or derived from the enzyme used.
  • proteolytic enzymes include peptidases that hydrolyze peptide bonds of peptides and proteases that hydrolyze peptide bonds of proteins.
  • the proteolytic enzyme used in the present invention may be a purified single peptidase or a single protease, or a composition containing a plurality of peptidases or proteases. Further, it may be a composition containing other enzymes to the extent that the activity of peptidase or protease is not impaired.
  • a commercially available product can be used as described later, or a cell-treated product or a partially purified product obtained by crushing or partially purifying a microorganism that produces the proteolytic enzyme. Enzymes may be used.
  • a processed product of a recombinant bacterium producing a proteolytic enzyme or an enzyme derived from the recombinant bacterium may be used. Ordinary genetic engineering techniques can be used to produce the recombinant bacteria.
  • the protein is preferably decomposed into a peptide having a lower molecular weight.
  • the proteolytic enzyme used in the present invention preferably contains a peptidase. .
  • X-prolyl dipeptidyl aminopeptidase is an enzyme that specifically releases amino terminal X-proline (X is an arbitrary amino acid residue) in a dipeptide unit. It is thought that it is easier to lower the molecular weight. From such a viewpoint, the microorganism or proteolytic enzyme used in the present invention is more preferably one having X-prolyl dipeptidyl aminopeptidase activity. Aspergillus oryzae has been reported to produce X-prolyl dipeptidyl aminopeptidase (H. Tachi, Phytochemistry, 31 (11), 3707-3709 (1992)). *
  • a commercially available proteolytic enzyme when used, its type is not particularly limited, but those commercially available as food additives can be suitably used.
  • Umamizyme G Protease A “Amano” G, Protease A “Amano” SD, Protease M “Amano” G, Protease M “Amano” SD (above, manufactured by Amano Enzyme Inc.), Sumiteam ⁇ LP, Sumiteam FP, Sumiteam LPL (Nippon Chemical Industry Co., Ltd.), Pandidase-2NP-2 (Yakult Pharmaceutical Co., Ltd.), Orientase ONS (Hibiai Co., Ltd.) and the like.
  • said proteolytic enzyme changes a shape, it can be used for this invention.
  • the shape may be granular, powder or liquid. As long as the protein can be hydrolyzed, it can be used in the present invention.
  • equinezyme G is more preferably used from the viewpoint of the strength of X-prolyl dipeptidyl aminopeptidase activity.
  • the red beans as raw materials for the DPP-4 inhibitor of the present invention are cowpea red beans (Vigna angularis), soybeans are soybeans (Glycine max), and kidney beans are kidney beans (Phaseolus vulgaris). Beans also include varieties such as Torame, Otobe, Uzura and Daifuku.
  • GMO soybean genetically modified soybean
  • non-GMO soybean can be used more suitably than GMO soybean from the viewpoint of DPP-4 inhibitory activity and taste.
  • the beans used in the present invention can be made from the beans themselves, or compositions such as natto, soy sauce, soy milk, rice bran, and the like, and the like, okaras and defatted products made from beans. Residues after making other foods from beans such as beans can also be used as raw materials.
  • the beans can be used as raw materials for producing the DPP-4 inhibitor of the present invention as they are, but drying, crushing, pulverizing, heating, pressing, degreasing, acid treatment, alkali treatment, juice extraction, extraction, etc.
  • the pre-processing may be performed. These pretreatments can be carried out in combination of two or more.
  • the method for treating the beans with microorganisms is not particularly limited.
  • microorganisms are grown on the surface, or water is added after the microorganisms are grown and further reacted to hydrolyze the peptide bonds of the proteins in the beans.
  • disassembling is mentioned.
  • a method of growing microorganisms in a state in which a bean material or a processed product thereof is suspended and / or dissolved in a liquid such as water, a method of growing a microorganism in a processed liquid bean product, and the like are also included.
  • the method for treating the beans with a proteolytic enzyme is not particularly limited.
  • proteolytic enzyme is sprinkled on the surface, or proteolytic enzyme is allowed to act in a state where the legume material or the treated product is suspended and / or dissolved in a liquid such as water.
  • a method of adding a proteolytic enzyme to a processed liquid bean product is included.
  • the processed microorganism or proteolytic enzyme obtained by the above method can be used as it is as a DPP-4 inhibitor, but it is deodorized and decolorized as long as the DPP-4 inhibitory activity is not lost. Etc. may be performed. Further, in order to concentrate the DPP-4 inhibitory active ingredient, fractionation by a method such as extraction, precipitation, filtration, ultrafiltration, column chromatography, or a combination of these methods may be performed.
  • the DPP-4 activity is determined by adding, for example, Glycyl-L-proline 4-methylcoumeric-7-amide as a substrate to the human DPP-4 enzyme, and measuring the amount of 7-amino-4-methylcoumarin produced with a fluorometer. It can be measured by quantification.
  • the DPP-4 activity is compared in the presence (sample) and absence (solvent control) of the analyte to be evaluated for DPP-4 inhibitory activity.
  • a sample in which DPP-4 activity is significantly reduced with respect to 4 activities is evaluated as “having DPP-4 inhibitory activity”.
  • the DPP-4 inhibitor of the present invention preferably has a DPP-4 activity of 70% or less, preferably 60% or less when the DPP-4 activity of the solvent control is 100%. More preferred are those that are 50% or less.
  • the DPP-4 inhibitor of the present invention may have not only DPP-4 inhibitory activity but also ⁇ -glucosidase inhibitory activity in a preferred embodiment.
  • the ⁇ -glucosidase activity can be measured, for example, by adding sucrose as a substrate to yeast-derived ⁇ -glucosidase and incubating, and quantifying the produced glucose with a commercially available glucose quantification kit.
  • the ⁇ -glucosidase activity is compared between the presence (sample) and absence (solvent control) of the sample to be evaluated for ⁇ -glucosidase inhibitory activity, and the ⁇ -glucosidase activity of the solvent control is compared.
  • a sample in which ⁇ -glucosidase activity is significantly reduced with respect to glucosidase activity is evaluated as “having ⁇ -glucosidase inhibitory activity”.
  • the DPP-4 inhibitor of the present invention preferably has an ⁇ -glucosidase inhibitory activity with which the ⁇ -glucosidase activity of the sample is 90% or less when the ⁇ -glucosidase activity of the solvent control is 100%, Those having an ⁇ -glucosidase inhibitory activity of 80% or less are more preferable.
  • a method for obtaining a peptide by hydrolyzing a protein tends to cause bitterness and odor.
  • the DPP-4 inhibitor of the present invention obtained by treating red beans or kidney beans with microorganisms, or a proteolytic enzyme produced by microorganisms, or soybeans, is treated with Aspergillus or aspergillus-derived proteolytic enzymes.
  • the DPP-4 inhibitor of the present invention obtained in the present invention has little bitterness and odor, and in particular, when a koji mold or a koji mold-derived proteolytic enzyme is used, a DPP-4 inhibitor excellent in taste is produced. I can do it. Therefore, the DPP-4 inhibitor of the present invention can be particularly preferably used for a composition for oral intake that is preferably excellent in taste.
  • the composition for oral intake as used herein refers to a composition that is taken orally by humans, livestock, pets, and the like, and specifically refers to foods and drinks, pharmaceuticals, feeds, and the like.
  • the DPP-4 inhibitor of the present invention can be used as a composition for oral intake as described above, or used as a composition that is directly administered into the digestive tract and absorbed from the digestive tract, such as enteral nutrition. You can also. Moreover, it can be used as it is for food and drink, for medicine, and for feed, but as a composition containing this, it can also be used for uses such as for food and drink, for medicine and for feed.
  • the form is not limited.
  • functional foods health functional foods (specific health foods, Functional foods), health foods, dietary supplements, sports supplements, etc.
  • it can be used as an easily available drug such as OTC, quasi-drug, cosmetics, etc. in addition to a medical drug for pharmaceutical use.
  • the DPP-4 inhibitor of the present invention When the DPP-4 inhibitor of the present invention is ingested as a general food or a functional food, it can be ingested directly, or as a composition mixed with additives such as known carriers and auxiliaries, Capsule, tablet, granule and other forms that can be taken easily can be taken.
  • additives such as known carriers and auxiliaries, Capsule, tablet, granule and other forms that can be taken easily can be taken.
  • various vitamins such as vitamins A, C, D and E can be added and used in combination.
  • Other functional foods to be used as a mixture are not particularly limited, but are known to be metabolic control effects such as blood glucose lowering action, lipid lowering action, anti-obesity action, etc., blood pressure lowering action, osteoporosis prevention and / or improvement action, etc. Examples of functional foods that have been used.
  • confectionery such as chewing gum, chocolate, candy, jelly, biscuits and crackers
  • frozen confectionery such as ice cream and ice confectionery
  • beverages such as tea, soft drinks, energy drinks and beauty drinks
  • udon Noodles such as Chinese noodles, spaghetti and instant noodles
  • kneaded products such as rice cakes, bamboo rings and hampen
  • seasonings such as dressings, mayonnaise and sauces
  • fats and oils such as margarine, butter and salad oil
  • bread, ham, soup, retort food It can be used for general foods such as frozen foods.
  • the dosage form is not particularly limited, and examples thereof include capsules, tablets, granules, injections, suppositories, and patches.
  • other pharmaceutically acceptable formulation materials such as excipients, disintegrants, lubricants, binders, antioxidants, colorants, anti-aggregation agents, absorption enhancers, solubilizers An agent, a stabilizer and the like can be added as appropriate.
  • the DPP-4 inhibitor of the present invention when used for medicine, it may be combined with other drugs such as antidiabetic drugs, antiobesity drugs, and anti-osteoporosis drugs.
  • other drugs such as antidiabetic drugs, antiobesity drugs, and anti-osteoporosis drugs.
  • Other anti-diabetic drugs and anti-obesity drugs are not particularly limited.
  • sulfonylurea drugs biguanide drugs, ⁇ -glucosidase inhibitors, insulin preparations, islin secretion promoters, insulin sensitizers, PPAR agonists ( PPAR ⁇ agonist, PPAR ⁇ agonist, PPAR ⁇ + ⁇ agonist), ⁇ 3 adrenergic receptor agonist, aldose reductase inhibitor, DPP-4 inhibitor, AMP kinase activator, type 1 11 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase (11 ⁇ -HSD1) Inhibitors, lipase inhibitors, appetite suppressants and the like.
  • Anti-osteoporosis drugs include active vitamin D3 preparations, estrogen preparations, selective estrogen receptor modulators, bisphosphonate preparations, vitamin K2 preparations, calcium preparations and the like.
  • ⁇ -Glucosidase is an enzyme that decomposes disaccharides such as maltose and sucrose into monosaccharides in the intestine. It is known that by inhibiting ⁇ -glucosidase, absorption of polysaccharides and disaccharides can be suppressed, and hyperglycemia after meals is remarkably suppressed, which is effective in preventing or improving diabetes. .
  • the ⁇ -glucosidase inhibitor has no effect on the increase in blood glucose level due to glucose intake.
  • the ⁇ -glucosidase inhibitor has limitations on how to take it, for example, its effect cannot be obtained unless it is taken immediately before meals.
  • the DPP-4 inhibitor of the present invention is not only effective in increasing blood glucose level due to glucose intake, but also has a high merit in that it does not matter when it is taken. Furthermore, since the DPP-4 inhibitor of the present invention preferably has both DPP-4 inhibitory activity and ⁇ -glucosidase inhibitory activity as described above, a stronger blood glucose level lowering effect can be expected.
  • the composition containing the DPP-4 inhibitor of the present invention can be used as a composition for preventing and / or improving diabetes.
  • the DPP-4 inhibitor of the present invention includes a blood glucose elevation inhibitor, a blood glucose lowering agent, an insulin secretion promoter, an active GLP-1 amount increasing agent, a glucagon secretion inhibitor, a pancreatic ⁇ cell regeneration promoter and / or It can also be used as an accelerator for sugar uptake into muscle.
  • the present invention is also a method for preventing and / or improving diabetes, wherein the DPP-4 inhibitor is administered to a subject.
  • the present invention is also a method for suppressing an increase in blood glucose level, in which the DPP-4 inhibitor is administered to a subject.
  • Diabetes prevention includes reducing the risk of developing diabetes.
  • the subjects of administration in the above cases include diabetic patients, diabetic reserve army (those that are in the normal range but have high blood sugar levels, and that the risk of developing diabetes is high due to genetic factors or lifestyle habits. ) Is preferred, but healthy individuals are also included.
  • a DPP-4 activity is measured using a commercially available measurement kit (DPP-4 Drug Discovery kit manufactured by BIOMOL) according to the instructions attached to the kit, and the DPP-4 activity is compared. Inhibitory activity was evaluated.
  • the measurement method is briefly shown below. In a white 96 half area plate attached to the measurement kit, 50 ⁇ L of a blank well, 35 ⁇ L of a control well, and 25 ⁇ L of a buffer (50 mM Tris, pH 7.5) were placed in a sample well.
  • the DPP-4 activity of the sample was calculated as follows, assuming the value of DPP-4 activity in the control as 100%.
  • DPP-4 activity (%) ⁇ (AB) / (CD) ⁇ ⁇ 100
  • A is the fluorescence intensity of the sample well 12 minutes after the start of incubation
  • B is the fluorescence intensity of the sample well immediately after the start of incubation
  • C is the fluorescence intensity of the control well 12 minutes after the start of incubation
  • D is the control well immediately after the start of incubation Represents the fluorescence intensity.
  • Example 1 Preparation of a koji mold processed product of beans 1 kg of each of commercially available soybeans, red beans, Otobe, Daifuku beans, purple flower beans and shikaku beans were steamed and then crushed, and if necessary, fried rice crackers were processed. After adding water to adjust the water content to about 50%, it was placed in a container equipped with a filter and capable of supplying sterile air, and autoclaved at 121 ° C. for 30 minutes.
  • bran bran obtained using Aspergillus oryzae KBN616 (manufactured by Bioc Co., Ltd.) is inoculated into the sterilized raw material so that microorganisms other than Neisseria gonorrhoeae are not mixed in the clean bench, and sterile air is placed in the container. For 48 hours at 31 ° C.
  • each gonococcal treatment solution was heated at 90 ° C. for 30 minutes and then filtered to obtain a clear solution. This was centrifuged at 14000 g for 100 minutes using a centrifugal ultrafiltration device with a molecular weight cut off of 3000 (Millipore Microcon YM-3), and the resulting filtrate was lyophilized to give a koji mold for each legume.
  • Got. The obtained bean bacilli-treated product was dissolved in water to a concentration of 10 mg / mL to give a sample (1 mg / mL as the concentration when measuring DPP-4 activity), and the DPP-4 inhibitory activity of each sample was described above. The method was evaluated. The results are shown in Table 1.
  • the processed products of Aspergillus and Daifuku beans which are a kind of soybeans, red beans, and kidney beans, have DPP-4 inhibitory activity, and the inhibitory activity is compared with other beans (purple beans, It was confirmed that it was higher than the processed product of koji mold.
  • Example 2 Preparation of Bean Proteolytic Enzyme Processed Products 3 g of commercially available red beans, peas, and big and late were pulverized in a mill and then autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes. After putting this in a container, 30 mL of water and 3 mL of a proteolytic enzyme solution (Umamizyme G (Amano Enzyme Inc.), 1% w / v aqueous solution) prepared separately were added. This was incubated at 45 ° C. for 24 hours, and then centrifuged at 1800 g for 30 minutes to remove undecomposed residues. The supernatant was collected and heated at 99 ° C.
  • a proteolytic enzyme solution Umamizyme G (Amano Enzyme Inc.)
  • any of the proteolytic enzyme processed products of red beans, trap beans, and major and late had DPP-4 inhibitory activity.
  • Example 3 Preparation of Proteolytic Enzyme Product of Beans (Preparation of Time-Change Sample) 3 g each of commercially available red beans, peas, and big and late beans were pulverized with a mill and then autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes. After putting this in a container, 30 mL of water and 3 mL of a proteolytic enzyme solution (Umamizyme G (Amano Enzyme Inc.), 1% w / v aqueous solution) prepared separately were added. This was started at 45 ° C. The reaction mixture was sampled 1 mL each before the start of incubation and 24 hours after the start, and each sample was heated at 99 ° C.
  • a proteolytic enzyme solution Umamizyme G (Amano Enzyme Inc.)
  • DPP-4 inhibitory activity was not observed before the enzyme treatment in any of red beans, peas, and dynasty, and DPP-4 inhibitory activity was observed in those subjected to the enzyme treatment for 24 hours. That is, it was clarified that the DPP-4 inhibitory activity does not appear in the water extract of red beans and kidney beans, but appears for the first time when each of the red beans and kidney beans is treated with an enzyme.
  • Example 4 Animal evaluation test Actually, the in-vivo of the enzyme-treated product of red beans, peas, and Odeki produced in Example 2 and the enzyme-treated product of defatted soybean prepared in the same manner as in Example 2 was evaluated using an oral glucose tolerance test.
  • C57BL / 6J SPF male mice (CLEA Japan, Inc.) were used at 10 weeks of age. Twenty mice were divided into 4 groups with 5 mice in each group. A total of four groups were evaluated in one experiment, that is, a control group (distilled water administration), a positive control group (sitagliptin administration) and two sample groups, and this experiment was performed twice to evaluate a total of four samples. .
  • Distilled water (control group), sitagliptin suspension (positive control group) or legume enzyme-treated aqueous solution (sample group) was orally administered at 10 mL / kg body weight. 30 minutes after administration of distilled water, sitagliptin suspension or sample, 40% aqueous glucose solution was orally administered at 5 mL / kg body weight. Blood was collected from the tail vein at 30, 60 and 120 minutes after oral administration of glucose, and the blood glucose level was measured in the same manner as the pre-value. Table 4 shows the blood glucose level measurement results.
  • Example 5 Measurement of ⁇ -Glucosidase Inhibition
  • the proteolytic enzyme-treated product of red beans prepared in Example 2 and the enzyme-treated product of defatted soybean prepared by the same method as in Example 2 were each 16.7 mg / mL.
  • the sample was dissolved in 0.25M phosphate buffer (pH 6.8), which is an assay buffer, to obtain a sample concentration.
  • the ⁇ -glucosidase activity was measured as follows. That is, 60 ⁇ L of sample was added to a 96-well plate, and 60 ⁇ L of assay buffer was added to a control well.
  • yeast-derived ⁇ -glucosidase (oriental yeast) prepared to 1.25 U / mL (10 ⁇ g protein / mL) was added and pre-incubated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • 20 ⁇ L of a 250 mM sucrose solution dissolved in assay buffer was added and incubated at 37 ° C. for 20 minutes (the concentration of the enzyme-treated product during the reaction was 10 mg / ml).
  • 100 ⁇ L of 2M Tris-HCl buffer (pH 7.0) was added to stop the reaction.
  • ⁇ -glucosidase activity (%) (A / B) ⁇ 100
  • A is the glucose level of the sample
  • B is the value of the glucose level of the control.
  • Example 6 Taste comparison of processed products of proteolytic enzymes of red beans and soybeans After grinding 6 g of commercially available red beans with a mill, they were sterilized by autoclave at 121 ° C for 15 minutes. Divided into these two, each was put in a separate container, then 30 mL of water and a separately prepared proteolytic enzyme solution (Umamizyme G (Amano Enzyme Inc .; protease derived from Aspergillus oryzae) 1% w / v aqueous solution or Bromelain F ( Amano Enzyme Inc .; pineapple-derived protease) 1% w / v aqueous solution) 3 mL each was added.
  • Umamizyme G Amano Enzyme Inc .; protease derived from Aspergillus oryzae
  • Bromelain F Amano Enzyme Inc .; pineapple-derived protease
  • the enzyme-treated product using an enzyme derived from Aspergillus is less bitter than the enzyme-treated product using a plant-derived enzyme (bromelain) in both the red bean enzyme-treated product and the soybean enzyme-treated product.
  • excellent in terms the red bean enzyme-treated product and the soybean enzyme-treated product were superior in that the red bean enzyme-treated product had less bitterness.

Abstract

　本発明は、食品を原料として得られる、味、吸収性の点からも経口摂取用途に適した、ＤＰＰ－４阻害剤および該ＤＰＰ－４阻害剤を含有する糖尿病を予防及び／又は改善する組成物を提供することを課題とする。本発明は、小豆またはインゲン豆を、微生物、または、微生物が産生する蛋白質分解酵素で処理して得られることを特徴とするＤＰＰ－４阻害剤を提供する。中でも小豆を麹または麹菌由来の蛋白質加水分解酵素で加水分解して、小豆中の蛋白質を断片化することにより、好適なＤＰＰ－４阻害剤が得られる。

Description

ジペプチジルペプチダーゼ－４阻害剤
　本発明は、ジペプチジルペプチダーゼ－４阻害剤およびその製造方法に関する。さらに、本発明は該ジペプチジルペプチダーゼ－４阻害剤を含有する糖尿病の予防及び／又は改善剤に関する。
　ジペプチジルペプチダーゼ－４（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ　Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ－４、以下「ＤＰＰ－４」と記載する）は、セリンプロテアーゼの１つであり、ペプチドのＮ末端から２番目のプロリン又はアラニンを認識して切断する酵素である。ＤＰＰ－４は哺乳動物組織中に広く分布し、特に腎臓、肝臓、腸管上皮、胎盤および血漿中に存在することが知られている。哺乳類におけるＤＰＰ－４の役割は完全には明らかになっていないが、神経ペプチドの代謝、Ｔ細胞の活性化、ガン細胞の内皮細胞への接着やＨＩＶの細胞内への侵入等において重要な役割を演じていると考えられている。ＤＰＰ－４の基質としては、栄養、代謝、免疫系および痛覚などに関連するペプチドが知られている。なかでも、グルコース依存的なインスリンの分泌亢進作用を示すグルカゴン様ペプチド－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－Ｌｉｋｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ－１：以下、「ＧＬＰ－１」と記載する）や胃抑制ポリペプチド（Ｇａｓｔｒｉｃ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅまたはＧｌｕｃｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅ）を、不活性化する酵素として、ＤＰＰ－４は注目されてきている（非特許文献１）。
　ＧＬＰ－１の生理作用としては、膵臓のβ細胞からのグルコース依存的なインスリンの分泌作用の他に、グルカゴンの分泌抑制作用、膵臓β細胞の保護及び増殖作用、胃排泄の抑制、肝臓でのグリコーゲン合成酵素促進作用などがある。さらに中枢においては視床下部の満腹中枢に作用して摂食量の減少を引き起こす（非特許文献２）。
　ＤＰＰ－４活性を阻害することなどによってＧＬＰ－１の分解を抑制すれば、グルコース濃度依存的にインスリン分泌を促進するなどＧＬＰ－１の有する生理活性が増強される事も知られている。これらの事実からＤＰＰ－４阻害作用を有する化合物は、１型糖尿病及び２型糖尿病などにおいて認められる耐糖能不全、食後高血糖、空腹時高血糖やそれに伴う肥満・糖尿病性合併症などに効果を示すことが期待される。また、インスリン分泌を促進し、筋肉への糖の取り込みを促進することから、運動時の筋肉へエネルギー供給を助ける作用も期待される。
　ＤＰＰ－４は、ニューロペプチドＹ、エンドモルフィン１、エンドモルフィン２、サブスタンスＰといった神経ペプチドの代謝にも関与している。したがって、ＤＰＰ－４を阻害する化合物は、これらの生理活性ペプチドの分解を抑制することにより、精神分裂病、鬱、不安、てんかん、ストレス性疾患の治療薬や鎮痛薬としても期待できる。さらにＤＰＰ－４は、種々のサイトカイン類やケモカイン類の代謝や、免疫担当細胞であるＴ細胞の活性化、癌細胞の内皮への接着、血液細胞の増殖等に関与していることが知られているので、これらの作用を介して、ＤＰＰ－４を阻害する化合物は、糖尿病の他に、関節リウマチ、自己免疫疾患、喘息や食物アレルギー等のアレルギー疾患、癌、癌転移、ＨＩＶ感染、貧血、血小板減少症等の予防及び／又は改善に有用であると考えられている。
　ＤＰＰ－４阻害剤としては化学合成によって得られる化合物が多数報告されている（特許文献１，２，３，４）。これらの内いくつかのものは既に糖尿病治療薬として実用化されている。一方、天然物由来のＤＰＰ－４阻害剤としては、ゼラチン由来のペプチド（特許文献５）、乳カゼイン由来のペプチド（特許文献６）、加水分解型タンニン（特許文献７）、パプリカなどの植物抽出物（特許文献８）などが知られている。また、ＤＰＰ－４を介した症状を予防及び／又は治療するために、蛋白質を公知の方法で加水分解して得られる物が使用できることが報告されている（特許文献９）。
特表２００５－５００３２１号公報 特表２００４－５３５４５５号公報 特表２００４－５３６１１５号公報 特開２０００－３２７６８９号公報 ＷＯ２００８／０６６０７０号公報 特開２００７－３９４２４号公報 特開２００８－２８０２９１号公報 特開２００７－２７７１６３号公報 特表２００８－５００３０４号公報
日薬理誌　１２５，３７９～３８４（２００５） Ｅｘｐｅｒｔ　Ｏｐｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．　Ｄｒｕｇｓ　１０９１－１１０２　（２００４）
　本発明は、食経験のある天然物を原料とし、ＤＰＰ－４阻害活性だけでなく、味、吸収性の点からも経口摂取用途に適した、ＤＰＰ－４阻害剤および該ＤＰＰ－４阻害剤を含有する糖尿病を予防及び／又は改善する組成物（飲食品、機能性食品、医薬品、経腸栄養剤、飼料等）を提供することを課題とする。
　本発明者らは前記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定の豆類中の蛋白質のペプチド結合を、微生物や微生物由来の蛋白質分解酵素によって加水分解して得られるものに、ＤＰＰ－４阻害作用があり、また味の点でも優れていることを見いだし、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、小豆またはインゲン豆を、微生物、または、微生物が産生する蛋白質分解酵素で処理して得られることを特徴とするＤＰＰ－４阻害剤に関する。上記微生物としては、麹菌、乳酸菌および納豆菌からなる群より選ばれる１種以上が好ましく、蛋白質分解酵素としては、麹菌、乳酸菌および納豆菌からなる群より選ばれる１種以上の微生物を由来とする酵素であるのが好ましい態様である。また、本発明は、大豆を、麹菌または麹菌由来の蛋白質分解酵素で処理して得られることを特徴とするＤＰＰ－４阻害剤にも関する。
　さらに本発明は、小豆またはインゲン豆を、微生物、または、微生物が産生する蛋白質分解酵素で処理することを特徴とするＤＰＰ－４阻害剤の製造方法にも関する。
　本発明によれば、食経験のある特定の豆類を、同じく食品に一般に使用されてきた微生物や微生物由来の酵素によって処理することで、優れたＤＰＰ－４阻害活性を有するＤＰＰ－４阻害剤や、それを有効成分として含有する飲食品、機能性食品、医薬品、飼料等が提供される。本発明のＤＰＰ－４阻害剤は、上記の点から安全性の上でも優れているだけでなく、味覚や吸収性の点でも特に経口摂取用途に適している。本発明のＤＰＰ－４阻害剤は、糖尿病を予防及び／又は改善するための組成物の有効成分として有用である。
　以下に本発明を詳細に説明する。
　本発明のＤＰＰ－４阻害剤は、小豆またはインゲン豆を、微生物、または、微生物が産生する蛋白質分解酵素で処理して得られるものである。すなわち本発明は、小豆またはインゲン豆を、微生物、または、微生物が産生する蛋白質分解酵素で処理することを特徴とするＤＰＰ－４阻害剤の製造方法でもある。本発明においては、上記豆類中の蛋白質のペプチド結合が加水分解されて断片化（低分子化）したものがＤＰＰ-４阻害剤の有効成分として関与していると考えられる。従って、小豆またはインゲン豆由来の蛋白質の加水分解物を有効成分とする、ＤＰＰ－４阻害剤もまた本発明に含まれる。
　本発明において、小豆またはインゲン豆を処理するのに使用される微生物としては特に限定されないが、蛋白質分解酵素を産生する微生物が好ましく、安全性の観点からは食品製造に使用されている微生物が好ましい。そのような微生物として、具体的には麹菌、乳酸菌、納豆菌などが挙げられる。この中でも麹菌が特に好ましい。
　また本発明において、小豆またはインゲン豆を処理するのに使用される蛋白質分解酵素としては、ペプチド結合を加水分解できる微生物由来の蛋白質分解酵素であれば特に限定されないが、麹菌、乳酸菌または納豆菌を由来とする蛋白質分解酵素が好ましく、麹菌を由来とする蛋白質分解酵素がより好ましい。
　さらに本発明においては、大豆を、麹菌または麹菌由来の蛋白質分解酵素で処理して得られるものもＤＰＰ－４阻害剤として使用できる。
　本発明において使用される、または使用される酵素の由来となる、麹菌は、国内外で食品の製造に関係し、安全なものであれば特に限定されず、例えば、醤油、味噌、酒などの生産に用いられるものを使う事ができる。そのような麹菌としては、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔａｍａｒｉ）、アスペルギルス・グラウカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｇｌａｕｃｕｓ）などのアスペルギルス属の他、紅麹菌などが挙げられる。この中でも、プロテアーゼ活性が高い点で醤油用麹菌を使うのが好ましく、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅやＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅなどがより好ましく、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅが特に好ましい。また上記のような麹菌を、豆、米、麦、ふすまなどに着生させた、いわゆる麹、種麹を利用しても良い。
　本発明において使用される、または使用される酵素の由来となる、乳酸菌としては、代謝により乳酸を生成する細菌類であれば特に限定されず、具体的には、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属などが挙げられる。
　また、本発明において使用される、または使用される酵素の由来となる、納豆菌としては、バチルス・サブチリス・ナットウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ｖａｒ．　ｎａｔｔｏ）が挙げられる。
　一般に蛋白質分解酵素には、ペプチドのペプチド結合を加水分解するペプチダーゼや蛋白質のペプチド結合を加水分解するプロテアーゼなどがある。本発明で使用される蛋白質分解酵素は、精製された単一のペプチダーゼや単一のプロテアーゼでも良いし、複数のペプチダーゼやプロテアーゼなどを含む組成物であっても良い。また、ペプチダーゼやプロテアーゼの活性を損なわない程度に他の酵素を含む組成物であっても良い。使用される蛋白質分解酵素としては、後述するように市販品を利用することもできるし、蛋白質分解酵素を産生する微生物を破砕したり、部分精製したりして得られる菌体処理物や部分精製酵素を利用しても良い。さらに、蛋白質分解酵素を産生する組換え菌の菌体処理物や該組換え菌を由来とする酵素でも良い。組換え菌の作製は通常の遺伝子工学的手法を用いることが出来る。
　蛋白質が分解され、腸管から吸収され易くなるためには、蛋白質はより低分子のペプチドに分解された方が好ましく、その様な観点から、本発明に用いる蛋白質分解酵素はペプチダーゼを含むものが好ましい。
　また、蛋白質のプロリン残基周辺は一般にプロテアーゼ、ペプチダーゼが作用しにくいことが知られている。Ｘ－プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼは、アミノ末端のＸ－プロリン（Ｘは任意のアミノ酸残基）をジペプチド単位で特異的に遊離する酵素であり、この酵素活性を有する蛋白質分解酵素は、蛋白質をより低分子化しやすいと考えられる。そのような観点から、本発明で使用される微生物または蛋白質分解酵素は、Ｘ－プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有するものがより好ましい。なお、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅは、Ｘ－プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼを産生することが報告されている（Ｈ．　Ｔａｃｈｉ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３１（１１），３７０７－３７０９（１９９２））。　
　本発明で市販品の蛋白質分解酵素を使用する場合、その種類は特に限定されないが、食品添加物として市販されているものを好適に用いることが出来る。例えば、ウマミザイムＧ、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＡ「アマノ」ＳＤ、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＭ「アマノ」ＳＤ（以上、天野エンザイム株式会社製）、スミチーム ＬＰ、スミチーム ＦＰ、スミチーム ＬＰＬ（以上、新日本化学工業株式会社製）、パンチダーゼ ＮＰ－２（ヤクルト薬品工業株式会社製）、オリエンターゼ ＯＮＳ（エイチビイアイ株式会社製）などが挙げられる。なお、上記の蛋白質分解酵素は、形状を変更したものであっても、本発明に用いることができる。形状は、顆粒状であってもよいし、粉末状や液状であってもよい。蛋白質を加水分解しうる限り、本発明に使用することができる。
　上記の蛋白質分解酵素の中でも、Ｘ－プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼ活性の強さの点から、ウマミザイムＧがより好適に用いられる。
　本発明のＤＰＰ－４阻害剤の原料となる小豆は、ササゲ属小豆（Ｖｉｇｎａ　ａｎｇｕｌａｒｉｓ）、大豆は、ダイズ属大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）、インゲン豆は、インゲン属インゲン豆（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）を示し、インゲン豆には、とら豆、大手亡、うずら豆、大福豆等の品種も含まれる。また、大豆に関しては、遺伝子組換え大豆（ＧＭＯ大豆）の蛋白質を、微生物や微生物由来のプロテアーゼで加水分解したときの、安全性やアレルギー原性についての十分なデータがない事から、非遺伝子組換え（ｎｏｎＧＭＯ）大豆を用いることが好ましい。また、ｎｏｎＧＭＯ大豆は、ＤＰＰ－４阻害活性や味などの点からも、ＧＭＯ大豆に比べより好適に用いることができる。
　上記の本発明で使用される豆類は、豆そのものを原料とすることも出来るし、納豆、醤油、豆乳、餡やその類似品などのように豆類を原料として製造される組成物やオカラや脱脂豆などのように豆類から他の食品を作った後の残渣等を原料として利用することも出来る。
　上記豆類は、そのまま本発明のＤＰＰ－４阻害剤を作製するための原料として使うことも出来るが、乾燥、破砕、粉砕、加熱、加圧、脱脂、酸処理、アルカリ処理、搾汁、抽出等の前処理を行っても良い。またこれら前処理は２種以上組み合わせて実施することもできる。さらに、上記豆類材料から蛋白質や蛋白質を多く含む成分を分離した後、本発明のＤＰＰ－４阻害剤を作製するための原料とすることも出来る。
本発明において、上記豆類を微生物で処理する方法は特に限定されない。例えば、豆類材料を必要に応じて上記前処理した後、その表面に微生物を生育させることや、微生物を生育させた後に水を添加しさらに反応させることによって、豆類中の蛋白質のペプチド結合を加水分解させる方法が挙げられる。さらに、豆類材料やその処理物を水などの液体に懸濁及び／又は溶解した状態で微生物を生育させる方法や、液体の豆類加工物に微生物を生育させる方法なども挙げられる。
また、本発明において、上記豆類を蛋白質分解酵素で処理する方法も特に限定されない。豆類材料を必要に応じて上記前処理した後、その表面に蛋白質分解酵素を振りかけたり、豆類材料やその処理物を水などの液体に懸濁及び／又は溶解した状態で蛋白質分解酵素を作用させることで、類中の蛋白質のペプチド結合を加水分解させる方法の他、液体の豆類加工物に蛋白質分解酵素を添加する方法などが挙げられる。
　本発明においては、上記方法によって得られる、微生物、または、蛋白質分解酵素の処理物を、そのままＤＰＰ－４阻害剤として利用することもできるが、ＤＰＰ－４阻害活性を失わない範囲で脱臭、脱色などを行ってもよい。また、ＤＰＰ－４阻害活性成分を濃縮するために、抽出、沈殿、ろ過、限外ろ過、カラムクロマトグラフィーなどの方法、あるいはこれらの方法の組合せによる分画を行ってもよい。
　ＤＰＰ－４活性は、例えば、ヒトＤＰＰ－４酵素に基質としてＧｌｙｃｙｌ－Ｌ－ｐｒｏｌｉｎｅ　４－ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｙｌ－７－ａｍｉｄｅを加えてインキュベートし、生成した７－ａｍｉｎｏ－４－ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎの量を蛍光光度計で定量することで測定できる。本発明においては、上記アッセイにおいて、ＤＰＰ－４阻害活性の評価の対象である検体が存在する場合（サンプル）と存在しない場合（溶媒対照）のＤＰＰ－４活性を比較し、溶媒対照のＤＰＰ－４活性に対し、有意にＤＰＰ－４活性を低下させたサンプルを、「ＤＰＰ－４阻害活性あり」と評価する。本発明のＤＰＰ－４阻害剤としては、溶媒対照のＤＰＰ－４活性を１００％としたときの、サンプルのＤＰＰ－４活性が、７０％以下となるものが好ましく、６０％以下となるものがより好ましく、５０％以下となるものが特に好ましい。
　また、本発明のＤＰＰ－４阻害剤は、ＤＰＰ－４阻害活性だけではなく、好ましい態様においてはα－グルコシダーゼ阻害活性を有する場合もある。α－グルコシダーゼ活性は、例えば酵母由来α－グルコシダーゼに、基質としてスクロースを加えてインキュベートし、生成したグルコースを市販のグルコース定量キットで定量することで測定できる。本発明においては、上記アッセイにおいて、α－グルコシダーゼ阻害活性の評価の対象である検体が存在する場合（サンプル）と存在しない場合（溶媒対照）のα－グルコシダーゼ活性を比較し、溶媒対照のα－グルコシダーゼ活性に対し、有意にα－グルコシダーゼ活性を低下させたサンプルを、「α－グルコシダーゼ阻害活性あり」と評価する。本発明のＤＰＰ－４阻害剤としては、溶媒対照のα－グルコシダーゼ活性を１００％としたときの、サンプルのα－グルコシダーゼ活性が、９０％以下となるα－グルコシダーゼ阻害活性を併せ持つものが好ましく、８０％以下となるα－グルコシダーゼ阻害活性を併せ持つものがより好ましい。
一般に、蛋白質を加水分解してペプチドを得る製法は、苦みや臭みが出やすいことが知られている。しかし、小豆またはインゲン豆を、微生物、または、微生物が産生する蛋白質分解酵素で処理して得られる本発明のＤＰＰ－４阻害剤、または、大豆を、麹菌または麹菌由来の蛋白質分解酵素で処理して得られる本発明のＤＰＰ－４阻害剤は、苦みや臭みが少なく、特に、麹菌や麹菌由来の蛋白質分解酵素を用いた場合に、呈味性に優れたＤＰＰ－４阻害剤を作製することが出来る。従って、本発明のＤＰＰ－４阻害剤は、呈味性に優れていることが好ましい経口摂取用の組成物に特に好ましく利用できる。ここで言う経口摂取用組成物とは、人又は家畜、ペットなどが経口的に摂取する組成物のことを言い、具体的には飲食品、医薬品、飼料等のことを言う。
　本発明のＤＰＰ－４阻害剤は、上記のように経口摂取用組成物として用いることも出来るし、経腸栄養剤などのように直接消化管内に投与し、消化管から吸収させる組成物として用いることもできる。また、そのまま飲食用、医薬用、飼料用などとして利用することも出来るが、これを含有する組成物として飲食用、医薬用、飼料用などの用途に用いることも出来る。本発明のＤＰＰ－４阻害剤を上記のような用途で用いる場合、その形態は限定されず、例えば、飲食用として、一般食品の他に、機能性食品（保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）、健康食品、栄養補助食品、スポーツサプリメントなど）などのサプリメントとして利用できる。あるいは、医薬用として医療用医薬品の他にＯＴＣなど容易に入手可能な医薬品又は医薬部外品、化粧品などとして利用できる。
　本発明のＤＰＰ－４阻害剤を一般食品または機能性食品として摂取する場合は、そのまま直接摂取することもできるし、また、公知の担体や助剤などの添加剤と混合された組成物として、カプセル剤、錠剤、顆粒剤など服用しやすい形態に成型して摂取することもできる。また、栄養強化を目的として、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅなどの各種ビタミン類を添加、併用して用いることもできる。さらに、他の機能性食品などと合剤にすることも出来る。合剤とする他の機能性食品としては、特に限定されないが、血糖低下作用、脂質低下作用、抗肥満作用等の代謝調節作用や、血圧低下作用、骨粗鬆症予防及び／又は改善作用、等の知られている機能性食品を挙げることが出来る。
　さらに、飲食物材料に混合して、チューインガム、チョコレート、キャンディー、ゼリー、ビスケット、クラッカーなどの菓子類；アイスクリーム、氷菓などの冷菓類；茶、清涼飲料、栄養ドリンク、美容ドリンクなどの飲料；うどん、中華麺、スパゲティー、即席麺などの麺類；蒲鉾、竹輪、はんぺんなどの練り製品；ドレッシング、マヨネーズ、ソースなどの調味料；マーガリン、バター、サラダ油などの油脂類；パン、ハム、スープ、レトルト食品、冷凍食品などの一般食品に使用することができる。
　本発明のＤＰＰ－４阻害剤を医薬用として用いる場合は、その剤形は特に限定されず、例えば、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、注射剤、座薬、貼付剤などが挙げられる。製剤化においては、薬剤学的に許容される他の製剤素材、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、安定化剤などを適宜添加して調製することができる。
　さらに、本発明のＤＰＰ－４阻害剤を医薬用として用いる場合に、他の抗糖尿病薬、抗肥満薬、抗骨粗鬆症薬などの医薬品と合剤にしても良い。他の抗糖尿病薬や抗肥満薬としては特に限定されないが、例えば、スルホニル尿素系薬、ビグアナイド系薬、α－グルコシダーゼ阻害薬、インスリン製剤、イスリン分泌促進薬、インスリン増感薬、ＰＰＡＲ作動薬（ＰＰＡＲα作動薬、ＰＰＡＲγ作動薬、ＰＰＡＲα＋γ作動薬）、β３アドレナリン受容体作動薬、アルドース還元酵素阻害薬、ＤＰＰ－４阻害薬、ＡＭＰキナーゼ活性化薬、１型１１β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１１β－ＨＳＤ１）阻害薬、リパーゼ阻害薬、食欲抑制薬等などが挙げられる。抗骨粗鬆症薬としては活性型ビタミンＤ３製剤、エストロゲン製剤、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、ビスホスホネート製剤、ビタミンＫ２製剤、カルシウム製剤などがあげられる。
　α－グルコシダーゼは、腸内でマルトースやシュークロースなどの二糖類を単糖類に分解する酵素である。α－グルコシダーゼを阻害することにより、多糖類及び二糖類の吸収を抑制することができ、食後の過血糖を顕著に抑制することから、糖尿病の予防あるいは改善に有効である事が知られている。しかしながら、メカニズムから明らかなように、α－グルコシダーゼ阻害剤はグルコース摂取による血糖値上昇に対する効果は認められない。また、α－グルコシダーゼ阻害剤は食事直前に摂取しないとその効果が得られないなど、服用方法の制限もある。本発明のＤＰＰ－４阻害剤は、グルコース摂取による血糖値上昇にも効果を有するだけでなく、服用時期を問わないという点でメリットが高い。さらに、本発明のＤＰＰ－４阻害剤は、上記の通り、より好ましくはＤＰＰ－４阻害活性とα－グルコシダーゼ阻害活性の両方を合わせ持つことから、より強い血糖値低下効果が期待できる。
　上記のことから、本発明のＤＰＰ－４阻害剤を含有する組成物は、糖尿病の予防及び／又は改善のための組成物として利用できる。また、本発明のＤＰＰ－４阻害剤は、血糖上昇抑制剤、血糖降下剤、インスリン分泌促進剤、活性型ＧＬＰ－１量増多剤、グルカゴン分泌抑制剤、膵β細胞再生促進剤及び／又は筋肉への糖の取り込み促進剤としても使用出来る。
 また、本発明は、上記ＤＰＰ－４阻害剤を投与対象に投与する、糖尿病の予防及び／又は改善方法でもある。また本発明は、上記ＤＰＰ－４阻害剤を投与対象に投与する、血糖値の上昇抑制方法でもある。糖尿病の予防とは、糖尿病の発生リスクの軽減も含まれる。また、上記の場合の投与対象としては、糖尿病患者、糖尿病予備軍（正常域ではあるが血糖値が高めであるもの、遺伝的要因または生活習慣から糖尿病になるリスクが高いことが指摘されるもの）が好ましいが、健常者も含まれる。
　以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　（ＤＰＰ－４阻害活性の測定法）
　本発明においては、市販の測定キット（ＢＩＯＭＯＬ社製　ＤＰＰ－４　Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ｋｉｔ）を用いて、キット添付の説明書に準じてＤＰＰ－４活性を測定し、その値を比較することでＤＰＰ－４阻害活性を評価した。以下に、簡単に測定方法を示す。
測定キットに付属の白色の９６ハーフエリアプレートに、ブランクのウェルには５０μＬ、コントロールのウェルには３５μＬ、サンプルのウェルには２５μＬのバッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）を入れた。次にサンプルウェルにサンプルを１０μＬ添加した後、コントロールとサンプルのウェルに酵素溶液（ヒトＤＰＰ－４酵素）を１５μＬ添加し、プレートミキサーで良く混合した。次に、全てのウェルにＤＰＰ－４の基質になるＧｌｙｃｙｌ－Ｌ－ｐｒｏｌｉｎｅ　４－ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｙｌ－７－ａｍｉｄｅを５０μＬ加えて（ウェル中の総液量１００μＬ）、３７℃でインキュベートし、酵素反応を行った。インキュベートは温度調節の出来る蛍光強度測定装置（ＰＯＷＥＲＳＣＡＮ　ＨＴ　大日本製薬製）の中で行い、インキュベート開始直後と１２分後に、励起波長３８０ｎｍ、測定波長４６０ｎｍで測定を行い、酵素反応の結果生成した７－ａｍｉｎｏ－４－ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎを測定した。
　なお、サンプルのＤＰＰ－４活性は、コントロールにおけるＤＰＰ－４活性の値を１００％として、以下のようにして算出した。
　ＤＰＰ－４活性（％）＝｛（Ａ－Ｂ）／（Ｃ－Ｄ）｝ｘ１００
　式中Ａはインキュベート開始１２分後のサンプルウェルの蛍光強度、Ｂはインキュベート開始直後のサンプルウェルの蛍光強度、Ｃはインキュベート開始１２分後のコントロールウェルの蛍光強度、Ｄはインキュベート開始直後のコントロールウェルの蛍光強度を表す。この時、ＤＰＰ－４活性の値が低いほど阻害活性が強いことを表す。
　（実施例１）豆類の麹菌処理物の調製
　市販の大豆、小豆、大手亡、大福豆、紫花豆、しかく豆それぞれ１ｋｇを、蒸煮してからあらくつぶし、必要に応じて炒熬割砕処理したものを加えて水分量が約５０％となるように調整した後、フィルターを装備し無菌空気を供給することができる容器に入れ、１２１℃で３０分間高圧蒸気滅菌した。次に、滅菌した原料に、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＫＢＮ６１６；株式会社ビオック製）を用いて得られたふすま麹３ｇをクリーンベンチ内で麹菌以外の微生物が混入しないように接種し、無菌空気を容器内に供給しながら３１℃で４８時間、麹菌のみで発酵を行った。 
　その後、クリーンベンチ内で得られたそれぞれの発酵物７５ｇを滅菌したガラス容器に取り、滅菌蒸留水１５０ｍＬを加えてシリコン栓をし、食塩を添加せずに、麹菌以外の微生物が存在しない条件下において３０℃で３日間処理を行い、麹菌処理液を得た。 
　その後、それぞれの麹菌処理液を、９０℃で３０分加熱をした後、濾過して澄明な液を得た。これを分画分子量３０００の遠心式限外ろ過デバイス(ミリポア製　マイクロコン　ＹＭ－３)を用いて１４０００ｇで１００分間遠心分画し、得られたろ液を凍結乾燥し、それぞれの豆類の麹菌処理物を得た。得られた豆類の麹菌処理物を１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように水に溶解してサンプルとし（ＤＰＰ－４活性測定時の濃度として１ｍｇ／ｍＬ）、各サンプルのＤＰＰ－４阻害活性を上述の方法で評価した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　このように、大豆、小豆、およびインゲン豆の一種である大手亡と大福豆の麹菌処理物にＤＰＰ－４阻害活性があることと、その阻害活性は比較に用いた他の豆類（紫花豆、しかく豆）の麹菌処理物よりも高いことが確認された。
　（実施例２）豆類の蛋白質分解酵素処理物の調製
　市販の小豆、とら豆、大手亡それぞれ３ｇを、ミルにて粉砕したのち、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した。これを容器に入れた後、水３０ｍＬと別途調製した蛋白質分解酵素液（ウマミザイムＧ（天野エンザイム株式会社）、１％w/v水溶液）３ｍＬを添加した。これを４５℃で２４時間インキュベートした後、１８００ｇ、３０分間遠心して分解されなかった残渣を取り除いた。上清を回収し、９９℃で６０分間加熱した後、再度１８００ｇ、３０分間遠心し、上清を回収した。これを分画分子量１００００の遠心式限外ろ過デバイス(ミリポア製　アミコンウルトラ－１５)を用いて１８００ｇ、６０分間遠心分画したろ液を凍結乾燥し、それぞれの豆類の蛋白質分解酵素処理物を得た。該酵素処理物を１０ｍｇ／ｍｌ、又は、３０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように水に溶解してサンプルとし（ＤＰＰ－４活性測定時の濃度としてそれぞれ１ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ）、これらのサンプルのＤＰＰ－４阻害活性を上述の方法で評価した。得られた結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　このように、小豆、とら豆、大手亡いずれの蛋白質分解酵素処理物も、ＤＰＰ－４阻害活性を有していた。
　（実施例３）豆類の蛋白質分解酵素処理物の調製（経時変化サンプルの調製）
　市販の小豆、とら豆、大手亡それぞれ３ｇを、ミルにて粉砕したのち、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した。これを容器に入れた後、水３０ｍＬと別途調製した蛋白質分解酵素液（ウマミザイムＧ（天野エンザイム株式会社）、１％ｗ／ｖ水溶液）３ｍＬを添加した。これを４５℃でインキュベートを開始した。インキュベート開始前、開始後２４時間後に１ｍＬずつ反応混合物をサンプリングし、それぞれを９９℃で６０分間加熱した後、１４０００ｇで１０分間遠心し、上清を回収した。これを分画分子量３０００の遠心式限外ろ過デバイス(ミリポア製　マイクロコン　ＹＭ－３)を用いて１４０００ｇで１００分間遠心分画し、ろ液を得た。これらのろ液をそのまま用いて上述の方法でＤＰＰ－４阻害活性を評価し、酵素処理前後の阻害活性を比較した。結果を、表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　小豆、とら豆、大手亡、いずれも酵素処理前にはＤＰＰ－４阻害活性は認められず、酵素処理を２４時間実施したものにＤＰＰ－４阻害活性が認められた。すなわち、ＤＰＰ－４阻害活性は、小豆、インゲン豆の水抽出物に認められるわけではなく、小豆、インゲン豆をそれぞれ酵素処理することにより初めて出現することが明らかとなった。
　（実施例４）動物評価試験
　実施例２で作製した小豆、とら豆、大手亡の酵素処理物と、実施例２と同様の方法で調製した脱脂大豆の酵素処理物の、生体内での実際の血糖降下作用について、経口グルコース負荷試験を用いて評価した。実験動物はＣ５７ＢＬ／６Ｊ ＳＰＦ雄性マウス (日本クレア社） を１０週齢で使用した。２０匹のマウスを各群５匹ずつ、４群に分けた。一回の実験でコントロール群（蒸留水投与）、ポジティブコントロール群（シタグリプチン投与）とサンプル群２つの合計４群で評価を行い、この実験を２回実施して計４つのサンプルの評価を行った。
前日夕方より絶食したマウスの尾静脈より採血を行い、簡易式血糖測定器（グルテストエース；三和化学研究所）を用いて血糖値を測定し、プレ値（０分）とした。ポジティブコントロールはシタグリプチン１００ｍｇ錠（メルク社製）を乳鉢ですりつぶし、シタグリプチン量に換算して０．１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように水に懸濁したものを使用した。投与サンプルは実施例２で（またはその方法に準じて）作製した各豆類の酵素処理物を蒸留水で４００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように溶解したものを用いた。蒸留水（コントロール群）、シタグリプチン懸濁液（ポジティブコントロール群）または豆類酵素処理物水溶液（サンプル群）をそれぞれ１０ｍＬ／ｋｇ体重で経口投与した。蒸留水、シタグリプチン懸濁液またはサンプル投与３０分後に、４０％グルコース水溶液を５ｍＬ／ｋｇ体重で経口投与した。グルコース経口投与３０、６０、１２０分後に尾静脈から採血し、プレ値と同様に血糖値を測定した。血糖値の測定結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　脱脂大豆、小豆、とら豆、大手亡、いずれの蛋白質酵素処理物も、グルコース負荷後の血糖値の上昇を有意に抑制した。なかでも小豆の蛋白質酵素処理物の血糖値上昇抑制効果が優れていることが確認された。
　（実施例５）α－グルコシダーゼ阻害の測定
　実施例２で作製した小豆の蛋白質分解酵素処理物と、実施例２と同様の方法で調製した脱脂大豆の酵素処理物を、それぞれ１６．７ｍｇ／ｍＬの濃度になるように　アッセイバッファーである０．２５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解しサンプルとした。α－グルコシダーゼ活性の測定は以下のように行った。すなわち、９６ウェルプレートにサンプルを６０μＬ、コントロールのウェルにはアッセイバッファーを６０μＬ添加した。その後、１．２５Ｕ／ｍＬ（１０μｇ蛋白／ｍＬ）に調製した酵母由来α－グルコシダーゼ（オリエンタル酵母）を２０μＬ添加し、３７℃で１０分間プレインキュベートした。次に、アッセイバッファーに溶解した２５０ｍＭスクロース溶液２０μＬを添加し、３７℃で２０分間インキュベートを行った（反応時の酵素処理物の濃度は１０ｍｇ／ｍｌ）。インキュベート終了後、２ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）を１００μＬ添加して反応を停止した。反応停止後、各ウェルの反応液５０μＬを別の９６ウェルプレートに移し、グルコースＣＩＩテストワコー試薬（和光純薬）２００μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした。インキュベート終了後、５０５ｎｍの吸光度を測定し、グルコース標準液を用いて作製した検量線から生成したグルコース量を定量した。なお、α－グルコシダーゼ活性は、コントロールにおけるα－グルコシダーゼ活性の値を１００％として、以下のように算出した。
　α－グルコシダーゼ活性（％）＝（Ａ／Ｂ）ｘ１００
　式中Ａはサンプルのグルコース量、Ｂはコントロールのグルコース量の値である。この時、α－グルコシダーゼ活性（％）が低いほど阻害活性が強いことを表す。得られた結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　このように、脱脂大豆の酵素処理物、小豆の酵素処理物ともにα－グルコシダーゼ阻害活性が認められた。
　（実施例６）小豆、大豆の蛋白質分解酵素処理物の呈味性比較
　市販の小豆６ｇをミルにて粉砕したのち、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した。これ２つに分け、それぞれ別の容器に入れた後、水３０ｍＬと別途調製した蛋白質分解酵素液（ウマミザイムＧ（天野エンザイム株式会社；麹菌由来プロテアーゼ）１％w/v水溶液、又は、ブロメラインＦ（天野エンザイム株式会社；パイナップル由来プロテアーゼ）１％w/v水溶液）それぞれ３ｍＬを添加した。これを４５℃で２４時間インキュベートした後、１８００ｇ、３０分間遠心して分解されなかった残渣を取り除いた。上清を回収し、９９℃で６０分間加熱した後、再度１８００ｇ、３０分間遠心し、上清を回収した。これを分画分子量１００００の遠心式限外ろ過デバイス(ミリポア製　アミコンウルトラ－１５)を用いて１８００ｇ、６０分間遠心分画したろ液を凍結乾燥し、それぞれの小豆酵素処理物を得た。大豆の２種類の酵素処理物についても同様に作製した。
　苦味試験は、得られた酵素処理物について５人のパネラーによる官能検査で行った。評価は以下のように点数を付けて行い、５人の平均を計算した。
５：苦味を感じない。
４：ほとんど苦味を感じない。
３：どちらとも言えない。
２：やや苦味を感じる。
１：苦味を感じる。
得られた結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　このように、小豆酵素処理物、大豆酵素処理物共に、麹菌由来である酵素（ウマミザイム）を用いた酵素処理物は、植物由来の酵素（ブロメライン）を用いた酵素処理物に比べ、苦味が少ない点で優れていた。また、小豆酵素処理物と大豆酵素処理物では、小豆酵素処理物の方が苦味が少ない点で優れていた。
 

Claims (15)

  1. 小豆またはインゲン豆を、微生物、または、微生物が産生する蛋白質分解酵素で処理して得られることを特徴とするＤＰＰ－４阻害剤。
  2. 微生物が、麹菌、乳酸菌および納豆菌からなる群より選ばれる１種以上である請求項１記載のＤＰＰ－４阻害剤。
  3. 蛋白質分解酵素が、麹菌、乳酸菌および納豆菌からなる群より選ばれる１種以上の微生物を由来とする酵素である請求項１記載のＤＰＰ－４阻害剤。
  4. 大豆を、麹菌または麹菌由来の蛋白質分解酵素で処理して得られることを特徴とするＤＰＰ－４阻害剤。
  5. 麹菌がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅである請求項２～４いずれか１項記載のＤＰＰ－４阻害剤。
  6. 蛋白質分解酵素がペプチダーゼを含むものである請求項１、３または４記載のＤＰＰ－４阻害剤。
  7. 蛋白質分解酵素が、Ｘ－プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有するものである請求項１、３または４記載のＤＰＰ－４阻害剤。
  8. 請求項１～７いずれか１項記載のＤＰＰ－４阻害剤を含有することを特徴とする、糖尿病の予防及び／又は改善用組成物。
  9. 小豆またはインゲン豆を、微生物、または、微生物が産生する蛋白質分解酵素で処理することを特徴とするＤＰＰ－４阻害剤の製造方法。
  10. 微生物が、麹菌、乳酸菌および納豆菌からなる群より選ばれる１種以上である請求項９記載のＤＰＰ－４阻害剤の製造方法。
  11. 蛋白質分解酵素が、麹菌、乳酸菌および納豆菌からなる群より選ばれる１種以上の微生物を由来とする酵素である請求項９記載のＤＰＰ－４阻害剤の製造方法。
  12. 大豆を、麹菌または麹菌由来の蛋白質分解酵素で処理することを特徴とするＤＰＰ－４阻害剤の製造方法。
  13. 麹菌がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅである請求項１０～１２いずれか１項記載のＤＰＰ－４阻害剤の製造方法。
  14. 蛋白質分解酵素がペプチダーゼを含むものである請求項９、１１または１２記載のＤＰＰ－４阻害剤の製造方法。
  15. 蛋白質分解酵素が、Ｘ－プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有するものである請求項９、１１または１２記載のＤＰＰ－４阻害剤の製造方法。
     
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