JP5745402B2 - α−ラクトアルブミン由来のトリプトファン含有ペプチドを含有する乳漿タンパク質加水分解物およびその使用 - Google Patents

Description

本発明は、乳漿タンパク質加水分解物、特に、α−ラクトアルブミンを富化した乳漿タンパク質に由来する、およびα−ラクトアルブミンに由来する加水分解物、ならびに、医薬、降圧剤、栄養補助食品、食品、および飼料を製造するためのその使用、ならびに、このようにして製造された医薬、降圧剤、栄養補助食品、食品、および飼料に関する。

末梢動脈高血圧（高血圧）は、西欧工業国で５０歳以上の成人の２人に１人が罹っている国民病である（収縮期血圧１４０ｍｍＨｇ超）。高血圧は、多くの続発症に、例えば、動脈閉塞症（冠動脈性心疾患、脳機能不全、末梢動脈閉塞症）を伴う血管変性（アテローム性動脈硬化症）、心肥大、心筋梗塞、および心不全、ならびに卒中発作に繋がる。これらの合併症のリスクは、収縮期および拡張期血圧の上昇に伴ってほぼ指数関数的に増加し、閾値は存在しない。収縮期血圧が１１０ｍｍＨｇの場合と比較して、心筋梗塞で死亡するリスクは、血圧が１４５ｍｍＨｇの場合には２倍になり、１６０ｍｍＨｇの場合には３倍になる。最近の高血圧治療の不可欠の要素は、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）活性阻害、即ち、１９８０年代初期以降、いわゆるＡＣＥ阻害剤の使用により有効性が広く記載されている方法による、いわゆるレニン−アンジオテンシン−アルドステロン系の阻害である。推定によれば、ドイツでは、今日、人口の約２０％、即ち、５５歳より上の２人に１人が、高血圧に対する医薬による治療を受けている。健康保険制度が負担する費用は、ＢＲＤでは２００５年には約１５億ユーロであったが、そのうち、約半分がＡＣＥ阻害剤の処方箋であった（非特許文献１）。このような背景から、高血圧の結果として起こる心血管死の更なる減少を達成できるように新種の予防法が必要である。これは、年齢による動脈血圧の変化（Ｅｎｔｗｉｃｋｌｕｎｇ）に良い影響を及ぼすように、毎日の食品に有効成分を添加することによって行うことができる。

高血圧は、獣医学においても、近年顕著な問題になっており、その結果、飼い主にその直接の治療費用が掛かっている。推定によれば、ドイツでは、約２３００万匹のペットが飼われており、そのうち約５３０万匹がイヌであり、７５０万匹がネコである（ドイツ統計年鑑、２００６年）。これらのペットの寿命が延びているため、ここでも高血圧はますます医薬上の問題になっている。

ペット飼育の個人的−社会的意義の他に、これには相当な経済的意義もある。例えば、ドイツでは２００８年に動物の餌の売上高は約２６億ユーロであったが、そのうち９０％をはるかに上回る大部分がイヌとネコの餌であった（出典：非特許文献２）。研究から、ネコの約６１％およびイヌの９３％以下が、その「最適な」飼育条件およびそれに伴う長い余命のため、その寿命の間に高血圧を発症することが示唆された（非特許文献３）。その場合、高血圧は、老齢に起因する腎臓疾患または別の代謝異常と関連して現れることが多く、これは、腎不全、失明、および神経医学的合併症に繋がる可能性がある（非特許文献４）。

一方で、食品タンパク質の構造中に、特に乳タンパク質中に存在し、インビトロでＡＣＥを阻害し得る複数のペプチドが既知である（非特許文献５）。そこで最もよく知られているのは、２つのトリペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−ＰｒｏおよびＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏであり、これらは、特殊な微生物（ラクトバチルス・ヘルベティカスＬＢＫ−１６Ｈ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ＬＢＫ−１６Ｈ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）を用いて乳発酵する際に、カゼインからタンパク質分解により生成される（非特許文献６）。「カソキニン（Ｃａｓｏｋｉｎｉｎｅ）」または「ラクトトリペプチド」としても知られているこれらのペプチドは、発酵乳製品中に生成され得るか、または事前に濃縮した後で特定の食品に添加され得る。一方で、血圧降下のための対応する機能性乳製品は、日本（「カルピス」）や複数の欧州諸国（フィンランド、ポルトガル、スイスでは「Ｅｖｏｌｕｓ」）で市販されている。

臨床試験から、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｒｏおよびＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを含有する発酵乳製品の摂取により、高血圧の場合に著しい血圧降下を達成できることが示唆されている（非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）が、最近の研究はそれと相反している（非特許文献１１、非特許文献１２）。

前述の理由で、さらに、ＡＣＥ阻害ペプチドによる血圧降下の原理を動物の飼料の場合に応用することも考えられる。その場合、基本的に全ての製品について使用が考えられる（湿潤および乾燥配合飼料の富化、特別な「スナック」など）。これらの飼料は同様に自由に販売することができ、飼い主はそれを、獣医が処方する医薬よりずっと少ない費用で使用することができる。

前述のペプチドを使用するこれまでの適用（Ａｐｐｌｉｋａｔｉｏｎ）は、次の欠点を特徴とする。例えば、それは、比較的効果の低い、即ち、比較的弱いＡＣＥ阻害剤を使用する。それによって、生物学的作用を得るには、当該食品（例えば、発酵した乳製品）に比較的高濃度のペプチドを添加しなければならず、これは、費用の理由からだけでなく感覚的な点からも好ましくないが、その理由は、食品タンパク質の加水分解の際に、苦く不快な味を有するペプチドを生成し、そのため食品中に使用することが困難になるからである。

特許文献１は、苦い香味を含まない生理活性ペプチドを含有する、加水分解された乳漿タンパク質製品を製造する方法を開示している。その目的で、乳漿タンパク質含有基質は、最大１０％の加水分解度が達成されるまで酵素により加水分解される。１０％の加水分解度は、加水分解されるタンパク質中のペプチド結合の平均１０％が切断されることに対応する。また、本発明の製品に含有される多数の生理活性ペプチドも開示されており、それらは、アミノ酸２〜１９個の長さであり、プロテアーゼ−ペプトン、β−ラクトグロブリン、グリコマクロペプチドおよびβ−カゼインの一次配列から遊離されたものである。

特許文献２は、ＡＣＥ阻害作用を有する組成物の製造方法を開示している。その目的で、乳漿タンパク質単離物がタンパク質分解消化される。ＡＣＥ阻害作用は特定のペプチドによるものとされていない。

特許文献３は、β−ラクトグロブリン含有基質を２段階で消化することによる、ＡＣＥ阻害作用を有するタンパク質加水分解物の酵素による製造を開示している。第１段階では、β−ラクトグロブリン含有基質を広域（Ｂｒｅｉｔｂａｎｄ）エンドプロテアーゼ、好ましくはアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）で消化し、第２段階では、プロリン特異性エンドプロテアーゼにより消化を行う。この発明は、とりわけ、出発物質中のβ−ラクトグロブリンの割合を増加させるために、基質として乳漿タンパク質を使用する場合、α−ラクトアルブミンなどの別の乳漿タンパク質を沈殿させることも開示している。

特許文献４は、カゼイン含有出発物質を乳酸菌で発酵させることにより、抗高血圧作用を有するペプチドを含有する製品の製造方法を開示している。その後、ナノろ過し、その後、保持液を回収することにより、ペプチド含有発酵製品が得られる。

Ｓａｔｏらは、ＡＣＥ阻害作用を有する様々なペプチドを記載しており、その中に、プロテアーゼＳアマノ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｓ Ａｍａｎｏ）を用いて褐藻類をタンパク質分解消化することにより得られたＩｌｅ−Ｔｒｐも記載されている（非特許文献１３）。

特許文献５は、サケの筋肉または肝臓からプロテアーゼ消化により、ＡＣＥ阻害作用を有する生理活性ペプチド、とりわけＩｌｅ−Ｔｒｐを製造することも開示している。

Ｋｕｂａらは、大豆製品の発酵により製造される伝統的な日本の食品中のＡＣＥ阻害ジペプチドＴｒｐ−Ｌｅｕを記載している（非特許文献１４）。

特許文献６は、肝障害を有する患者、ならびに、術後、感染症または熱湯傷の患者のための食品組成物を開示しており、それは、脂質成分としての脂肪酸を多く含む油および乳レクチンまたは大豆レクチンの他に、タンパク質成分として乳タンパク質加水分解物および発酵した乳製品から得られたタンパク質を含有する。この食品組成物の有利な作用は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６などの炎症性サイトカインの抑制によるものとされる。この作用の原因である個々のペプチドには言及していない。この加水分解は、純粋に経験的−現象学的に行われ、化学分析目標値（例えば、加水分解度、分子量範囲、個々のペプチド）は記載されていない。

特許文献７は、確かに、乳漿タンパク質由来のＡＣＥ阻害ペプチドに関するものであるが、専ら、より高い分子量のペプチド（アミノ酸２〜１４個のオリゴペプチド）に関するものである。しかし、ジペプチドＩｌｅ−ＴｒｐおよびＴｒｐ−Ｌｅｕには言及していない。

Ｍｕｌｌａｌｙ，Ｍ．Ｍ．らの出版物（非特許文献１５）は、α−ラクトアルブミンおよびβ−ラクトグロブリンの特定の配列領域に対応するＡＣＥ阻害作用を有する合成ペプチドに関する。しかし、この配列は、ジペプチドＩｌｅ−ＴｒｐおよびＴｒｐ−Ｌｅｕを含まない。

Ｐｈｉｌａｎｔｏ−Ｌｅｐｐａｅｌａｅ Ａ．らの要約（非特許文献１６）は、全般に、乳漿加水分解物のＡＣＥ阻害作用に関する。

欧州特許第１０８７６６８Ｂ１号明細書 国際公開第０１／８５９８４号パンフレット 国際公開第２００６／０２５７３１号パンフレット 欧州特許第１２２６２６７Ｂ１号明細書 特開２００６−０９６７４７号公報 国際公開第２００４／０４７５６６号パンフレット 国際公開２００７／００４８７６Ａ２号パンフレット

Ｓｃｈｗａｂｅ Ｕ．ｕｎｄ Ｐｆａｆｆｒａｔｈ Ｅ．Ａｒｚｎｅｉｖｅｒｏｒｄｎｕｎｇｓ−Ｒｅｐｏｒｔ ２００６．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，２００６ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｖｅｒｂａｎｄ Ｈｅｉｍｔｉｅｒｂｅｄａｒｆ ＩＶＨ ｅ．Ｖ．，"Ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ ＰＥＴ Ｍａｒｋｅｔ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓａｌｅｓ Ｄａｔａ"ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｖｈ−ｏｎｌｉｎｅ．ｄｅ／ｆｉｌｅａｄｍｉｎ／ｕｓｅｒ＿ｕｐｌｏａｄ／Ｇｅｒｍａｎ＿Ｐｅｔ＿Ｍａｒｋｅｔ＿２００８＿Ａ４．ｐｄｆ Ａｃｉｅｒｎｏ Ｍ．Ｊ．，Ｌａｂａｔｏ Ｍ．Ａ．（２００５）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｌｉｎ．Ｔｅｃｈ．Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍ．Ｐｒａｃｔ．２０：２３−３０ Ｂｒｏｗｎ Ｓ．Ａ．，Ｈｅｎｉｋ Ｒ．Ａ．（１９９８）Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｖｅｔ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍ．Ｐｒａｃｔ．２８：１４８１−９４ Ｓａｉｔｏ Ｔ．Ａｎｔｉｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｃａｓｅｉｎ ａｎｄ ｗｈｅｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２００８，６０６，２９５−３１７ Ｎａｋａｍｕｒａ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｓｏｕｒ ｍｉｌｋ．Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．１９９５，７８，７７７−７８３ Ｈａｔａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ｓｏｕｒ ｍｉｌｋ ｏｎ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｉｎ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｓｕｂｊｅｃｔｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．１９９６，６４，７６７−７７１ Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｒａｍｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｓｏｕｒ ｍｉｌｋ ｏｎ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｉｎ ｂｏｒｄｅｒｌｉｎｅ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｍｅｎ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２００４，１７，７０１−７０６ Ｓｅｐｐｏ Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｍｉｌｋ ｈｉｇｈ ｉｎ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｈａｓ ａ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ−ｌｏｗｅｒｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｓｕｂｊｅｃｔｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．２００３，７７，３２６−３３０ Ｍｉｚｕｎｏ Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃａｓｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｉｎ ａ ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ａｎｄ ｍｉｌｄ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ． Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．２００５，９４，８４−９１ Ｌｅｅ Ｙ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ｍｉｌｋ ｄｒｉｎｋ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ｗｈｅｙ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｉｌｄ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．２００７，４６，２１−２７ Ｅｎｇｂｅｒｉｎｋ Ｍ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｃｔｏｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ｓｈｏｗ ｎｏ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ａ ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２００８，５１，３９９−４０５ Ｓａｔｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｗａｋａｍｅ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｎｔｉｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｒａｔｓ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２００２；５０（２１）６２４５−５２ Ｋｕｂａ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ−Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｔｏｆｕｙｏ Ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｆｏｏｄ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００３，６７（６）１２７８−１２８３ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，Ｖｏｌ．３７７，ｐｐ．２５９−２６０，Ａｐｒｉｌ １９９６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００）６７（１），ｐｐ．５３−６４ Ｃｕｓｈｍａｎ，Ｄ．Ｗ． ａｎｄ Ｃｈｅｕｎｇ，Ｈ．−Ｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ ｏｆ Ｒａｂｂｉｔ Ｌｕｎｇ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９７１，２０，１６３７−１６４８

これまで使用されたペプチドは、主としてＡＣＥ阻害作用があり、別の標的系（エンドセリン変換酵素、マトリックス金属タンパク質分解酵素）に対する作用、従って広い血管保護作用は記載されていない。さらに、これまで記載されたペプチドの多くは、３個以上のアミノ酸からなるオリゴペプチドである。このため、小腸における加水分解不安定性が顕著であり、それに対応して経口アベイラビリティが低い。

α−ラクトアルブミンは、今日、チーズの製造過程で乳漿の一部として毎日トンのスケールで生じる。今のところ包括的な使用はなされていない。従って、これまで食品業界でほとんど利用されなかった食品タンパク質（α−ラクトアルブミン）を、機能性食品の製造に利用（「加工（Ｖｅｒｅｄｅｌｕｎｇ）」）することは、非常に望ましい。

本特許の新規な点および対象は、ＡＣＥ阻害作用を有し、機能性食品、栄養補助食品または医薬組成物の成分として使用できるα−ラクトアルブミン由来の特定のトリプトファン含有ペプチド（加水分解物）の使用である。

本明細書に記載の本発明の目的は、効果が高く、即ち、ＡＣＥ阻害作用が強く、従って血圧を降下させる可能性があるペプチドを、これまで広く利用されなかった乳漿タンパク質であるα−ラクトアルブミンのタンパク質分解により生成し、機能性食品の生理活性成分として使用することである。

本発明の目的は、さらに、ＡＣＥ阻害による血圧降下の他に、他の関連する標的系（ＥＣＥ、ＭＭＰ）の阻害により更なる血管保護に寄与するトリプトファン含有ペプチドを含有する製品を使用可能にすることである。本明細書に記載の本発明により、非常に様々な有効な機能性食品が開発される。

意外なことに、これらの目的は、本発明の乳漿タンパク質加水分解物によって達成される。

本発明は、ＡＣＥ阻害および抗高血圧作用を有する乳漿タンパク質加水分解物を含み、それは、配列番号２〜３２から選択される配列を有する少なくとも１種類の生理活性トリプトファン含有ペプチドを生理学的に有効な量含有する。本発明のタンパク質加水分解物は、乳漿タンパク質単離物または純粋なα−ラクトアルブミンの広範な（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）加水分解によって得られる。本発明の意味では広範な加水分解とは、加水分解物中のペプチドの平均モル質量（Ｍｏｌｍａｓｓｅｎ）が４ｋＤａ未満、好ましくは１０００Ｄａ未満、特に５００Ｄａ未満であることと理解されるものとする。これは、タンパク質をジペプチド〜ペンタペプチドに分解することに対応する。この場合、加水分解は、好ましくは酵素により行われる。

加水分解の出発物質として、乳漿と同様に、市販の乳漿粉末、乳漿タンパク質単離物、乳漿タンパク質調製物または乳漿から得られるα−ラクトアルブミンも適しており、これらは、精密ろ過、等電沈殿、クロマトグラフィー等の方法工程により工業的にさらに処理されたものである。好ましくは、加水分解の出発物質としてα−ラクトアルブミンが使用される。タンパク質α−ラクトアルブミンは、牛乳の乳漿中に、全乳漿タンパク質の約２０％の割合で含有されており、従って、β−ラクトグロブリンに次いで、牛乳の乳漿中に２番目に多い乳漿タンパク質である。有利には、本発明の乳漿タンパク質加水分解物は、これまで食品業界でほとんど利用されなかったこの食品タンパク質を機能性食品の製造に利用できるようにする（「加工」）。この「廃棄化合物」の加水分解により、高血圧に予防的および薬理学的な影響を及ぼすＡＣＥ阻害剤として利用可能な、生物学的に効果の高いペプチドが得られる。

意外なことに、本発明の乳漿タンパク質加水分解物中に、加水分解により、α−ラクトアルブミンの一次配列に由来するアミノ酸２〜５個、好ましくは２〜３個、特に好ましくは２個の長さを有する生理活性トリプトファン含有ペプチドが遊離される。本発明の生理活性トリプトファン含有ペプチドは、アミノ酸トリプトファンを末端の位置に、即ち、Ｃ末端またはＮ末端アミノ酸として含有する。好ましくは、トリプトファンはＣ末端に位置する。

本発明の生理活性ペプチドの配列は、従って、α−ラクトアルブミンの一次配列から生じ、当該トリプトファン残基（Ｗ２６、Ｗ６０、Ｗ１０４、およびＷ１１８）と１〜４個のアミノ酸を含み、このアミノ酸は、α−ラクトアルブミン配列中で、当該トリプトファン残基のＮ末端またはＣ末端にある。

ウシα−ラクトアルブミン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ００７１１［ＬＡＬＢＡ＿ＢＯＶＩＮ］）の一次配列は、配列番号１に対応する：

１ １１ ２１
ＥＱＬＴＫＣＥＶＦＲ ＥＬＫＤＬＫＧＹＧＧ ＶＳＬＰＥＷＶＣＴＴ
３１ ４１ ５１
ＦＨＴＳＧＹＤＴＱＡ ＩＶＱＮＮＤＳＴＥＹ ＧＬＦＱＩＮＮＫＩＷ
６１ ７１ ８１
ＣＫＤＤＱＮＰＨＳＳ ＮＩＣＮＩＳＣＤＫＦ ＬＤＤＤＬＴＤＤＩＭ
９１ １０１ １１１ １２１
ＣＶＫＫＩＬＤＫＶＧ ＩＮＹＷＬＡＨＫＡＬ ＣＳＥＫＬＤＱＷＬＣ ＥＫＬ
（配列番号１）

本発明の加水分解物を製造するために牛乳の乳漿を使用する場合、本発明の生理活性ペプチドの配列は、ウシα−ラクトアルブミンの一次配列から生じ、含有されるトリプトファン（Ｗ２６、Ｗ６０、Ｗ１０４、およびＷ１１８）のうちの１つのＮ末端またはＣ末端にある１〜４個のアミノ酸と当該トリプトファンを含む。

本発明の生理活性トリプトファン含有ペプチドは、従って、好ましくは、配列番号２〜８を有するジペプチド、配列番号９〜１６を有するトリペプチド、配列番号１７〜２４を有するテトラペプチド、および配列番号２５〜３２を有するペンタペプチドを含む。

本発明のトリプトファン含有ペプチドの配列を次の表に記載する：

特に好ましくは、本発明の乳漿タンパク質加水分解物中には、食品中に検出されたこれまでで最も効力のあるＡＣＥ阻害剤（ＩＣ_５０＝０．７μＭ）であるジペプチドＩｌｅ−Ｔｒｐ、および／または同様に効果の高いジペプチドＴｒｐ−Ｌｅｕ（ＩＣ_５０＝１０μＭ）が含有されている。本発明の乳漿タンパク質加水分解物中に含有され、α−ラクトアルブミンに由来するこれまでに知られていないジペプチドは、強いＡＣＥ阻害を特徴とし、食品ペプチドに関して記載されたこれまでで最も高い効果を有する。

生理活性トリプトファン含有ペプチドは、ＡＣＥ阻害剤と構造的類似性を有する。この構造的類似性のため、ＡＣＥ阻害またはそれに伴う血圧降下の他に、広範な生理学的作用、即ち、血管保護、心重量の減少、血管壁肥厚の退縮、心筋梗塞および脳卒中の予防に繋がる可能性がある。これらのペプチドを含有する乳漿タンパク質加水分解物を用いた自然発症高血圧ラットでの実験から、このような作用が示唆された。

本発明の乳漿タンパク質加水分解物は、ＡＣＥ阻害のＩＣ_５０値を特徴とする。ＩＣ_５０値が低いほど、ＡＣＥ阻害作用が高い。本発明の乳漿タンパク質加水分解物のＩＣ_５０は、好ましくは、５０〜１００ｍｇ乳漿タンパク質加水分解物／リットル、好ましくは２０〜５０ｍｇ乳漿タンパク質加水分解物／リットル、特に好ましくは２〜２０ｍｇ乳漿タンパク質加水分解物／リットルである。

ＩＣ_５０値が低く、ＡＣＥ阻害が強いため、それに加えて、必要なペプチド添加の量が非常に少なく（前述のトリペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−ＰｒｏおよびＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏと比較して、Ｉｌｅ−Ｔｒｐでは約１／１０のみ）、これは、起こり得る感覚的な点に鑑みて、有利である。即ち、タンパク質加水分解物は、加水分解により、たいてい苦味を持つようになり、そのため、飲食に適している食品、または経口摂取される医薬の製造における使用が明らかに制限される。この苦い味により、タンパク質加水分解物は、非常に限られた範囲でしかこれらの製品に添加できない。しかし、本発明の乳漿タンパク質加水分解物は、少量で既に効果が高く、従って、有利には、食品および経口投与される医薬の製造に使用することができる。

本発明の乳漿タンパク質中に含有される効果の高いペプチドは、好ましくは、例えば、配列番号３、４、７、１１、１４、１７および２２を有するペプチドなどの疎水性の高いアミノ酸からなる。

このため本トリプトファン含有ペプチドは、有利には、加水分解に対して安定であり、そのため、加水分解時間が長い場合でも、加水分解物は本発明のトリプトファン含有ペプチドを有効な濃度含有すると考えることができる。

本発明は、さらに、本発明の乳漿タンパク質加水分解物の製造方法を含む。加水分解は、好ましくは、少なくとも酵素アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）およびトリプシンを用いて酵素により行われる。この２つの酵素を用いた消化は、逐次的にまたは同時に実施することができる。酵素／基質比（ｇ酵素／ｇ基質）は、好ましくは１：１０〜１：１０，０００である。

特に好ましくは、その後に他の酵素を用いた消化を行うか、または他の酵素を、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）およびトリプシンを用いた消化に添加する。使用される酵素は、好ましくはエンドプロテアーゼ、特に好ましくは、キモトリプシン、パンクレアチン、ペプシン、およびコロラーゼ（Ｃｏｒｏｌａｓｅ）ＰＰなどの酵素である。

加水分解速度は、使用される酵素ならびにその濃度および加水分解温度に依存する。また、例えば、ｐＨ値または加水分解基質の化学組成などの他のパラメータも加水分解速度に影響を及ぼす可能性がある。

加水分解は、含有されるタンパク質の５０％超が４ｋＤａ未満、好ましくは１ＫＤａ未満、特に好ましくは５００Ｄａ未満のモル質量を有するまで、実施される。それは、タンパク質がジペプチド〜ペンタペプチドに分解されることに対応する。本発明のジペプチドＩｌｅ−ＴｒｐおよびＴｒｐ−Ｌｅｕは、例えば、約３１７Ｄａのモル質量を有する。十分長い時間、加水分解を実施することによって、本発明の乳漿タンパク質加水分解物中に生理活性トリプトファン含有ペプチドができるだけ高い割合で得られることが確実になる。酵素による加水分解は、１０℃〜８０℃、好ましくは３０℃〜７０℃、特に好ましくは５０℃〜６０℃の温度で実施される。このとき、加水分解の進行を例えばゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で監視し、所望の加水分解度を達成した後、酵素の失活により、好ましくは８０℃〜１００℃の温度に加熱することにより停止させる。加水分解段階（インキュベーション時間）は、好ましくは１２時間〜３６時間、好ましくは１８時間〜３０時間、特に好ましくは２０〜２８時間持続する。

本発明は、また、本発明の乳漿タンパク質加水分解物を製造するための乳漿タンパク質の使用も含む。本発明の生理活性トリプトファン含有ペプチドは、乳漿タンパク質α−ラクトアルブミンの一次配列に含まれており、酵素による加水分解でこれから遊離される。従って、好ましくは、乳漿タンパク質加水分解物を製造するために、α−ラクトアルブミンを富化した乳漿タンパク質、特に好ましくはα−ラクトアルブミン自体も乳漿タンパク質として、乳漿タンパク質加水分解物の製造に使用される。

本発明は、さらに、ＡＣＥ阻害および抗高血圧作用を有する配列番号２〜３２から選択される配列を有する生理活性トリプトファン含有ペプチドの製造方法を含む。ここで、本方法は、乳漿タンパク質の加水分解、および、その後、乳漿タンパク質加水分解物から生理活性トリプトファン含有ペプチドを得ることを含む。ここで、好ましくは、加水分解は、請求項７〜１０に開示されている方法に従って実施される。

加水分解の出発物質として、乳漿、市販の乳漿粉末、乳漿タンパク質単離物、乳漿タンパク質調製物または乳漿から得られるα−ラクトアルブミンが適しており、それらは、精密ろ過、等電沈殿、クロマトグラフィー等により工業的にさらに処理されたものである。従って、本発明は、生理活性トリプトファン含有ペプチドを製造するための乳漿タンパク質の使用も含む。

乳漿中に十分な量のα−ラクトアルブミン（約１００ｍｇ／リットル）を含有する限り、原則的にどのような種類の哺乳類の乳汁も本発明の加水分解物の製造に適している。しかし、牛乳の乳漿を使用することが好ましい。

例えば、有機溶媒を用いた抽出、限外ろ過などの調製化学の標準的技術で、または好ましくは分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）で生理活性トリプトファン含有ペプチドを得る。

乳漿タンパク質加水分解物から単離されたトリプトファン含有ペプチドを食品に添加することができる。このような食品としては、食品（Ｎａｈｒｕｎｇｓｍｉｔｔｅｌ）および嗜好品（Ｇｅｎｕｓｓｍｉｔｔｅｌ）、ならびに栄養補助食品などの食品が挙げられる。最後に、α−ラクトアルブミン由来の新規で効果のあるトリプトファン含有ペプチドは、ＡＣＥ阻害剤の医薬製造に適している。

本発明は、また、食品を製造するための本発明の乳漿タンパク質加水分解物の使用も含む。さらに、本発明は、降圧薬を製造するための本発明の乳漿タンパク質加水分解物の使用を含む。

本発明は、同様に、食品を製造するための、請求項１１に従って製造された生理活性トリプトファン含有ペプチドの使用を含む。

最後に、本発明は、降圧薬を製造するための、請求項に従って製造された請求項１１に記載の生理活性トリプトファン含有ペプチドの使用を含む。本発明の医薬は、特に経口投与に適しており、経口投与に適したどのような製剤にも調合できる。適した投与形態としては、例えば、粉末、インスタント粉末、圧縮錠剤（Ｐｒｅｓｓｌｉｎｇｅ）、顆粒、錠剤、発泡錠（Ｂｒａｕｓｅｔａｂｌｅｔｔｅｎ）、カプセル、糖衣錠、またはシロップ等がある。

本明細書に記載の、生理活性トリプトファン含有ペプチドを含有する乳漿タンパク質加水分解物は、直接、食品に添加することができる（例えば、乳飲料および乳漿飲料、フルーツジュース、清涼飲料水）。

乳漿タンパク質加水分解物は、また、凍結乾燥または噴霧乾燥により乾燥し、粉末に加工することができる。その場合、乳漿タンパク質加水分解物は、最終調製される（ｋｏｎｆｅｋｔｉｏｎｉｅｒｔ）、かつ／または、ビタミン、鉱物性物質、および／または微量元素などの別の栄養強化剤（Ｎａｈｒｕｎｇｓｍｉｔｔｅｌｅｒｇａｅｎｚｕｎｇｓｓｔｏｆｆｅｎ）と一緒に配合物中に使用される成分として使用可能である。粉末は、食品の添加物として、さらに、顆粒、錠剤、カプセル、パスチル（Ｐａｓｔｉｌｌｅｎ）、ロゼンジ（Ｓｕｅｓｓｉｇｋｅｉｔｅｎ）および液剤を製造するためにルースパウダーとして使用するのに適している。場合によっては、粉末に補助剤（Ｈｉｌｆｓｓｔｏｆｆｅ）および結合剤を添加することができる。

本発明の乳漿タンパク質加水分解物は、好ましくは、インスタント製品（可溶性飲料粉末、例えば、ココア、コーヒーまたは茶製品の飲料粉末、シロップ、濃縮液、発泡粉末または発泡錠など）として提供され、約５〜５０ｇ、好ましくは５〜１０ｇの分包に包装されており、例えば、２５０ｍｌの水またはフルーツジュースに溶解させることができる。インスタント粉末は、インスタント粉末の総重量に基づいて、本発明の乳漿タンパク質加水分解物を好ましくは５０重量％〜９８重量％、好ましくは７０重量％〜９５重量％、特に好ましくは８０重量％〜９２重量％の量で含有する。

乳漿タンパク質加水分解物は、その場合、インスタント粉末の他の成分の担体材料の役割もすることができるが、インスタント粉末は、他の通常の担体物質も含有することができる。乳漿タンパク質加水分解物の他に、インスタント粉末は、場合によっては、鉱物性物質、微量元素、ビタミン、天然および合成甘味料、香味料、酸味料、炭酸化合物、着色料、保存料、酸化防止剤、安定剤、および／またはその他の食品添加物を含有する。

インスタント飲料粉末の製造は、当業者に周知であり、標準的方法で行われる。

動物用の乾燥飼料／ペレット中のペプチドを置換するために、類似の方法を使用することができる。

本発明は、さらに、本発明の乳漿タンパク質加水分解物または本発明の方法で製造された少なくとも１種類の生理活性トリプトファン含有ペプチドを含有する食品を含む。

このような食品としては、例えば、ベーカリー製品類、特に、パン、クッキー、ペーストリー、長持ちのするベーカリー製品、ビスケット、およびワッフル、デザート類、特に、プディング、クリームおよびムース、ブレッドスプレッド類、マーガリン製品、ショートニング、果物製品類、特に、粒入りジャム、マーマレード、ゼリー、果物の保存食品、果物のピューレ、フルーツジュース、濃縮果汁、果肉飲料および果物粉末、野菜製品類、特に、野菜保存食品、野菜ジュース、および野菜ピューレ、シリアル、ミューズリ、およびシリアル混合物（Ｃｅｒｅａｌｉｅｎ−Ｍｉｓｃｈｕｎｇｅｎ）、または甘い菓子類、例えば、チョコレート、ボンボン、チューインガム、糖果、リコリス菓子、マシュマロ、フレークおよびヌガー製品である。

このような食品は、好ましくは、乳製品（Ｍｉｌｃｈｅｒｚｅｕｇｎｉｓ）または乳製品（Ｍｉｌｃｈｐｒｏｄｕｋｔ）である。乳製品は、特に好ましくは、乳汁、乳汁から製造されるブレッドスプレッド、乳飲料、乳漿飲料、ヨーグルトおよびヨーグルト飲料、および乳汁から製造されるその他の清涼飲料水ならびにアイスクリーム、生チーズ−、チーズ−、バター−、ケフィア−、カッテージチーズ、発酵乳−、バターミルク−、生クリーム−、コンデンスミルク−、粉乳−、乳漿−、乳糖−、乳タンパク質−、半脂肪バター（Ｍｉｌｃｈｈａｌｂｆｅｔｔ−）、乳漿混合（Ｍｏｌｋｅｎｍｉｓｃｈ）−、または、乳脂肪−製品または調製物を含む群から選択される。

食品は、場合によっては、栄養強化剤、補助剤、および／または甘味料を含有する。栄養強化剤または補助剤は、好ましくは、香味料、例えば、バニリン、着色料、味覚物質、乳化剤、例えば、レシチン、増粘剤、例えば、ペクチン、ローカストビーンガムまたはグアーガム、酸化防止剤、保存料、トリグリセリド、および天然または合成ビタミン類、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＢ_１、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_６、ビタミンＢ_１２、ビタミンＢ複合体、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、および／またはビタミンＫからなる群から選択される。甘味料は、好ましくは、スクラロース、サイクラミン酸ナトリウム、アセスルファムＫ、アスパルテーム、サッカリン、アセスルファム、サイクラミン酸塩類、タウマチン、およびネオヘスペリジンから選択される。

抗高血圧効果のある成分の栄養補給は、有利には、薬理学的治療のための補完的使用に適しており、例えば、食塩摂取の制限、スポーツ、ヨガ、および他の食事療法などの様々な補助的（「生活様式」）方法を補足する。乳漿製品のタンパク質分解から得られるＡＣＥ阻害ペプチドは、従って、機能性食品中で、本質的に高血圧の予防および補助的治療に寄与する。

最後に、α−ラクトアルブミン由来の新規で有効なトリプトファン含有ペプチドは、ＡＣＥ阻害剤の医薬製造に適しており、例えば、血管壁再構築を含めた高血圧の薬物療法において、心重量減少に、血流予備能の改善に、および心筋梗塞のリスクおよび脳卒中のリスクの低減に、単剤としてまたは合剤（Ｋｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｐｒａｅｐａｒａｔ）として使用可能である。

本発明は、従って、本発明の乳漿タンパク質加水分解物または本発明の方法により製造された少なくとも１種類の生理活性トリプトファン含有ペプチドを含有する降圧薬を含む。降圧薬は、その場合、まだ他の作用物質、好ましくは他のＡＣＥ阻害剤または他の血圧降下作用物質を含有することができる。医薬は、その他に、溶剤、溶解補助剤、酸化防止剤、吸収促進剤、および他の添加剤を含有することができる。医薬は、液体または固体の形態で存在することができ、好ましくは経口投与される。

本発明の乳漿タンパク質加水分解物または本発明の方法で製造された生理活性トリプトファン含有ペプチドは、その他に、動物用食品の添加物としても、動物用栄養補助食品（スナック）としてもまたは動物用医薬としても適している。乳漿タンパク質加水分解物または本発明の方法で製造された生理活性トリプトファン含有ペプチドは、その場合、直接または乾燥した形態で固体飼料、濃厚飼料（Ｋｒａｆｔｆｕｔｔｅｒ）、濃厚飼料（Ｋｏｎｚｅｎｔｒａｔｋｒａｆｔｆｕｔｔｅｒ）、栄養補助飼料（Ｆｕｔｔｅｒｅｒｇａｅｎｚｕｎｇｓｍｉｔｔｅｌｎ）、飲料水、塩なめ石（Ｌｅｃｋｓｔｅｉｎ）、またはこのような組成物のための予備混合物に添加することができる。乳漿タンパク質加水分解物は、飼い主が粉末として動物の餌または飲料水に混入することができる。場合によっては、粉末は、乳漿タンパク質加水分解物のほかに、添加物および補助剤を含有する。特に、他の添加剤は、鉱物性物質、ビタミン、微量元素、糖、麦芽、糖蜜、穀類、ふすま、種子（特に油脂植物の種子）、タンパク質、アミノ酸、塩、油、脂肪、脂肪酸、果物、果物の成分または果物エキス、またはこれらの混合物の群から選択されてもよい。

このようにして、ペットおよび有用動物（例えば、ウマ、ウシ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ブタ、ノウサギ、カイウサギ、モルモット、ハムスター、またはトリなど）の餌、ならびに、動物園の動物または外来動物（例えば、サル、シマウマ、アンテロープ、キリン、ネコ科の猛獣、水牛、およびげっ歯類の動物等）の餌も同様に、本発明の乳漿タンパク質加水分解物で富化することができるが、前述の動物に限定されるものではない。

飼料配合物中に（飼料としてまたは栄養強化剤として）本発明の乳漿タンパク質加水分解物を５０重量％以下添加することができる。しかし、通常、乳漿タンパク質加水分解物は、組成物中に０．０１〜２０重量％、好ましくは０．０５〜１０重量％、特に好ましくは０．０５〜５重量％の範囲で添加される。その場合、添加される乳漿タンパク質加水分解物の量およびその粒度は、それぞれ考慮される動物の種類に依存する。

乳漿タンパク質加水分解物が、場合によっては、他の前述した添加物の少なくとも１つと一緒に、栄養補助飼料として提供される場合、これは、事前に最終調製することなく直接、成分の混合物として、または顆粒、圧縮錠、ペレット、粉末、糖衣錠、シロップ、懸濁剤の形態または他の何らかの適した投与形態で行われる。

好ましくは、本発明の乳漿タンパク質加水分解物を含有する栄養補助飼料は、飼い主が各動物に個々の用量を投与できる形態で提供される。これは、例えば、粉末または顆粒の場合に、しかしまた、糖衣錠またはペレットの場合にも、特にもたらされる。

本発明は、最後に、血管壁再構築、心重量減少、血流予備能の改善、および心筋梗塞のリスクや卒中発作のリスクの低減を含めた、高血圧の治療方法も含み、本発明の乳漿タンパク質加水分解物を薬学的に有効な用量で規則的に投与することを特徴とする。
なお、本願は特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る。
１．広範な加水分解によって得られる、Ｃ末端またはＮ末端のトリプトファンおよび前記トリプトファンのＣ末端またはＮ末端にある１〜４個のアミノ酸を含む、α−ラクトアルブミンの部分配列からなる少なくとも１種類の生理活性トリプトファン含有ペプチドを生理学的に有効な量含有する、ＡＣＥ阻害および抗高血圧作用を有する乳漿タンパク質加水分解物。
２．前記生理活性トリプトファン含有ペプチドが、配列番号２〜３２から選択されることを特徴とする、上記１に記載の乳漿タンパク質加水分解物。
３．前記加水分解物中に含有されるタンパク質の５０％超が、４ｋＤａ未満のモル質量（Ｍｏｌｍａｓｓｅ）を有することを特徴とする、上記１または２に記載の乳漿タンパク質加水分解物。
４．上記１〜３のいずれか一項に記載の乳漿タンパク質加水分解物を製造するための乳漿タンパク質の使用。
５．配列番号２〜３２から選択される配列を有する、ＡＣＥ阻害および抗高血圧作用を有する生理活性トリプトファン含有ペプチドを製造するための乳漿タンパク質の使用。
６．加水分解が、少なくとも酵素アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）およびトリプシンを用いて酵素により実施されることを特徴とする、ＡＣＥ阻害および抗高血圧作用を有する乳漿タンパク質加水分解物の製造方法。
７．含有されるタンパク質の５０％超が４ｋＤａ未満のモル質量を有するまで、前記加水分解が実施されることを特徴とする、上記６に記載の方法。
８．加水分解に使用される乳漿タンパク質が、α−ラクトアルブミンが富化されていることを特徴とする、上記６または７に記載の方法。
９．乳漿タンパク質としてα−ラクトアルブミンが使用されることを特徴とする、上記６〜８のいずれか一項に記載の方法。
１０．前記酵素による加水分解が、１０℃〜８０℃で実施される、上記６〜９のいずれか一項に記載の方法。
１１．乳漿タンパク質がまず加水分解され、乳漿タンパク質加水分解物から生理活性ジペプチドが得られる、上記１または２に記載の生理活性トリプトファン含有ペプチドの製造方法。
１２．上記１〜３のいずれか一項に記載の乳漿タンパク質加水分解物、上記６〜１０のいずれか一項により製造される乳漿タンパク質加水分解物、および／または、上記１１に記載の方法により製造される生理活性トリプトファン含有ペプチドの、医薬、食品、動物用医薬または飼料における使用。
１３．上記１〜３のいずれか一項に記載の乳漿タンパク質加水分解物、および／または、上記６〜１０のいずれか一項に記載の方法によって製造される乳漿タンパク質加水分解物、および／または、上記１１に記載の方法によって製造される生理活性トリプトファン含有ペプチドを含有する食品。
１４．上記１〜３のいずれか一項に記載の乳漿タンパク質加水分解物、および／または、上記６〜１０のいずれか一項に記載の方法によって製造される乳漿タンパク質加水分解物、および／または、上記１１に記載の方法によって製造される生理活性トリプトファン含有ペプチドを含有する医薬。
１５．上記１〜３のいずれか一項に記載の乳漿タンパク質加水分解物、および／または、上記６〜１０のいずれか一項に記載の方法によって製造される乳漿タンパク質加水分解物、および／または、上記１１に記載の方法によって製造される生理活性トリプトファン含有ペプチドを含有する飼料。

添付の図面を参照して実施例をより詳細に説明する。

未分解の（ｎａｔｉｖｅｎ）乳漿タンパク質（Ｍｉｌｅｉ６０ ０ｈ）、ならびに４時間（Ｍｉｌｅｉ６０ ４ｈ）および４８時間（Ｍｉｌｅｉ６０ ４８ｈ）インキュベートした後の加水分解された乳漿タンパク質のモル質量分布のＧＰＣクロマトグラムを示す。 加水分解時間の増加に伴う低分子量物質（ｌｍｗ）の増加、ならびに高分子量物質（ｈｍｗ）の減少を示す。 加水分解時間に依存した乳漿タンパク質粉末Ｍｉｌｅｉ６０のＡＣＥ阻害のＩＣ_５０値を示す。 初期（０週）、７週間および１５週間給餌試験した後の自然発症高血圧ラットの収縮期血圧を示す。本発明のペプチドを含有する調製物（ＰＰ）、そのままの乳漿タンパク質を有する飼料（ＭＰ）、ならびに、対照として、既知のＡＣＥ阻害剤であるカプトプリルを有するラット飼料、ならびにプラセボを投与した。ＰＰでは、カプトプリルに匹敵する血圧降下が起こった。

実施例１：乳漿タンパク質粉末Ｍｉｌｅｉ６０の酵素による加水分解
乳漿タンパク質Ｍｉｌｅｉ６０をタンパク質分解作用のある酵素で、即ち、ブタすい臓から得られたトリプシン（ＥＣ３．４．２１．４）、ならびに他の２種類のプロテアーゼ、Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）（バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））およびＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ））で、酵素により加水分解した。次の表は、加水分解の実施を示す。

ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により、様々な時間インキュベートした試料のモル質量分布で加水分解度を分析した。続いて、標準と比較することによりモル質量を求めた。８９．１Ｄａ（アラニン）〜２５．０ｋＤａ（キモトリプシノーゲン）の範囲で較正した（表２も参照）。排除限界を測定するために、デキストランブルーを使用した。吸収性の差に基づいて、様々な濃度の標準物質を使用した。次に、較正に必要な標準物質、ならびにそのモル質量、およびクロマトグラフィーに使用される濃度および保持時間を表に要約する。

加水分解度を測定するために、全ての試料について、反応混合物（Ａｎｓａｔｚ）に均一なタンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌを選択した。リン酸緩衝食塩水で溶離した。溶出物質の検出は、２２０および２８０ｎｍで行った。実施に使用した化学物質およびパラメータを以下に示す。

乳漿粉末Ｍｉｌｅｉ６０の加水分解プロセスを４８時間調べた。酵素による消化の程度をＧＰＣで、続いて、２２０ｎｍおよび２８０ｎｍの紫外吸光検出で測定した。モル質量分布を特徴付けるため、試料クロマトグラムを５つの部分（６６〜２４ｋＤａ、２４〜４ｋＤａ、４〜１ｋＤａ、１〜０．１７５ｋＤａおよび＜０．１７５ｋＤａ）に分割し、その領域を図１に示す。それによって、例えば、まだどの程度までそのままのタンパク質が存在するか、または、加水分解中、主にアミノ酸、短鎖または長鎖のペプチドが遊離されるかが分かり、それによって、また、可能なＡＣＥ阻害剤を生成するための情報を得ることができる。

図１に、幾つかの選択された加水分解段階（４ｈ、４８ｈ）ならびに未消化の乳漿タンパク質粉末（０ｈ）のモル質量分布が示されている。出発タンパク質中には、予想されるように、複数の高分子量化合物（６６〜２４ｋＤａ）が存在する。それは、主に、主タンパク質、即ち、α−ラクトアルブミン（大部分が単量体の形態で存在する）とβ−ラクトグロブリンである。後者は、Ｍｉｌｅｉ６０中のタンパク質の大部分を構成し、主に二量体として存在する。

しかし、また、例えば、一番最初の領域で溶離するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの他の乳漿タンパク質も、または乳性タンパク質成分のグリコシリル化した形態もこの方法で検出される。より小さい物質は、生成物中に存在しないか、または有意量では存在しない。わずか１０分後に既に（表４参照）、乳漿タンパク質、特にα−ラクトアルブミンが比較的多く分解し、それは、酵素による消化中、連続的に進行するが、４８時間後でも完全には加水分解しない。加水分解中、化合物の割合はますます低分子量領域に移るが、低分子量領域には主にジペプチドならびに遊離アミノ酸が存在する。さらに分かり易く示すため、ＧＰＣクロマトグラムの面積百分率から得られる加水分解物中のモル質量分布を表４に総括した。

ここでも、加水分解の継続中、高分子量領域から低分子量領域に移り続けることが明らかになるが、完全な分解は達成されない。４８時間酵素により消化した後、最後に、主に遊離アミノ酸が存在する＜０．１７５ｋＤａの領域が大部分を占めるのではなく、モル質量１〜０．１７５ｋＤａの化合物が加水分解物中の高い割合を構成する。

高分子量（２４〜６６ｋＤａ）化合物の分解または低分子量（＜０．１７５ｋＤａ）物質の遊離は、２４時間加水分解した後、それ以前の時間と比較して明らかに横ばいになる（図２参照）。

特定の時間以降、直線的な分解、ひいては小さい化合物の遊離が起こらず、約１８時間後に平坦域が生じた、即ち、加水分解は比較的ゆっくりとしか進行しなかった。最も多い加水分解は、最初の１時間で進行し、４時間後にはペプチドの５１％超が４ｋＤａ未満であった。

実施例２：タンパク質加水分解物のＡＣＥ阻害効果の測定
タンパク質加水分解物のＡＣＥ活性の測定は、ＣｕｓｈｍａｎおよびＣｈｅｕｎｇにより１９７９年に記載された酵素試験（非特許文献１７）に準拠して行った。ただし、複数の変更を行った。使用したＡＣＥは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈを介して購入したカイウサギの肺に由来する酵素である。天然の基質、アンジオテンシンＩの類似体と考えられているＮ−ベンゾイル−グリシル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシン（ＨＨＬ）を基質として使用した。ＡＣＥは、Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシン（ＨＬ）およびＮ−ベンゾイル−グリシン（馬尿酸）への加水分解を触媒する。

馬尿酸はＵＶ活性（λ_ｍａｘ＝２２８ｎｍ）であるため、ＲＰ−ＨＰＬＣにより測定される含有量で、その変換、ひいては酵素活性を求めることができる。一連の濃度の各阻害剤溶液を用いて、ＡＣＥ活性を半分に低下させるのに必要な阻害剤濃度（ＩＣ_５０）を求めることができる。

表５に、活性試験の実施に必要な試薬を記載する。

試験液は全て、２回蒸留水に溶解させた。

表６は、ＡＣＥ活性試験の実施を示す。各一連の測定で、２つの酵素ブランク値も一緒に実施したが、ブランク値では、試料溶液の代わりに、同量の２回蒸留水を添加した。ブランク値は、１００％ＡＣＥ活性に対応する。ＩＣ_５０値の算出は、ソフトウェアプログラムＳｉｇｍａＰｌｏｔ５．０で行った。

表７に、馬尿酸を定量化するためのＲＰ−ＨＰＬＣパラメータ、ならびに、対応して希釈される較正に必要な原液を記載する。

表８は、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて馬尿酸の含有量を測定するために使用した勾配を示す。

様々な時間インキュベートした試料の他に、ブランク値試料も分析したが、それらは使用した全ての酵素と乳漿タンパク質粉末を加水分解試料と同じ濃度で含有した。ただし、全ての物質を添加した後直ぐに１００℃で１０分間インキュベートすることにより酵素作用を失活させた。同様に、個々の化合物で、場合によっては起こり得るＡＣＥに対する効果を調べた。そのために酵素を失活させ、起こり得るＡＣＥ阻害を個々に調べた。乳漿タンパク質粉末でも全く同様に行う。熱処理されなかった乳漿タンパク質粉末の阻害作用も調べた。加水分解試料のＩＣ_５０値を測定するために、ＡＣＥ活性試験で複数の濃度を使用した。１０００ｍｇタンパク質／ｌのタンパク質濃度から出発した。この原液を１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：５０、１：１００に希釈し、ＡＣＥ阻害効果に関して全ての溶液を調べた。値を求めるために、ここでもＳｉｇｍａＰｌｏｔ ５．０で処理した。

使用した加水分解酵素トリプシンおよびアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）ならびに乳漿タンパク質粉末のＡＣＥ活性に対して及ぼし得る効果を調べるために、それが使用された混合物中に酵素を個々に含むもの、および、酵素を添加していないＭｉｌｅｉ６０の溶液を加水分解物と同様に１００℃で１０分間熱処理した。これはプロテアーゼを変性させるために行ったが、その理由は、さもなければ、ＡＣＥの消化、ひいてはこの阻害も考慮に入れなければならないからである。この試験から、失活した酵素単独でも混合物でも、またタンパク質もＡＣＥに影響を及ぼさないということが分かった。それに対して、酵素を失活させるために直ぐに１００℃で１０分間インキュベートされた乳漿タンパク質粉末と３種類の酵素の溶液は、比較的強いＡＣＥ阻害を示した。乳漿タンパク質の十分に測定可能な加水分解を引き起こし、ＡＣＥ阻害ペプチドを遊離するのに、数分で十分であったことが明らかである。これは、使用したプロテアーゼによって、酵素による分解が多く達成されることを裏付ける。

試験がさらに経過する間に、製造された各加水分解物はＡＣＥ阻害能を示した。データをより詳しく比較するために、各試料のＩＣ_５０値を求め、表９に示す。

加水分解物の阻害能は、最初の４時間以内は増加し続け、４時間後の加水分解物についてわずか４２ｍｇタンパク質／ｌの非常に低いＩＣ_５０値が求められた。その後、やがて阻害効果は減少した。８時間加水分解した後、４時間後の加水分解物と同じ効果を達成するには、２倍超の試料が必要である。意外なことに、阻害効果は再び増加し、２４時間または３０時間後に最も強い阻害作用が達成されたが、ただし、それは４８時間加水分解した後に再び低下した。加水分解時間に対する加水分解物のＩＣ_５０値がプロットされている図３に、この結果を再度示す。

乳漿タンパク質の加水分解の経過における阻害能の経過の変動は、ＡＣＥ阻害化合物が生成し、分解したということによって、説明できる。タンパク質分解は時間が経つにつれて、ますます遅くなるため、ＡＣＥ阻害能の変化もまた、加水分解時間が長くなるにつれますます進行が遅くなると考えることができる。意外なことに、２４時間後の加水分解物では、４時間後の加水分解物と同様に、ＡＣＥ活性の著しい低下が起こる。この場合、これらの作用は様々な阻害剤によるものであると考えられるが、その理由は、インキュベーション時間が経過するにつれ、乳漿タンパク質成分は酵素の作用を受けやすくなり、そのため、効力のある阻害剤、例えば、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ（α−Ｌａ５９−６０）を後になってようやく遊離できるからである。また、２４時間後の加水分解物中には、４時間後の加水分解物より、分子量１〜０．１７５ｋＤａの化合物が多く存在した。

実施例３：
加水分解の経過における本発明のジペプチドＴｒｐ−ＬｅｕおよびＩｌｅ−Ｔｒｐの遊離は、ＧＰＣおよびＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析計）によって分析された。

本発明のジペプチドを明確に同定できるようにするため、まず、ＲＰ−ＨＰＬＣで加水分解物を分離し、その後、２２０ｎｍおよび２８０ｎｍのＵＶで検出した。高分解能ＥＳＩ−ＴＯＦ−質量分析計で個々のピークのモル質量を求めた。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）の原理は、試料溶液を細かい霧状に噴霧し、それから溶媒を完全に蒸発させることができることに基づく。残存する試料分子は、電荷移動により溶媒からの１つ以上のプロトンを含有する。その後、イオンは飛行時間分析計（飛行時間＝ＴＯＦ）で、質量／電荷比（ｍ／ｚ）に応じて分離される。最後に、求めたモル質量から、プログラムＤａｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ^ＴＭで可能なアミノ酸組成を決定することができる。

これらの分析方法では、選択された加水分解物を４０ｍｇ／ｍｌの濃度で使用し、メンブレンフィルタでろ過した。使用したＨＰＬＣパラメータを表１０に記載する。

分析された質量を、一緒に実施した標準ペプチドＩｌｅ−ＴｒｐおよびＴｒｐ−Ｌｅｕ（Ｂａｃｈｅｍ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｌ ａｍ Ｒｈｅｉｎ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）と比較した。試料の注入量は５０μｌであった。勾配系を表１１に示す。

本発明のジペプチドに関してＲＰ−ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳで測定されたパラメータを表１２に要約する。表には、その他に、ジペプチドについて得られたＩＣ_５０値を記載する。酵素阻害活性の測定は、実施例２に記載のように行い、そのために標準ペプチドＩｌｅ−ＴｒｐおよびＴｒｐ−Ｌｅｕ（Ｂａｃｈｅｍ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｌ ａｍ Ｒｈｅｉｎ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）を使用した。

ＧＰＣでは、一緒に実施した標準ペプチドのピークと比較することによって、ジペプチドの同定を行った。

強力なＡＣＥ阻害ペプチドＩｌｅ−Ｔｒｐは、３時間加水分解した後、加水分解物中に明確に検出された。従って、Ｔｒｐ−Ｌｅｕと同様に、一定の時間後にようやくプロテアーゼが作用できる（ｚｕｇａｅｎｇｌｉｃｈ）ようになると思われる。しかし、これらのペプチドは両方とも安定であり、さらにアミノ酸に消化されないように思われるが、その理由は、後に続く加水分解物全てにこの２つのペプチドがＧＰＣで測定できたからである。

実施例４：自然発症高血圧ラットでの給餌実験
本発明によるトリプトファン含有ペプチドを含有する乳漿タンパク質加水分解物の、動脈血圧に及ぼす影響に関する決定的な重要性は、動物実験において、自然発症高血圧ラットで客観化された（図４）。ここで、乳漿タンパク質加水分解物は、対照の食餌と比較して、収縮時血圧が７週間後に２１±６ｍｍＨｇ顕著に降下した。カプトプリル（第１世代のＡＣＥ阻害剤）の給餌により、同じ時間で、血圧が２８±７ｍｍＨｇ降下した。

乳漿タンパク質加水分解物の他の有利な効果は、本発明のトリプトファン含有ペプチドを有する調製物の給餌後に、対照と比較して心重量が８％減少した（カプトプリル：１６％減）ことであり、対照と比較して冠動脈血流予備能は７５％増加した。このことから、乳漿タンパク質加水分解物によって包括的な心臓および血管保護効果が得られることが考えられる。

Claims (17)

1. 少なくとも酵素アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）およびトリプシンを用いて酵素により実施される加水分解によって得られる、配列番号４の配列を有する生理活性トリプトファン含有ペプチドまたは配列番号７の配列を有する生理活性トリプトファン含有ペプチドを含有する、ＡＣＥ阻害および抗高血圧作用を有する乳漿タンパク質加水分解物であって、該加水分解物中に含有されるタンパク質の５０％超が４ｋＤａ未満のモル質量（Ｍｏｌｍａｓｓｅ）を有する、乳漿タンパク質加水分解物。
2. 前記酵素による加水分解が、少なくとも酵素アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）、トリプシンおよびフレーバーザイム（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）を用いて実施されることを特徴とする、請求項１に記載の乳漿タンパク質加水分解物。
3. 前記酵素による加水分解が、１０℃〜８０℃で実施されることを特徴とする、請求項１または２に記載の乳漿タンパク質加水分解物。
4. 前記酵素による加水分解が、１２〜３６時間実施されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の乳漿タンパク質加水分解物。
5. 酵素／基質比（ｇ酵素／ｇ基質）が１：１０〜１：１０，０００であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の乳漿タンパク質加水分解物。
6. 加水分解が、少なくとも酵素アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）およびトリプシンを用いて酵素により実施されることを特徴とする、配列番号４の配列を有する生理活性トリプトファン含有ペプチドまたは配列番号７の配列を有する生理活性トリプトファン含有ペプチドを含有する、ＡＣＥ阻害および抗高血圧作用を有する乳漿タンパク質加水分解物の製造方法。
7. 加水分解が、少なくとも酵素アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）、トリプシンおよびフレーバーザイム（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）を用いて酵素により実施されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
8. 含有されるタンパク質の５０％超が４ｋＤａ未満のモル質量を有するまで、前記加水分解が実施されることを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。
9. 加水分解に使用される乳漿タンパク質が、α−ラクトアルブミンが富化されていることを特徴とする、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 乳漿タンパク質としてα−ラクトアルブミンが使用されることを特徴とする、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記酵素による加水分解が、１０℃〜８０℃で実施される、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記酵素による加水分解が、１２〜３６時間実施される、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 酵素／基質比（ｇ酵素／ｇ基質）が１：１０〜１：１０，０００である、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 乳漿タンパク質がまず加水分解され、乳漿タンパク質加水分解物から生理活性ジペプチドが得られる、請求項１に記載の生理活性トリプトファン含有ペプチドの製造方法。
15. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の乳漿タンパク質加水分解物、および／または、請求項６〜１３のいずれか一項に記載の方法によって製造される乳漿タンパク質加水分解物、および／または、請求項１４に記載の方法によって製造される生理活性トリプトファン含有ペプチドを含有する食品。
16. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の乳漿タンパク質加水分解物、および／または、請求項６〜１３のいずれか一項に記載の方法によって製造される乳漿タンパク質加水分解物、および／または、請求項１４に記載の方法によって製造される生理活性トリプトファン含有ペプチドを含有する医薬。
17. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の乳漿タンパク質加水分解物、および／または、請求項６〜１３のいずれか一項に記載の方法によって製造される乳漿タンパク質加水分解物、および／または、請求項１４に記載の方法によって製造される生理活性トリプトファン含有ペプチドを含有する飼料。

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