KR101698216B1 - 펩타이드-결합된 트립토판과 폴리펩타이드-결합된 트립토판의 혼합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 10 내지 90%, 바람직하게는 20 내지 80%의 트립토판이 유리 트립토판 또는 펩타이드-결합된 트립토판으로 존재하고, 10 내지 90%, 바람직하게는 20 내지 80%의 트립토판이 폴리펩타이드-결합된 트립토판으로 존재하는, 트립토판을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

펩타이드-결합된 트립토판과 폴리펩타이드-결합된 트립토판의 혼합물{MIXTURE OF PEPTIDE-BOUND TRYPTOPHAN AND POLYPEPTIDE-BOUND TRYPTOPHAN}
본 발명은 트립토판을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
뇌의 세로토닌 수준은 기분, 경계 상태, 각성 상태, 수면 개시, 수면 품질, 불안완화 효과, 우울증, 정서 반응 제어, 식욕 및 성적 행동과 관련되어 있다. 뇌의 세로토닌 수준에서의 변화가 천연 아미노산인 L-트립토판(Trp 또는 W)의 이용가능성과 관련되어 있다는 많은 문헌이 존재한다. 이 연관성 때문에, 혈장 트립토판 수준을 증가시키는 방법이 많은 관심을 받았다. 개인당 약 1g/일의 양의 트립토판이 임상적으로 유의한 효과를 생성하는 것으로 보고되었다([Markus et al., Am. J Clin. Nutr 2005;81, 1026-1033]). 혈장 트립토판 수준을 증가시키는 한가지 방법은 유장 단백질인 알파-락트알부민이 풍부한 단백질 제제를 섭취하는 것을 포함한다. 알파-락트알부민 제제는 쉽게 이용가능하고, 비교적 높은 트립토판 농도를 갖는다. 그러나, 예를 들면 독일 특허 제4130284호 및 일본 특허 제2279700호에서와 같이 알파-락트알부민이 그대로 제공되는 접근 방법은 뇌의 트립토판과 세로토닌 수준의 주요 결정자가 혈장 트립토판 농도가 아니라 소위 Trp/LNAA 비라는 점([Fernstrom and Wurtman. Science 1971, 173, 149-152])을 고려하지 않는다. 이 Trp/LNAA 비는 혈장 중의 큰 중성 아미노산(LNAA: 즉, 타이로신, 페닐알라닌, 루신, 아이소루신 및 발린의 합)의 수준에 대한 트립토판의 몰 비를 나타낸다. 이들 LNAA는 아마도 혈관-뇌 차단벽을 가로지르는 동일한 수송 기작을 이용하기 때문에, 뇌로의 흡수에 대해 트립토판과 경쟁한다. 따라서, 뇌의 트립토판 농도를 증가시키는 가장 효과적인 방법은 높은 Trp/LNAA 비를 갖는 제제를 공급하는 것이다. 예를 들면 제 WO02/46210호와 같은 다수의 문헌이 개선된 Trp/LNAA 비를 갖는 알파-락트알부민으로부터의 펩타이드 분획의 제조에 대해 언급하고 있다.
유리 트립토판, 즉 유리 아미노산의 이용은 높은 Trp/LNAA 비를 갖는 제제를 제공하는 가장 간단하고 저렴한 접근법을 제공할 것이다. 그러나, 많은 국가에서는 유리 트립토판의 공급을 엄격하게 규제하는 법률이 존재한다. 다양한 적용 형태에서 허용가능한 최대의 유리 트립토판 수준은 나라마다 다양하다. 보다 자연스러운 방식으로 추가의 식이 트립토판을 공급하기 위해서, 보다 최근의 접근법은 트립토판이 풍부한 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다. 언급된 바와 같이, 알파-락트알부민 및 이의 가수분해물이 혈장 트립토판 수준을 개선하기 위한 안전한 옵션으로서 인기를 얻고 있다. 그러나, 트립토판이 풍부한 제제를 위한 출발 지점으로서 알파-락트알부민을 이용하는 것은 최대 Trp/LNAA 비 및 비용의 측면에서 단점을 갖고 있다. 알파-락트알부민 및 베타-락토글로불린은 유장의 주요 단백질 성분을 형성한다. 산업적 규모로 알파-락트알부민과 베타-락토글로불린을 완전히 분리시키기 어렵기 때문에, 비용 효과적인 알파-락트알부민 제제는 베타-락토글로불린을 또한 함유할 것으로 생각된다. 알파-락트알부민이 5.3%의 몰 트립토판 함량을 갖는 반면, 베타-락토글로불린의 트립토판 함량은 단지 2%이다. 알파-락트알부민이 0.11의 몰 Trp/LNAA 비를 갖는 반면, 베타-락토글로불린은 0.04 이하의 몰 Trp/LNAA 비를 갖는다. 알파-락트알부민 제제의 베타-락토글로불린으로의 너무나 명확한 임의의 오염이 최종 생성물의 Trp/LNAA 비를 극적으로 감소시킬 것이다.
뇌 세로토닌 수준을 변화시킬 수 있는 제제에서의 넓은 이해관계를 고려하면, 다양한 식품 및 기능 식품 제품에서 널리 적용가능한 높은 Trp/LNAA 비를 갖는 단백질 및 펩타이드 제제에 대한 개선된 생산 방법이 요구된다.
본 발명은
- 바람직하게는 수용성이고, 0.1 초과, 바람직하게는 0.15 초과의 Trp/LNAA 비를 갖는 펩타이드-결합된 트립토판 조성물 및/또는 유리 트립토판; 및
- 바람직하게는 수용성이고, 0.15 초과의 Trp/LNAA 비를 갖는 폴리펩타이드-결합된 트립토판 조성물
을 함께 모으는, 바람직하게는 혼합시키는 단계를 포함하는, 트립토판-함유 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 리소자임, 바람직하게는 달걀 리소자임을 가수분해시켜 5 내지 45의 가수분해도(DH)를 갖는 가수분해물을 생성하는 단계, 및 임의적으로(optionally) 예컨대 아르기닌 또는 리신 함유 펩타이드 부분을 제거함으로써 가수분해물을 분획화시키거나, 풍부하게 하거나, 정제하는 단계에 의해 펩타이드-결합된 트립토판 조성물을 수득한다. 바람직하게는, 폴리펩타이드-결합된 트립토판 조성물은 손상되지 않은 리소자임, 바람직하게는 달걀 리소자임이다.
본 발명은 또한 10 내지 90%, 바람직하게는 20 내지 80%의 트립토판이 유리 트립토판 또는 펩타이드-결합된 트립토판으로 존재하고, 10 내지 90%, 바람직하게는 20 내지 80%의 트립토판이 폴리펩타이드-결합된 트립토판으로 존재하는, 트립토판을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 임의적으로, 조성물은 펩타이드-결합된 트립토판에 추가하여 유리 트립토판을 포함한다. 일반적으로, 펩타이드-결합된 트립토판이 또한 존재하는 경우, 10% 미만의 트립토판이 유리 트립토판의 형태일 것이고, 바람직하게는 본 발명의 조성물에 존재하는 트립토판의 0 내지 5%, 보다 바람직하게는 0 내지 2%, 가장 바람직하게는 0 내지 1%의 트립토판이 유리 트립토판일 것이다. 일반적으로 0.1 내지 20g의 본 발명의 조성물이 섭취를 위한 투여량으로 이용될 것이다.
바람직하게는, 30몰% 초과, 바람직하게는 40몰% 초과, 보다 바람직하게는 50몰% 초과, 보다 더 바람직하게는 60몰% 초과, 보다 더 바람직하게는 70몰% 초과, 가장 바람직하게는 80몰% 초과의 펩타이드-결합된 트립토판이 다이- 또는 트라이펩타이드의 형태로 존재한다. 또한, 바람직하게는 40몰% 초과, 보다 바람직하게는 50몰% 초과, 보다 더 바람직하게는 60몰% 초과, 보다 더 바람직하게는 70몰% 초과, 가장 바람직하게는 80몰% 초과의 폴리펩타이드-결합된 트립토판이 손상되지 않은 단백질, 바람직하게는 리소자임으로 존재한다.
본 발명의 다른 양태는 기능 식품, 바람직하게는 약제로서의 본 발명의 조성물 또는 리소자임, 또는 기능 식품, 바람직하게는 약제로서의 본 발명의 조성물의 용도, 또는 기능 식품, 바람직하게는 약제의 제조에서 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이고, 바람직하게는 기능 식품, 바람직하게는 약제는 기분, 인지, 식욕, 경계 상태, 각성 상태, 수면 개시, 수면 품질, 불안완화 효과, 우울증, 정사 반응 제어 또는 성적 행동을 예방하거나 치료하거나 개선하는데 이용되거나, 또는 식품, 사료, 식이 보충제의 제조에서의 성분으로 이용된다.
또한, 본 발명은 섭취한 후 15분 내지 240분, 바람직하게는 30분 내지 240분의 기간 동안 혈장 Trp/LNAA 비를 증가시키도록 섭취하기 위한 본 발명의 조성물 또는 리소자임의 용도에 관한 것이다. 이러한 증가는 본 발명의 조성물 또는 리소자임의 섭취 직전, 또는 본 발명의 조성물 또는 리소자임을 섭취하지 않은 상태의 혈장 Trp/LNAA 비와 비교된다.
유리하게는, 본 발명의 조성물은 또한 탄수화물을 포함한다.
본 발명의 트립토판-함유 조성물은 경구 섭취시 장기간동안 혈장에서의 높은 Trp/LNAA 비를 가능하게 하는 2개의 명확하게 식별가능한 분획을 포함한다. 한 분획은 쉽게 흡수가능한 저분자량 펩타이드의 형태인 펩타이드-결합된 트립토판 및 따라서, 트립토판-함유 펩타이드 또는 유리 트립토판을 포함한다. 트립토판-함유 펩타이드의 경우 이 분획은 많은 비율의 트립토판이 혼입된 다이- 및 트라이펩타이드를 포함한다. 다른 분획은 바람직하게는 경구 섭취후 이의 펩타이드-결합된 트립토판을 매우 느리게만 방출하는 손상되지 않은 단백질의 형태인 폴리펩타이드-결합된 트립토판, 및 따라서, 트립토판-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 따라서, 본 발명은 경구 섭취시, 트립토판-함유 펩타이드 분획만을 이용하였을 때와 비교해서 오랜기간동안 혈액중에서 높은 Trp/LNAA 수준을 신속하게 자아내고 유지하는 이들 2개의 트립토판-풍부 분획의 새로운 조합을 개시한다. 저분자량 분획에 존재하는 펩타이드-결합된 트립토판은 바람직하게는 달걀 리소자임에서 유래하고, 폴리펩타이드-결합된 트립토판 분획 또는 더 큰 분자량 분획은 바람직하게는 리소자임, 예를 들면 손상되지 않은 달걀 리소자임 또는 높은 Trp/LNAA 비를 갖는 손상되지 않은 단백질과 같은 다른 폴리펩타이드-결합된 트립토판 공급원으로부터 유래한다. 바람직하게는 트립토판-함유 폴리펩타이드는 위장 조건하에서 단백질 가수분해에 저항할 수 있는 단백질이다. 유리하게는, 이런 폴리펩타이드-결합된 트립토판, 예를 들면 손상되지 않은 리소자임과 같은 손상되지 않은 단백질은 프로테아제 내성에 대한 시험에서 개시된 바와 같은 위장 조건하에서 단백질 가수분해에 저항할 수 있다(재료 및 방법 부분 참조).
쉽게 흡수가능한 트립토판-함유 펩타이드 분획은 바람직하게는 수용성이고, 15 초과, 바람직하게는 20 초과의 DH, 0.10 초과, 바람직하게는 0.15 초과의 Trp/LNAA 비를 갖고, 바람직하게는 펩타이드 AW(다이펩타이드로서) 또는 GNW(트라이펩타이드로서), 보다 바람직하게는 AW 및 GNW를 포함한다. 적합한 트립토판-함유 펩타이드 분획의 예는 리소자임과 알파-락트알부민의 가수분해물이고, 리소자임 가수분해물이 바람직한 트립토판-함유 펩타이드 분획이다.
더 느린 속도로 트립토판을 제공하는 폴리펩타이드-결합된 트립토판 분획은 10 미만, 바람직하게는 5 미만의 DH를 갖는다. 손상되지 않은 단백질은 0의 DH를 갖는다. 폴리펩타이드-결합된 트립토판 분획은 바람직하게는 수용성이다. 또한, 폴리펩타이드-결합된 트립토판 분획은 0.15 초과의 Trp/LNAA 비를 갖고, 인간의 위장에서 일반적인 조건하에서 단백질 가수분해에 저항한다. 후자의 요건에 대한 생체 외 시험은 본원의 재료 및 방법 부분에 규정되어 있다.
전술된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 예를 들면 인슐린 생산을 자극하기 위한 탄수화물을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명은 폴리펩타이드-결합된 트립토판 분획뿐만 아니라 유리 트립토판 또는 펩타이드-결합된 트립토판 분획을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 펩타이드-결합된 트립토판 분획은 0.1 이상, 바람직하게는 0.15 이상, 보다 바람직하게는 0.15 내지 1.8의 몰 Trp/LNAA 비를 갖고, 바람직하게는 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상의 상이한 펩타이드를 포함하며, 이들 펩타이드는 바람직하게는 수용성이다. 바람직하게는 이 조성물은 AW(다이펩타이드로서) 또는 GNW(트라이펩타이드로서), 바람직하게는 AW 및 GNW, 가장 바람직하게는 AW 및 GNW를 포함하고, 여기서 AW 대 GNW의 몰 비는 1 대 2 내지 10 대 1이고, 바람직하게는 1 대 2 내지 5 대 1이다. 더욱이, 트립토판-함유 펩타이드에는 트립토판이 풍부하고, 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상의 상이한 다이- 또는 트라이펩타이드를 포함하고, 다이- 또는 트라이펩타이드로부터 선택된 펩타이드가 총 다이- 또는 트라이펩타이드의 5몰% 이상의 양으로 존재하고, 펩타이드-결합된 트립토판의 30몰% 초과, 바람직하게는 40몰% 초과, 보다 바람직하게는 50몰% 초과, 보다 더 바람직하게는 60몰% 초과, 보다 더 바람직하게는 70몰% 초과, 가장 바람직하게는 80몰% 초과가 다이- 또는 트라이펩타이드의 형태로 존재한다. 펩타이드-결합된 트립토판 분획은 바람직하게는 리소자임 가수분해물 또는 정제되거나 분획화된 리소자임 가수분해물이다. 본 발명자는 본 발명에 따른 이러한 가수분해물이 생체 내에서 높은 혈장 Trp/LNAA 비를 신속하게 생성한다는 것을 발견하였다. 상당히 놀랍게도, 혈장에서 검출된 Trp/LNAA 비는 충분히 높은 투여량으로 주어졌을 때 가수분해물의 Trp/LNAA의 비보다 더 높은 것으로 발견되었다. 충분히 높은 투여량은 바람직하게는 10g 초과, 12g 초과, 또는 14g 초과의 리소자임 가수분해물이다. 이 분획의 또다른 이점은 Trp 함유 펩타이드가 매우 작아서 심지어 덜 바람직한 Trp/LNAA 비를 갖는 단백질-풍부 생성물과 조합된 경우에 조차, 가수분해물이 높은 혈장 Trp/LNAA 비를 즉각적으로 생성할 수 있다는 점이다. 본 발명의 조성물은 유리 트립토판을 추가로 포함할 수 있고, 예를 들면 유리 트립토판이 조성물에 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 이 조성물은 펩타이드-결합된 트립토판이 존재하는 경우 유리 트립토판을 1중량% 이하(건조물 기준)로 함유한다.
바람직하게는, 폴리펩타이드-결합된 트립토판 분획은 0.15 초과, 바람직하게는 0.15 내지 0.5의 몰 Trp/LNAA 비를 갖고, 손상되지 않은 리소자임은 0.23의 Trp/LNAA 비를 갖는다. 이의 섭취시, 폴리펩타이드-결합된 트립토판 분획은 또한 펩타이드-결합된 트립토판을 제공하지만, 이 폴리펩타이드-결합된 트립토판 분획으로부터 생체 내에서 방출된 펩타이드-결합된 트립토판은 펩타이드-결합된 트립토판 분획으로부터 나온 펩타이드-결합된 트립토판에 비해 내장 흡수에서 훨씬 더 늦게 이용가능해지게 된다. 유리하게는, 폴리펩타이드-결합된 트립토판 분획과 펩타이드-결합된 트립토판 분획 둘 모두를 동시에 섭취한 경우, 폴리펩타이드-결합된 트립토판 분획으로부터 나온 펩타이드-결합된 트립토판의 내장 흡수가 펩타이드-결합된 트립토판 분획으로부터 나온 펩타이드-결합된 트립토판 또는 유리 트립토판의 내장 흡수에 비해 더 늦은 시간에 발생하게 된다. 본 발명자는 이런 지연된 트립토판 방출이 인간의 위에서의 효소 가수분해에 저항하는 손상되지 않은 단백질의 경구 흡수에 의해 달성될 수 있다는 것을 발견하였다. 바람직하게는 이런 손상되지 않은 단백질은 높은 Trp/LNAA 비를 갖는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 가수분해된 리소자임 및 (손상되지 않은) 리소자임 혼합물의 조성물의 맛은 (손상되지 않은) 리소자임이 없이 가수분해된 리소자임을 포함하는 조성물에 비해 개선된다.
본 발명의 다른 양태는 기분, 생리전 증후군(PMS), 인지, 경계 상태, 각성 상태, 수면 개시, 수면 품질, 불안완화 효과, 우울증, 정서 반응 제어 또는 성적 행동을 개선하기 위해, 또는 기분, 인지, 식욕, 경계 상태, 각성 상태, 수면 개시, 수면 품질, 불안완화 효과, 우울증, 정서 반응 제어 또는 성적 행동을 위한 식품, 애완동물 사료, 사료, 식이 보충제 또는 기능 식품 조성물의 제조에서의 성분으로서 이용하기 위한, 폴리펩타이드-결합된 트립토판 및 임의적으로 탄수화물과 조합된 유리 트립토판 또는 펩타이드-결합된 트립토판 분획을 포함하는 조성물 또는 리소자임의 용도에 관한 것이다. 유리 트립토판 또는 펩타이드-결합된 트립토판, 폴리펩타이드-결합된 트립토판 및 임의적으로 탄수화물과는 별개로, 조성물은 또한 스트레스 또는 우울증 감소 또는 경계 상태, 기분, 인지 또는 수면 패턴을 개선하기 위한 "뇌" 영양을 위해 추천되는 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물을 포함하거나, 본 발명의 방법에 따라 제조되거나, 바람직하게는 손상되지 않은 달걀 리소자임과 조합된 펩타이드 GNW(트라이펩타이드로서), SW(다이펩타이드로서) 또는 AW(다이펩타이드로서)를 포함하는 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 식품(유아용 분유 포함), 애완동물 사료, 사료, 식이 보충제 또는 기능 식품 조성물이 개시되어 있다.
추가의 실시양태에 따르면, 펩타이드 또는 조성물을 섭취한지 90분 이내, 바람직하게는 60분 이내, 보다 바람직하게는 30분 이내, 가장 바람직하게는 15분 이내에 혈장 중의 Trp/LNAA 비를 증가시키거나, 또는 조성물을 섭취한지 90분 이내, 바람직하게는 60분 이내, 보다 바람직하게는 30분 이내, 가장 바람직하게는 15분 이내에 혈장 중의 Trp/LNAA 비가 증가된 기능 식품 조성물을 제조하기 위한, 본 발명의 트립토판-함유 조성물의 용도가 개시되어 있다. 또다른 양태에 따르면, 본 발명의 조성물을 섭취한지 90분, 바람직하게는 120분 내지 240분, 보다 바람직하게는 150분을 지나서도 증가된 혈장 Trp/LNAA 비를 유지하기 위한 본 발명의 트립토판-함유 조성물의 용도가 개시되어 있다. 보다 더 바람직한 실시양태에 따르면, 조성물을 섭취한지 90분, 바람직하게는 120분 내지 240분, 보다 바람직하게는 150분을 지나서도 증가된 혈장 중의 Trp/LNAA 비를 유지하기 위한 기능 식품 조성물을 제조하기 위한, 본 발명의 트립토판-함유 조성물 또는 리소자임의 용도가 개시되어 있다.
본 발명은 매우 짧은 간격 후에 혈장 중의 Trp/LNAA 비를 효과적으로 증가시키기에 매우 적합한 유리 트립토판 및/또는 펩타이드-결합된 형태로서 존재하는 트립토판, 및 폴리펩타이드-결합된 트립토판이 조성물에 존재하지 않은 상황에 비해 더 오랜 기간동안 높은 혈장 Trp/LNAA 비를 지속하게 하는 폴리펩타이드-결합된 트립토판을 포함하는 조성물을 제공한다. 이 효과는 본 발명의 조성물을 섭취한 후 90 내지 240분에 특히 주목할만하다. 탄수화물과 조합된 2개의 트립토판 함유 분획이 신속하고 긴 Trp/LNAA 증가에 기여한다는 점에 주목하였다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 보다 쉽게 흡수가능한 펩타이드-결합된 트립토판은 산업적 공정에서의 효소적 (예비)가수분해에 의해 리소자임, 바람직하게는 달걀 리소자임으로부터 수득될 수 있고, 즉, 바람직하게는 (달걀) 리소자임이 가수분해물의 형태로 제공된다. 가수분해물의 형태로 제공되므로, 트립토판-함유 펩타이드의 위장 흡수가 매우 용이하다. 폴리펩타이드-결합된 트립토판 분획은 바람직하게는 인간의 위에서 분해되지 않거나 단지 최저로 분해되는 높은 Trp/LNAA 비를 갖는 손상되지 않은 단백질로 제공된다. 바람직하게는 이 손상되지 않은 단백질은 달걀의 리소자임이다. 우유으로부터 나온 알파-락트알부민(이는 종종 Trp/LNAA 혈액 비를 증가시키기 위해 이용된다)은 이 분자가 리소자임에 비해 더 낮은 Trp/LNAA 비를 갖기 때문에 폴리펩타이드-결합된 트립토판의 적합한 공급원으로서 간주되지 않는다. 본 발명에 따른 조성물은 쉽게 흡수가능한 유리 트립토판 및/또는 펩타이드-결합된 트립토판, 예를 들면 리소자임 가수분해물, 및 프로테아제-저항성 폴리펩타이드-결합된 트립토판, 예를 들면 손상되지 않은 단백질, 바람직하게는 리소자임의 혼합물임을 특징으로 한다. 임의적으로, 조성물은 탄수화물 또는 유리 트립토판을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 유리 트립토판 및/또는 바람직하게는 가수분해물로서의 펩타이드-결합된 트립토판 및 바람직하게는 리소자임과 같은 손상되지 않은 단백질로서의 폴리펩타이드-결합된 트립토판을 1:3 내지 1:0.2의 범위의 중량 비(단백질 무수 중량 기준)로 혼합함으로써 생산된다. 보다 바람직하게는, 조성물은 1:1 내지 1:0.4의 단백질의 무수 중량 비로 가수분해물 및 손상되지 않은 단백질을 포함한다. 쉽게 흡수될 수 있는 분획과 프로테아제-저항성 단백질 분획 둘 모두 0.10 초과, 바람직하게는 0.15 초과의 분자 Trp/LNAA 비를 특징으로 한다. 조성물은 분말, 액체 또는 페이스트로서 제공될 수 있다. 이들 액체 또는 페이스트는 중성 또는 산성 pH 값을 가질 수 있다. 바람직하게는, 혼합물은 5 미만, 보다 바람직하게는 4 미만의 pH 값을 갖는다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 달걀 리소자임은 존재하는 펩타이드의 50몰% 초과, 바람직하게는 60몰% 초과, 보다 바람직하게는 75몰% 초과가 500 Da 미만의 분자량을 갖는 펩타이드 조성물을 포함하는 가수분해물로 전환된다. 단, 가수분해물에 존재하는 펩타이드의 분자량 분포는 본원의 재료 및 방법 부분에 개시된 바와 같이 수행된다.
쉽게 흡수가능한 분획의 중요한 이점은 유리 트립토판 또는 다이- 및 트라이펩타이드에 포함되는 트립토판이 경구 섭취한 직후 내장벽을 가로질러 혈류로 이동된다는 점이다. 결과적으로, 혈장 트립토판 수준은 뇌 세로토닌 수준에 미치는 직접적인 효과와 거의 동시에 증가된다. 본원의 실시예 6 및 11에 제시된 자료는 이러한 다이- 및 트라이펩타이드의 형태로 제시된 트립토판 잔기가 높은 Trp/LNAA 비를 매우 신속하게 야기한다는 것을 보여준다. 이와 관련하여, 이들 다이- 및 트라이펩타이드의 형태로 제공되는 트립토판 잔기는 유리 트립토판에 비해 보다 더 효과적인 것으로 보인다. 본 발명의 방법에 따르면, 0.10 이상, 바람직하게는 0.15 이상의 분자 Trp/LNAA 비를 갖는 수용성 펩타이드 분획이 수득되고, 단 가수분해물의 아미노산 분석은 본원의 재료 및 방법 부분에 개시된 바와 같이 수행된다.
다이- 및 트라이펩타이드의 형태인 트립토판을 제공하는 또다른 중요한 이점은 이들 펩타이드의 위장 흡수가 너무나 신속해서 단백질 함유 식품, 예를 들면 자연적으로 덜 바람직한 Trp/LNAA 비를 갖는 낙농 제품과 조합되어 섭취될 수 있고, 또한 섭취한지 90분 이내, 바람직하게는 60분 이내, 보다 바람직하게는 30분 이내에 혈장에서 Trp/LNAA 비를 효과적으로 증가시킨다. 따라서, 본 발명은 펩타이드를 섭취한지 90분 이내, 바람직하게는 60분 이내, 가장 바람직하게는 30분 이내에 혈장 중의 증가된 Trp/LNAA 비를 수득하기 위한, 또는 펩타이드를 섭취한지 90분 이내, 바람직하게는 60분 이내, 가장 바람직하게는 30분 이내에 혈장 중의 증가된 Trp/LNAA 비를 수득하기 위한 기능 식품 조성물의 제조를 위한, 본 발명의 조성물 및/또는 리소자임의 용도를 제공한다. 본원에서 증가된 Trp/LNAA 비란 본 발명의 조성물을 섭취 또는 흡입하기 전의 상황과 비교하였을 때 이 비의 증가를 의미한다.
"단백질" 또는 "폴리펩타이드"는 30개 초과의 아미노산 잔기를 포함하는 쇄로서 본원에서 정의된다.
"손상되지 않은 단백질" 또는 "손상되지 않은 폴리펩타이드"는 재료 및 방법 부분에서 개시된 SDS-PAGE 방법을 이용하여 비교하였을 때 천연 단백질과 동일한 분자량을 갖는 단백질로서 본원에서 정의된다.
손상되지 않은 단백질의 "프로테아제-저항성"이란 물질 및 방법 부분에 규정된 바와 같이 측정된다.
본원에서 "펩타이드" 또는 "올리고펩타이드"란 펩타이드 결합을 통해 연결된 2개 이상의 아미노산의 쇄를 의미한다. 용어 "펩타이드" 및 "올리고펩타이드"는 동의어로서 간주되고(흔히 인식되는 바와 같이), 각각의 용어가 내용상 필요하면 서로 교환되어 사용될 수 있다.
펩타이드-함유 트립토판 또는 트립토판-함유 펩타이드 조성물 또는 분획(분획 및 조성물은 본원에서 상호교환적으로 사용된다)은 하나 이상의 트립토판-함유 펩타이드를 포함하는 조성물을 의미한다. 본원에서, 펩타이드-함유 트립토판 또는 트립토판-함유 펩타이드 조성물은 단지 하나의 펩타이드를 포함할 수 있고, 바람직하게는 이 조성물은 하나 초과의 펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드-함유 트립토판 또는 트립토판-함유 폴리펩타이드 조성물 또는 분획(분획 및 조성물은 본원에서 상호교환적으로 사용된다)은 하나 이상의 트립토판-함유 폴리 펩타이드를 포함하는 조성물을 의미한다. 본원에서, 폴리펩타이드-함유 트립토판 또는 트립토판-함유 폴리펩타이드 조성물은 단지 하나의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
트립토판 함유-펩타이드란 하나 이상의 트립토판 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드를 의미한다. 트립토판 함유-폴리펩타이드란 하나 이상의 트립토판 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다.
펩타이드-결합된 트립토판이란 펩타이드에서 아미노산으로서 존재하는 트립토판을 의미한다. 폴리펩타이드-결합된 트립토판이란 폴리펩타이드에서 아미노산으로서 존재하는 트립토판을 의미한다.
본 발명의 트립토판-함유 조성물은 펩타이드-함유 트립토판 조성물 및 폴리펩타이드-함유 트립토판 조성물을 포함하고, 따라서, 하나 이상의 트립토판-함유 펩타이드 및 하나 이상의 트립토판-함유 폴리펩타이드를 포함한다.
유리 트립토판이란 유리 아미노산으로서의 트립토판을 의미하고, 따라서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 일부가 아니다.
"수용성" 펩타이드란 pH 5.0의 물에 가용성인 펩타이드이다.
본원의 모든 (올리고)펩타이드 및 폴리펩타이드 구조식 또는 서열은 일반적인 관행에 따라 아미노 말단에서 카복시 말단의 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기술된다. 본원에서 사용되는 아미노산의 1문자 코드는 당 분야에 공지되어 있고, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에서 발견될 수 있다.
단백질 가수분해물, 가수분해물 또는 가수분해된 단백질이란 단백질의 효소 가수분해에 의해 형성된 생성물을 의미하고, 풍부화되거나 분획화된 가수분해물은 예를 들면 선택된 펩타이드가 풍부하거나, 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 가수분해물에서 제거된 단백질 가수분해물의 분획이다. 풍부화된 가수분해물이란 바람직하게는 펩타이드의 혼합물(또는 펩타이드 혼합물)이다. 따라서, 본 발명의 펩타이드 혼합물은, 2 이상, 바람직하게는 3 이상, 보다 바람직하게는 4 이상의 트립토판 함유 펩타이드의 혼합물이다. 보다 바람직하게는, 혼합물은 존재하는 펩타이드의 50몰% 이상, 바람직하게는 60몰% 이상, 가장 바람직하게는 75몰% 이상이 500 Da 미만의 분자량을 갖는 펩타이드 조성물을 포함한다. Trp/LNAA 비는 다른 큰 중성 아미노산(LNAA, 즉, 타이로신, 페닐알라민, 루신, 아이소루신 및 발린의 합)의 수준에 대한 트립토판의 몰 비를 나타낸다. 혈장 Trp/LNAA 비를 제외하고는, Trp/LNAA 비는 단지 펩타이드-결합된 아미노산 및/또는 폴리펩타이드-결합된 아미노산에만 관련되어 있다. 혈장 Trp/LNAA 비의 경우, Trp/LNAA 비는 유리 아미노산에 관련되어 있다. 따라서, 유리 트립토판, 타이로신, 페닐알라닌, 루신, 아이소루신 및 발린은 Trp/LNAA 비에서 고려되지 않는다.
펩타이드-결합된 아미노산은 펩타이드의 일부인 아미노산으로 유리 아미노산이 아니다.
Tyr/BCAA 비는 분지쇄 아미노산(BCAA; 즉, 루신, 아이소루신 및 발린의 합)의 수준에 대한 타이로신의 몰 비를 나타낸다. 바람직한 Tyr/BCAA 비는 0.1보다 높고, 바람직하게는 0.12보다 높다.
바람직한 수면 개시 및 품질은 침대에 누운지 45분 이내에 들어가는 조용한 잠으로 정의된다.
기분은 정신의 감정적 상태로서 정의되고, 바람직하게는 기분 상태 설문 조사 프로파일(본원의 실시예 6 참조)을 이용하여 측정된다.
인지는 문제 해결, 학습, 기억 및 언어와 같은 영역에 대한 조합된 기술로서 정의된다.
식욕은 배고픔에 의해 자극되는 먹고자 하는 갈망으로 정의된다.
경계 상태는 정신의 의식적 또는 각성 상태로서 정의되고, 바람직하게는 맥워쓰 시계 시험(Mackworth Clock Test) 및 임계적 트랙킹 과제(Critical Tracking Task)(본원의 실시예 9 참조)를 이용하여 측정된다.
불안완화 효과는 공포, 걱정 또는 근심이 완화되는 느낌을 생성하는 효과이다.
우울증은 심각하고 지속적인 기쁨이 없는 느낌을 특징으로 하는 정신 상태로서 정의된다.
용어 성적 행동은 리비도에 대한 동의어로서 본원에서 사용된다.
제WO02/46210호에서, 유장 단백질 가수분해물에서 트립토판의 수준을 증가시키는 방법이 개시되어 있다. 사용된 방법에서, 유장은 먼저 하나 이상의 산 프로테아제, 바람직하게는 펩신, 레닌, 산 진균 프로테아제, 키모신, 파파인, 브로멜라인, 키모파파인 또는 피신에 의해 산성 pH에서 가수분해된다. 바람직한 항온처리 조건은 pH 1.5 내지 3.5이고, 소수성 성질을 갖는 펩타이드를 생성하도록 선택된다. 가수분해는 트립토판 잔기가 큰 소수성 펩타이드에 혼입되는 방식으로 신중하게 수행된다. 작은 보다 수용성인 펩타이드에는 훨씬 더 적은 트립토판 잔기가 존재한다. 후속적인 가공 단계에서, 이들 큰 트립토판-함유 펩타이드의 침전이 촉진되도록 pH를 4.0 내지 6.0으로 증가시켜 유장 가수분해물로부터 이들의 선택적인(selective) 회수를 촉진시킨다. 트립토판이 비교적 큰 펩타이드에만 존재하면, 혈액으로의 트립토판의 흡수가 지연되어 특히 다른 단백질과 조합되었을 때 식품 또는 음료 성분으로서의 제제의 사용 가능성이 제한된다. 손상되지 않은 알파-락트알부민은, 재료 및 방법 부분에서 규정된 시험에 따라 측정하였을 때 프로테아제-저항성이 아니기 때문에, 본 발명에 따른 손상되지 않은 단백질 분획으로 간주되지 않는다는 점이 강조되어야만 한다.
본 발명은 산업적으로 이용가능하고 높은 Trp/LNAA 비를 특징으로 하는 단백질로부터 출발하는 간단한 가수분해 방법을 개시하고 있다. 본 발명의 가수분해 방법은 단백질 트립토판 기준으로 30% 초과의 트립토판 수율을 갖고, 트립토판을 포함하는 수용성 펩타이드 조성물을 생성한다. 트립토판 잔기의 더 많은 부분이 다이- 및 트라이펩타이드에 포함된다는 사실은 혈류로의 즉각적인 흡수를 의미한다. 앞으로 개시될 바와 같이, 이 성질로 인해 가수분해물의 더 다양한 식품 또는 기능 식품 제품으로의 혼입이 가능해진다. 상당히 놀랍게도, 본 발명은 또한 경구 섭취시, 본 발명에 따른 가수분해물이 실제 가수분해물의 Trp/LNAA 비보다 더 높은 혈장 Trp/LNAA 비를 생성할 수 있음을 개시하고 있다.
본 발명에 따르면, 달걀 리소자임은 높은 Trp/LNAA 비를 갖는 본 발명의 조성물을 위한 편리한 출발 물질로서 사용되고, 이는 경구 섭취되면, 혈액에서 신속하고 오래 지속되는 증가된 Trp/LNAA 비를 야기한다. 리소자임은 3 내지 4%의 농도로 달걀 흰자에 존재한다. 이의 예외적으로 높은 등전점을 이용함으로써, 간단한 양이온 크로마토그래피 정제 단계 및 임의적으로 결정화 단계를 이용하여 리소자임이 달걀 흰자로부터 산업적으로 단리된다. 생성된 생성물은 거의 순수하고, 이 산업적으로 이용가능한 생성물은 7.8%의 분자 트립토판 함량, 및 0.15 이상의 분자 Trp/LNAA 비를 갖는다. 따라서, 리소자임, 즉, 손상되지 않은 단백질은 순수한 알파-락트알부민 및/또는 베타-락토글로불린에 비해 상당히 더 높은 Trp/LNAA 비를 갖는다. 따라서, 본 발명에 따른 리소자임 가수분해물은 바람직하게는 0.15 초과, 보다 바람직하게는 0.20 초과, 보다 더 바람직하게는 0.23 초과, 보다 더 바람직하게는 0.25 초과, 가장 바람직하게는 0.30 초과의 몰 LNAA 비를 갖는다. 일반적으로 몰 Trp/LNAA 비는 3.0 미만이다. 이런 리소자임은 트립토판-함유 펩타이드 또는 조성물에 대한 바람직한 출발점을 나타내고, 폴리펩타이드-결합된 트립토판 조성물로서 이용될 수 있다. 리소자임(EC 3.2.1.17)은 박테리아 세포 벽의 특정한 펩티도글리칸 결합을 가수분해하여 용균을 야기하는 효소이다. 이의 살균 효과로 인해, 리소자임은 감염을 예방함으로써 숙주 방어에서 중요한 역할을 한다. 생리적 조건하에서, 리소자임 분자는 단백질 가수분해 공격에 매우 저항성이다. 이 비정상적인 저항성은 발생학적 근거로 설명될 수 있다: 침입 박테리아가 매우 다양한 프로테아제를 분비할 수 있으므로, 이런 프로테아제에 민감한 리소자임 분자는 신속하게 불활성화될 것이다. 이의 프로테아제 저항성은 반추동물의 위 리소자임에 대해 예시되었다([Dobson et al., J. Biol Chem. 1984, 259 (18)11607-11616]). 구조적 관점에서, 분자 내의 4개의 다이설파이드 결합의 존재는 리소자임의 프로테아제 저항성에 부가될 것으로 예상될 수 있다. 본원의 실시예 1에 제시된 자료에 근거하여, 달걀 리소자임은 단백질 가수분해 공격에 대해 저항성인 것으로 간주될 수 있고, 즉, 분자가 인간의 내장관의 근위 부분에서 효율적으로 소화될 수 있을것 같지 않다. 이 프로테아제 저항성의 결론은, 이의 매우 매력적인 Trp/LNAA 비에도 불구하고, 손상되지 않은 리소자임은 단순히 트립토판 잔기가 위장관에 존재하는 생리학적 조건하에서 쉽게 방출되지 않기 때문에 혈장 트립토판 수준을 신속하게 증가시키기에 적합한 공급원이 아니라는 것이다. 그러나, 손상되지 않은 달걀 리소자임은 거의 중성 pH 조건하에서 효소적으로 가수분해될 수 있다([Porter et al., J. Agric. Food Chem. 1984, 32, 334-339]). 이 문헌은 손상되지 않은 달걀 리소자임이 인간의 내장의 보다 먼 부분에서 펩타이드-결합된 트립토판을 방출할 수 있을 것이라는 본 발명자의 관찰과 일치한다. 상기 개시된 쉽게 흡수가능한 "예비소화된" 리소자임 가수분해물과 함께 이는 경구 섭취시 혈장에서 Trp/LNAA 비의 즉각적인 급격한 상승 및 후속적인 느리고 지속적인 펩타이드 결합된 Trp의 방출을 야기하는 제제의 제조에 대한 예상치못한 가능성을 연다. 이들 동역학은 뇌에서 도파민뿐만 아니라 세로토닌에 대한 새롭고 놀라운 효과를 이끌어내는 혈장 중의 Trp/LNAA 수준에서 재현된다.
식이 흡입시, 식품에 존재하는 단백질은 더 작은 분획으로 점차적으로 가수분해된 후, 소장 벽을 가로질러 이동하여 혈액으로 흡수된다. 위장관에서는, 위, 췌장 및 소장에 기원하는 다수의 상이한 프로테아제가 식이 단백질의 가수분해에 대해 활성이다.
엔도프로테아제(endoprotease), 예를 들면 펩신, 트립신 및 키모트립신은 식이 단백질을 더 작은 올리고펩타이드로 분해한다. 이들 엔도프로테아제중에서, 펩신만이 위 주변의 산 중에서 활성이다. 트립신 및 키모트립신은 십이지장, 공장 및 내장의 보다 먼 부분에서 우세한 거의 중성인 환경에서 활성이 된다. 그런 다음, 이들 엔도프로테아제에 의해 형성된 올리고펩타이드는 다수의 다른 효소, 예를 들면 다이- 및 트라이펩티딜 펩티다제에 의해 추가로 가수분해되어 다이- 및 트라이펩타이드를 생성하고, 아미노- 및 카복시펩티다제에 의해 추가로 가수분해되어 유리 아미노산을 생성한다. 유리 아미노산 또는 다이- 및 트라이펩타이드의 이동에 특이적인 담체 시스템이 내장 벽을 가로질러 혈류로의 효율적인 이동을 담당한다. 식이 흡입시, 유리 아미노산, 다이- 및 트라이펩타이드가 혈류에 즉각 혼입되게 된다. 트라이펩타이드보다 큰 펩타이드는 섭취되기 위해서 추가의 효소 분해를 필요로 한다.
본 발명자는 본 발명의 트립토판-함유 조성물이 예를 들면 낙농 제품으로 제시되는 고 단백질 함유 식품 매트릭스로 혼입될 경우 또한 효과적임을 발견하였다. 이는 단백질 함유 식품 매트릭스가 높은 LNAA 부하량을 나타내고 따라서 높은 Trp/LNAA 비를 갖는 제품의 효과를 감소시킬 것으로 예상될 수 있기 때문에 상당히 놀랍다. 이 예상치못한 현상에 대해 가능한 설명은 일상적인 식품 제품이 광범위하게 가수분해된 단백질이 아니라 손상되지 않은 단백질을 혼입하고 있다는 것이다. 본 발명에 따른 가수분해물의 전형적인 크기 분포가 도 3에 제시되어 있다. 이 도면에 따르면, 펩타이드에 혼입된 트립토판과 타이로신의 대부분은 500 Da 미만의 분자량을 갖는다. 트립토판(Mw=186) 및 타이로신(Mw=163)의 매우 높은 분자량과 매우 낮은 수준의 유리 트립토판만이 존재한다는 사실을 고려하면, 이들 펩타이드의 대부분이 트라이- 또는 다이-펩타이드일 것으로 생각된다. 사용되는 파장에서 트립토판이 타이로신에 비해 훨씬 더 높은 몰 흡수성을 가지므로, 피크 값은 주로 트립토판을 혼입한 펩타이드를 의미할 것이다.
본 발명에 따른 트립토판-함유 조성물에 존재하는 트립토판 함유 다이- 및 트라이펩타이드가 예를 들면 비-가수분해된 매트릭스 단백질에 의해 제시된 다량의 LNAA에 비해 훨씬 더 신속하게 흡수되기 때문에, 다량의 매트릭스 단백질의 존재에도 불구하고, 높은 혈장 Trp/LNAA 비가 수득될 수 있다고 추정된다.
특정한 상황은 오랜 시간동안 높은 혈장 Trp/LNAA 비를 요구한다. 예를 들면 수면 시간을 개선하거나 연장하기 위한 경우, 또는 오랜기간동안 개선된 인지 성능을 요구하는 상황. 또한, 생리전 증후군 또는 폐경후 여성의 경우에 대해 개시된 바와 같은 기분 개선이 요구되는 상황이 본 발명의 조성물이 특히 적절한 사례이다. 펩타이드-결합된 트립토판, 예를 들면 리소자임 가수분해물은 거의 즉각적으로 혈장 Trp/LNAA 비를 증가시키고, 폴리펩타이드-결합된 트립토판, 예를 들면 높은 Trp/LNAA 비를 갖는 펩신 저항성 단백질의 느린 섭취는 인간의 내장의 보다 말단 부분에서 펩타이드-결합된 트립토판의 지속적 방출을 보증하여 본 발명의 조성물을 흡입한 후 120 내지 240분의 기간에도 혈장의 Trp/LNAA 비를 증가시킬 것이다.
흥미롭게도, 본 발명자의 현재의 실험 자료는 또한 본 발명의 가수분해물이, 충분히 높은 투여량으로 주어졌을 때, 가수분해물의 Trp/LNAA 비보다 훨씬 높은 인간 지원자의 혈액에서의 Trp/LNAA 비를 생성할 수 있다는 것을 나타내는 것으로 보인다. 충분히 높은 투여량이란 바람직하게는 10g 초과, 12g 초과 또는 14g 초과의 리소자임 가수분해물이다. 비록 이런 현상이 알려져 있지 않고, 본 발명자가 아는 지식의 한도내에서는, 이러한 효과에 대해 허용되는 설명이 존재하지 않지만, 이는 리소자임 분자의 매우 높은 아르기닌 함량에 기인할 수 있는 것으로 생각된다. 실시예에 도시된 실험 자료를 설명하기 위해 현재 주장되는 작업 가설이 본원에 개시된다. 이 가설은 본 발명자의 현재의 식견을 제시하고자 이용되는 것으로, 본 발명이 이 이론에 의해 어떤식으로든 제한되거나 연관되어서는 안된다. 따라서, 본 발명은 가설의 정확성과는 독립적으로 존재한다. 혈액 인슐린의 증가는 혈액으로부터 말초 조직, 특히 근육으로의 아미노산의 흡수를 촉진시킨다. 그러나, 혈액에서 트립토판이 혈장 단백질인 알부민에 결합되어 있기 때문에, 트립토판은 이러한 경로를 크게 벗어난다. 결과적으로, 증가된 인슐린 수준은 LNAA의 농도를 감소시키지만, 트립토판의 농도는 감소시키지 않고, 따라서 혈액중의 Trp/LNAA 비를 증가시킨다. 탄수화물 섭취가 인슐린 분비를 야기하고, 말초 조직 및 특히 근육에서의 LNAA의 섭취를 자극하기 때문에, 혈장 Trp/LNAA 비는 탄수화물 섭취에 의해 증가된다([Fernstrom and Wurtman, 1972, Metabolism, vol. 21, No. 4, 337-342]). 탄수화물 섭취와는 별개로, 인슐린 분비는 또한 특정한 아미노산에 의해 자극되는 것으로 알려져 있다. 개별적인 아미노산의 주입으로부터 생성된 혈장 아미노 질소 수준이 매우 유사하기 때문에, 인슐린 반응은 상당히 다양하다. 문헌[Floyd et al., J Clin Invest 45(9):1487-502]은 아미노산에 대한 인슐린의 반응이 아르기닌 > 리신 > 루신 > 페닐알라닌 > 발린 > 메티오닌 순서로 감소된다고 확립하였다. 리소자임에 아미노산 아르기닌이 특히 풍부하다는 점을 고려하면, 아르기닌에 의해 야기된 인슐린 자극 효과가 높은 Trp/LNAA 비를 생성하는 것으로 추측하고자 한다.
탄수화물이 그의 인슐린 자극 효과에 대해 공지되어 있기 때문에, 본 발명의 가수분해물은 바람직하게는 탄수화물과 조합되어 배합된다. 빨리 흡수될 수 있는 펩타이드-결합된 트립토판 및 느리게 흡수될 수 있는 폴리펩타이드-결합된 트립토판과 함께, 본 발명의 바람직한 조성물은 탄수화물을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 리소자임, 바람직하게는 달걀 리소자임은 산업적인 공정으로 효소적으로 (예비)가수분해되고, 즉, (달걀) 트립토판-함유 펩타이드 조성물은 바람직하게는 가수분해물 또는 풍부화된 가수분해물의 형태로 제공된다. 이런 (풍부화된) 가수분해물의 형태로 제공됨으로써, 트립토판 함유 펩타이드의 내장 흡수가 크게 용이해진다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 달걀 리소자임이 존재하는 펩타이드의 50몰% 초과, 바람직하게는 60몰% 초과, 보다 바람직하게는 75몰% 초과가 500 Da 미만의 분자량을 갖는 트립토판 함유 펩타이드 개체군을 포함하는 가수분해물 또는 풍부화된 가수분해물로 전환된다. 바람직하게는 이런 (풍부화된) 가수분해물은 유리 트립토판을 1중량%(무수물 기준) 이하로 함유한다. 가수분해물에 존재하는 트립토판 함유 펩타이드의 분자량 분석은 본원의 재료 및 방법 부분에 개시된 바와 같이 수행되고, 도 3에 도시되어 있다. 후자의 실시양태의 중요한 이점은 다이- 및 트라이펩타이드에 포함된 트립토판이 경구 섭취후 즉시 내장 벽을 가로질러 혈류로 이동된다는 점이다. 결론적으로, 혈장 트립토판 수준은 뇌 세로토닌 수준에 대해 직접적인 효과로 거의 즉각적으로 증가된다. 상당히 놀랍게도, 본원의 실시예 6에 제시된 자료는 이들 다이- 및 트라이펩타이드의 형태로 제시된 트립토판 잔기의 효율이 유리 트립토판에 비해 보다 효율적이라는 점을 보여준다. 이러한 관측 결과는 본 발명에 의해 제공되는 이점을 강조한다.
제WO2006/009448호는 항고혈압 성질을 갖는 달걀 단백질로부터 수득된 단백질 가수분해물, 및 또한 이들 가수분해물을 포함하는 식품 제품 및 식품 보충제를 제공한다. 이 문헌은 달걀 리소자임으로부터 수득된 것들을 비롯하여 많은 수의 가수분해물의 제조를 개시한다. 모든 이런 가수분해물은 인간이 경구 섭취하였을 때 혈압을 낮추거나 혈압 상승을 방지하고자 한다. 제WO2006/009448호는 또한 섭틸리신(EC3.4.21.62; 상표명 알칼라제(Alcalase) 또는 프로텍스(Protex))를 이용하여 알칼리 조건하에서 수득되는 리소자임 가수분해물의 제조에 대해 개시한다. 수득되는 고도의 가수분해에 따라, 이들 리소자임 가수분해물은 500 Da 미만의 분자량을 갖는 높은 비율의 펩타이드를 함유한다. 그러나, 제WO2006/009448호의 어디에도 리소자임이 뇌의 세로토닌 수준에 긍정적인 영향을 미칠 수 있는 높은 트립토판 함량을 갖는 단백질 공급원이라는 사실이 언급되어 있지 않다. 또한 리소자임 가수분해물이 높은 양의 트립토판 및 비교적 낮은 양의 LNAA를 혼입하고 있는 수용성 펩타이드를 포함하고 있다는 내용도 개시되어 있지 않다. 제WO2006/009448호는 또한 리소자임 또는 리소자임 가수분해물 중 하나의 높은 아르기닌 및 리신 함량에 대해서도 언급하고 있지 않다. 본 발명자는 본원에 제공된 자료에 근거하여, 아르기닌과 리신의 편재하는 존재와 조합된 리소자임 분자의 높은 트립토판 함량으로 인해 리소자임이 높은 Trp/LNAA 비를 생체 내에서 생성하기에 완벽한 출발 물질이 된다는 점을 발견하였다. 또한, 제WO2006/009448호는 다른 단백질 함유 식품과 함게 섭취되었을 때 본 발명에서 이용되는 가수분해물에 의해 제공되는 이점에 대해 언급하고 있지 않다. 막 필터의 이용을 제외하고는, 제WO2006/009448호는 선택된 아미노산 조성물을 갖는 이들 가수분해물로부터 펩타이드 분획을 수득하는 방법 또는 트립토판 함량을 증가시키거나 Trp/LNAA 비를 증가시키기 위해 특정한 방법을 이용하는 점에 대해 언급하고 있지 않다. 또한, 비-분해된 손상되지 않은 리소자임과 조합된 매우 분해된 리소자임 가수분해물을 제공하는 이점이 기록되어 있지 않다.
본원의 실시예 4에 제공된 자료는 리소자임을 섭틸리신과 함께 알칼리 pH에서 항온처리함으로써 수득된 리소자임 가수분해물에 Ala-Trp(AW) 다이펩타이드가 특히 풍부하다는 점을 나타낸다. 이러한 발견으로 인해 화학적으로 합성된 AW 다이펩타이드가 본 발명의 리소자임 가수분해물에 대한 적합한 대안을 제공할 수 있다고 제안된다. 비록 합성 다이펩타이드의 이용이 명확한 법률적 단점을 갖고 있지만, 이의 비용 효율성 및 이의 이상적인 Trp/LNAA 비는 중요한 이점이다. 이론적으로 20개의 상이한 트립토판 함유 다이펩타이드가 이용가능하지만, 본 발명자의 조사는 다이펩타이드인 Ala-Trp(AW) 및 Ser-Trp(SW)가 합성 다이펩타이드를 통해 혈장 Trp/LNAA 비를 개선하기 위한 특히 바람직한 옵션을 나타냄을 보여준다. 화학적 합성을 통한 AW 및 SW 다이펩타이드의 생산은 예를 들면 ["Peptides: Chemistry and Biology" by N. Sewald and H.D. Jakubke, Eds. Wiley-VCH Verlag GmbH, 2002, Chapter 4]에 개시된 종래의 기법을 이용하여 가능하다. 대규모 생산에 적합한 화학적 펩타이드 생산의 특히 비용 효과적인 방법은 C-말단 보호를 위한 메틸 에스터 및 N-보호를 위한 벤질옥시카보닐(Z) 또는 tert-부틸옥시카보닐 기의 사용과 조합된 카복실 기의 활성화를 위한 알킬클로로포르메이트 또는 피발로일 클로라이드의 사용에 근거한다. 다이펩타이드 SW의 비용 효과적인 합성을 위한 상세한 과정은 실시예 5에 개시되어 있다. 이런 화학적으로 합성된 트립토판 함유 다이펩타이드의 높은 Trp/LNAA 비를 갖는 폴리펩타이드-결합된 트립토판, 예를 들면 펩신-저항성 단백질, 바람직하게는 손상되지 않은 리소자임과의 조합은 신규하다.
본 발명에 따른 조성물을 이용할 수 있으므로, 기술적 및 경제적 이점을 갖는 다른 신규하고 놀라운 용도가 예상된다.
새로운 용도는 다양한 유아 분유 제품에 본 발명의 조성물 및/또는 리소자임을 혼입하는 것이다. 우유는 20%의 유장 단백질을 함유하고, 인간의 모유는 40 내지 60%의 유장 단백질을 함유한다. 결과적으로, 우유가 인간의 모유에 비해 더 적은 알파-락트알부민 및 따라서 트립토판을 함유한다. 정상적인 만기 출생아는 일반적으로 우유에 근거한 분유를 먹고, 이는 모유와 등가의 아미노산 프로파일을 제공하지 않는다. 비록 부족한 트립토판 공급의 결과가 완전히 알려져 있지는 않지만, 트립토판이 많은 유아 분유 제품이 유아의 의식 행동 및 수면 개시 및 품질에 유리한 효과를 생성할 수 있다. 높은 혈장 트립토판 수준이 건강한 신생아에서 조용한 수면의 빠른 개시를 촉진한다는 강한 징후가 문헌[Yogman and Zeisel in N Engl J Med. 1983 Nov 10; 309(19):1147-1149]에 제공되어 있다. 따라서, 본 발명은 트립토판 수준이 상승된 유아 분유 제품을 위한 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 식사 대체 제품에 사용될 수 있다. 예를 들면 제WO2005/023017호는 식사 대용 제품에서 적합한 성분으로서 고 투여량의 젤라틴의 이점에 대해 개시하고 있다. 젤라틴은, 우수한 감각 수용성 성질을 제공하지만, 필요한 아미노산 균형을 제공하지 않고, 예를 들면 필수 아미노산인 트립토판을 혼입하고 있지 않다. 따라서 EC 지령 96/8/EC에서 요구되는 바와 같은 적절히 균형잡힌 아미노산을 갖는 조성물에 도달하려면, 트립토판이 이런 젤라틴 함유 조성물에 첨가되어야만 한다. 제WO2005/023017호에서는 트립토판이 바람직하게는 트립토판-풍부 단백질의 형태, 예를 들면 달걀 흰자 분말 또는 전체 달걀 분말의 형태로 첨가된다. 본 발명자는, 이들 가수분해물이 훨씬 더 농축된 형태로 트립토판을 공급하므로, 본 발명에 따른 트립토판 함유 조성물이 이 문제에 대한 개선된 해결책을 제공함을 발견하였다. 더욱이, 리소자임 그 자체가 필요한 양의 모든 필수 아미노산을 함유하고 있고, 그 자체가 식사 대용물에 이상적으로 부합하는 영양학적으로 완전한 단백질이다.
본 발명의 또다른 양태에 따르면, 리소자임 및/또는 본 발명의 조성물을 이용하여 유아, 어린이 및 성인의 수면 개시 및 품질을 향상시킨다. 수면 장애는 다양한 연령 군에 속하는 사람들 사이에서 매우 흔하고 의학적 장애와 관련되어 있다. 본 발명의 트립토판-함유 조성물은 일반적으로 수면 장애를 치료하는데 유용하지만, 이들은 인지, 생리학적, 사회적 및 행동 교란과 관련된 문제점들을 해결하기 위한 유용한 수단을 나타낸다. 예는 우수한 수면 건강법의 확립, 수면 개시와 관련된 장애 또는 일주기성 리듬 수면 장애를 극복하는 것이다. 제품은 또한 예를 들면 섬유근육통 환자의 정신 상태 및 수면 개시 및 품질을 개선하는데 유용할 수 있다. 섬유근육통 증후군은 심히 교란된 수면 개시 및 통증 및 감정적 스트레스와 관련된 만성 통증 증후군이다. 본 발명자는 본 발명에 따른 조성물 및/또는 리소자임을 정기적으로 섭취하면 일반적으로 수면 장애를 겪는 환자의 수면 개시 및 품질이 개선된다는 점을 발견하였다.
본 발명의 조성물은 (반-) 필수 아미노산의 공급과 같은 추가의 이점을 제공한다. 리소자임은 높은 트립토판 수준을 가질 뿐만 아니라, 상당한 수의 타이로신 잔기 또한 혼입하고 있다. 타이로신은 신경전달물질인 도파민의 전구체이고, 혈장 타이로신 수준이 뇌의 도파민 수준에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 리소자임 가수분해물은 다른 공지된 고-트립토판 펩타이드에 비해 더 적은 LNAA를 함유할 뿐만 아니라, 또한 다른 공지된 고-트립토판 펩타이드에 비해 더 적은 분지쇄 아미노산(BCAA)을 함유한다. 이는, BCAA가 도파민 전구체인 타이로신의 혈장 이용가능성을 낮추는 것으로 알려져 있기 때문에 중요하다. 따라서 이의 높은 Try/BCAA 비와 조합된 이의 높은 Trp/LNAA 비로 인해 리소자임이 독특한 분자가 된다. 따라서, 리소자임 가수분해물 및 손상되지 않은 리소자임을 포함하는 본 발명의 조성물은 "뇌 음식", 즉 적절한 신경전달물질 수준에 필요한 필수 아미노산의 공급을 위한 뇌 음식으로서 매우 적절하다. 도파민 시스템은 보상과 동기부여 매개에 있어서의 이의 결정적인 역할, 및 집중, 기억, 경계 상태, 주의, 문제 해결 및 정신운동 조정에 대한 이의 효과에 대해 알려져 있다. 본원의 실시예 9에 예시된 바와 같이, 본 발명에 따른 리소자임 가수분해물의 섭취는 각성 상태, 경계 상태, 집중 및 정신운동 조정에 상당히 유리한 효과를 갖고 있다. 이러한 발견은 본 발명에 따른 조성물이 세로토닌 시스템뿐만 아니라, 도파민 시스템을 자극할 것으로 예상될 수 있음을 입증한다.
여러 그룹의 사람들이 이러한 발견으로부터 이익을 얻을 수 있다. 예를 들면 폐경기인 여성은 집중할 수 없는 점과 관련된 문제 해결 능력 감소에 대해 일반적으로 불평을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 이 연령 그룹의 여성들이 이러한 문제점을 해결하는데 특히 적합하다. 젊은 여성 및 중년 여성에게는, 생리전 증후군이 상당히 흔하다. 이 증후군은 매우 다양한 증상들을 특징으로 하지만, 우울증 및 기분 불안에 대한 불평이 종종 발생하고 있다. 이러한 불평을 해결하기 위해, 플루옥세틴과 같은 선택적인 세로토닌 재흡수 억제제가 종종 처방되고, 더 약한 증상을 갖고 있는 여성의 경우, 식이 조절 및 스트레스 예방이 추천된다. 본원의 실시예 6 및 9에 개시된 실험 결과에 근거하여, 본 발명의 조성물은 특히 이런 더 약한 증상의 경우에 탁월한 치료효과를 제공한다. 또한, 불충분한 도파민은 주의력 결핍 과다행동 장애(ADHD)와 관련되어 있으므로, 이러한 장애의 증상들은 본 발명에 따른 조성물에 의해 경감될 수 있을 것으로 예상된다. 스트레스-후 성과에 대한 유리한 효과가 스트레스-내성 환자에서 특히 명확하다는 본 발명자의 발견은 놀랍다. 이에 대한 가능한 설명은 (과)활성 세로토닌 시스템을 가진 스트레스를 받은 사람은 그들의 세로토닌 저장분을 보충하기 위해 음료수로부터 트립토판을 필요로 하고, 따라서 업무 성과를 개선하는데 이러한 트립토판을 이용할 수 없다는 것일 수 있다. 이러한 추리에 따르면, 과활성 세로토닌 시스템이 없는 스트레스-내성인 사람은 세로토닌 저장분을 보충하기 위해 트립토판을 필요로 하지 않아서, 스트레스-후 성과를 개선하는데 트립토판을 이용할 수 있다. 다른 설명은 이들 효과가 실제로는 도파민 과정의 자극 효과로 인한 것이라는 것일 수 있다. 도파민 합성은 타이로신이 풍부한 식품 성분, 특히 낮은 수준의 분지쇄 아미노산(BCAA)과 조합된 타이로신이 풍부한 식품 성분에 의해 개선될 수 있다. 이들 작업 가설은 실시예에 나타난 실험 자료를 설명하기 위해 본원에 개시되어 있고, 본 발명자의 현재의 식견을 나타내기 위한 것이다. 그러나, 본 발명이 이들 가설로 어떤 식으로든 연결되거나 제한되어서는 안된다. 또한 본 발명은 이들 가설의 정확성과는 무관하게 존재한다. 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 리소자임은 높은 트립토판 수준을 가질 뿐만 아니라, 또한 상당한 수의 타이로신 잔기를 혼입하고 있다.
리소자임 및/또는 본 발명의 조성물은 또한 식품 제품의 시스테인 함량을 상승시킨다. 비록 필수 아미노산은 아니지만, 시스테인 농도는 여러 식품 제품에서 제한되고 있다. 시스테인의 내인성 합성에는 메티오닌의 존재가 요구되고, 시스테인과 유사하게, 메티오닌 농도는 많은 식품 제품에서 제한되고 있다. 식품의 증가된 시스테인 함량의 이점은 다른 것들 중에서도 메티오닌의 혈청 호모시스테인 상승 효과에 대한 길항 효과와 관련되어 있다. 이 발견은 제WO 03/055335호에 개시되어 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 높은 시스테인 수준을 특징으로 한다. 실제로, 리소자임 분자는 트립토판 잔기(6)보다 더 많은 시스테인 잔기(8)를 함유하고 있다. 이런 면에서, 본 발명의 조성물은 일부 제품의 시스테인 함량을 증가시키기에 탁월한 공급원을 형성한다. 증가된 시스테인 함량은 유아 분유와 같은 제품에 중요한 것으로 발견되었다. 카제인 또는 카제인과 유장 단백질의 혼합물에 근거한 유아 분유뿐만 아니라 대두에 근거한 제품, 및 실제로 단백질의 주 공급원이 비교적 낮은 양의 트립토판 또는 시스테인을 함유하는 단백질에 의해 제공되는 모든 단백질이 풍부한 제품의 경우에 그러하다. 우유 및 젤라틴으로부터 나온 단백질 성분과는 별개로, 옥수수 단백질, 효모 단백질, 완두콩 단백질, 대두 단백질 및 쌀 단백질이 이런 단백질의 예이다. 또한, 상기 언급된 높은 투여량의 젤라틴을 함유하는 식사 대용 제품은 불충분한 양의 시스테인을 함유한다.
예를 들면 트립토판을 포함하는 다이- 또는 트라이펩타이드, 특히 SW(다이펩타이드로서) 또는 AW(다이펩타이드로서)를 함유하는 본 발명의 조성물 및/또는 리소자임은 식품 또는 음료로서, 특수 영양 용도용 식품으로서, 식이 보충제로서, 기능 식품으로서 또는 심지어는 사료 또는 애완동물 사료와 같은 임의의 적합한 형태로 이용될 수 있다. 리소자임 함유 조성물은 이들 제품의 정상적인 가공단계 중의 임의의 단계에서 첨가될 수 있다. 식품 또는 음료에 사용되는 경우, 본 발명에 따른 제품의 섭취 후 혈액에서 높은 Trp/LNAA 비를 유지하기 위해서 비교적 낮은 단백질 함량을 갖는 제품이 바람직하다. 관련된 식품 제품은 예를 들면 시리얼 바, 초콜렛 및 초콜렛 함유 음료, 제빵 항목, 예를 들면 케이크 및 쿠키, 및 또한 액체 식품, 예를 들면 스프 또는 스프 분말을 포함한다. 우유 및 요구르트와 같은 낙농 식품과는 별개로, 다른 적합한 음료는 비-알콜성 음료수 및 알콜성 음료수, 및 또한 식수 및 액체 식품에 첨가되는 액체 제제를 포함한다. 비-알콜성 음료수는 바람직하게는 광천수, 스포츠 드링크, 과일 쥬스, 레모네이드, 차, 커피, 디카페인 커피, 농축 드링크, 예를 들면 샷(shot), 에너지 드링크(예를 들면 글루쿠로노락톤, 카페인 또는 타우린 함유 드링크) 및 탄산 음료(예를 들면 거품 음료(pops), 소다 및 콜라)이다.
리소자임 및/또는 본 발명의 조성물과 조합하기에 바람직한 것들은 "뇌 영양"을 위해 추천되는 화합물, 예를 들면 철, 아연, 마그네슘, 비타민(특히 B2, B6, 엽산 및 C), 오메가-3 및 DHA 지방 또는 지방산, 글루코스, GABA, 콜린, 포스파티딜 세린, 코-엔자임 Q10, 크레아틴, 타우린 및 5-HTP; 스트레스 또는 우울증 완화를 위해 추천되는 화합물, 예를 들면 길초근, 초콜렛, 세인트 존스 워쓰(St John's worth), 5-HTP, 포스파티딜 세린, 알콜, 레몬 밤, 녹차 또는 녹차 추출물, 카모마일 또는 S-아데노실 메티오닌; 각성 상태를 개선하는데 추천되는 화합물, 예를 들면 카페인, 구아라나, 인삼, 은행나무, 세인트 존스 워쓰 및 5-HTP; 기분 개선에 추천되는 화합물, 예를 들면 GABA, 5-HTP, PEA, 초콜렛, 녹차 또는 녹차 추출물, 은행나무, 샐비어 또는 S-아데노실 메티오닌; 또는 수면 개선에 추천되는 화합물, 예를 들면 우유 펩타이드, 유리 트립토판, 오피오이드 펩타이드 또는 멜라토닌이다. 특수 영양 용도용 식품의 예는 스포츠 식품, 슬리밍 식품, 유아 분유 및 병원 식품의 범위를 포함한다. 본원에서 이용되는 용어 식이 보충제란 식사에 보충되고자하는 화합물 또는 화합물의 혼합물을 함유하는, 입으로 섭취되는 제품을 의미한다. 이들 제품 중의 화합물 또는 화합물의 혼합물은 비타민, 무기질, 허브 또는 다른 식물 및 아미노산을 포함할 수 있다. 식이 보충제는 또한 추출물 또는 농축액일 수 있고, 정제, 캡슐, 연질 젤, 젤 캡, 액체 또는 분말과 같은 다양한 형태로 발견될 수 있다.
본 발명의 트립토판 함유 조성물 및/또는 리소자임은 또한 기능 식품 조성물로서 또는 기능 식품 조성물에서, 또는 기능 식품의 제조에 이용될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 기능 식품은 영양 및 약학 분야 둘 모두에서의 유용성을 의미한다. 리소자임 및/또는 본 발명에 따른 기능 식품 조성물은 인체를 비롯한 동물의 몸에 투여되기에 적합한 임의의 형태일 수 있고, 특히 경구 투여에 편리한 임의의 형태, 예를 들면 고형 형태, 예컨대 식품 또는 사료(용 첨가제/보충제), 식품 또는 사료 프리믹스, 정제, 환제, 과립, 드라제, 캡슐 및 발포성 제제, 예를 들면 분말 및 정제, 또는 액체 형태, 예를 들면 용액, 유화액 또는 현탁액, 예컨대 음료, 페이스트 및 오일 현탁액일 수 있다. 본 발명의 가수분해물이 혼입되어 있는 제어(지연) 방출 제제 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 또한, 일부 식사에서 빠져있는 충분한 양의 필수 영양분이 수득되도록 멀티-비타민 및 무기 보충제를 본 발명의 기능 식품 조성물에 첨가할 수 있다. 멀티-비타민 및 무기 보충제는 또한 생활양식 패턴으로 인한 영양 손실 및 결핍에 대한 보호 및 질병 예방에 유용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 리소자임 및/또는 조성물은 예를 들면 기분 개선, 또는 예를 들면 노인 및 또한 더 젊은 사람들, 예컨대 시험을 준비하는 학생 및 컴퓨터나 인터넷 게임을 하는 사람들을 위해 인지 기능, 예를 들면 학습, 기억, 각성 상태 및 경계 상태를 개선하기 위한 기능 식품 또는 영양 보충제로서 이용될 수 있다. 이전에 언급된 바와 같이, 폐경전 및 폐경후의 여성의 경우, 리소자임 및/또는 본 발명의 조성물이 특히 적절하다. 리소자임 및/또는 본 발명의 조성물은 스포츠 인구(훈련 스케쥴을 수행하는 전문 운동선수, 및 또한 테니스나 골프를 치는 사람들과 같은 휴양 스포츠 인구 둘 모두)에 특히 적절하다. 이는 본 발명이 상기 개시된 바와 같은 본 발명에 따른 가수분해물의 용도 및 "컨디션 개선제"로서의 용도, 즉 질병에 걸려있거나 정상적으로 건강한 사람에게서 화나고 피곤함을 감소시키기 위한(궁극적으로는 과도한 훈련 위험을 감소시키기 위한), 물리적 및 정신적 피로도를 감소시키거나 방지하거나 경감시키기 위한, 방해받지않는 수면을 돕기 위한, 즉 불면증 및 수면 장애에 대항하고, 수면을 개선하기 위한, 그리고 보다 일반적인 측면으로 에너지를 증가시키기 위한, 특히 뇌 에너지 생산을 증가시키기 위한 용도에 관한 것임을 의미한다. 또한, 일반적으로 인지 개선을 위한, 그리고 주의력 및 집중력, 기억력 및 기억할 수 있는 능력, 학습 능력, 언어 처리, 문제 해결 및 지적 기능을 유지 또는 개선하기 위한 용도; 단기 및 장기 기억력을 개선하기 위한 용도; 정신적 경계 상태를 증가시키기 위한 용도; 정신적 각성 상태를 개선하기 위한 용도; 정신적 피로를 감소시키기 위한 용도; 인지 건강을 유지하기 위한, 균형잡힌 인지 기능을 유지하기 위한 용도에 관한 것이다. 높은 Trp/LNAA 비를 갖는 비용 효과적인 제제를 수득하기 위해 필요한 경우, 본 발명의 가수분해물은 임의적으로 유리 트립토판을 포함한다.
도 1은 실시예 6에 상세하게 설명된 제품의 섭취 후 시간에 대한 함수로서 혈장중의 몰 Trp/LNAA 비를 나타낸다. REF = 카제인 가수분해물, ALAC = 손상되지 않은 알파-락트알부민, Trp = 유리 트립토판, WEPS = 트립토판-풍부화된 리소자임 가수분해물, SYN = 합성 다이펩타이드 Ser-Trp.
도 2는 실시예 6에 상세하게 설명된 제품의 섭취 후 시간에 대한 함수로서 (기분 상태의 시험 프로파일(POMS)에 의해 측정된) 부정적인 느낌을 나타낸다. REF = 카제인 가수분해물, ALAC = 손상되지 않은 알파-락트알부민, Trp = 유리 트립토판, WEPS = 트립토판-풍부화된 리소자임 가수분해물, SYN = 합성 다이펩타이드 Ser-Trp.
도 3은 리소자임 가수분해물의 수용성 펩타이드 분획의 크기 분포를 나타낸다. 재료 및 방법 부분에 상세히 설명된 바와 같은 가수분해물에 존재하는 펩타이드와 단백질의 분자량 분포를 측정하기 위한 방법을 이용하여, 실시예 3에 개시된 방법에 따라 제조된 리소자임 가수분해물을 분석하였다. 214nm에서의 흡광 측정은 펩타이드 결합의 존재를 기록한다. 280nm에서의 흡광 측정은 트립토판과 타이로신의 방향족 측쇄의 존재를 기록한다. 트립토판이 이 파장에서 훨씬 더 높은 몰 흡광도를 갖기 때문에, 피크 값은 주로 트립토판 혼입 펩타이드를 나타낸다.
도 4는 실시예 9에 개시된 실험의 연구 디자인의 흐름도이다. 높음: 스트레스-민감성 지원자; 낮음: 스트레스-내성 지원자; hydr: Trp-풍부 리소자임 가수분해물; 위약: 카제인 가수분해물.
도 5는 실시예 9에 개시된 실험의 전형적인 연구 일의 흐름도이다. 마심: Trp-풍부 가수분해물 또는 위약을 함유하는 음료 섭취; 혈액: 혈장 아미노산 수준을 평가하기 위한 혈액 샘플링; 성과: 제어될 수 없는 스트레스 전과 후의 성과 시험; 스트레스: 산수 과제.
도 6은 실시예 9에 개시된 실험의 위약(plc) 또는 리소자임 가수분해물(Trp-hydr)을 섭취한 후의 혈장 Trp/LNAA 비(μmol/ℓ)를 나타낸다. 흑색 기호: 스트레스 민감성 환자; 비어있는 기호: 스트레스-내성 환자.
도 7은 실시예 9에 개시된 바와 같은 맥워쓰(Mackworth) 시계 시험의 결과를 나타낸다. 위약(plc; 왼쪽 패널) 또는 Trp-풍부 가수분해물(Trp-hydr: 오른쪽 패널), 산수 과제 전(스트레스 전) 또는 후(스트레스 후)의 정확한 반응의 수(수직 축). 흑색 기호: 스트레스 민감성 환자; 비어있는 기호: 스트레스-내성 환자. 상이한 개입 제품이 별개의 날짜에 주어지기 때문에, 동일한 처리 및 날 이내의 스트레스 전과 스트레스 후 사이만이 적절히 비교될 수 있다.
도 8은 실시예 9에 개시된 바와 같이 수행된 임계적 트랙킹 과제의 결과를 나타낸다. 위약(plc) 또는 Trp-풍부 가수분해물(Trp-hydr)을 섭취한 후 람다 CT(환자가 달성한 복잡성의 최종 수준을 나타냄)가 표현된다. 흑색 기호: 스트레스 민감성 환자; 회색 기호: 스트레스-내성 환자.
도 9는 산성 pH 조건하에서 펩신과 함께 항온처리된 리소자임 및 유장 단백질의 SDS-PAGE를 나타낸다. 레인 1: 그 자체로서의 리소자임, 레인 2: 펩신 분해 후의 리소자임; 레인 3: 그 자체로서의 유장 단백질; 레인 4: 펩신 소화 후의 유장 단백질; 레인 5: 그 자체로서의 펩신.
도 10은 가수분해된 리소자임(P2B = 다이아몬드), 손상되지 않은 리소자임(Lys= 사각형), 및 손상되지 않은 리소자임과 가수분해된 리소자임의 혼합물(Mix = 삼각형)의 섭취시 혈장 Trp/LNAA 비의 동역학을 나타낸다. 3개의 처리는 모두 동일한 Trp 함량을 갖는다. 3개의 제품이 모두 정확하게 동일한 "곡선 아래 면적" 값을 생성한다(이는 손상되지 않은 리소자임뿐만 아니라 리소자임 가수분해물이 완전히 소화되어 혈액으로 흡수됨을 나타낸다)는 점을 주목할만하다.
재료 및 방법
재료
상표명 "프로텍스 6L"의 섭틸리신은 제넨커(Genencor)(네덜란드 라이덴 소재)에서, 펩신은 시그마(Sigma)에서, 트립신/키모트립신(돼지 PEM)의 혼합물은 노보자임스(Novozymes)(덴마크 배그스바에르드 소재)에서 수득하였다. 리소자임은 디에스엠 푸드 스페셜티즈(DSM Food Specialties)(네덜란드 델프트 소재)에서 델보자임(Delvozyme) L(22% 무수물 기준)로서 또는 무수 델보자임 G 과립으로서 수득하였다.
카제인 가수분해물("REF")을 본질적으로 문헌[Edens et al., J Agric Food Chem, 53(20)7950-7957, 2005]에 개시된 바와 같이 수득하였다. 나트륨 카제네이트를 프로텍스 6L로 광범위하게 가수분해하고, pH를 4.5로 낮추고, 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 이용하여 20% 초과의 DH에 도달하였다. 한외여과한 후, 투과액을 열 처리하여 임의의 남아있는 효소 활성을 불활성화시키고, 최종적으로 분무 건조시켰다. 손상되지 않은 알파-락트알부민("ALAC")을 다비스코 푸즈 인터내셔날 인코포레이티드(Davisco Foods International, Inc.)(미국 미네소타주 레 수어 소재)로부터 "바이오퓨어(Biopure)"(90% 초과 알파-락트알부민)를 수득하고; 트립토판-풍부화된 리소자임 가수분해물("WEPS")을 실시예 4에 개시된 바와 같이 수득하고; 합성 Ser-Trp 다이펩타이드("SYN")를 실시예 5에 개시된 바와 같이 수득하고; 순수한 L-트립토판("TRP")을 네덜란드 알미레 소재의 오르티카(Orthica)에서 L-트립토판 -400으로서 수득하였다.
트립토판-함유 폴리펩타이드, 특히 손상되지 않은 단백질의 프로테아제 내성 시험
인간의 위에서의 소화성을 시험하기 위해, 맥 이반(Mc IIvane) 완충액(0.2M 시트르산 + Na2HPO4), pH 4.0 중에서 손상되지 않은 단백질 5%(w/w) 용액을 펩신(시그마; 손상되지 않은 단백질에 대한 1% w/w 펩신)과 함께 2시간동안 37℃에서 항온처리하였다. 프로테아제 내성은 펩신 항온처리에 의해 영향을 받지 않는 단백질의 %로서 정의된다. "영향을 받지 않는"은 단백질의 분자량이 펩신 항온처리 결과 변화하지 않음을 의미하고; "단백질의 %"는 소화 후 곡선 아래 면적에 100을 곱한 값을 소화 전 곡선 아래 면적으로 나눈 값을 의미하고; "곡선 아래 면적"은 사용된 정량 분석 방법(이후 참조)에 의해 제공되는 초기 분자량을 갖는 단백질의 면적을 의미한다.
하기 규정된 프로토콜에 따라 SDS-PAGE 후에 염색하여 분자량을 비교한다. 젤을 염색한 후, 옵티고(OptiGo) 영상 시스템(아이소겐 라이프 사이언스(Isogen Life Science; www.isogen-life-science.com))을 이용하여 디지탈 이미지를 준비한 후, 윈도우 XP에서 구동되는 토탈랩(Totallab) TL 100, 버젼 2006 소프트웨어(넌리니어 다이나믹스 리미티드(Nonlinear Dynamics Ltd.; www.nonlinear.com))을 이용하여 선택된 단백질 밴드를 정량 분석한다. 펩신 항온처리후에도 50% 초과의 단백질이 여전히 원 분자량을 갖고 있으면 본원에서는 단백질이 프로테아제 내성이라고 정의한다.
SDS - PAGE
사용된 리소자임 제제의 순도를 SDS-PAGE에 의해 확인하였다. SDS-PAGE 및 염색에 이용된 모든 재료를 인비트로겐(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)에서 구입하였다. 제조자의 지시에 따른 SDS 완충액을 이용하여 시료를 제조하고, 제조자의 지시에 따라 MES-SDS 완충 시스템을 이용하여 12% 비스-트리스 젤 상에서 분리시켰다. 심플리 블루 세이프 스테인(Simply Blue Safe Stain)(콜로이드성 쿠마시(Coomassie) G250)을 이용하여 염색하였다. 가수분해 전에, 리소자임은 젤 상에서 약 14k Da의 분자량을 갖는 단일 밴드로 나타났다.
LC / MS / MS 분석
P4000 펌프(써모 엘렉트론(Thermo Electron), 네덜란드 브레다 소재)에 커플링된 이온 트랩 질량 분광계(써모 엘렉트론, 네덜란드 브레다 소재)를 이용한 HPLC를 이용하여 본 발명에 따른 방법에 의해 생성된 효소적 단백질 가수분해물 중에서 트립토판 함유 펩타이드(주로 다이- 및 트라이펩타이드)의 존재를 검출하였다. 형성된 펩타이드를 용출을 위한 밀리(Milli)Q 물(밀리포어(Millipore), 미국 매사추세츠주 베드포드 소재) 중의 0.1% 포름산(용액 A) 및 아세토니트릴 중의 0.1% 포름산(용액 B)의 구배와 조합된 인에르트실(Inertsil) 3 ODS 3, 3㎛, 150*2.1mm 컬럼(배리언 벨지움(Barian Belgium), 벨기에 소재)을 이용하여 분리시켰다. 100%의 용액 A에서 시작하여, 이를 10분간 유지하고, 25분동안 20% B로 선형 증가시키고, 직후에 출발 조건으로 돌아가고, 안정화를 위해 15분간 유지하였다. 사용된 주입 부피는 50마이크로리터이고, 유속은 분당 200마이크로리터이고, 컬럼 온도를 55℃에서 유지하였다. 주입된 시료의 단백질 농도는 약 50㎍/ml이었다. 관심있는 펩타이드의 확인은 체류 시간, 양성자화된 분자에 근거하고, 약 30%의 최적 충돌 에너지를 이용한 관심있는 펩타이드에 대한 전용 MS/MS를 이용하였다. 특정한 트립토판 함유 펩타이드의 정량을 외부 표준 방법을 이용하여 수행하였다. 테트라펩타이드인 VVPP(M=410.2)를 이용하여 MS 방식에서의 최적의 민감성에 대해, 그리고 MS/MS 방식에서의 최적 분획화를 위해 조정하고, 5㎍/ml의 일정한 주입을 수행하여, MS 방식에서 양성자화된 분자를 수득하고, MS/MS 방식에서 약 30%의 최적 충돌 에너지를 이용하여 B- 및 Y-이온 시리즈를 생성하였다.
LC/MS/MS 전에, 효소적 단백질 가수분해물을 주위 온도 및 13000 rpm에서 10분간 원심분리하고, 상층액을 밀리포어(Millipore) 물 여과 장치를 통해 여과된 탈염수(밀리Q 물)로 1:100으로 희석시켰다.
아미노산 분석
혈장 중의 아미노산 프로파일을 실시예 6 또는 11에 개시된 바와 같이 문헌[van Eijk et al., J. Chromatogr. 1993: 620: 143-148]에 따라 HPLC에 의해 분석하였다. 워터스(미국 매사추세츠 밀포드 소재)의 아미노산 분석 시스템의 조작자 매뉴얼에 규정된 피코택(PicoTag) 방법에 따라 다른 아미노산 분석을 수행하였다. 이를 위해 시료를 건조시키고 페닐아이소티오시아네이트를 이용하여 직접 유도체화시켰다. 존재하는 유도체화된 아미노산을 개시된 HPLC 방법을 이용하여 정량하였다. 일반적인 산 가수분해동안 Trp 및 Cys가 파괴되므로, 이들 2가지 아미노산의 정량을 위해 특별한 방법을 이용하였다. 가수분해동안의 Cys 분해를 방지하기 위해, 이 아미노산을 먼저 과산화수소를 이용하여 시스테산으로 산화시킨 후 정량하였다. 트립토판의 분석은 살짝 개질된 워터스 방법에 근거한다. 이 방법에서 펩타이드 용액 분취량을 진공하에서 건조시킨 후 0.2% 트립타민을 함유하는 4M 메탄설폰산 중에서 질소하에서 150℃에서 1시간동안 가수분해시켰다. 반응 생성물을 올텍 알티마(Alltech Altima) C18 컬럼 및 형광 검출기가 구비된 HPLC를 이용하여 직접 정량하였다.
가수분해도
다양한 양성자분해 혼합물과의 항온처리 동안 수득된 가수분해도(DH)를 빠른 OPA 시험([Nielsen, P.M.; Petersen, D.; Dambmann, C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis. Journal of Food Science 2001, 66, 642-646])을 이용하여 모니터링하였다.
켈달 질소
총 켈달 질소를 유동 주입 분석에 의해 측정하였다. TKN 방법 카세트 5000-040이 구비된 테케이터(Tecator) FIASTAR 5000 유동 주입 시스템, SOFIA 소프트웨어가 있는 펜티엄 4 컴퓨터 및 테케이터 5027 오토샘플러를 이용하여, 단백질 함유 용액으로부터 방출된 암모니아를 590nm에서 정량하였다. 방법의 동적 범위에 상응하는 양의 시료 양(0.5 내지 20 mg N/ℓ)을 95 내지 97% 황산과 함께 분해 튜브에 놓고 켈탭(Kjeltab)을 200℃에서의 30분 및 이어서 360℃에서의 90분의 소화 프로그램에 가하였다. FIASTAR 5000 시스템에 주입한 후, 질소 피크를 측정하고, 이로부터 측정된 단백질의 양을 추정할 수 있다.
가수분해물에 존재하는 펩타이드 및 단백질의 분자량 분포
프로테아제 처리된 단백질 시료의 펩타이드 크기 분포를 고압 펌프, 10 내지 100㎕의 시료를 주입할 수 있는 주입 장치 및 컬럼 용출액을 214nm에서 모니터링할 수 있는 UV 검출기가 구비된 자동화된 HPLC 시스템 상에서 수행하였다.
이 분석에 사용된 컬럼은 20mM 인산 나트륨/250mM 염화 나트륨 pH 7.0 완충액으로 평형화된 슈퍼덱스 펩타이드(Superdex Peptide) HR 10/300 GL(아머샴(Amersham))이었다. 시료(전형적으로 50㎕)를 주입한 후, 0.5ml/분의 유속에서 90분동안 완충액을 이용하여 다양한 성분을 컬럼으로부터 용출시켰다. 분자량 마커로서 사이토크롬 C(분자량: 13,500 Da), 아프로티닌(분자량: 6510 Da) 및 테트라글리신(분자량: 246 Da)의 혼합물을 이용하여 시스템을 보정하였다.
하기 실시예가 본 발명을 추가로 예시한다.
실시예
실시예 1
달걀 리소자임은 펩신 또는 트립신/ 키모트립신에 의해 분해되지 않는다
인간의 위장관에서의 소화성을 시험하기 위해, 달걀 리소자임을 펩신 및 또한 트립신과 키모트립신의 혼합물과 함께 생체 외에서 항온배양하였다. 두가지 항온배양 모두 위(펩신)와 십이지장(트립신/키모트립신)에서 우세한 pH 조건하에서 수행하였다. 이를 위해 5%(w/w) 리소자임 용액을 효소(리소자임 단백질에 대한 1% w/w 효소)와 함께 37℃에서 2시간동안 항온처리하였다. 진행되는 단백질 가수분해 결과로서의 주요한 pH 변화를 방지하기 위해서, 맥 이반 완충액(0.2M 시트르산 + Na2HPO4)에서 항온처리를 수행하였다. 37℃에서 2시간동안 가수분해한 후 수득되는 낮은 DH 값(표 1 참조)은, 성공적인 단백질분해가 10% 이상의 DH 값을 야기할 수 있는 것으로 예상될 수 있기 때문에, 리소자임 분자가 위, 십이지장 및 공장에서의 소화 조건을 흉내낸 조건하에서 분해될 수 없음을 입증한다. 따라서, 손상되지 않은 달걀 리소자임 분자에 존재하는 트립토판 잔기는 위장관에서 방출되지 않고, 따라서, 손상되지 않은 달걀 리소자임에 존재하는 트립토판 분자가 섭취 직후 혈장 트립토판 수준에 기여할 수 없다는 것을 의미한다.
[표 1]
Figure 112010077422254-pct00001

실시예 2
달걀 리소자임은 증가된 pH 값에서 섭틸리신에 의해 효과적으로 분해된다
비-생리적 pH 및 효소 조건하에서 효소 가수분해에 대한 리소자임의 민감성을 시험하기 위해, 리소자임 용액을 알칼리 pH 조건하에서 미생물 섭틸리신(EC 3.4.21.62)과 함께 항온처리하였다. 이를 위해, 5%(w/w) 리소자임 용액을 존재하는 리소자임 단백질 1g당 12.5㎕의 프로텍스 6L과 함께 pH 7.0, 8.0 및 9.0에서 항온처리하였다. 1M NaOH를 이용하여 pH를 일정하게 조절하면서 60℃에서 3시간동안 항온처리를 수행하였다. 항온처리는 임의의 유의한 침전없이 약간 탁한 용액을 생성하였다. 섭틸리신 활성을 불활성화시키기 위한 가열 단계 후, 다양한 항온처리액의 DH 값을 재료 및 방법 부분에 개시된 프로토콜에 따라 측정하였다. 생리적 조건(실시예 1 참조)에서 수득된 결과와는 대조적으로, 섭틸리신을 이용한 알칼리 항온처리 조건은 완전한 리소자임 가수분해를 생성하였다. pH 7.0 항온처리는 6.3의 DH를 생성하였고, pH 8.0 항온처리는 11.2의 DH를 생성하였고, pH 9.0 항온처리는 16.4의 DH를 생성하였다. 반응 생성물의 후속적인 SDS-PAGE 분석은 전체 리소자임 분자가 분해되었음, 즉, 섭틸리신 항온처리를 견딘 큰 분자량 분획이 없다는 것을 나타낸다. 또한, 크라운팩(Crownpak) CR+ 컬럼(다이셀(Diacel)) 상에서의 가수분해물의 HPLC 분석은 pH 9.0에서의 오랜 기간의 가열 후에조차 트립토판 함유 펩타이드의 유의한 라세미화가 없음을 입증한다.
실시예 3
프로텍스를 이용한 리소자임 가수분해 및 형성된 펩타이드의 확인
10%(w/w)의 순수한 리소자임을 함유하는 용액을 NaOH를 이용하여 pH 8.2로 조절하고, 52℃로 가열하였다. 존재하는 단백질 1g당 25㎕의 프로텍스를 첨가함으로써 가수분해를 시작하였다. 연속적으로 교반하고, pH를 8.2로 유지함으로써, 5.5시간동안 계속 가수분해하면 보이는 침전물이 없는 거의 투명한 용액이 수득되었다. 프로텍스 활성을 불활성화시키기 위한 가열 단계 후에, DH 분석을 위해 시료를 취하였다. 용액의 DH는 거의 30%로 밝혀졌다. 열 처리된 용액을 10 kDa 필터 상에서 한외여과하여 완전히 투명한 용액을 생성하였다. 이 투명한 용액을 LC/MS 분석, 존재하는 펩타이드와 단백질의 분자량 분포, 및 또한 이온 교환 크로마토그래피에 이용하였다.
존재하는 펩타이드와 단백질의 분자량 분포에 대한 결과를 얻기 위해서, 투명한 용액을 재료 및 방법 부분에 개시된 분자량 크기 분석에 가하였다. 수득된 결과(도 3 참조)는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(즉, 트립토판, 타이로신 및 페닐알라닌)이 혼입된 거의 모든 펩타이드가 500 kDa 미만의 분자량을 가짐을 명확하게 나타냈다. 이들 아미노산의 고분자량을 고려하면, 결과는 이들 작은 펩타이드가 대부분 트라이펩타이드 또는 다이펩타이드중 하나임을 의미한다.
재료 및 방법 부분에 개시된 방법에 따라 LC/MS 분석을 수행하였다. 트립토판("W")을 함유하는 이들 펩타이드를 선택함으로써, 펩타이드 AW, GNW, WIR, NAW, WVA, VAW, AWR, SLGNW 및 소량의 WW 및 SRWW가 검출될 수 있다. 항온처리 후의 가수분해물 중의 유리 트립토판의 수준은 존재하는 총 (리소자임) 트립토판의 1% 미만을 나타내는 것으로 확립되었다.
다이- 및 트라이펩타이드가 내장 벽에 존재하는 펩타이드 전달자에 의해 쉽게 흡수되기 때문에, 이런 펩타이드에 존재하는 트립토판 잔기가 신속하게 흡수되고 본 발명의 리소자임 가수분해물의 경구 섭취시 증가된 혈장 트립토판 수준을 야기할 것이라는 것은 의심할 여지가 없다.
실시예 4
가수분해물의 트립토판 함량 증가
리소자임에는 매우 많은 양의 염기성인 아르기닌 및 리신 잔기가 혼입되어 있다. 또한 리소자임 분자에는 상당한 수의 산성인 글루타메이트 및 아스파테이트 잔기가 혼입되어 있다. 이 자료를 이용하여 높은 Trp/LNAA 비를 특징으로 하는 가수분해물에 대한 혁신적이고 우아한 정제 경로를 고안하여 왔다. 그러나, 이 정제 경로에 대한 본질적인 요구사항은 또한 아르기닌 또는 리신 잔기나 글루타메이트 또는 아스파테이트 잔기중 어느 하나를 함유하는 펩타이드에서 단지 매우 소수의 트립토판 잔기가 나타난다는 점이다. 실시예 3에 제시된 바와 같이, 여기에 이용되는 특정한 가수분해 경로는 아르기닌 잔기를 함유하는 트립토판 함유 펩타이드를 매우 적게 생성하고, 리신, 글루타메이트 또는 아스파테이트 잔기를 함유하는 펩타이드를 전혀 생성하지 않는다. 이론은 글루타메이트 또는 아스파테이트 잔기가 있는 펩타이드와 없는 펩타이드 사이의 최대 전하 차이가 pH 3 부근에서 달성될 수 있다고 예측한다. 아르기닌 또는 리신 잔기가 있는 펩타이드와 없는 펩타이드 사이의 최대 전하 차이는 pH 5 부근에서 달성될 수 있다.
이 접근법의 선별력을 예증하기 위해, 리소자임 가수분해물을 실시예 3에 특정된 방법에 따라 제조하였다. 그런 다음, 상기 가수분해물의 pH를 아세트산을 이용하여 pH 3.1로 조정하였고, 약 0.5g의 단백질을 20mM 시트르산 나트륨 pH 3.1로 평형화된 15ml 베드 부피의 SP 세파로스 FF(지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 벨기에 디에겜 소재)에 적용하였다. 컬럼을 1 컬럼 부피의 시트르산 나트륨 완충액으로 세척하여, 글루타메이트 또는 아스파테이트가 혼입되어 있는 펩타이드 대부분을 제거한 후, 용출 완충액을 20mM 시트르산 나트륨 완충액 pH 5.1로 변화시켰다. 컬럼을 3 컬럼 부피의 후자의 완충액으로 세척하는 동안, 일정 범위의 트립토판 함유 펩타이드가 용출되었다. LC/MS 분석에 따르면, 다이펩타이드 AW, 및 또한 트라이펩타이드 GNW, NAW, WVA, VAW가 다량으로 존재하고, 소량의 펜타펩타이드 SLGNW가 존재한다. 다양한 pH 5.1 분획의 아미노산 분석은 선택적인 통합(pooling)이 1.75의 분자 Trp/LNAA 비 및 거의 30%의 트립토판 수율을 갖는 용액을 생성하였음을 보여주었다. 덜 선택적인 통합은 0.4의 분자 Trp/LNAA 비 및 70%의 트립토판 수율을 갖는 용액을 생성하였다. 후속적으로, 컬럼을 3 컬럼 부피의 20mM 시트르산 나트륨 pH 7.1로 세척하였다. LC/MS 자료에 따르면, 이 단계는 아르기닌 함유 펩타이드인 WIR, AWIR 및 놀랍게도 펩타이드 WW를 용출시켰다. 컬럼을 1M의 NaOH, 물 및 1M의 아세트산 용액으로 최종 세척하여 컬럼을 다음 단계에 대해 준비시켰다.
실시예 5
다이펩타이드 Ser - Trp 의 화학적 합성
다이펩타이드인 Ser-Trp를 표준 펩타이드 기술에 따라 합성하였다. 제 1 단계에서, Z-Ser-OH와 Trp-OMe를 탄소 무수물 기법([J.Am.Chem.Soc. 1967, 5012])을 통해 커플링시켜 보호된 다이펩타이드 Z-Ser-Trp-OMe를 생성하였다. 이를 위해 Trp-OME·HCl을 테트라하이드로푸란(THF)에 현탁시키고, 후속적으로 N-메틸모폴린(NMM)을 첨가하였다. 혼합물을 1시간동안 교반한 후, 테트라하이드로푸란/다이메틸포름아미드(THF/DMF) 중의 Z-Ser 용액에 첨가하였다. 두번째 등가량의 NMM을 첨가하고, 혼합물을 -15℃로 냉각시켰다. 아이소부틸 클로로포르메이트를 내부 온도가 -15℃를 초과하지 않는 속도로 첨가하였다. 후속적으로, 혼합물을 3시간동안 교반하고, 온도가 주위온도까지 상승되게 하고, 침전된 NMM·HCl을 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 4℃에서 하룻밤동안 보관한 후, 임의의 추가의 침전물을 여과하고, 여과액을 진공에서 농축하였다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 에틸 아세테이트/헵탄)에 의해 정제하였다. 조합된 분획을 농축하고, 물로 세척하여, 임의의 남아있는 DMF를 제거하고, 진공에서 농축하였다.
제 2 단계에서, Z-Ser-Trp-OMe의 효소적 가수분해를 알칼라제(Alcalase) 2.5L DX를 이용하여 수행한 후([Int.J.Peptide Protein Res. 1990, 52]), 촉매적 가수소분해하여 목적 펩타이드를 회백색 고형물로서 수득하였다. 이를 위해, 정제된 Z-Ser-Trp-OMe를 tBuOH 및 물에 용해시키고, 알칼라제 2.5L DX(노보자임스, 덴마크 배그사바에르드 소재)를 첨가하였다. (거의) 모든 출발 물질이 소비될 때까지 혼합물을 교반하였다. 그런 다음, 혼합물을 진공하에서 농축시키고, 잔사를 pH 7의 물에 취하였다. 수성 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하여 임의의 남아있는 출발 물질을 제거한 후, 수성 상을 산성화시켰다. 에틸 아세테이트를 이용한 추출에 의해 목적 생성물, 즉 Z-Ser-Trp-OH를 단리하고; 추출액을 황산 나트륨 상에서 건조시키고, 진공에서 농축시켰다.
제 3 단계에서, 다이펩타이드인 Ser-Trp-OH를 수득하였다. 이를 위해 농축된 Z-Ser-Trp-OH를 MeOH 및 물(1:1)에 용해시키고, Pd/C를 첨가하고, 혼합물을 양의 수소 대기(5바)하에서 교반하였다. 반응이 종결되면, 촉매 + 대부분의 생성물을 여과에 의해 제거하고, 여과액을 버렸다. 필터를 밀리Q 물로 광범위하게 세척하고, 여과액을 진공에서 농축시켜 다이펩타이드인 Ser-Trp-OH를 백색 내지 회백색 고형물로서 수득하였다. 아세톤-물의 혼합물 중에서 생성물을 교반하고, 펩타이드를 여과에 의해 단리함으로써 추가의 정제를 달성하였다. 이는 경구 섭취에 적합한 생성물을 생성한다.
실시예 6
건강한 지원자에서 혈장 Trp/LNAA 비 및 기분에 미치는 상이한 트립토판 공급원의 효과
본 연구의 목적은 상이한 트립토판 함유 제제를 섭취한 후 건강한 지원자의 혈장 Trp/LNAA 프로파일 및 기분을 조사하는 것이다. 하기 제제를 시험하였다:
- 손상되지 않은 알파-락트알부민(물질 및 재료 부분 참조)
- 가수분해된 카제이네이트 (DH>20%; 물질 및 재료 부분 참조)
- 높은 Trp/LNAA 비를 갖는 Trp-풍부화된 리소자임 가수분해물(실시예 4 참조)
- 합성 SW 다이펩타이드(실시예 5)
- 유리 L-트립토판(물질 및 재료 부분 참조)
18명의 건강한 학생(9명의 남성 및 9명의 여성; 18 내지 30세)이 본 연구에 참여하였다. 참여 배제 기준은 만성 질환 소유자 및 현재 아픈 사람, 정신적 또는 의학적 병력, 약물 또는 마약 복용자, 알콜 섭취자(2유니트/일 초과), 대사 질환, 호르몬 질환 또는 내장 질환이 있는 사람 및 불규칙적 식사 또는 이상 식습관(건강 및 생활 습관 설문법에 의해 평가됨)을 가진 사람이다. 실험에 참여한 대상은 정상 범위의 체질량 지수(BMI, 20 내지 25kg/m2)이고, 여성 대상은 피임에 대해 적합하다. 여성은 중-후기 여포상(제4일 내지 제10일)동안 참가하였고, 피임을 이용하는 여성은 실제로 피임약을 이용하였을 때 참가하였다. 참가자들은 비흡연자이고 연구전 또는 연구동안 알콜을 이용하지 않았다. 실험에 참여한 모든 대상은 사전 동의서 형식에 서명하였다. 본 연구는 2000년 10월에 스코틀랜드 에딘버그의 52차 WMA 총회에서 채택된 의약품 임상시험 관리 기준(GCP)의 EC 원칙에 따라 수행되었다.
대상들에게 하룻밤동안 굶도록 지시하였다; 물 또는 설탕이 안든 차만을 허용하였다. 5회의 실험 아침 회합동안, 대상자들은 상이한 농도의 Trp 또는 LNAA를 함유한 음료를 섭취한 후의 혈장 Trp/LNAA 농도 및 기분을 모니터링하기 위해 실험실을 방문하였다. 다양한 음료의 제시 순서는 대등하였고, 4회의 실험일은 한주의 간격을 가졌다. 각각의 실험일 아침에, 상이한 농도의 트립토판(Trp) 또는 LNAA를 함유한 312ml의 음료가 제공되었다(표 2). 모든 음료는 0.10g의 감미제(아세설팜)를 함유하였고, 312ml가 되도록 물로 채워졌다. 식이 조건에 대해 모르는 연구 보조자가 상이한 음료의 투여를 수행하였다.
[표 2]
Figure 112010077422254-pct00002

혈액 시료를 섭취하기 전 및 섭취한지 15분, 30분, 60분, 90분, 120분, 180분 및 210분 후에 나트륨 헤파린을 함유하는 5ml 바큐테이너 튜브에 2벌씩 수집한 후, 4℃에서 5000rpm에서 5분동안 원심분리하였다. 생성된 상층액을 설파살리실산(4mg/100㎕)과 혼합하고, 분석할 때까지 -80℃에 바로 저장하였다. HPLC를 이용하여 혈장 아미노산 분석을 수행하고, 문헌[van Eijk et al., J. Chromatogr. 1993: 620: 143-148]에 개시된 바와 같이 2 내지 3㎛ 비스코프 스페리소브 ODS II 컬럼을 이용하였다. 혈장의 트립토판 몰 농도를 큰 중성 아미노산인 발린, 아이소루신, 루신, 타이로신 및 페닐알라닌의 혈장 몰 농도의 합으로 나누어서, 혈장 Trp/LNAA 비를 계산하였다. 일반 선형 모델(GLM: 윈도우의 경우 SPSS 12.0)을 이용하여 분산의 다변수 및 단변수 분석(MANOVA 및 ANOVA)을 반복 측정함으로써 통계 분석을 수행하였다. 모든 통계치는 P=0.05의 유의 수준에서 평가하였다.
혈장 Trp / LNAA 값
혈장 Trp/LNAA 비에 대한 대상자 내부 인자로서 조건과 시간을 이용한 분산의 첫번째 반복 측정 분석 결과는 시간과 조건의 주요 유의 효과 및 조건 X 시간의 유의한 상호작용을 밝혀냈다. "SYN"(60분 후에 263% 증가) 및 "WEPS"(90분 후에 255% 증가)를 제공한 후에 혈장 Trp/LNAA 비에서 가장 높은 유의 증가가 발견되었다(도 1 참조). 이들 2가지 제품을 섭취한 후의 Trp/LNAA 비의 증가는, "TRP"(120분 후의 191% 증가) 또는 "ALAC"(120분 후의 67% 증가)중 하나를 섭취한 후에 비해 상당히 더 빠르고 높았다. "REF"를 섭취한 후에는 60분부터 시작하여 210분까지 Trp/LNAA가 유의하게 감소(-27%)하였다.
"WEPS"를 이용하였을 때 발견되는 Trp/LNAA의 255% 상승은, 손상되지 않은 알파-락트알부민을 이용하여 이전에 발견된 50 내지 70%의 증가치([Markus et al., 2000; Booij et al., 2006]), 및 탄수화물과 같은 다른 식품을 이용한 모든 이전에 보고된 20 내지 45%의 증가치([Markus, 2003])를 상당히 초과한다. 혈장 Trp/LNAA에서의 40 내지 50% 변동이 뇌에서의 Trp 수준 및 5-HT 합성 및 방출을 변화시키기에 충분할 것으로 생각되지만([Markus et al., 2000]), 이러한 255% 상승은 이용가능한 뇌 Trp 및 5-HT에서 훨씬 더 큰 상승을 야기하고, 따라서, 기능적으로 활성인 뇌 5-HT를 훨씬 더 많이 방출시킬 수 있을 것으로 예상된다.
기분 상태의 프로파일( POMS )
기분 상태 설문지 프로파일([Wald and Mellenbergh, Ned Tijdschr Psychol 1990: 45: 86-90])의 독일식 짧은 버전의 종이와 연필 버전을 이용하여 "강한 부정" 내지 "강한 긍정" 범위의 VAS 스케일로서 다양한 참가자의 기분 변화를 측정하였다. POMS는 기분에 대해 다음과 같은 5가지의 상이한 서브스케일을 포함한다: 부정적 기분 상태를 언급하는 분노, 우울함, 피로 및 긴장, 및 긍정적 기분에 관한 활력.
총 기분 점수에 대한 대상자 내부 인자로서 조건과 시간을 이용한 분산의 반복 측정 분석 결과는 시간의 유의 효과, 및 조건 X 시간의 유의한 상호작용을 밝혔고, 이는 시간 경과에 따른 기분 변화가 조건마다 상당히 다르다는 것을 나타낸다. "WEPS" 및 "TRP"를 섭취한지 60분 후에 기분이 필적할만하게 개선되는 것으로 발견되었지만, 단지 "WEPS"의 경우 "TRP"와 비교하였을 때 섭취한지 210분후까지도 기분이 더욱 개선되었다. 이와는 대조적으로 "REF" 및 "ALAC"를 섭취한 후에는 아무런 기분 변화가 발견되지 않았다. 손상되지 않은 알파-락트알부민을 섭취한 후의 기분 효과가 없는 것은 손상되지 않은 알파-락트알부민을 섭취한 후 급성 스트레스에 노출된 스트레스-민감성 대상에서만 어느 정도의 유리한 효과를 보여준 이전의 연구와 유사하다([Markus et al., 2000; Markus et al., 2000, Markus, 2003]). 비록 "SYN"을 섭취한 후에도 기분이 개선되는 것으로 보이지만, 이 효과는 이 실험 설정에서는 유의하지 않다.
이러한 현재의 결과는 혈장 Trp/LNAA에서의 큰 255% 증가가 정상적인 비-스트레스-민감성 대상에서의 기분 개선에 충분할 수 있다고 제시한다. 이전의 발견에 근거하여, Trp-개선된 리소자임 가수분해물이 기분에 미치는 이러한 유리한 효과는 높은 정신적 스트레스 조건하의 스트레스-민감성 대상에서는 훨씬 더 클 것으로 예상된다([Markus, 2003]). 본 발명자의 예상과는 대조적으로, 합성 다이펩타이드의 섭취 후에, 기분이 상당히 개선되지 않았다. 이 예상치 못한 결과는 현재의 실험 설정 또는 이들 다양한 공급원으로부터의 트립토판의 생체이용성에서의 차이에 기인한 것일 수 있다.
[표 3]
카제인 가수분해물("REF"), 손상되지 않은 알파-락트알부민("ALAC") 또는 Trp-개선된 리소자임 가수분해물("WEPS")을 섭취한 후 시간에 따른 혈장 아미노산 농도(μmol/ℓ)의 변화
Figure 112010077422254-pct00003
[표 4]
유리 L-Trp("TRP") 또는 합성 다이펩타이드 SW("SYN")를 섭취한 후 시간에 따른 혈장 아미노산 농도(μmol/ℓ)의 변화
Figure 112010077422254-pct00004
실시예 7
대규모 리소자임 가수분해
대규모 리소자임 가수분해 과정에서, 본질적으로 실시예 3에 개시된 방법을 일부 사소하게 변화시켜 수행하였다. 7.3%(w/w) 순수한 리소자임을 함유한 용액을 65℃로 가열시킨 후, NaOH를 이용하여 pH를 8.2로 조절하였다. 무수물 1g 당 25㎕의 프로텍스 6L을 첨가함으로써 가수분해를 시작하였다. 연속적으로 교반하고, pH 8.2 및 온도 53℃를 유지하면서, 2시간동안 계속 가수분해하였다. 그런 다음, pH 값을 9.0으로 증가시키고, 추가 3.5시간동안 항온처리하여 일부 침전물이 있는 용액을 생성하였다. 그런 다음, 용액의 pH를 4.5로 낮추고, 용액을 4℃ 미만으로 냉각시켰다. 완전히 투명한 생성물을 수득하기 위해서, 액체를 Z2000 필터(폴(Pall)) 상에서 여과한 후, 과량의 물과 염을 나노여과를 통해 제거하였다. 그런 다음, 생성된 농축액을 120℃에서 7초동안 UHT 처리하고, 증발시키고, 최종적으로 분무 건조시켜 무수 형태의 리소자임 가수분해물을 수득하였다. 이렇게 수득된 생성물은 약 0.19의 몰 Trp/LNAA 비를 가졌다.
실시예 8
리소자임 가수분해물이 혼입된 음료의 제조
하기 방법은 무-지방 리소자임 가수분해물을 함유하는 딸기 드링크의 제제를 예시한다. 10g의 리소자임 가수분해물 분말(실시예 7에 따라 제조됨)에, 40g의 글루코스, 2.4g의 시트르산, 0.38g의 말산, 0.15g의 슈크랄로즈 및 0.5g의 딸기향(부터레센스(Buteressence), 네덜란드 잔담 소재)을 첨가하였다. 이 분말 혼합물을 1ℓ의 물에 쉽게 용해시켜 높은 Trp/LNAA 및 높은 Tyr/BCAA 비를 갖는 쉽게 마실 수 있는 음료를 수득하였다. 분말 혼합물은 예를 들면 사세(sachet) 충진에 적합하다. 포장된 액체 제품은 다양한 공지된 기법을 이용하여 생산될 수 있다.
실시예 9
스트레스-민감성 및 스트레스-내성 건강한 지원자에서 스트레스 후 성과에 미치는 리소자임 가수분해물의 효과
본 연구의 목적은 실시예 7에 개시된 방법에 따라 제조된 리소자임 가수분해물의 효과를 위약(카제인 단백질 가수분해물; 실시예 6 참조)과 혈장 Trp/LNAA 수준 및 이의 스트레스 후 성과 과제에서의 결과 측면에서 비교하였다. 사용된 성과 시험은 개인의 "각성 상태" 및 "눈-운동 제어" 측면을 다루는 것으로 알려져 있다.
40명의 개인(20명의 남성 및 20명의 여성)이 본 연구에 참여하였다. 연구전 설문지에 기초하여, 이 군의 절반은 스트레스-내성으로 분류되고, 나머지 절반은 스트레스-민감성으로 분류된다. 개인 및 일반적인 연구 수행에 대한 참여 및 배제 기준은 실시예 6에 개시된 바와 동일하였다. 연구 디자인의 흐름도가 도 4에 제시되어 있고, 전형적인 연구 일의 개요가 도 5에 제공되어 있다.
실험일 아침에, 대상자는 공복인 채로 실험실에 도착하였다. 도착시, 이들에게 리소자임 가수분해물 또는 위약(즉, 카제인 가수분해물을 함유한 음료)중 하나를 주었다. 시험 음료와 위약 음료의 조성은 표 5에 개설되어 있다.
[표 5]
Figure 112014031122211-pct00017

300ml의 음료를 섭취한지 90분 후에, Trp/LNAA 비를 평가하기 위해 혈액 시료를 취하였다(실시예 6 참조). 후속적으로, 스트레스-내성 또는 스트레스-민감성 대상의 군중 하나를 스트레스에 노출시킨 후 성과 시험에 노출시켰다. 이 스트레스는 소음 자극하에서 수행되어야만 하는 산수 과제로 구성되었다. 대상자는 시험에서의 그들의 성과가 소음의 존재 유무에 달려있다고 생각하도록 유도되었다. 실제로, 산수 과제는 모든 대상자가 각각의 시도에서 실패하도록 조작되었다. 이 설정은 심리학적 스트레스를 야기하는 것으로 알려져 있고, 매우 제어하기 힘든 것으로 인식된다([Peters, M. L., Godaert, G. L. R., Ballieux, R. E. et al. (1998). Cardiovascular and catecholamine response to experimental stress: effects of mental effort and controllability. Psychoneuroendocrinology. 23, 1-17]). 산수 과제 후에, 첫번째 성과 시험을 반복하여 혈액 Trp/LNAA 비의 작용 영향력하에서의 성과에 대한 스트레스의 효과를 정량하였다.
수행된 성과 시험은 맥워쓰 시계 시험([Mackworth, N (1948) The breakdown of vigilance during prolonged visual search. Quart J Exp Psych. 1, 6-21]) 및 임계적 트랙킹 과제([Jex HR et al., (1966) A "critical" tracking task for man-machine research related to the operator's effective delay time. NASA Contract Rep NASA CR.:1-105])였다.
맥워쓰 시계 시험은 지속된 기간동안의 "각성", 경계 상태 및 집중도를 측정하기 위해 널리 이용된다. 대상을 시계 상의 초침을 흉내 낸 60개 점이 원형 배열되어 있는 컴퓨터 스크린의 정면에 앉게 한다. 점은 500ms당 하나의 속도로 시계방향으로 잠시동안 밝아진다. 일반적으로 회전은 단일(1개의 점) 점프로 진행된다. 대상자는 정상적인 순서에서 점중 하나를 건너뜀으로써 표적이 드물게 불규칙한 간격으로 이중(2개의 점) 점프하여 진행된다는 지시를 받았다. 그러면 대상자가 가능한 한 빨리 버튼을 눌러야만 한다. 이런 경우가 45분의 시험동안 총 30번 제시되었다. 10회는 각각의 연속적인 15분 기간 이내에 발생하고, 8초 내지 7.2분의 간격을 가졌다.
임계적 트랙킹 과제는 1차 보상 지각-운동 조화 과제에서 나타나는 오차 신호를 제어하는 능력을 측정하는 지각-운동 성과 과제로서 이용된다. 이 과제동안, 대상자는 민감한 조이스틱을 이용함으로써 컴퓨터 스크린 상의 불안정한 커서를 제어해야만 한다. 오차는 수평 선형 스케일 상의 중앙점으로부터의 커서의 수평 이탈로서 나타날 것이다. 대상자는 연속적으로 조이스틱을 보상 이동시킴으로써 불안정한 커서가 축의 중심에 유지되어 이탈이 0으로 감소되도록 노력해야만 한다. 커서 이탈 빈도는 시간의 확률적인 선형 함수로서 증가하고, 따라서, 대상자는 점점 더 높은 빈도로 보상 이동할 것이 요구된다. 또한, 대상자의 보상 반응은 상 지연(오차로부터 빼지는 것이 아니라 더해지는 반응)이 증가하는 빈도를 증가시켜 결과적으로 제어력을 잃어버리게 된다. 대상자가 제어력을 잃게 되는 빈도가 임계적 빈도이다. 시험은 5회 수행되었고, 이 시험의 의존적 변수로서 가장 낮은 값과 가장 높은 값을 제외하고 평균 임계적 빈도를 계산하였다.
음료를 섭취한지 90분 후에 측정된 혈장 Trp/LNAA 비는 혈장 Trp/LNAA 비에 미치는 유의 효과(P<0.0001)가 적용되는 실험 조건에 따라 변화한다는 점을 드러내었다. 리소자임 가수분해물("Trp-hydr")의 섭취는 혈장 Trp/LNAA 값을 0.25μmol/ℓ로 증가시켰다. 카제인 가수분해물("plc")의 섭취는 Trp/LNAA 비를 0.08μmol/ℓ로 증가시켰다(도 6). 관련된 아미노산 각각에 대한 값을 표 6에 제공한다.
[표 6]
Figure 112010077422254-pct00006

카제인 가수분해물을 섭취한 후 맥워쓰 시계 시험을 치른 개인들의 양쪽 군 모두의 성과는 스트레스에 대한 노출에 의해 상당히 손상되었다. 그러나, Trp-풍부 리소자임 가수분해물을 섭취하면 스트레스-내성 군에서 이러한 성과 손상이 방지되었다. 상당히 놀랍게도, Trp-풍부 가수분해물은 스트레스-민감성 그룹에서는 이러한 성과 손상을 방지하지 않았다. 수득된 자료는 도 7에 그래프로 표현되어 있다.
임계적 트랙킹 과제에서, 람다 CT 값은 대상에 의해 달성된 복잡성의 최종 수준을 나타낸다. 람다 CT 값이 더 높을수록, 제어력이 더 좋다. 본 실험에서 수득된 자료는, Trp-풍부 가수분해물을 섭취하였을 때 스트레스에 노출된 후의 람다 CT 값이 상당히 더 높았음을 보여준다. 스트레스-내성 개인중에서는 위약 처리군에 비해 16% 증가가 기록될 수 있었다. 상당히 놀랍게도, 또한 이 시험에서, 스트레스-민감성 군에서의 람다 CT 값은 Trp-풍부 가수분해물과 위약 사이에 유의한 차이를 나타내지 않았다.
실시예 10
리소자임과 알파-락트알부민의 프로테아제 내성
베타-락토글로불린과 함께, 알파-락트알부민은 유장의 주요 단백질 구성성분을 형성한다. 이의 높은 Trp/LNAA 비 때문에, 단리된 알파-락트알부민 분획 및 또한 알파-락트알부민 가수분해물은 개선된 혈장 트립토판 수준에 대한 인기를 얻어왔다. 비록 알파-락트알부민 및 달걀 리소자임 둘 모두가 비정상적으로 높은 Trp/LNAA 비를 갖지만, 다른 측면에서 이들 2가지 분자는 상당히 상이하다. 본원에 따르면, 높은 Trp/LNAA 비를 갖는 펩신-내성 분자가 더 오랜 기간동안 높은 혈장 Trp/LNAA 비를 유지하는데 필수적이다. 본원에서, 본 발명자는 달걀 리소자임과는 상이하게, 알파-락트알부민은 펩신-내성이 아님을 입증한다. 이는 하기의 실험에서 예증되었다. 인간의 위에서의 조건을 흉내내기 위해서 5%(w/w)의 리소자임 및 유장 단백질(다비스코의 바이프로(Bipro))의 용액을 맥 이반 완충액(0.2M 시트르산 + Na2HPO4)에서 펩신(리소자임 또는 유장 단백질의 중량에 대한 1중량%의 시그마 펩신)과 함께 pH 4에서 37℃에서 2시간동안 항온처리하였다. 두가지 용액을 5분간 80℃에서 가열하여 반응을 종결한후, 소량의 시료를 SDS-PAGE(재료 및 방법 부분 참조)에 가하여 다양한 펩신 처리된 분자의 일체성을 시험하였다.
도 9는 손상되지 않은 달걀 리소자임의 양이 산성 pH 조건하에서 펩신과 함께 항온처리됨으로써 유의하게 감소되지 않는다는 것을 명확하게 나타낸다. 유장 단백질인 베타-락토글로불린 및 알파-락트알부민 중에서, 베타-락토글로불린은 거의 손상되지 않고 보존되지만, 알파-락트알부민은 거의 완전히 분해된다. 이는 베타-락토글로불린뿐만 아니라 리소자임이 재료 및 방법 부분에서 규정된 시험에 따라 "프로테아제 내성"이고, 알파-락트알부민이 "프로테아제 내성"이 아님을 의미한다. 이 발견은, 리소자임과는 달리, 알파-락토알부민이 폴리펩타이드 결합된 트립토판의 적합한 공급원으로 간주되지 않음을 입증한다. 베타-락토글로불린이 펩신 분해에 대해 상당히 내성이라는 사실에도 불구하고, 이 분자는 Trp/LNAA 비(0.04)가 매우 낮기 때문에 적합한 트립토판 공급자가 아니다.
실시예 11
리소자임 가수분해물을 손상되지 않은 분자와 조합함으로써 연장된 높은 Trp/LNAA 수준
펩타이드-결합된 트립토판 조성물과 폴리펩타이드-결합된 트립토판 조성물의 조합의 이점을 입증하기 위해, 15명의 건강한 개인을 포함한 연구를 수행하였다. 배제 기준은 다음과 같다: 만성 질환자 및 조사자의 판단에 따랐을 때 현재 아픈 사람; 정신 질환 병력; 선택적 세로토닌 재흡수 억제제(SSRI) 이용; 중추신경계를 표적으로 하는 보충제, 예를 들면 트립토판, 에페드린 또는 세인트 존스 워쓰 함유 보충제 이용; 달걀 알레르기; 약물 남용; 조사 또는 시판되는 제품을 비롯한 임의의 다른 연구에 동시 참가; 인공 감미제에 대한 과민성; 조사자의 판단에 따랐을 때 위장 기능을 간섭하는 임의의 위장 질병(의 병력); 위장관을 표적으로 하는 약물, 예를 들면 제산제의 이용. 최종적으로, 여성의 경우, 임신 또는 의학적으로 허용되지 않는 피임 방법의 이용이 또한 배제 기준이다. 실험에 참가하는 모든 대상자는 사전 동의서 형식에 서명하였다.
방법
본 연구는 상이한 처리제의 섭취 사이에 적어도 3일의 세척 기간을 가지며, 무작위의 이중 맹검의 교차 디자인에 따라 수행되었다.
3회의 실험일 아침 회합동안, 대상자는 6g의 손상되지 않은 리소자임, 6g의 리소자임 가수분해물 또는 6g의 가수분해물과 손상되지 않은 제품의 혼합물중 하나를 함유하는 음료를 섭취한 후 혈장 Trp/LNAA 농도를 모니터링하기 위해 실험실을 방문하였다. 음료는 빨대가 있는 병 중의 멸균된 제품으로 제공되었다. 손상되지 않은 리소자임을 델보자임(Delvozyme) G로서 수득하였다. 실시예 7에 개시된 바와 같이 가수분해물을 제조하고, 혼합물에는 가수분해물로서의 Trp 30몰% 및 손상되지 않은 리소자임으로서의 Trp 70몰%가 혼입되었다. 모든 음료는 6g의 리소자임 유래된 단백질, 0.10g의 감미제(아세설팜)를 함유하고, 300ml 음료가 되도록 물을 채웠다. 연구 보조자는 상이한 음료의 투여가 수행되는 식이 조건을 모른다.
대상자는 최소한 8시간동안 금식한 후 아침 8시와 9시 사이에 현장을 방문하였다. 혈액 채취용 가요성 캐뉼라를 덜 쓰는 팔뚝에 삽입하였다. 3가지 실험 음료중 하나를 섭취한 후, 혈액 시료를 섭취 전(t=0) 및 섭취한지 15분, 30분, 60분, 90분, 120분, 180분, 210분 및 240분 후에 채취하여 혈장 Trp/LNAA 비를 측정하였다. 이들 240분 동안, 물이 아닌 임의의 음식 또는 음료의 섭취는 금지되었다.
혈장 측정
약 5ml의 혈액을 리튬 헤파린 혈액 관에 수집하고, 흔들고, 즉시 얼음에 넣었다. 그런 다음, 시료를 원심분리하고, 750㎕ 혈장을 5-SSA(4mg/100ml 혈장)와 혼합하였다.
이들 용액을 13,000rpm에서 5분동안 원심분리하고, 20㎕의 상층액에 40㎕의 내부 표준물(2L의 1.2mM HCl 중의 160mg의 알파-알미노-아디프산)을 첨가하였다. 50㎕의 보레이트 완충액(워터스 AccQ.Tag 키트 제품 번호 186003836에 포함됨), 40㎕의 0.4M NaOH 및 20㎕의 시약(워터스 AccQ.Tag 키트 제품 번호 186003836에 포함됨)을 첨가하고, 혼합하고, 55℃에서 10분동안 가열하였다. 후속적으로 1㎕를 컬럼에 주입하고, 문헌[van Eijk et al., J. Chromatogr. 1993: 620: 143-148]에 개시된 바와 같이 분석을 진행하였다.
결과
3가지의 상이한 처리시 시간의 변수로서의 혈장 Trp/LNAA 비를 도 10에 나타내었다. 3가지 처리 모두 Trp/LNAA 비를 증가시켰다. 리소자임 가수분해물을 섭취한 후 가장 빠르고(15분 이내) 가장 가파른 증가가 관찰되었다. 손상되지 않은 리소자임은 Trp/LNAA 비를 훨씬 더 느리게 증가시켰지만, 또한 시간 경과에 따른 Trp/LNAA 비의 감소가 훨씬 더 느렸다. 손상되지 않은 리소자임과 가수분해된 리소자임의 혼합물은 중간 결과를 낳았다.
"반복 측정" 분석에서, 3개의 처리 모두 시간 상호작용에 의해 유의하게 상이한 처리(P<0.001)를 나타내었고, 이는 3개의 곡선 모두가 상당히 다른 형태를 가짐을 나타낸다. 3개의 생성물 모두가 정확하게 동일한 "곡선 아래 면적" 값을 나타낸다는 것이 리소자임 가수분해물과 손상되지 않은 가수분해물 둘 모두가 완전히 소화되어 혈액으로 흡수됨을 나타낸다는 점에 주목할 만하다.
실시예 12
리소자임 가수분해물과 손상되지 않은 리소자임의 조합은 최종 생성물의 맛을 개선한다
리소자임 가수분해물을 손상되지 않은 분자와 혼합시키면, 최종 생성물의 맛 표현에서의 상당한 변화가 주목되었다. 하기 비의 가수분해물과 손상되지 않은 분자가 4g/200ml의 물의 최종 농도로 제조되었다:
- 100% 리소자임 가수분해물
- 70% 리소자임 가수분해물 - 30% 리소자임
- 50% 리소자임 가수분해물 - 50% 리소자임
- 30% 리소자임 가수분해물 - 70% 리소자임
이들 모든 조합에서, 트립토판의 최종 몰 농도는 정확하게 동일하였다. 가수분해물을 실시예 7에서 개시된 바와 같이 제조하였고, 손상되지 않은 리소자임으로는 델보자임 G 과립 제품을 이용하였다.
가수분해물 그 자체의 맛이 약간 쓴 반면, 비-가수분해된 생성물을 첨가하면 이 쓴 맛이 증가되게 차폐되고, 이 쓴 맛은 좀처럼 사라지지 않는 약간 단 맛 느낌으로 보상된다. 맛에 대한 숙련된 시험 패널은 순수한 가수분해물보다 가수분해물/손상되지 않은 리소자임 혼합물을 선호하였다.

Claims (14)

  1. - 수용성이고, 0.1 초과의 Trp/LNAA 몰비를 갖는 펩타이드-결합된 트립토판 조성물, 유리 트립토판, 또는 둘 모두; 및
    - 수용성이고, 0.15 초과의 Trp/LNAA 몰비를 갖는 폴리펩타이드-결합된 트립토판 조성물
    을 함께 모으는 단계를 포함하는, 기분 또는 각성 상태를 예방하거나 치료하기 위한 제제의 제조 방법으로서,
    상기 제제가 AW 또는 GNW를 포함하는, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    리소자임 또는 알파 락트알부민을 가수분해함으로써 5 내지 45의 가수분해도(DH)를 갖는 가수분해물을 제조하는 단계, 및 가수분해물을 분획화, 풍부화 또는 정제하는 단계에 의해, 펩타이드-결합된 트립토판 조성물을 수득하는, 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    폴리펩타이드-결합된 트립토판이 리소자임인, 방법.
  4. 트립토판과 AW 또는 GNW를 포함하는, 기분 또는 각성 상태를 예방하거나 치료하기 위한 제제로서,
    10 내지 90몰%의 트립토판이 펩타이드-결합된 트립토판, 유리 트립토판, 또는 둘 모두로 존재하고,
    10 내지 90몰%의 트립토판이 폴리펩타이드-결합된 트립토판으로 존재하는,
    제제.
  5. 제 4 항에 있어서,
    펩타이드-결합된 트립토판의 30몰% 초과가 다이펩타이드 또는 트라이펩타이드의 형태로 존재하는, 제제.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    폴리펩타이드-결합된 트립토판의 30몰% 초과가, 리소자임인 손상되지 않은 단백질로서 존재하는, 제제.
  7. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    수용성인 하나 이상의 트립토판-함유 펩타이드를 포함하거나, 또는 수용성인 펩타이드-결합된 트립토판 분획이 0.10 이상의 Trp/LNAA 몰비를 갖는, 제제.
  8. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    다이펩타이드 또는 트라이펩타이드에서 선택된 하나 이상의 트립토판-함유 펩타이드를 포함하고, 이에 의해 다이펩타이드 또는 트라이펩타이드에서 선택된 트립토판-함유 펩타이드가 다이펩타이드 및 트라이펩타이드의 총 양의 5몰% 이상의 양으로 존재하는, 제제.
  9. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    리소자임 가수분해물의 수용성 분획을 포함하는, 제제.
  10. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    제 1 항 또는 제 2 항의 방법에 의해 수득되는, 제제.
  11. 기분 또는 각성 상태를 예방하거나 치료하기 위한 제제를 제조하기 위하여 사용되는, 트립토판과 AW 또는 GNW를 포함하는 조성물로서,
    10 내지 90몰%의 트립토판이 펩타이드-결합된 트립토판, 유리 트립토판, 또는 둘 모두로 존재하고,
    10 내지 90몰%의 트립토판이 폴리펩타이드-결합된 트립토판으로 존재하는, 조성물.
  12. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    제 4 항 또는 제 5 항에 따른 제제를 섭취하기 직전의 혈장 Trp/LNAA 몰비, 또는 제 4 항 또는 제 5 항에 따른 제제를 섭취하지 않았을 때의 혈장 Trp/LNAA 몰비와 비교하였을 때, 15분 내지 240분의 기간 동안 혈장 Trp/LNAA 몰비를 증가시키기 위해 사용하기 위한, 제제.
  13. 삭제
  14. 삭제
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