JP5130829B2 - クレアチンホスホキナーゼ分泌抑制組成物 - Google Patents

Description

本発明は、分子量５００以下のペプチド画分が６５％以上且つ、遊離アミノ酸が１０％以下であるオリゴペプチド混合物を有効成分とするクレアチンホスホキナーゼ分泌抑制組成物を提供するものである。

スポーツや肉体労働の後に生じる遅発性筋肉痛は、伸張性収縮を繰り返すことによる筋繊維上の微小な損傷とその後の炎症反応が原因と考えられている（非特許文献１、２）。

クレアチンホスホキナーゼ（creatine phosphokinase （CPK））はATPとクレアチンとの間での高エネルギーリン酸基の転移（Lohmann転移）を可逆的に触媒する転移酵素である。CPKは組織細胞内に存在し、細胞の損傷、破壊および細胞膜の透過性亢進により、血中に逸脱してくる逸脱酵素である。血中CPK活性は、筋損傷の指標として臨床的に用いられている（非特許文献３）。

すなわち、筋肉が損傷している状態では、血中CPK活性が高い値を示し、遅発性筋肉痛などの肉体疲労が生じるということである。

2004年６月２３日の大豆ペプチド健康フォーラム（第３回マスコミセミナー）において、１日4000mgの大豆蛋白由来ペプチドを飲料で補給すると、CPKが減少する効果が開示されている。（http://www.daizupeptide.jp/report/se003_index2.html）
しかし、この大豆蛋白由来ペプチドの分子量分布は、1000以上が22.5％、500〜1000が20.5％、500以下が57.0％である。

（参考文献）
Armstrong RB. Mechanisms of exercise-induced delayed onset muscular soreness: a brief review. Med Sci Sports Exerc 1984; 16: 529-538. MacIntyre DL, Reid WD, McKenzie DC. Delayed muscle soreness. The inflammatory response to muscle injury and its clinical implications. Sports Med 1995; 20: 24-40. Clarkson PM, Nosaka K, Braun B. Muscle function after exercise-induced muscle damage and rapid adaptation. Med Sci Sports Exerc. 1992; 24: 512-520.

本発明は、従来より優れたCPK分泌抑制組成物の提供を目的とした。

本発明者等は運動負荷直後の男性に分子量分布の異なる大豆ペプチドを投与し、CPK分泌抑制に関する効果を検討した。
背景技術の項でも述べたように、分子量分布が、1000以上が22.5％、500〜1000が20.5％、500以下が57.0％である大豆ペプチドを１日4000mgを飲料で補給すると、CPKが減少することは確認された。
さらに鋭意研究を進めるなかで、分子量５００以下のペプチド画分が６５％以上且つ、遊離アミノ酸が１０％以下であるオリゴペプチド混合物のほうが前記大豆ペプチドよりCPKの分泌を抑制する効果に優れることを見出した。
即ち、本発明は、大豆蛋白を酵素分解して得られる分子量５００以下のペプチド画分が６５％以上且つ、遊離アミノ酸が１０％以下であるオリゴペプチド混合物を有効成分とするクレアチンホスホキナーゼ分泌抑制組成物である。クレアチンホスホキナーゼ分泌抑制組成物は経口摂取用が好ましい。

本発明により分子量５００以下のペプチド画分が６５％以上且つ、遊離アミノ酸が１０％以下であるオリゴペプチド混合物を有効成分とするCPK分泌抑制組成物が完成され、これにより運動後の筋損傷を予防もしくは効率的に修復することで、遅発性筋肉痛などの肉体疲労を軽減することができるようになったものである。
これは、従来知られていた分子量分布が、1000以上が22.5％、500〜1000が20.5％、500以下が57.0％である大豆ペプチドより優れたCPK減少効果を有するものである。

本発明は、大豆蛋白を酵素分解して得られる分子量５００以下のペプチド画分が６５％以上且つ、遊離アミノ酸が１０％以下であるオリゴペプチド混合物を有効成分とするクレアチンホスホキナーゼ分泌抑制組成物である。
本発明に用いる大豆蛋白は公知の大豆蛋白を用いることができる。また、11S大豆蛋白を基質とした場合は、副生する沈澱が少なく、良好に分解を行うことができる。
例えば、この11S大豆蛋白を酵素分解して得られるペプチド混合物の場合について具体的に説明する。
この11S大豆蛋白は公知の方法により大豆β-コングリシニン（7Sグロブリン）と大豆グリシニン（11Sグロブリン）を含む通常の分離大豆たん白質や豆乳から大豆グリシニン（11Sグロブリン）を分画して得ることができる。例えば特開2000-058492号公報、特開2002-028198号公報、特開2004-043160号公報に開示の方法が挙げられる。
例えば、 Plant Physiol. 56, 19-22（1975）、J. Agric. Food Chem., 24, 1117- 1121 （1976）、及び、 J. Agric. Food Chem., 40, 941-944（1982）等の方法に従って行なうことができる。また遺伝的に7Sグロブリンを欠損させた7S欠損大豆から抽出して得ることもできる。これら大豆たん白質は抽出液のまま、或いは乾燥物とした上で再度水溶液として、以下の分解を行なうことができる。

そして、上記大豆たん白質スラリーまたは水溶液を基質とし、プロテアーゼ処理を行なう。ここで用いるプロテアーゼは、プロテアーゼの分類において「金属プロテアーゼ」，「酸性プロテアーゼ」，「チオールプロテアーゼ」，「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼ、好ましくは「金属プロテアーゼ」，「チオールプロテアーゼ」，「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼの中から、２種以上、好ましくは３種以上の異なった分類に属する酵素を、順次もしくは同時に作用させることができる。

このプロテアーゼの分類は、酵素化学の分野に於て通常行なわれている、活性中心のアミノ酸の種類による分類方法であり、各々の代表として「金属プロテアーゼ」にはBacillus中性プロテイナーゼ，Streptomyces中性プロテイナーゼ，Aspergillus中性プロテイナーゼ，サモアーゼ等、「酸性プロテアーゼ」にはペプシン，Aspergillus酸性プロテイナーゼ，スミチームAP等、「チオールプロテアーゼ」にはブロメライン，パパイン等、「セリンプロテアーゼ」にはトリプシン，キモトリプシン，ズブチリシン，Streptomycesアルカリプロテイナーゼ，Aspergillusアルカリプロテイナーゼ，アルカラーゼ，ビオプラーゼ等が挙げられるが、これ以外の酵素でも作用ｐＨや阻害剤との反応性により、その分類を確認することができる。活性中心が異なる酵素間では、基質への作用部位が大きく異なる為に、「切れ残り」を減らし、効率よくオリゴペプチドを得ることができる様になる。

或いは異なった起源（起源生物）の酵素を併用することで、更に効率良くオリゴペプチドを製造することができる。同分類でも起源が異なれば、基質であるたん白質への作用部位も異なり、結果としてジ，トリペプチドの収率を増やすことが出来る。２種以上、好ましくは３種以上の異なった起源の酵素を、順次もしくは同時に作用させることができる。また、２種以上の分類の異なる酵素に、同分類で起源の異なる酵素を１種以上併用することも好ましい。

これらプロテアーゼはエキソ活性が少ないものが好ましい。また、粗酵素や酵素製剤は複数種のプロテアーゼを含んでいる場合があるが、この際は実質的な活性を示すプロテアーゼが、それぞれ別々に存在するものとして扱うことができる。またそれぞれのプロテアーゼは活性中心や起源により分類することができる。

反応ｐＨや反応温度は、それぞれのプロテアーゼの至適条件、或いは活性の得られる条件であり、特に２種以上のプロテアーゼを同時に用いる際は、共に活性が得られる条件を選択する。通常反応ｐＨは各々の酵素の至適ｐＨ付近であり、温度は0〜100℃，好ましくは20〜80℃，更に好ましくは40〜60℃で反応を行なう。反応時間もｐＨや温度により変化するので特には限定しないが、概ね5分〜24時間、好ましくは10分〜12時間、更に好ましくは30分〜6時間が適当である。反応後、反応液は60℃〜100℃で加熱することで残存酵素活性を失活させる。

反応液はそのまま乾燥を行なうこともできるし、任意のｐＨに調整することもでき、またｐＨ調整時に発生する沈澱物や懸濁物を遠心分離や濾過等により除去することもできる。また、この後に活性炭や吸着樹脂等により、精製を行なうこともできる。

以上のように、大豆蛋白を酵素分解して得られる分子量５００以下のペプチド画分が６５％以上且つ、遊離アミノ酸が１０％以下であるオリゴペプチド混合物がクレアチンホスホキナーゼ分泌を抑制する効果（CPK減少効果）に優れるものである。
かかるペプチド画分がアミノ酸まで分解されて遊離アミノ酸の量が多くなるとCPK減少効果が劣り、分子量分布が、1000以上が22.5％、500〜1000が20.5％、500以下が57.0％になるとCPK減少効果を有するものの、本発明より劣るものとなる。

本発明のCPK分泌抑制組成物は前記ペプチド混合物を有効成分として剤または食品とすることができる。例えば、錠剤、粉末状、顆粒状、固形状、流動物状、液状等の形態とすることができる。

例えば、本発明の組成物が剤として投与される場合は、有効成分を単独で、又は薬学的に許容される担体と混合して各種の投与形態に調製して投与することができる。いずれの場合もこれらは適当な薬学的に許容される担体を用いて通常の方法に従い製剤化できる。ここで用いられる担体としては通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば充填剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤等の希釈剤乃至賦形剤等を例示できる。投与形態は特に限定されず、治療目的に応じて適宜選択できるが、例えば経口的投与の場合には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤等の形態で投与できる。簡易性の点から経口的投与が望ましい。
また、本発明に関わる医薬品は、大豆蛋白を酵素分解して得られる分子量５００以下のペプチド画分が６５％以上且つ、遊離アミノ酸が１０％以下であるオリゴペプチド混合物を含み、CPK分泌を伴う筋損傷、筋肉痛、肉体疲労の少なくともいずれかを予防および改善する作用を有するものであればよく、大豆蛋白を酵素分解して得られる分子量５００以下のペプチド画分が６５％以上且つ、遊離アミノ酸が１０％以下であるオリゴペプチド混合物以外に含まれる成分として、特に限定されるものではない。本医薬品は経口的に投与できる剤形であることが好ましい。具体的には、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、ドリンク剤、シロップ剤等を挙げることができる。

また、例えば、本発明の組成物が食品の場合は、飲料のような液体食品やプロテインバーのような固形食品とすることができる。また一般の食品に本発明の前記ペプチド混合物を混合して食することもできる。即ち、大豆蛋白を酵素分解して得られる分子量５００以下のペプチド画分が６５％以上且つ、遊離アミノ酸が１０％以下であるオリゴペプチド混合物のみからなる食品でもよく、大豆蛋白を酵素分解して得られる分子量５００以下のペプチド画分が６５％以上且つ、遊離アミノ酸が１０％以下であるオリゴペプチド混合物以外の成分を含む食品でもよい。
その他にも例えば、いわゆる栄養補助食品（サプリメント）として大豆蛋白を酵素分解して得られる分子量５００以下のペプチド画分が６５％以上且つ、遊離アミノ酸が１０％以下であるオリゴペプチド混合物を含む錠剤、顆粒剤、散剤、ドリンク剤等を挙げることができる。

本発明の組成物の摂取に関して、特に1日の摂取回数は限定しないが、運動前後、もしくは運動中の摂取が好ましい。
効果的にCPKの分泌抑制するための一回の投与量としては、有効成分である大豆蛋白を酵素分解して得られる分子量５００以下のペプチド画分が６５％以上且つ、遊離アミノ酸が１０％以下であるオリゴペプチド混合物を標準体重の人（60kg)に対し、2g以上、好ましくは6g以上、より好ましくは10g以上が適当である。
本発明の組成物はヒトを対象とするものであることはいうまでもないが、ヒトに限定されるものではなく、広く動物全般を対象とすることができる。

以下に実施例を示す。

［製造例１］
脱脂大豆1部を水10部に溶解し、pH7.0で1時間、攪拌下で抽出を行い、オカラを遠心分離で除いて脱脂豆乳を得た。得られた脱脂豆乳に0.01%の亜硫酸水素ナトリウムを加え、塩酸でpH6.4とした。脱脂豆乳を2〜5℃で6時間静置し、遠心分離で沈殿物を回収し、水酸化Naで中和後、高温殺菌及び噴霧乾燥を行って11S大豆蛋白を得た。
このようにして得られた11S大豆蛋白質を基質にして、以下の方法に従いペプチドを調製した。すなわち、11S大豆蛋白質の8%溶液に対し、サモアーゼ（起源；Bacillus thermoproteolyticus, 金属プロテアーゼ, 大和化成）を対蛋白質あたり2%加え、pH9.0, 58℃で60分間作用させた。次にビオプラーゼ（起源；Bacillus sp. セリンプロテアーゼ, ナガセケムテック）を対蛋白質あたり1%加え、pH7.5, 58℃で60分作用させた。スミチームFP（起源；Aspergillus sp., 金属プロテアーゼ、新日本化学工業）を対蛋白質あたり1%加え、pH7.5、58℃で60分作用させた。
以上の処理の後、90℃, 20分で加熱して反応を停止させ、噴霧乾燥してオリゴペプチド混合物（Ｔ１）を得た。
原料の11S大豆蛋白質に対する固形分収率は、96重量%であった。また、乾燥固形分あたりCPは87％、遊離アミノ酸含量は8%であった。また、SDS溶媒系ゲルろ過分析により測定した分子量分布は分子量1000以上が8%、500-1000が20%、500以下が72%であった。

[製造例２]
３％分離大豆たん白質溶液に対して、サモアーゼ（起源；Bacillus thermoproteolyticus，金属プロテアーゼ，大和化成）を対たん白質あたり２％加え、pH9.0，58℃で60分間作用させた。次にビオプラーゼ（起源；Bacillus sp.セリンプロテアーゼ，ナガセケムテック）を対たん白質あたり１％加え、pH7.5，58℃で60分作用させた。スミチームFP（起源；Aspergillus sp.，金属プロテアーゼ、新日本化学工業）を対たん白質あたり１％加え、pH7.5，58℃で60分作用させた。
以上の処理の後、90℃，20分で加熱して反応を停止した後、噴霧乾燥してオリゴペプチド混合物（Ｔ２）を得た。原料の分離大豆たん白質に対する固形分収率は、87重量%であった。

以上、製造例１で得られたオリゴペプチド混合物（Ｔ１）、製造例２で得られたオリゴペプチド混合物（Ｔ２）及び市販ペプチド混合物（「ハイニュートＤＣ６」不二製油株式会社製）の分子量分布及び遊離アミノ酸を以下の方法で調べた。
この結果、前述のようにオリゴペプチド混合物（Ｔ１）の分子量分布は、1000以上が8.0重量％（以下％）、500〜1000が20.0％、500以下が72.0％、遊離アミノ酸が8％であった。
また、オリゴペプチド混合物（Ｔ２）の分子量分布は、1000以上が9.5％、500〜1000が18.9％、500以下が71.6％、遊離アミノ酸が4％であった。
これに比べ、市販ペプチド混合物（「ハイニュートＤＣ６」不二製油（株）製）の分子量分布は、1000以上が22.5％、500〜1000が20.5％、500以下が57.0％、遊離アミノ酸が2％であった。表１に各混合物の分子量分布をまとめた。

得られたペプチド混合物は、以下の方法により分子量分布などを測定する。
○分解率測定
1 重量%濃度の試料に、30重量%のトリクロロ酢酸（TCA）を等量添加し、3,000rpm 10分間遠心し、得られた上澄をケルダール法にて測定し、別途ケルダール法にて測定した全粗たん白質に対する割合として算出した。

○分子量測定方法
２種のカラム直列接続によってペプチド用ゲルろ過システムを組み、分子量マーカーとなる既知ペプチドをチャージし、分子量と保持時間の関係において検量線を求めた。酵素分解した分解物（１％）を10,000×g、10分で遠心した上清を、ゲルろ過用溶媒で２倍希釈し、その5μlをアプライした。各分子量画分の含有量比率％については、全体の吸光度のチャート面積に対する、特定の分子量範囲（時間範囲）の面積の割合によって求めた（１stカラム：Superdex 75 10/300GL、 2ndカラム：Superdex Peptide 7.5/300GL，溶媒：1%SDS/10mMリン酸緩衝液,pH8.0，２５℃，流速：0.25ml/min，検出：OD220nm）。

なお、分子量分布測定用に用いた分子量マーカーは（株）ペプチド研究所販売の以下のものである。
Neurotensin (1673 Da)
Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (1046 Da)
Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (775 Da)
Arg-Arg-Gly-Asp-Met (763 Da)
Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu (555 Da)
Leu-Leu-Tyr (407.5 Da)
Glu-Glu-Glu (405 Da)
Val-Tyr-Val (380 Da)
Arg-Gly-Asp (346 Da)
Ile-Pro-Ile (342 Da)
Thr-Val-Leu (331 Da)
Leu-Trp (317 Da)
Val-Tyr (280 Da)
Glu-Glu (276 Da)
Gly-Gly-Gly-Gly (246 Da)
Ile-Asn (245 Da)
Leu-Gly-Gly (245 Da)
Leu-Leu (224.3 Da)
Val-Val (216.3 Da)
Gly-Gly-Gly (189 Da)
Pro (115 Da)

○遊離アミノ酸含量測定
試料（4mg/ml）に等量の3%スルホサリチル酸を加え、室温で15分間振とうする。10,000rpm 10分間遠心し、得られた上清を0.45μmのフィルターでろ過し、アミノ酸分析装置（日本電子製 JLC500V）にて、遊離アミノ酸を測定する。遊離アミノ酸量はケルダール法にて得られた全粗蛋白質に対する量として算出した。

［実施例１］
（実験材料および方法）
1. 11S大豆蛋白質の調製
11S大豆蛋白質は製造例1に従い調製した。
2. 11Sペプチドと大豆オリゴペプチド混合物の調製
11Sペプチドは製造例1に、大豆オリゴペプチド混合物は製造例2に従い調製した。
3. 市販大豆ペプチド混合物は不二製油株式会社製 ハイニュートDC6を用いた。
4. 被験者
既往症を持たず、薬を服用していない20歳の健常な男性16名を被験者とした。試験
期間中、被験者には試験結果に影響を及ぼす可能性のあるサプリメントの摂取を禁止し
た。
5. 運動負荷
本試験は、プラセボ飲料を対照とした二重盲検にて、1週間のウォッシュアウト期間を設定し、クロスオーバー試験にて実施した。運動負荷前に採血を行った後、被験者には、重量負荷無しのフルスクワット25回を1分間のインターバルで4セット行わせ、運動直後に各試験飲料を30秒かけて摂取させた。運動負荷後の採血は、30分後、18時間後に行った。なお、試験飲料として、11S大豆蛋白質、11Sペプチド、大豆オリゴペプチド混合物もしくは市販ペプチド混合物を8g含む飲料を摂取させた。各試験飲料は、味のマスキングのため砂糖、被験者が試験飲料を識別できないように、カラメル色素を加えた。対照となるプラセボ飲料は窒素源が入っていない以外、他の試験飲料と組成は同じにした。
6. 血液パラメーター
CPKの動態を調べた。
４．統計解析
各測定値は、平均±標準誤差で示した。一元配置分散分析によりF値に有意差（p＜0.05）が認められた場合、Student Newman Keuls 法により有意差検定を行い、有意水準5%未満の場合に有意差ありと判断した。

（結果）
表２に運動前に対する運動後のCPK活性の変化量を各試験飲料別に示す。表中の上付き文字は異なる文字間で有意差（p＜0.05）があることを示す。
CPKの値は、運動負荷後30分で群間に有意差は確認されなかったが、18時間後のCPK活性の上昇は、プラセボ摂取群に対し、窒素源を含んだ試験飲料を摂取した群において有意な低下が見られた。これらの結果は、運動によって生じた筋損傷を抑制したことを示唆する。一方、11S蛋白質摂取群に対し、ペプチド摂取群のCPK変化量は低下傾向、もしくは有意な低下が見られ、筋損傷を効果的に軽減することが示唆された。さらに、同じペプチド混合物であっても、低分子ペプチド（＜500）を多く含む11Sペプチドや大豆オリゴペプチド混合物のほうが、市販大豆ペプチド混合物より有意な低下が見られ、より強い筋損傷軽減効果が認められた。この結果は、低分子ペプチド（＜500）を多く含むペプチド混合物のほうが、吸収効率がよく、より効果的に運動後の筋損傷を軽減するものと考えられた。

本発明のCPK分泌抑制組成物は運動の際に摂取することにより、筋肉の損傷を予防、もしくは効率的に修復することで遅発性筋肉痛などの肉体疲労を軽減する効果を有する食品素材、食品および医薬品として実施することができる。したがって、食品産業や医薬品産業において利用可能である。

Claims (2)

1. 大豆蛋白を酵素分解して得られる分子量５００以下のペプチド画分が６５％以上且つ、遊離アミノ酸が１０％以下であるオリゴペプチド混合物を有効成分とする経口摂取用クレアチンホスホキナーゼ分泌抑制組成物。
2. 大豆蛋白が11S大豆蛋白である、請求項１記載の経口摂取用クレアチンホスホキナーゼ分泌抑制組成物。