EA029869B1 - Способ получения обогащенного триптофаном гидролизата лизоцима и композиция, содержащая гидролизат - Google Patents

Способ получения обогащенного триптофаном гидролизата лизоцима и композиция, содержащая гидролизат Download PDF

Info

Publication number
EA029869B1
EA029869B1 EA201400526A EA201400526A EA029869B1 EA 029869 B1 EA029869 B1 EA 029869B1 EA 201400526 A EA201400526 A EA 201400526A EA 201400526 A EA201400526 A EA 201400526A EA 029869 B1 EA029869 B1 EA 029869B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
tryptophan
lysozyme
hydrolyzate
ratio
composition
Prior art date
Application number
EA201400526A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201400526A1 (ru
Inventor
Синдерелла Кристина Герхардт
Люппо Эденс
Original Assignee
ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. filed Critical ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Publication of EA201400526A1 publication Critical patent/EA201400526A1/ru
Publication of EA029869B1 publication Critical patent/EA029869B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/08—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from eggs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/30—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis
    • A23J3/32—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents
    • A23J3/34—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/30—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis
    • A23J3/32—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents
    • A23J3/34—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes
    • A23J3/341—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of animal proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A61K31/405—Indole-alkanecarboxylic acids; Derivatives thereof, e.g. tryptophan, indomethacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/26—Psychostimulants, e.g. nicotine, cocaine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

Изобретение касается способа получения обогащенного триптофаном гидролизата лизоцима, имеющего высокое содержание триптофана и низкое содержание больших нейтральных аминокислот (LNAA) и высокое содержание аргинина и лизина, включающего стадии ферментативного гидролиза лизоцима в щелочных условиях для получения гидролизата с выходом более чем 30% триптофана из лизоцима и имеющего уровень свободного триптофана менее чем 1 вес.% в расчете на сухое вещество от общего количества триптофана в гидролизате, ультрафильтрации полученного гидролизата и обогащения гидролизата после ультрафильтрации с помощью ионообменной хроматографии при рН около 3. В прелпочтительном варианте осуществления лизоцим представляет собой лизоцим куриных яиц. Настоящее изобретение также касается композиции, содержащей обогащенный триптофаном гидролизат лизоцима, полученный согласно способу по изобретению, предназначенной для увеличения отношения триптофана к сумме тирозина, фенилаланина, лейцина, изолейцина и валина (отношение Trp/LNAA) в плазме крови и поддержания этого отношения в течение периода времени от 15 до 240 мин.

Description

Настоящее изобретение также касается композиции, содержащей обогащенный триптофаном гидролизат лизоцима, полученный согласно способу по изобретению, предназначенной для увеличения отношения триптофана к сумме тирозина, фенилаланина, лейцина, изолейцина и валина (отношение Т^р/^NΑΑ) в плазме крови и поддержания этого отношения в течение периода времени от 15 до 240 мин.
029869
Область техники
Настоящее изобретение касается касается способа получения обогащенного триптофаном гидролизата лизоцима, имеющего высокое содержание триптофана и низкое содержание больших нейтральных аминокислот (ΕΝΑΑ) и высокое содержание аргинина и лизина, и композиции, содержащей предложенный гидролизат, предназначенной для увеличения отношения триптофана к сумме тирозина, фенилаланина, лейцина, изолейцина и валина (отношение Ττρ/ΕΝΑΑ) в плазме крови и поддержания этого отношения в течение периода времени от 15 до 240 мин.
Уровень техники
Уровни серотонина в мозге коррелируют с настроением, внимательностью, активностью, засыпанием и качеством сна, эффектами, снижающими тревожность, депрессией, эмоциональным контролем, аппетитом и половым поведением. Имеется множество публикаций, в которых изменения в уровнях серотонина в мозге коррелируют с доступностью натуральной аминокислоты Ь-триптофана (Тгр или V). Поскольку такая корреляция существует, способы повышения уровней триптофана в плазме крови привлекают пристальное внимание. Сообщалось, что количество триптофана около 1 г в день на индивидуума обеспечивает клинически достоверные эффекты (Маткик с( а1., Αт. 1 С1т. ΝιιΙγ 2005;81, 1026-1033). Один из способов увеличения уровней триптофана в плазме крови включает употребление белковых препаратов, обогащенных белком молочной сыворотки альфа-лактальбумином. Препараты альфа-лактальбумина легко доступны и содержат относительно высокую концентрацию триптофана. Однако подходы, в которых предоставляется альфа-лактальбумин сам по себе, смотри, например, ИЕ 4130284 и ДР 2279700, не учитывают, что основным определяющим фактором уровней триптофана и серотонина в мозге является не концентрация одного триптофана в плазме крови, а так называемое отношение Ττρ/ΕΝΑΑ (Регпкйот апй Уиптап. 8с1епсе 1971, 173, 149-152). Это отношение Ττρ/ΕΝΑΑ представляет собой молярное отношение триптофана к уровням Больших Нейтральных Аминокислот (Ьатде №и1та1 Λιηίηο Лайл ΕΝΑΑ, то есть к сумме тирозина, фенилаланина, лейцина, изолейцина и валина) в плазме крови. Эти ΕΝΑΑ конкурируют с триптофаном за поступление в мозг, вероятно из-за того, что используется один и тот же механизм транспорта через гематоэнцефалический барьер.
Таким образом, самым эффективным путем увеличения концентраций триптофана в мозге является применение препаратов с высоким отношением Ττρ/ΕΝΑΑ. Большое число публикаций, в частности УО 02/46210, посвящено получению пептидных фракций из альфа-лактальбумина, имеющих улучшенные отношения Ττρ/ΕΝΑΑ.
Применение свободного триптофана, то есть свободной аминокислоты, было бы самым простым и дешевым способом предоставления препаратов с высоким отношением Ττρ/ΕΝΑΑ. Однако во многих странах существует законодательство, которое строго регулирует применение свободного триптофана. Максимально допустимые уровни свободного триптофана в разных лекарственных формах в разных странах варьируют. Для обеспечения поставки дополнительного пищевого триптофана в более натуральном виде более новые подходы имеют целью предоставление богатых триптофаном белков. Как отмечалось выше, альфа-лактальбумин, а также его гидролизаты приобрели популярность в качестве безопасного способа для повышения уровней триптофана в сыворотке крови. Однако применение альфалактальбумина в качестве отправной точки для богатых триптофаном препаратов несет с собой недостатки в плане максимальных отношений Ττρ/ΕΝΑΑ и стоимости. Альфа-лактальбумин и беталактоглобулин являются основными белковыми компонентами молочной сыворотки. Поскольку полное разделение альфа-лактальбумина и бета-лактоглобулина в промышленном масштабе является трудновыполнимым, из этого следует, что экономически приемлемые по затратам препараты альфалактальбумина будут содержать также и бета-лактоглобулин. В то время как альфа-лактальбумин имеет молярное содержание триптофана 5,3%, содержание триптофана в бета-лактоглобулине составляет только 2%. В то время как альфа-лактальбумин имеет молярное отношение Ττρ/ΕΝΑΑ 0,11, беталактоглобулин имеет молярное отношение Ττρ/ΕΝΑΑ не более, чем 0,04. Таким образом, очевидно, что любое загрязнение препаратов альфа-лактальбумина бета-лактоглобулином будет существенно снижать отношение Ττρ/ΕΝΑΑ в конечном продукте.
С учетом высокой заинтересованности в препаратах, которые модулируют уровни серотонина в мозге, имеется потребность в улучшенных способах производства белковых и пептидных препаратов, обладающих высоким отношением Ττρ/ΕΝΑΑ, которые можно широко применять в различных пищевых продуктах и нутрицевтиках.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение касается способа получения обогащенного триптофаном гидролизата лизоцима, имеющего высокое содержание триптофана и низкое содержание больших нейтральных аминокислот (ΕΝΑΑ) и высокое содержание аргинина и лизина, включающий стадии
ферментативного гидролиза лизоцима в щелочных условиях для получения гидролизата с выходом более чем 30% триптофана из лизоцима и имеющего уровень свободного триптофана менее чем 1 вес.% в расчете на сухое вещество от общего количества триптофана в гидролизате, ультрафильтрации полученного гидролизата и
обогащения гидролизата после ультрафильтрации с помощью ионообменной хроматографии при
- 1 029869
рН около 3.
В предпочтительном варианте осуществления лизоцим представляет собой лизоцим куриных яиц.
Настоящее изобретение также касается композиции, содержащей обогащенный триптофаном гидролизат лизоцима, полученный согласно способу по изобретению, предназначенной для увеличения отношения триптофана к сумме тирозина, фенилаланина, лейцина, изолейцина и валина (отношение Тгр/ΕΝΑΑ) в плазме крови и поддержания этого отношения в течение периода времени от 15 до 240 мин.
Осуществление изобретения
Предлагаемая содержащая триптофан композиция включает две четко различающиеся фракции, которые при пероральном приеме обеспечивают высокие отношения Тгр/ΕΝ АА в плазме крови в течение длительного времени. Одна фракция включает связанный триптофан в составе пептидов, и, следовательно, содержащий триптофан пептид находится в легко абсорбируемой форме низкомолекулярных пептидов, или свободный триптофан. Эта фракция в случае содержащего триптофан пептида включает большое количество ди- и трипептидов, содержащих триптофан. Другая фракция включает связанный триптофан в составе полипептидов, и, следовательно, содержащий триптофан полипептид, предпочтительно находящийся в форме интактного белка, после перорального приема высвобождает содержащийся в нем триптофан только очень медленно. Таким образом, настоящая заявка на изобретение описывает новую комбинацию этих двух богатых триптофаном фракций, которая при пероральном употреблении быстро повышает и поддерживает высокие уровни Тгр/ΕΝΑΑ в плазме крови в течение более длительного времени по сравнению с применением только пептидной фракции, содержащей триптофан. Связанный триптофан в составе пептидов, присутствующий в низкомолекулярной фракции, предпочтительно происходит из лизоцима куриных яиц, связанный триптофан в составе полипептидов или высокомолекулярная фракция предпочтительно представляет собой лизоцим, например интактный лизоцим куриных яиц, или другой источник связанного триптофана в составе полипептидов, такой как интактный белок с высоким отношением Тгр/ΕΝΑΑ. Предпочтительно полипептид, содержащий триптофан, представляет собой белок, который может противостоять протеолитическому расщеплению в условиях желудка. Предпочтительно такой связанный триптофан в составе полипептида, такого как интактный белок, подобно интактному лизоциму может противостоять протеолитическому расщеплению в условиях желудка, как описано в тесте на устойчивость к протеазам (смотри Материалы и Методы).
Легко поглощаемая содержащая триптофан пептидная фракция является предпочтительно растворимой в воде, имеет предпочтительно значение ΌΗ (степени гидролиза) выше, чем 15, более предпочтительно значение ΌΗ выше, чем 20, отношение Тгр/ΕΝΑΑ больше, чем 0,10, предпочтительно больше, чем 0,15, и предпочтительно включает пептиды Αν (как дипептид) или ΟΝν (как трипептид), боле предпочтительно Αν и ΟΝν. Примерами пригодной содержащей триптофан пептидной фракции являются гидролизаты лизоцима и альфа-лактальбумина, гидролизат лизоцима является предпочтительной содержащей триптофан пептидной фракцией.
Фракция связанного триптофана в составе полипептидов, предоставляющая триптофан с более медленной скоростью, обычно имеет значение ΌΗ ниже 10, предпочтительно ниже 5. Интактный белок имеет значение ΌΗ, равное 0. Фракция связанного триптофана в составе полипептидов предпочтительно является растворимой в воде. Более того, фракция связанного триптофана в составе полипептидов имеет отношение Тгр/ΕΝΑΑ больше, чем 0,15 и устойчива к протеолитическому расщеплению в условиях, преобладающих в желудке человека. Тест ίη уйго для последнего требования представлен в разделе Материалы и Методы настоящей заявки на изобретение.
Как отмечалось выше, композиция настоящего изобретения предпочтительно включает углевод для стимуляции, например, секреции инсулина.
Настоящее изобретение касается композиции, включающей фракцию свободного триптофана или связанного триптофана в составе пептидов, а также фракцию связанного триптофана в составе полипептидов. Фракция связанного триптофана в составе пептидов имеет молярное отношение Тгр/ΕΝΑΑ, по меньшей мере 0,1, предпочтительно по меньшей мере 0,15 и более предпочтительно между 0,15 и 1,8, и включает предпочтительно по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два разных пептида, которые предпочтительно растворимы в воде. Предпочтительно эта композиция включает Αν (как дипептид) или ΟΝν (как трипептид), предпочтительно Αν и ΟΝν, и наиболее предпочтительно Αν и ΟΝν, где молярное отношение Αν к ΟΝν находится между 1 к 2 и 10 к 1, предпочтительно между 1 к 2 и 5 к 1. Более того, содержащие триптофан пептиды богаты триптофаном и включают по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два разных ди- или трипептида, где пептид(ы), выбираемый(ые) из ди- или трипептидов, присутствует(ют) в количестве по меньшей мере 5 мол.% от общего количества ди- и трипептидов, и в составе которых присутствует больше чем 30 мол.%, предпочтительно больше чем 40 мол.%, более предпочтительно больше чем 50 мол.%, еще более предпочтительно больше чем 60 мол.%, все еще более предпочтительно больше чем 70 мол.% и наиболее предпочтительно больше чем 80 мол.% связанного триптофана в составе пептидов в форме ди- или трипептида. Фракция связанного триптофана в составе пептидов предпочтительно представляет собой гидролизат лизоцима или очищенный или фракционированный гидролизат лизоцима. Мы обнаружили, что этот гидролизат согласно настоящему изобретению быстро генерирует высокие отношения Тгр/ΕΝΑΑ в плазме крови ίη νΐνο. Со- 2 029869
вершенно неожиданно было обнаружено, что отношения Ττρ/ΕΝΑΑ, определяемые в плазме крови, были выше, чем отношение Ττρ/ΕΝΑΑ в исходном гидролизате, когда он принимался в достаточно высокой дозе. Достаточно высокая доза представляет собой предпочтительно дозу больше чем 10 г, больше чем 12 г или больше чем 14 г гидролизата лизоцима. Еще одним преимуществом этой фракции является то, что содержащие триптофан пептиды являются очень маленькими, так что даже в комбинации с богатыми белком продуктами с менее предпочтительными отношениями Ττρ/ΕΝΆΛ, гидролизат можеп немедленно генерировать высокие отношения Ττρ/ΕΝΆΛ в плазме крови. Композиция настоящего изобретения может дополнительно включать свободный триптофан, например, свободный триптофан может быть добавлен в композицию. Предпочтительно эта композиция не содержит больше, чем 1% (по весу, в расчете на сухое вещество) свободного триптофана в том случае, когда в ней присутствует связанный триптофан в составе пептидов.
Предпочтительно фракция связанного триптофана в составе полипептидов имеет молярное отношение Ττρ/ΕΝΆΛ больше чем 0,15, предпочтительно между 0,15 и 0,5, интактный лизоцим имеет отношение Ττρ/ΕΝΆΛ равное 0,23. При употреблении в пищу, фракция связанного триптофана в составе полипептидов также обеспечивает появление связанного триптофана в составе пептидов, однако связанный триптофан в составе пептидов, который образуется ίη νίνο из фракции связанного триптофана в составе полипептидов, становится доступным для всасывания в кишечнике гораздо позже, чем связанный триптофан в составе пептидов из фракции связанного триптофана в составе пептидов. Преимуществом является и то, что всасывание в кишечнике связанного триптофана в составе пептидов, образующихся из фракции связанного триптофана в составе полипептидов, происходит гораздо позже по времени, чем всасывание в кишечнике свободного триптофана или связанного триптофана в составе пептидов из фракции связанного триптофана в составе пептидов в том случае, когда обе фракции употребляются одновременно. Мы обнаружили, что такое замедленное высвобождение триптофана может быть достигнуто путем перорального приема интактных белков, которые устойчивы к ферментативному гидролизу в желудке человека. Предпочтительно такие интактные белки имеют высокое отношение Ττρ/ΕΝΆΛ.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения вкус композиции смесей гидролизованного лизоцима и (интактного) лизоцима является улучшенным по сравнению с композицией, включающей гидролизованный лизоцим без (интактного) лизоцима.
Другим аспектом настоящего изобретения является применение лизоцима или композиции, которая включает фракцию свободного триптофана или связанного триптофана в составе пептидов в комбинации со связанным триптофаном в составе полипептидов и необязательно углеводом для улучшения настроения, облегчения пременструального синдрома (РМ§), улучшения познавательных способностей, активности, внимательности, засыпания и качества сна, снижения тревожности, депрессии, улучшения эмоционального контроля или полового поведения, или для применения в качестве ингредиента в производстве пищевых продуктов, корма для домашних животных, кормов, пищевой добавки или композиции нутрицевтика для улучшения настроения, улучшения познавательных способностей, аппетита, активности, внимательности, засыпания и качества сна, снижения тревожности, депрессии, улучшения эмоционального контроля или полового поведения. Помимо свободного триптофана или связанного триптофана в составе пептидов, связанного триптофана в составе полипептидов и необязательно углевода, композиция может также включать соединения, рекомендованные для "питания" мозга, для облегчения стресса или депрессии или для улучшения внимания, настроения, познавательных способностей или характера сна.
Раскрывается пищевой продукт (включая питание для новорожденных), корм для домашних животных, корма, пищевая добавка или композиция нутрицевтика, включающие композицию настоящего изобретения или полученную согласно способу настоящего изобретения, или предпочтительно композицию согласно настоящему изобретению, включающую пептиды ΟΝΑ (как трипептид), §А (как дипептид) или ДА (как дипептид) в комбинации с интактным лизоцимом куриных яиц.
Согласно другому воплощению раскрывается применение содержащей триптофан композиции настоящего изобретения для повышения отношения Ττρ/ΕΝΆΛ в плазме крови в пределах 90 мин, предпочтительно в пределах 60 мин, более предпочтительно в пределах 30 мин и наиболее предпочтительно в пределах 15 мин после приема внутрь пептидов или композиции, или для производства композиции нутрицевтика для повышения отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови в пределах 90 мин, предпочтительно в пределах 60 мин, более предпочтительно в пределах 30 мин и наиболее предпочтительно в пределах 15 мин после приема внутрь композиции. Согласно еще одному воплощению раскрывается применение содержащей триптофан композиции настоящего изобретения для поддержания повышенного отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови на периоды после 90 мин, предпочтительно между 120 и 240 мин, более предпочтительно после 150 мин после приема внутрь композиции. Согласно еще одному другому воплощению раскрывается применение лизоцима или содержащей триптофан композиции настоящего изобретения для производства композиции нутрицевтика для поддержания повышенного отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови на периоды после 90 мин, предпочтительно между 120 и 240 мин, более предпочтительно после 150 мин после приема внутрь композиции.
Настоящее изобретение предоставляет композицию, включающую триптофан в виде свободного
- 3 029869
триптофана и/или в связанной форме в составе пептидов, который очень хорошо обеспечивает эффективное повышение отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови через очень короткий промежуток времени, и связанный триптофан в составе полипептидов для поддержания высокого отношения Ττρ/ΕΝΆΛ в плазме крови в течение более продолжительного периода времени по сравнению с ситуацией, когда в композиции отсутствует связанный триптофан в составе полипептидов. Этот эффект особенно заметен в интервале от 90 до 240 мин после приема внутрь композиции настоящего изобретения. Мы подчеркиваем, что эти две включающие триптофан фракции в комбинации с углеводом вносят свой вклад в быстро достигаемое и продолжительное повышение отношения Ττρ/ΕΝΆΛ.
Согласно одному аспекту настоящего изобретения легко всасываемый, связанный триптофан в составе пептидов может быть получен из лизоцима, предпочтительно лизоцима куриных яиц, путем ферментативного (пре-)гидролиза в промышленном способе, то есть лизоцим (куриных яиц) предпочтительно предоставляется в форме гидролизата. При предоставлении в форме гидролизата всасывание в желудочно-кишечном тракте соодержащих триптофан пептидов значительно облегчается. Фракция связанного триптофана в составе полипептидов предпочтительно представлена интактным белком с высоким отношением Ττρ/ΕΝΆΛ, который не деградирует или только незначительно деградирует в желудке человека. Предпочтительно этот интактный белок представляет собой лизоцим куриных яиц. Альфалактальбумин из коровьего молока, который часто применяется для повышения отношений Ττρ/ΕΝΆΛ в плазме крови, не может рассматриваться в качестве подходящего источника связанного триптофана в составе полипептидов, поскольку эта молекула имеет более низкое отношение Ττρ/ΕΝΆΛ, чем лизоцим. Композиция согласно настоящему изобретению характеризуется присутствием смеси легко всасываемого свободного триптофана и/или связанного триптофана в составе пептидов, таких как гидролизат лизоцима, и связанного триптофана в составе полипептидов, устойчивых к протеазам, таких как интактный белок, предпочтительно лизоцим. Не обязательно данная композиция может включать углевод или свободный триптофан. Предпочтительно композиция настоящего изобретения производится путем смешивания свободного триптофана и/или связанного триптофана в составе пептидов, предпочтительно в виде гидролизата, и связанного триптофана в составе полипептидов, предпочтительно в виде интактного белка, такого как лизоцим, в весовых отношениях (измеренных на сухой вес белка) в диапазоне от 1:3 до 1:0,2. Более предпочтительно композиция включает гидролизат и интактный белок в отношениии на сухой вес белка от 1:1 до 1:0,4. Как легко всасываемая фракция, так и устойчивая к протезам белковая фракция характеризуются молекулярными отношениями Ττρ/ΕΝΆΛ выше чем 0,10, предпочтительно выше чем 0,15. Композиции могут предоставляться в виде порошков, жидкостей или паст. Жидкости или пасты могут иметь нейтральные или кислые значения рН. Предпочтительно смеси имеют значение рН ниже 5, более предпочтительно ниже 4.
В еще одном воплощении настоящего изобретения лизоцим куриных яиц превращается в гидролизат, включающий пептидную композицию, в которой больше, чем 50 молярных %, предпочтительно больше, чем 60 мол.%, более предпочтительно больше чем 75 мол.% содержащихся в ней пептидов имеют молекулярный вес меньше 500 Да. При этом распределение по молекулярным весам пептидов в гидролизате должно проводиться так, как это описано в разделе Материалы и Методы настоящей Заявки на изобретение.
Важным преимуществом легко всасываемой фракции является то, что триптофан, находящийся в виде свободного триптофана или в составе ди- и трипептидов, транспортируется через стенку кишечника в кровоток немедленно после перорального употребления. Как следствие, уровни триптофана в плазме крови возрастают практически сразу, что оказывает прямой эффект на уровни серотонина в мозге. Данные, представленные в примерах 6 и 11 настоящей заявки на изобретение, показывают, что остатки триптофана, представленные в форме таких ди- и трипептидов, очень быстро обеспечивают высокие отношения Ττρ/ΕΝΆΛ. С этой точки зрения, вероятно, остатки триптофана, представленные в форме этих ди- и трипептидов, являются даже более эффективными, чем свободный триптофан. Согласно способу настоящего изобретения получаемая водорастворимая пептидная фракция имеет значение молекулярного отношения Ττρ/ΕΝΑΑ по меньшей мере 0,1, предпочтительно по меньшей мере 0,15, при условии, что анализ аминокислотного состава гидролизата проводится так, как это описано в разделе Материалы и Методы настоящей Заявки на изобретение.
Еще одним важным преимуществом предоставления триптофана в форме ди- и трипептидов является то, что поглощение этих пептидов в желудочно-кишечном тракте происходит настолько быстро, что они могут употребляться в комбинации с другой содержащей белки пищей, такой как молочные продукты, которые обычно имеют менее желательное отношение Ττρ/ΕΝΑΑ, и кроме того, обеспечивают эффективное увеличение отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови уже в течение периода 90 мин, предпочтительно 60 мин, более предпочтительно 30 мин после употребления.
Таким образом, настоящее изобретение предоставляет применение лизоцима и/или композиции настоящего изобретения для получения повышенного отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови в течение 90 мин, предпочтительно 60 мин, более предпочтительно 30 мин после употребления пептидов, или для производства композиции нутрицевтика для получения повышенного отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови в течение 90 мин, предпочтительно 60 мин, более предпочтительно 30 мин после употребления
- 4 029869
пептидов. Повышенное отношение Тгр/ΕΝΑΑ в тексте настоящего изобретения означает повышение этого отношения по сравнению с ситуацией до приема или употребления композиции настоящего изобретения.
Термин "белок" или "полипептид" в используемом здесь значении означает цепь, включающую более чем 30 аминокислотных остатков.
Термин "интактный белок" или "интактный полипептид" в используемом здесь значении означает белок с молекулярным весом, идетичным молекулярному весу природного белка при их сравнении методом δΌδ-РЛОЕ (электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия), который описан в разделе Материалы и Методы.
"Устойчивость к протеазам" интактного белка определяется так, как это описано в разделе Материалы и Методы.
Термин "пептид" или "олигопептид" в используемом здесь значении означает цепь из по меньшей мере двух аминокислот, которые связаны друг с другом пептидной связью. Термины "пептид" и "олигопептид" рассматриваются как синонимы (как это обычно делается) и каждый термин может использоваться взаимозаменяемо, как требуется по контексту.
Под композицией или фракцией (фракция и композиция в данном контексте используются взаимозаменяемо), содержащей триптофан в составе пептидов или пептиды, содержащие триптофан, подразумевается композиция, которая включает по меньшей мере один пептид, содержащий триптофан. В тексте настоящего изобретения композиция, содержащая триптофан в составе пептидов или пептиды, содержащие триптофан, может включать только один пептид, предпочтительно эта композиция включает более, чем один пептид. Под композицией или фракцией (фракция и композиция в данном контексте используются взаимозаменяемо), содержащей триптофан в составе полипептидов или полипептиды, содержащие триптофан, подразумевается композиция, которая включает, по меньшей мере, один полипептид, содержащий триптофан. В тексте настоящего изобретения композиция, содержащая триптофан в составе полипептидов или полипептиды, содержащие триптофан, может включать только один полипептид.
Пептид, содержащий триптофан, означает пептид, который включает по меньшей мере один аминокислотный остаток триптофана. Полипептид, содержащий триптофан, означает полипептид, который включает по меньшей мере один аминокислотный остаток триптофана.
Под связанным триптофаном в составе пептида подразумевается триптофан, который присутствует в виде аминокислоты в пептиде. Под связанным триптофаном в составе полипептида подразумевается триптофан, который присутствует в виде аминокислоты в полипептиде.
Содержащая триптофан композиция настоящего изобретения включает композицию содержащих триптофан пептидов и композицию содержащих триптофан полипептидов, и, таким образом, будет включать по меньшей мере один содержащий триптофан пептид и по меньшей мере один содержащий триптофан полипептид.
Свободный триптофан означает триптофан в виде свободной аминокислоты и, таким образом, не является частью пептида или полипептида.
"Водорастворимый пептид" представляет собой пептид, который растворим в воде при рН 5,0.
Все формулы (олиго )пептидов и полипептидов или их последовательности написаны здесь слева направо в направлении от аминоконца к карбоксиконцу в соответствии с общепринятой практикой. Используемый здесь однобуквенный код для обозначения аминокислот широко известен в данной области техники и может быть найден в ЗатЬгоок, с1 а1. (Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, 2"'1 ей. Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬогаЮгу, Со1й §ргшд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргезз, Со1й §ргшд НагЬог, ΝΥ, 1989).
Под белковым гидролизатом, гидролизатом или гидролизованным белком подразумевается продукт, который получен путем ферментативного гидролиза белка, обогащенный или фракционированный гидролизат представляет собой фракцию белкового гидролизата, например, обогащенную определенными пептидами, или в которой пептиды или полипептиды были удалены из гидролизата. Таким образом, обогащенный гидролизат представляет собой предпочтительно смесь пептидов (или пептидную смесь). Таким образом, пептидная смесь настоящего изобретения представляет собой смесь, по меньшей мере, двух, предпочтительно, по меньшей мере, трех, более предпочтительно, по меньшей мере, четырех пептидов, содержащих триптофан. Более предпочтительно смесь включает пептидную композицию, в которой больше, чем 50 мол.%, предпочтительно даже больше чем 60 мол.% и наиболее предпочтительно больше чем 75 мол.% имеющихся пептидов имеют молекулярный вес меньше 500 Да. Отношение Тгр/ΕΝΑΑ представляет собой молярное отношение триптофана по отношению к уровням других Больших Нейтральных Аминокислот (Ъагде №и!га1 Лпппо Ас1Й8, ΕΝΑΑ:, то есть, сумма тирозина, фенилаланина, лейцина, изолейцина и валина). За исключением отношения Тгр/ΕΝΑΑ в плазме крови, отношение Тгр/ΕΝΑΑ касается только связанных аминокислот в составе пептидов и/или полипептидов. Для отношения Тгр/ΕΝΑΑ в плазме крови отношение Тгр/ΕΝΑΑ касается свободных аминокислот. Таким образом, свободные триптофан, тирозин, фенилаланин, лейцин, изолейцин и валин не учитываются в отношении Тгр/ΕΝΑΑ.
Связанные аминокислоты в составе пептидов представляют собой аминокислоты, которые являются частью пептидов, а не свободными аминокислотами. Отношение Туг/ВСАА представляет собой мо- 5 029869
лярное отношение тирозина к уровням аминокислот с разветвленной боковой цепью (Вгаисйеб Сйаш Ашшо Лс1б8, ВСАА; то есть, суммалейцина, изолейцина и валина). Предпочтительно отношение Туг/ВСАА выше чем 0,1, предпочтительно выше чем 0,12.
Благоприятные характер и качество сна определяются как спокойный сон, который наступает в пределах 45 мин после отхода ко сну.
Настроение определяется как эмоциональное состояние ума и предпочтительно измеряется с применением Ргой1е о£ Мооб §1а1е8 сщеЛюппаие (см. пример 6 настоящей Заявки на изобретение).
Познавательные (когнитивные) способности определяются как комбинированное умение в таких областях, как принятие решений, обучение, память и языковые навыки.
Аппетит определяется как желание есть, стимулируемое чувством голода.
Бдительность определяется как внимательное или бдительное состояние ума, предпочтительно измеряемое с помощью Маск^ойй С1оск Тек! и СгШса1 Тгаскшд Такк (см. пример 9 настоящей Заявки на изобретение).
Под успокаивающими эффектами понимаются эффекты, которые приводят к устранению чувства страха, опасности или тревоги.
Депрессия определяется как состояние ума, которое характеризуется тяжелым и постоянным чувством остутствия удовольствия.
Термин "половое поведение" в используемом здесь значении является синонимом либидо.
В патенте \УО 02/46210 описан способ для увеличения уровня триптофана в гидролизатах белка молочной сыворотки. В используемом способе сыворотка сначала гидролизуется при кислых значениях рН с применением одной или более кислых протеаз, предпочтительно пепсина, реннина, кислой протеазы грибов, химозина, папаина, бромелаина, химопапаина или фицина. Предпочтительно инкубация проводится при рН между 1,5 и 3,5 и условия подбираются таким образом, чтобы получаемые пептиды имели гидрофобную природу. Гидролиз специально проводится таким образом, чтобы остатки триптофана были в включены в состав больших гидрофобных пептидов. Гораздо меньшее количество остатков триптофана присутствует в составе маленьких, более водорастворимых пептидов. На следующей стадии процесса рН повышается до значений от 4,0 до 6,0 для стимуляции преципитации этих больших пептидов, содержащих триптофан, что облегчает их избирательное извлечение из гидролизата молочной сыворотки. Триптофан присутствует только в относительно больших пептидах, поэтому поступление триптофана в кровь будет замедлено, что ограничивает возможности применения такого препарата в качестве ингредиента пищевых продуктов или напитков, особенно в комбинации с другими белками. Необходимо подчеркнуть, что интактный альфа-лактальбумин не рассматривается как фракция интактного белка согласно настоящему изобретению, поскольку он не является устойчивым к протеазам согласно данным теста, описанного в разделе Материалы и Методы.
Настоящее изобретение раскрывает прсотой способ гидролиза, начинающийся с белка, который является промышленно доступным и характеризуется высоким отношением Тгр/ΓΝΑΑ. Способ гидролиза настоящего изобретения обеспечивает выход более чем 30% триптофана из белка и обеспечивает получение водорастворимой пептидной композиции, включающей триптофан. Тот факт, что большая часть остатков триптофана входит в состав ди- и трипептидов, означает немедленное поступление в кровоток. Как будет раскрыто далее, это свойство позволяет включать гидролизат в большое количество разнообразных пищевых продуктов или нутрицевтиков. Совершенно неожиданно, настоящее изобретение также раскрывает, что при пероральном употреблении гидролизат согласно настоящему изобретению может обеспечивать более высокие отношения Тгр/ΓΝΑΑ в плазме крови, чем отношение Тгр/ΓΝΑΑ в самом гидролизате.
Согласно настоящему изобретению лизоцим куриных яиц применяется в качестве удобного исходного материала для композиции настоящего изобретения с высоким отношением Тгр/ΓΝΑΑ, которая при пероральном употреблении приводит к быстрому и долговременному повышению отношения Тгр/ΓΝΑΑ в крови. Лизоцим присутствует в белке куриных яиц в концентрации 3-4%. С учетом преимуществ его исключительно высокой изоэлектрической точки, лизоцим выделяется в промышленных мастштабах из белка куриных яиц с применением стадии простой катионообменной хроматографии не обязательно с последующей стадией кристаллизации. Получаемый продукт является почти чистым и этот промышленно доступный продукт имеет молекулярное содержание триптофана 7,8% и молекулярное отношение Тгр/ΓΝΑΑ по меньшей мере 0,15. Таким образом, лизоцим, то есть интактный белок, имеет такое отношение Тгр/ΓΝΑΑ, которое значительно выше, чем таковое у альфа-лактальбумина и/или бета- лактоглобулина. Таким образом, гидролизаты лизоцима согласно настоящему изобретению предпочтительно имеют молярное отношение Тгр/ΓΝΑΑ, которое выше чем 0,15, более предпочтительно молярное отношение Тгр/ΓΝΑΑ выше чем 0,20, даже более предпочтительно молярное отношение Тгр/ΓΝΑΑ выше чем 0,23, еще более предпочтительно молярное отношение Тгр/ΓΝΑΑ выше чем 0,25 и наиболее предпочтительно молярное отношение Тгр/ΓΝΑΑ выше чем 0,30. Как правило, молярное отношение Тгр/ΓΝΑΑ является ниже чем 3,0. Таким образом, такой лизоцим является предпочтительным исходным материалом для триптофан-содержащих пептидов или композиций и может применяться в качестве композиции связанного триптофана в составе полипептидов. Лизоцим (ЕС 3.2.1.17) представляет собой фермент, спо- 6 029869
собный гидролизовать специфические пептидогликановые связи в клеточных стенках бактерий, что приводит к лизису клеток. Благодаря своему бактерицидному действию лизоцим играет важную роль в защите хозяина, предотвращая инфекции. В физиологических условиях молекула лизоцима очень устойчива к действию протеаз. Эта необычная устойчивость имеет под собой эволюционную основу: поскольку вторгающиеся в организм бактерии способны секретировать разнообразые протеазы, молекула лизоцима, которая чувствительна к таким протеазам, будет быстро инактивироваться. Его устойчивость к протезам хорошо иллюстрируется, например, лизоцимами желудка жвачных (Όοόδοη с1 а1., 1. ΒίοΙ Сйет. 1984, 259 (18) 11607-11616). Со структурной точки зрения можно ожидать, что наличие в молекуле лизоцима четырех дисульфидных связей вносит свой вклад устойчивость лизоцима к протеазам. На основании данных, представленных в примере 1 настоящего изобретения, лизоцим куриных яиц может считаться настолько устойчивым к протеолитической атаке, что маловероятно, что его молекула может быть эффективно переварена в проксимальной части кишечника человека. Следствием такой устойчивости к протезам является то, что несмотря на очень привлекательное отношение Ττρ/ΕΝΆΛ, интактный лизоцим не является подходящим источником для быстрого повышения уровней триптофана в плазме крови по той простой причине, что в физиологических условиях, имеющихся в желудочно-кишечном тракте, остатки триптофана высвобождаются не очень легко. Однако интактный лизоцим куриных яиц может быть ферментативно гидролизован в условиях, близких к нейтральным значениям рН (Ройет е1 а1., 1. Адпе. Ροοά Сйет. 1984, 32, 334-339). Данные этой статьи согласуются с нашими наблюдениями, согласно которым лизоцим куриных яиц способен высвобождать связанный триптофан в составе пептидов в нижних отделах желудочно-кишечного тракта. В комбинации с упоминавшимся выше легко доступным "заранее переваренным" гидролизатом лизоцима, это обеспечивает неожиданную возможность создания препарата, который при пероральном употреблении приводит к быстрому повышению отношения Ττρ/ΡΝΑΑ в плазме крови и к последующему медленному и продолжительному высвобождению триптофана, входящему в состав пептидов. Эти кинетические особенности воспроизводятся в уровнях Ττρ/ΡΝΑΑ в плазме крови, обеспечивая новые и неожиданные эффекты на содержание серотонина и дофамина в мозге.
При употреблении в качестве пищи, белки, содержащиес я впищевых продуктах, постепенно гидролизуются на более мелкие фрагменты, которые после этого транспортируются через стенку тонкого кишечника и поступают в кровь. В желудочно-кишечном тракте содержащиеся в пище белки гидролизуются множеством разных протеаз, которые секретируются желудком, поджелудочной железой и тонким кишечником. Эндопротеазы, такие как пепсин, трипсин и химотрипсин, расщепляют белки пищи на более мелкие олигопептиды. Из этих эндопротеаз только пепсин активен в кислой среде желудка. Трипсин и химотрипсин становятся активными в среде со значениями рН, близкими к нейтральным, которые преобладают в двенадцатиперстной кишке, тощей кишке и более дистальных отделах кшечника. Олигопептиды, образованные этими эндопротеазами, гидролизуются далее множеством других ферментов, таких как ди- и трипептидил-пептидазы, с образованием ди- и трипептидов, и таких как амино- и карбоксипептидазы, с образованием свободных аминокислот. За эффективный транспорт через стенку кишечника в кровоток отвечают системы переносчиков, специфические для транспорта свободных аминокислот или ди- и трипептидов. При употреблении в пищу свободные аминокислоты, ди- и трипептиды сразу попадают в кровоток. Пептиды большего размера, чем трипептиды, для своего поступления в кровоток требуют дополнительного ферментативного расщепления.
Мы установили, что содержащая триптофан композиция настоящего изобретения также является эффективной при её включении в пищевые матрицы с высоким содержанием белка, например, в молочные продукты. Это является совершенно неожиданным, так как пищевые матрицы с высоким содержанием белка имеют высокие уровни ΡΝΑΑ, и таким образом, как можно было ожидать, должны снижать действие продуктов с высокими отношениями Ττρ/ΡΝΑΑ. Возможным объяснением этого неожиданного феномена является то, что обычные пищевые продукты содержат интактные, а не сильно гидролизованные белки. Типичное распределение гидролизата по размерам согласно настоящему изобретению представлено на фиг. 3. Согласно этой фигуре, большинство пептидов, включающих триптофан и тирозин, имеют молекулярный вес меньше 500 Да. Учитывая очень высокий молекулярный вес триптофана (Мв = 186) и тирозина (Мв = 163) и тот факт, что свободный триптофан присутствует в гидролизатах в очень небольшом количестве, можно сделать вывод, что большинство этих пептидов будет представлять собой три- или дипептиды. Поскольку при используемой длине волны триптофан имеет гораздо более высокое молярное поглощение, чем тирозин, пиковые значения будут относиться преимущественно к пептидам, включающим триптофан.
Поскольку содержащие триптофан ди- и трипептиды, присутствующие в содержащей триптофан композиции согласно настоящему изобретению, всасываются гораздо быстрее, чем, например, большие количества ΡΝΑΑ, присутствующие в негидролизованных белках матрицы, мы предполагаем, что это является причиной того, что даже в присутствии больших количеств белков матрицы могут быть получены высокие уровни Ττρ/ΡΝΑΑ.
Определенные ситуации требуют высоких уровней Ττρ/ΡΝΑΑ в плазме крови в течение длительных периодов времени. Например, чтобы улучшить и продлить сон, или в ситуациях, требующих повышенных когнитивных способностей в течение длительного времени. Композиции согласно настоящему изо- 7 029869
бретению являются очень важными также в ситуациях, которые трубуют улучшения настроения, таких как описаны для случаев пременструального синдрома или для женщин в период после менопаузы. Тогда как связанный триптофан в составе пептидов, таких как гидролизат лизоцима, будет обеспечивать практически немедленное повышение отношения Тгр/ΕΝΆΆ, медленное переваривание полипептидов, в составе которых находится связанный триптофан, таких как устойчивый к пепсину белок с высоким уровнем Тгр/ΕΝΆΆ, будет гарантировать длительное высвобождение связанного триптофана в составе полипептидов в более удаленных отделах кишечника человека, что обеспечит повышенное отношение Тгр/ΕΝΆΆ в плазме крови в период времени между 120 и 240 мин после употребления композиции настоящего изобретения.
Интересно отметить, что представленные нами экспериментальные данныетакже, вероятно, указывают на то, что гидролизат согласно настоящему изобретению может обеспечивать отношения Тгр/ΕΝΆΆ в плазме крови волонтеров, которые выше, чем отношение Тгр/ΕΝΆΆ в гидролизате, когда гидролизат дается в достаточно высокой дозе. Достаточно высокая доза предпочтительно представляет собой дозу больше чем 10 г, больше чем 12 г или больше чем 14 г гидролизата лизоцима. Хотя такой феномен неизвестен, и согласно имеющимся у нас сведениям не существует общепринятого объяснения этого эффекта, мы полагаем, что это может быть связано с исключительно высоким содержанием аргинина в молекуле лизоцима. Здесь раскрывается имеющаяся в настоящее время рабочая гипотеза для объяснения экспериментальных данных, показанных в примерах. Эта гипотеза предназначена для иллюстрации точки зрения авторов настоящего изобретения, но настоящее изобретение никак не связано или не ограничено этой гипотезой. Таким образом, настоящее изобретение никак не зависит от корректности данной гипотезы. Увеличение уровня инсулина в крови стимулирует транспорт аминокислот из крови в периферические ткани, особенно в мышцы. Однако это не затрагивает в значительной степени триптофана, поскольку триптофан в крови связан с белком плазмы альбумином. Вследствие этого повышенные уровни инсулина снижают концентрацию ΕΝΆΆ, но не триптофана, повышая, таким образом, отношение Тгр/ΕΝΆΆ в крови. Поскольку употребление углеводов стимулирует секрецию инсулина и транспорт ΕΝΑΑ в периферические ткани, особенно в мышцы, при употреблении углеводов отношения Тгр/ΕΝΆΆ в плазме крови увеличиваются (Регп81гот апб Аибтап, 1972, МсШЬоПчп. νοί. 21, № 4, 337-342). Известно также, что помимо употребления углеводов секреция инсулина стимулируется определенными аминокислотами. Если уровни аминного азота в плазме крови при инфузии индивидуальных аминокислот являются очень близкими, что ответы инсулина значительно варьируют. Р1оуб е1 а1 (1 СПп 1п\'С81 45(9): 1487-502) установили, что ответ инсулина уменьшается в следующем ряду аминокислот аргинин > лизин > лейцин > фенилаланин > валин > метионин. Учитывая тот факт, что лизоцим особенно богат аминокислотой аргинином, можно предположить, что запускаемый аргинином эффект стимуляции секреции инсулина приводит к высоким отношениям Тгр/ΕΝΆΆ.
Поскольку углеводы известны своим стимулирующим действием на секрецию инсулина, гидролизаты согласно настоящему изобретению предпочтительно готовятся в комбинации с углеводами. В дабавление к присутствию быстро поглощаемого связанного триптофана в составе пептидов и медленно поглощаемого связанного триптофана в составе полипептидов, предпочтительная композиция согласно настоящему изобретению включает углевод.
В одном воплощении настоящего изобретения лизоцим, предпочтительно лизоцим куриных яиц, ферментативно (пре-)гидролизуется промышленным способом, то есть, композиция содержащих триптофан пептидов (из куриных яиц) предпочтительно предоставляется в форме гидролизата или обогащенного гидролизата. Предоставление содержащих триптофан пептидов в форме такого (обогащенного) гидролизата значительно облегчает всасывание триптофана в кишечнике. В другом воплощении настоящего изобретения лизоцим куриных яиц превращается в гидролизат или обогащенный гидролизат, включающий популяцию содержащих триптофан пептидов, в которой больше чем 50 мол.%, предпочтительно больше чем 60 мол.%, более предпочтительно больше чем 75 мол.% имеющихся пептидов имеют молекулярный вес меньше 500 Да. Предпочтительно такой (обогащенный) гидролизат не содержит больше чем 1% (по весу, в расчете на сухое вещество) свободного триптофана. Анализ молекулярного веса содержащих триптофан пептидов, присутствующих в гидролизате, проводится как это описано в разделе Материалы и Методы настоящего изобретения и проиллюстрирован на фиг. 3. Важным преимуществом последнего воплощения является то, что триптофан, входящий в состав ди- и трипептидов, транспортируется через стенку кишечника в кровоток сразу после перорального употребления. Вследствие этого уровни триптофана в плазме крови увеличиваются практически немедленно, что оказывает прямой эффект на уровни серотонина в мозге. Совершенно неожиданно результаты, представленные в примере 6 настоящего изобретения, показывают, что эффективность остатков триптофана, представленных в форме ди- и трипептидов, является даже более высокой, чем эффективность свободного триптофана. Это наблюдение показывает преимущества, предоставляемые настоящим изобретением.
Патент АО 2006/009448 предоставляет белковые гидролизаты, полученные из белков куриного яйца, обладающие антигипертензивными свойствами, а также пищевые продукты и пищевые добавки, включающие эти гидролизаты. Этот документ раскрывает получение большого количества гидролизатов,
- 8 029869
включая гидролизаты, получаемые из лизоцима куриных яиц. Назначением всех эти гидролизатов является снижение давления крови или предотвращение повышений давления крови при пероральном употреблении людьми. В νθ 2006/009448 также описывается производство гидролизатов лизоцима, полученных в щелочных условиях с применением субтилизина (ЕС3.4.21.62; коммерческие названия Л1еа1а8е или Рго1ех). Учитывая высокую степень гидролиза в процессе их получения, эти гидролизаты лизоцима содержат большую долю пептидов с молекулярным весом ниже 500 Да. Однако нигде в тексте νθ 2006/009448 нет ссылок на тот факт, что лизоцим представляет собой источник белка с высоким содержанием триптофана, что может оказывать положительныое влияние на уровни серотонина в мозге. Не упоминается также, что гидролизаты лизоцима содержат водорастворимые пептиды, включающие большое количество триптофана и относительно низкое количество ΕΝΑΑ. В νθ 2006/009448 также не упоминается высокое содержание аргинина и лизина либо в лизоциме, либо в гидролизатах лизоцима. На основании данных, представленных в настоящй Заявке на изобретение, мы установили, что высокое содержание триптофана в молекуле лизоцима в комбинации с высоким содержанием аргинина и лизина делает лизоцим идеальным исходным материалом для достижения высоких отношений Тгр/ΕΝΑΑ ίη νίνο. Кроме того, в тексте νθ 2006/009448 не отмечается преимуществ, предоставляемых гидролизатом, применяемым в настоящем изобретении, при его совместном употреблении с другими содержащими белок пищевыми продуктами. Кроме применения мембранных фильтров, в тексте νθ 2006/009448 также не упоминаются способы получения из этих гидролизатов пептидных фракций, имеющих определенный аминокислотный состав, или применения специфических способов для увеличения содержания триптофана или для увеличения отношений Тгр/ΕΝΑΑ. Кроме того, не отмечается преимущества предоставления гидролизата высоко деградированного лизоцима в комбинации с не деградированным интактным лизоцимом.
Данные, представленные в примере 4 настоящей Заявки на изобретение, показывают, что гидролизат лизоцима, полученный при инкубации лизоцима при щелочном рН с субтилизином, особенно богат дипептидом А1а-Тгр (Αν). Это позволяет предполагать, что химически синтезированный дипептид Αν может выступать в качестве приемлемой альтернативы для данного гидролизата лизоцима. Хотя применение синтетического дипептида имеет очевидные сложности, связанные с законодательством, важным преимуществом является его коммерческая эффективность и его идеальное отношение Тгр/ΕΝΑΑ. Теоретически доступными являются двадцать содержащих триптофан дипептидов, однако наши исследования показали, что дипептиды Αία-Тгр (Αν) и 8ег-Тгр (δν) обеспечивают наиболее предпочтительную возможность для повышения отношений Тгр/ΕΝΑΑ в плазме крови при применении синтетических дипептидов. Производство дипептидов Αν и δν путем химического синтеза является возможным с применением обычных способов, например, описанных в Ν. δета1б апб Η.Ό. НкиЬке "РерОбез: Скет18йу апб Вю1о§у", Εάδ. \νίΚγ-νί'.Ή Уег1ад ОтЬН, 2002, Скар1ег 4. Конкретные эффективные по стоимости способы химического синтеза пептидов, пригодные для промышленного производства, основаны на применении алкилхлорформиатов или пивалоилхлорида для активации карбоксильной группы в комбинации с применением метиловых эфиров для С-концевой защиты и бензилоксикарбонильной (Ζ) или третбутилоксикарбонильной групп для Ν-концевой защиты. Детальное описание способа эффективного по стоимости способа синтеза дипептида δν представлено в примере 5. Комбинация такого химически синтезированного содержащего триптофан дипептида со связанным триптофаном в составе полипептидов, таких как устойчивый к пепсину белок с высоким отношением Тгр/ΕΝΑΑ, предпочтительно интактный лизоцим, является новой.
Имея в доступности композицию согласно настоящему изобретению, можно предвидеть другие новые и неожиданные её применения, которые имеют технические и экономические преимущества.
Новым применением могло бы быть включение лизоцима и/или композиции настоящего изобретения в различные пищевые смеси для маленьких детей. Коровье молоко содержит 20% белка сыворотки, а человеческое молоко - от 40 до 60%. Вследствие этого коровье молоко содержит меньше альфалактальбумина и, следовательно, триптофана по сравнению с человеческим молоком. Обычно доношенные дети в норме употребляют детские смеси на основе коровьево молока, то есть продукты, которые не обеспечивают аминокислотного профиля, эквивалентного таковому материнского молока. Хотя последствия недостаточного употрбления триптофана до конца не известны, продукты для детского питания с высоким содержанием триптофана могут иметь положительные эффекты на сознательное поведение и характер и качество сна у маленьких детей. Прямое указание на то, что высокий уровень триптофана в плазме крови обеспечивает быстрое засыпание и спокойный сон здоровых новорожденных, представлено в работе Уодтап апб Ζе^8е1 в Ν Епд1 ί Меб. 1983 Νον 10; 309(19): 1147-1149. В соответствии с этим настоящее изобретение предоставляет композиции для пищевых продуктов для маленьких детей, в которых повышен уровень триптофана.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения композиция согласно настоящему изобретению может применяться в заменителях пищевых продуктов. Например, νθ 2005/023017 описывает преимущества желатина в высоких дозировках как пригодного компонента в заменителях пищевых продуктов. Хотя желатин обеспечивает прекрасные органолептические свойства, он не обеспечивает требуемого аминокислотного баланса, например, он не содержит незаменимой аминокислоты триптофана. Таким
- 9 029869
образом, для того, чтобы получить композицию с необходимым аминокислотным балансом, как это требуется согласно ЕС ОпссОус 96/8/ЕС, в такие содержащие желатин композиции должен добавляться триптофан. В \νϋ 2005/023017 триптофан предпочтительно добавляется в форме богатого триптофаном белка, например, порошка яичного белка или цельного яичного порошка. Мы теперь установили, что содержащие триптофан композиции согласно настоящему изобретению обеспечивают улучшенное решение этой проблемы, поскольку данные гидролизаты поставляют триптофан в намного более концентрированной форме. Более того, лизоцим сам по себе содержит все незаменимые аминокислоты в необходимом количестве, и следовательно представляет собой полноценный в питательном смысле белок, который идеально подходит на роль заменителя пищевых продуктов.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения лизоцим и/или композиция согласно настоящему изобретению применяется для улучшения характера и качества сна у новорожденных, детей и взрослых. Проблемы со сном широко распространены среди индивидуумов, принадлежащих к разным возрастным группам, и связаны с медицинскими нарушениями. Содержащие триптофан композиции согласно настоящему изобретению являются полезными для лечения связанных со сном проблем в целом, но они представляют собой полезный инструмент для преодоления проблем, связанных с когнитивными, психологическими, социальными и поведенческими нарушениями. Примерами этого являются достижение хорошей гигиены сна, преодоление проблем с засыпанием или нарушений циркадного ритма сна. Продукты также могут быть полезны для улучшения характера и качества сна и психического состояния, например, у пациентов, страдающих фибромиалгией. Синдром фибромиалгии представляет собой хронический болевой синдром, который сопряжен с тяжелыми нарушениями характера и качества сна и эмоциональным стрессом. Мы установили, что регулярное употребление композиции согласно настоящему изобретению и/или лизоцима улучшает характер и качество сна у индивидуумов, страдающих от связанных со сном проблем в целом.
Композиция согласно настоящему изобретению обеспечивает дополнительные преимущества, такие как предоставление (полу-)незаменимых аминокислот. Лизоцим имеет не только высокий уровень триптофана, но также содержит значительное число остатков тирозина. Тирозин является предшественником нейротрасмиттера дофамина и известно, что уровни тирозина в плазме крови влияют на уровни дофамина в мозге. Гидролизат лизоцима содержит не только меньше БЫЛА, чем другие известные пептиды с высоким содержанием триптофана, он также содержит меньше аминокислот с разветвленной боковой цепью (ВСАА), чем другие известные пептиды с высоким содержанием триптофана. Это является важным, поскольку известно, что ВСАА снижают доступность в плазме предшественника дофамина тирозина. Таким образом, его высокое отношение Тгр/БЫЛА в комбинации с его высоким отношением Туг/ВСАА делает лизоцим уникальной молекулой. Следовательно композиция согласно настоящему изобретению, включающая гидролизат лизоцима и интактный лизоцим, представляет собой очень хорошую "пищу для мозга", то есть обеспечивает поставку незаменимых аминокислот, необходимых для обеспечения подходящих уровней нейротрансмиттеров. Известно, что дофаминовая система играет критическую роль в обеспечении положительного подкрепления и в мотивации, а также известно, что она оказывает влияние на концентрацию, память, бдительность, внимание, принятие решений и психомоторную координацию. Как показано в примере 9 настоящего изобретения, употребление гидролизата лизоцима согласно настоящему изобретению обеспечивает достоверные положительные эффекты на бдительность, внимательность, концентрацию и психомоторную координацию. Эти результаты показывают, что можно ожидать, что композиция согласно настоящему изобретению будет стимулировать не только серотониновую систему, но и дофаминовую систему.
Некоторые группы людей могут получить пользу благодаря этому открытию. Например, женщины в период менопаузы обычно жалуются на пониженную способность к принятию решений, которую они связывают с неспособностью концентрироваться. Таким образом, композиция согласно настоящему изобретению особенно хорошо подходит для решения этих проблем у женщин из такой возрастной группы. В категории молодых женщин и женщин среднего возраста довольно обычным является предменструальный синдром. Этот синдром характеризуется большим разнообразием симптомов, однако часто встречаются жалобы на депрессию и неустойчивость настроения. Для разрешения этих проблем часто назначаются селективные ингибиторы обратного захвата серотонина, такие как флуоксетин, а для женщин с более мягкими симптомами рекомендуются изменения в диете и профилактика стресса. На основе результатов экспериментов, описанных в примерах 6 и 9 настоящего изобретения, композиция согласно настоящему изобретению обеспечивает прекрасное лечение в особенности таких умеренных случаев. Кроме того, недостаток дофамина связан с синдромом дефицита внимания и гиперактивности (айеиДоийеПсй НурегасОуПу Лзогйег, АЛИИ), и можно ожидать, что симптомы этого синдрома будут смягчаться при прмеме композиции согласно настоящему изобретению. Наши данные о том, что положительные эффекты на постстрессовые проявления особенно выражены у устойчивых к стрессу субъектов являются неожиданными. Возможным объяснением этого может быть то, что испытывающие стресс люди со (сверх-)активной серотониновой системой нуждаются в получении триптофана из напитков для восполнения их запасов серотонина и, следовательно, не могут использовать этот триптофан для улучшения своей способности к решению задач. Согласно это точке зрения устойчивые к стрессу люди без сверхак- 10 029869
тивной серотонинэргической системы не нуждаются в триптофане для восполнения их запасов серотонина и могут использовать этот триптофан для улучшения своего пост-стрессового поведения. Альтернативным объяснением может быть то, что эти эффекты в действительности являются результатом стимулирующего действия дофаминэргических процессов. Синтез дофамина может усиливаться ингрединтами пищи, богатыми тирозоном, особенно в случае комбинации с низкими уровнями аминокислот с разветвленной цепью (ВСАА). Эти рабочие гипотезы раскрываются здесь для объяснения экспериментальных данных, показанных в примерах, и приводятся для объяснения имеющейся в настоящее время точки зрения авторов изобретения. Однако настоящее изобретение никак не связано или не ограничивается этими гипотезами. Таким образом, настоящее изобретение не зависит от корректности этих гипотез. Как говорилось в другом месте, лизоцим имеет не только высокий уровень триптофана, но также включает в себя значительное число остатков тирозина.
Лизоцим и/или композиция согласно настоящему изобретению также увеличивает содержание цистеина в пищевых продуктах. Хотя цистеин и не является незаменимой аминокислотой, его концентрации во многих пищевых продуктах являются ограниченными. Эндогенный синтез цистеина требует наличия метионина, а подобно цистеину, концентрации метионина во многих пищевых продуктах являются ограниченными. Преимущества повышенного содержания цистеина в пище связаны, среди прочего, с его антагонистическим действием на эффект метионина, повышающий содержание гомоцистеина в сыворотке крови. Эти данные описаны в патенте νθ 03/055335. Композиция согласно настоящему изобретению также характеризуется высоким уровнем цистеина. Действительно, молекула лизоцима содержит даже больше остатков цистеина (8), чем остатков триптофана (6). В этом отношении композиция согласно настоящему изобретению является прекрасным источником для увеличения содержания цистеина в определенных продуктах. Было установлено, что повышенное содержание цистеина является важным для таких продуктов, как детское питание. Не только для детского питания на основе казеина или смесей казеина и белков молочной сыворотки, но также и для продуктов на основе сои и, на самом деле, для всех богатых белком продуктов, в которых основным источником белка являются белки, содержащие относительно небольшие количества триптофана или цистеина. Помимо белковых компонентов коровьево молока и желатина, примерами таких белков являются белок кукурузы, белок дрожжей, белок гороха, белок сои и белок риса. Кроме того, упоминавшиеся выше заменители пищевых продуктов, содержащие высокие дозы желатина, содержат недостаточные количества цистеина.
Лизоцим и/или композиция согласно настоящему изобретению, которая включает, например, диили трипептид, которые включают триптофан, особенно 8ν (как дипептид) или Αν (как дипептид), может применяться в любой подходящей форме, такой как продукт питания или напиток, как Продукты для Специального Питания (Εοοά ίοτ 8рес1а1 ΝιιΙπΙίοηαΙ Икек), как диетическая добавка, как нутрицевтик или даже в качестве кормов или корма для домашних животных. Содержащая лизоцим композиция может добавляться на любой стадии обычного процесса производства этих продуктов. При применении в пищевых продуктах или напитках, продукты с относительно низким содержанием белка являются предпочтительными для того, чтобы поддерживать высокое отношение Ττρ/ΤΝΆΛ в крови после употребления продуктов согласно настоящему изобретению. Важные пищевые продукты включают, например, хлебные батончики, шоколад и содержащие шоколад напитки, хлебобулочные изделия, такие как кексы и печенье, а также жидкие продукты, такие как супы или суповые порошки. Помимо молочных продуктов, таких как молоко и йогурт, другие подходящие напитки включают безалкогольные и алкогольные напитки, а также жидкие композиции для добавления в питьевую воду и жидкую пищу. Безалкогольные напитки предпочтительно представляют собой минеральную воду, спортивные напитки, фруктовые соки, лимонады, чаи, кофе, кофе без кофеина, концентрированные напитки, такие как концентраты шипучих напитков, энергетические напитки (например, напитки, содержащие глюкуронолактон, кофеин или таурин) и газированные напитки (например, шипучие напитки, содовые напитки и кола).
Предпочтительными комбинациями с лизоцимом и/или композицией согласно настоящему изобретению являются комбинации с соединениями, рекомендованными для "питания мозга", такими как железо, цинк, магний, витамины (особенно В2, В6, фолиевая кислота и витамин С), омега-3 и докозагексаеновая (ΌΗΑ) жирные кислоты и содержащие их жиры, глюкоза, ГАМК, холин, фосфатидилсерин, кофермент 010. креатин, таурин и 5-гидрокситриптамин (5-НТР), или комбинации с соединениями, рекомендованными для облегчения стресса или депрессии, такими как валериана, шоколад, зверобой, 5-НТР, фосфатидилсерин, спирт, мелисса, зеленый чай или экстракты зеленого чая, ромашка или 8аденозилметионин, или комбинации с соединениями, рекомендованными для улучшения бдительности, такими как кофеин, гуарана, женьшень, гинкго билоба, зверобой и 5-НТР, или комбинации с соединениями, рекомендованными для улучшения настроения, такими как ГАМК, 5-НТР, ΡΕΑ, шоколад, зеленый чай или экстракты зеленого чая, гинкго билоба, шалфей или 8-аденозилметионин, или комбинации с соединениями, рекомендованными для улучшения сна, такими как пептиды молока, свободный триптофан, опиоидные пептиды или мелатонин. Примеры продуктов для специального питания включают категории спортивного питания, продуктов для похудения, детского питания и лечебного питания. Термин "пищевые добавки" в используемом здесь значении означает продукт, употребляемый в пищу (через рот), который содержит соединение или смесь соединений, предназначенных для пополнения диеты. Со- 11 029869
единение или смесь соединений в этих продуктах могут включать витамины, минеральные вещества, травы или другие вещества растительного происхождения и аминокислоты. Пищевые добавки также могут представлять собой экстракты или концентраты, и могут производиться во множестве форм, таких как таблетки, капсулы, мягкие гели, гелевые капсулы, жидкости или порошки.
Содержащая триптофан композиция настоящего изобретения и/или лизоцим могут также применяться как или в составе композиции нутрицевтика или в производстве нутрицевтика. Термин "нутрицевтический" в используемом здесь значении означает полезность применения как в пищевой, так и в фармацевтической областях. Лизоцим и/или нутрицевтические композиции согласно настоящему изобретению могут готовиться в любой форме, пригодной для введения в организм животного, включая организм человека, особенно в любой форме, которая является традиционной для перорального введения, например, в твердой форме, такой как пищевые продукты или корма и добавки/дополнения к ним, заранее приготовленные смеси (премиксы) пищевых продуктов или кормов, таблетки, пилюли, гранулы, драже, капсулы и шипучие смеси, такие как порошки и таблетки, или в жидкой форме, такой как растворы, эмульсии или суспензии, такие как, например, напитки, пасты и масляные суспензии. Композиции с контролируемым (замедленным) высвобождением, включающие гидролизаты согласно настоящему изобретению, также являются частью настоящего изобретения. Кроме того, в нутрицевтические композиции настоящего изобретения могут добавляться мультивитаминные и минеральные добавки для получения адекватного количества важного пищевого компонента, который отсутствует в некоторых диентах. Мультивитаминные и минеральные добавки могут также быть полезными для профилактики заболеваний и зашиты от недостатка и дефицита пищевых компонентов, которые возникают из-за специфического образа жизни.
В предпочтительном аспекте настоящего изобретения лизоцим и/или композиция могут применяться в качестве нутрицевтической или пищевой добавки, например, для улучшения настроения или для улучшения когнитивных функций, таких как обучаемость, память, внимательность и бдительность, например, у пожилых людей, но также и у более молодых людей, таких как студенты, которые готовятся к экзаменам, и у людей, играющих, например, в компьютерные или Интернет-игры. Как говорилось выше, для женщин в период перед и после менопаузы лизоцим и/или композиция согласно настоящему изобретению имеют особое значение. Лизоцим и/или композиция согласно настоящему изобретению также имеют особое значение для спортсменов, как для спортсменов-профессионалов с напряженными графиками интенсивных тренировок, так и для для людей, занимающихся спортом на отдыхе, таких как игроки в теннис или гольф. Это означает, что настоящее изобретение касается применения гидролизата согласно настоящему изобретению, как это указано выше, и как "средства для улучшения состояния", то есть, для снижения раздражительности и усталости (в конечно счете, снижая риск перетренировки), для снижения или предотвращения или облегчения физической и умственной усталости, для обеспечения спокойного сна, то есть для борьбы с бессонницей и нарушениями сна и для улучшения сна, и для повышения энергии в более общем смысле, особенно для улучшения продукции энергии в мозге, у больных или здоровых индивидуумов. Более того, для улучшения когнитивных способностей в целом, и особенно для поддержания или улучшения внимания и концентрации, памяти и возможности запоминания, способности к обучению, обработки лингвистической информации, принятия решений и интеллектуальной деятельности, для улучшения как кратковременной, так и долговременной памяти, для повышения остроты ума, для усиления умственной бдительности, для снижения умственной усталости, для поддержки хорошего когнитивного здоровья, для поддержания сбалансированных когнитивных функций. Если это необходимо для получения экономически выгодных композиций с высоким отношением Тгр/ΤΝΆΆ, гидролизаты согласно настоящему изобретению не обязательно включают свободный триптофан.
Перечень фигур
Фиг. 1. Молярное отношение Тгр/ΕΝΆΆ в плазме крови как функция от времени после употребления продуктов, описанных в примере 6. КЕР= гидролизат казеина, АТАС= интактный альфалактальбумин, Тгр= свободный триптофан, АЕР§= обогащенный триптофаном гидролизат лизоцима, §ΥΝ= синтетический дипептид §ег-Тгр.
Фиг. 2. Плохое настроение (измеренное согласно тесту Ргой1е οί Μοοά 51а1еъ 1еъ1 (РОМ§)) как функция от времени после употребления продуктов, описанных в примере 6. КЕР= гидролизат казеина, АЬАС= интактный альфа-лактальбумин, Тгр= свободный триптофан, АЕР§= обогащенный триптофаном гидролизат лизоцима, 8ΥΝ= синтетический дипептид §ег-Тгр.
Фиг. 3. Распределение по размеру фракции водорастворимых пептидов гидролизата лизоцима. Применение метода для определения распределения молекулярных весов пептидов и белков, присутствующих в гидролизатах, детально описано в разделе Материалы и Методы, анализировался гидролизат лизоцима, полученный согласно способу, описанному в примере 3. Измерения поглощения при 214 нм отражают наличие пептидных связей. Измерения поглощения при 280 нм отражают присутствие ароматических боковых цепей триптофана и тирозина. Поскольку при этой длине волны триптофан обладает гораздо более высоким молярным поглощением, чем тирозин, максимальные значения относятся, главным образом, к пептидам, включающим триптофан.
Фиг. 4. Схема, показывающая дизайн проведения эксперимента, описанного в примере 9. Ηί§1ι: вос- 12 029869
приимчивые к стрессу волонтеры; 1ο\ν: устойчивые к стрессу волонтеры; йуйг: богатый триптофаном гидролизат лизоцима; р1аееЬо: гидролизат казеина.
Фиг. 5. Схема расписания типичного дня проведения эксперимента, описанного в примере 9. Эпик: употребление напитка, содержащего богатый триптофаном гидролизат или плацебо; Ь1оо4: взятие образца крови для определения уровней аминокислот в плазме; регГогтапсе: выполнение тестов перед и после некотролируемого стресса; кГгекк: арифметическая задача.
Фиг. 6. Отношения Тгр/ΕΝΆΆ в плазме крови (мкмоль/л) после приема плацебо (р1с) или гидролизата лизоцима (Тгр-йубг) в эксперименте, описанном в примере 9. Закрашенные значки: восприимчивые к стрессу субъекты; незакрашенные значки: устойчивые к стрессу субъекты.
Фиг. 7. Результаты теста МаскетогГй С1оск ТекГ, проведенного, как описано в примере 9. Количество правильных ответов (вертикальная ось) после приема плацебо (р1с; левая часть графика) или богатого триптофаном гидролизата (Тгр-йубг; правая часть графика), перед (Рге-кГгекк) или после (РокГ-кГгекк) решения арифметической задачи. Закрашенные значки: восприимчивые к стрессу субъекты; незакрашенные значки: устойчивые к стрессу субъекты. Поскольку разные продукты давались в разные дни, корректное сравнение может быть сделано только между условиями перед стрессом и после стресса при применении одного и того же продукта и в пределах одного и того же дня.
Фиг. 8. Результаты теста С’пОса1 Тгаскшд Такк, проведенного, как описано в примере 9. Лямбда СТ (показывающая конечный уровень сложности, который достигается субъектами) выражена после приема плацебо (р1с) или богатого триптофаном гидролизата (Тгр-йубг). Черные значки: восприимчивые к стрессу субъекты; серые значки: устойчивые к стрессу субъекты.
Фиг. 9. Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия лизоцима и белков молочной сыворотки, проинкубированных с пепсином при кислых значениях рН. Дорожка 1: исходный лизоцим; дорожка 2: лизоцим после переваривания пепсином; дорожка 3: исходные белки молочной сыворотки; дорожка 4: белки молочной сыворотки после переваривания пепсином; дорожка 5: пепсин сам по себе.
Фиг. 10. Кинетика отношений Тгр/ΕΝΆΆ в плазме крови после приема гидролизованного лизоцима (Р2В = ромбы), интактного лизоцима (Ьук = квадраты), и смеси интактного и гидролизованного лизоцима ((Μίχ = треугольники). Все три продукта имели одинаковое содержание триптофана. Важно подчеркнуть, что все три продукта дают абсолютно одинаковые значения "площади под кривой", что говорит о том, что гидролизат лизоцима как и сама молекула интактного лизоцима полностью перевариваются и поступают в кровь.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Материалы и методы
Материалы
Субтилизин под коммерческим названием "РгоГех 6Ь" был получен от Сепепсог (ЬеИеп, Тйе №Гйег1ап4к), пепсин от §1§та и смесь трипсина и химотрипсина (Рогсше РЕМ) от Шсо/утек (Вадкуаегб, Эептагк). Лизоцим был получен либо как ЭеКо/уте Ь (22% сухого вещества), либо как сухой гранулированный ЭеКо/уте С от ΌδΜ Рооб Зретаййек (Эе1Г1. Тйе №1йег1ап4к).
Гидролизат казеина ("КЕЕ") был получен, как описано Ебепк еГ а1. (ί Адпс Рооб Сйет, 53(20)79507957, 2005). Казеинат натрия был интенсивно гидролизован с применением РгоГех 6Ь и после снижения рН до 4,5 пролин-специфичной эндопротеазой до достижения значения ΌΗ >20%. После ультрафильтрации фильтрат был обработан нагреванием для инактивации любых оставшихся ферментативных активностей и высушен при распылении. Интактный альфа-лактальбумин ("АЬАС") был получен как "Вюриге" (>90% альфа-лактальбумина) от Эауйсо Еообк йиегпайопак 1пс. (Ье 8еиег, ΜΝ); обогащенный триптофаном гидролизат лизоцима ("^ЕР§") был получен, как описано в примере 4; синтетический дипептид §ег-Тгр ("δΥΝ") был получен, как описано в примере 5; чистый Ь-триптофан ("ТКР") был получен как Е-йурГорйаи-400 от ОйЫса, А1теге, Тйе №Гйег1аи4к.
Тест на протеазную устойчивость содержащих триптофан полипептидов, особенно интактных белков
Для оценки устойчивости белка в желудке человека 5% раствор (по весу) интактного белка был проинкубирован с пепсином (δίβίικι; 1% пепсина (по весу) по отношению к интактному белку) в течение 2 часов при 37°С в буфере Мс Пуапе (0,2 М лимонная кислота плюс №2НРО4), рН 4,0. Степень устойчивости к протеазам была определена как процент белка, который не изменяется после инкубации с пепсином. "Не изменяется" означает, что молекулярный вес белка не изменяется в результате инкубации с пепсином, "процент белка" означает площадь под кривой после перваривания, умноженную на 100 и деленную на площадь под кривой до переваривания, "площадь под кривой" представляет собой площадь белковой полосы, имеющей исходный молекулярный вес, полученную с помощью количественного анализа по применяемому способу (см. ниже). Молекулярные веса сравнивались согласно данным δΌδэлектрофореза с последующим прокрашиванием по протоколу, описанному ниже. После прокрашивания геля было получено цифровое изображение с применением системы ОрОСо ипащпд кукГет (1кодеп ЬгГе δ^ΐ'^; №№№.1кодеп-1гГе-кс1епсе.сот), после чего проводился количественный анализ выбранных белковых полос с применением программного обеспечения ТоГа11аЬ ТЬ 100, версия 2006 (ШпПпеаг Оупапйск
- 13 029869
Ий; теууте.попйпеат.сот) под оболочкой ^1пйоте8 ХР. Согласно этому тесту белок является устойчивым к протеазам, если после инкубации с пепсином остается более чем 50% белка с исходным молекулярным весом.
Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (δϋδ-РАСЕ)
Чистота используемых препаратов лизоцима проверялась с помощью ЗИЗ-РАОЕ. Все используемые материалы для ЗИЗ-РАОЕ и прокрашивания были получены от 1пуйтодеп (СаткЪай, СА, ИЗ). Образцы готовили с применением ЗИЗ буфера для образцов, согласно инструкции производителя и разделяли в 12% Βίδ-Ττίδ гелях с применением буферной системы МЕЗ-ЗИЗ согласно инструкции производителя. Прокрашивание проводили с использованием З1тр1у В1ие ЗаГе З1аш (Коллоидный Соота881е С250). До гидролиза лизоцим проявлялся на геле как одна полоса с молекулярным весом примерно 14 кДа.
ЬС/М8/М8 анализ (жидкостная хроматография с масс-спектрометрией)
Для определения присутствия пептидов, содержащих триптофан (главным образом, ди- и трипептидов), в ферментативных гидролизатах белков, полученных по способу согласно настоящему изобретению, применялся метод НРЬС с масс-спектрометром с ионной ловушкой (ТНегто Е1ес1топ, Вгеба. 1Не Ие1Нет1апЙ8), соединенный с насосом Р4000 (ТНегто Е1ес1топ, Втейа, 1Не Ие1Нег1апЙ8). Образующиеся пептиды были разделены с применением колонки 1пеп8Й 3 ОЭЗ 3,3 мкм, 150x2,1 мм (Уапап Ве1дшт, Ве1дшт) в комбинации с элюцией градиентом 0,1% муравьиной кислоты в воде МйН О (МйИроге, ВейГогй, МА, ИЗА; Раствор А) и 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (Раствор В). Градиент начинался со 100% Раствора А, раствор пропускался в течение 10 мин, затем линейно повышался до 20% раствора В за 25 мин и немедленно возвращался в исходные условия, в которых поддерживался 15 мин для стабилизации. Объем вводимого раствора составлял 50 мкл, скорость тока составляла 200 мкл в минуту и температура колонки поддерживалась равной 55°С. Концентрация белка во вводимом образце составляла примерно 50 мкг/мл. Идентификация представляющих интерес пептидов основывалась на времени удержания, протонированности молекулы и с применением МЗ/МЗ для интересующих пептидов, при использовании оптимальной энергии столкновения примерно 30%. Количественное измерение специфических содержащих триптофан пептидов проводилось с помощью метода внешнего стандарта.
Для настройки оптимальной чувствительности в режиме МЗ и для оптимальной фрагментации в режиме МЗ/МЗ был использован тетрапептид УУРР (Мв = 410,2) с проведением постоянной инфузии 5 мкг/мл, что обеспечивало протонирование молекулы в режиме МЗ и оптимальную энергию столкновения около 30% в режиме МЗ/МЗ, с генерацией серий В- и Υ-ионов.
Перед проведением ЬС/МЗ/МЗ ферментативные гидролизаты белков центрифугировали при комнатной температуре при 13000 об/мин в течение 10 мин, после чего супернатант разводили в отношении 1:100 деминерализованной водой, профильтрованной через систему для фильтрации воды МйНроте (водой МйНР).
Аминокислотный анализ
Содержание аминокислот в плазме крови было проанализировано методом ВЭЖХ (НРЬС) согласно уап Еук е! а1 (1. СНгота1одг. 1993: 620: 143-148), как описано в примере 6 или в примере 11.
Другие аминокислотные анализы были проведены согласно методу РюоТад, как описано в Инструкции для операторов Системы Аминокислотного Анализа Атшо Лай Апа1у818 Зу81ет оГ \Уа1ег8 (МйГогй МА, ИЗА). Для этого конечные образцы были высушены и прямо превращены в производные с помощью фенилизотиоцианата. Образовавшиеся производные аминокислот были количественно измерены с помощью метода ВЭЖХ, как это описано. Поскольку при обычном кислом гидролизе Тгр и Су8 разрушаются, для количественного определения этих двух аминокислот применялись специальные методы. Для предотвращения разрушения Су8 во время гидролиза, эта аминокислота сначала окислялась до цистеиновой кислоты с помощью перекиси водорода и затем проводилось количественное определение. Анализ триптофана основывался на незначительно модифицированном методе \Уа1ег8. В этом методе аликвота раствора пептида высушивалась в вакууме и затем гидролизовалась в течение 1 ч при 150°С в атмосфере азота в 4 М метансульфоновой кислоте, содержащей 0,2% триптамина. Продукт реакции прямо количественно измерялся с использванием ВЭЖХ на колонке А111есН А1йта С18 и флуоресцентной детекции.
Степень гидролиза
Степень гидролиза (Иедтее оГ Нуйго1у818, ИН), получаемая при инкубации с различными протеолитическими смесями, определялась с помощью быстрого теста ОРА (№екеп, Р.М.; Ре1ег8еп, Ό.; ИашЪтапп, С. 1тргоуей те1Ной Гог йеЮпттпд Гоой рго1еш йедгее оГ Нуйго1у818. 1оитпа1 оГ Гоой Заепсе 2001, 66, 642-646).
Азот по Кьельдалю
Общий азот по Кьельдалю был измерен с помощью Иоте 1щес1юп Апа1у818. Аммиак, освобождающийся из содержащих белок растворов, количественно измерялся при 590 нм с использованием Теса1ог ИАЗТАК 5000 Иоте Ьдесйоп Зу81ет, оборудованной ТКИ Ме1Ной Са88е11е 5000-040, компьютером Реп1шт 4 с программным обеспечение ЗОИА и автоматическим устройством для забора проб Теса1ог 5027 Аи!о8атр1ег. Количество образцов, соответствующее диапазону чувствительности метода (0,5-20 мг/л), помещалось в пробирку для расщепления вместе с 95-97% серной кислотой и К)еЙаЪ, и расщеплялось в
- 14 029869
соответствии с программой в течение 30 мин при 200°С, а затем в течение 90 мин при 360°С. После введения в систему ΕΙΑ8ΕΑΚ 5000 измерялся пик азота, из которого можно было рассчитать количество измеренного белка.
Распределение пептидов и белков, присутствующих в гидролизатах по молекулярному весу
Анализ распределения пептидов по размеру в образцах белков, обработанных протеазами, проводился с помощью автоматической системы ВЭЖХ, оборудованной насосом высокого давления, устройством для введения образцов, позволяющим вводить 10-100 микролитровый образец, и УФ-детектором, позволяющим измерять поглощение элюата с колонки при 214 нм.
Для этого анализа использовалась колонка Зирегйех Рерййе ΗΚ 10/300 ОЬ (Αте^δйат), уравновешенная буфером 20 мМ фосфат натрия / 250 мМ хлорид натрия, рН 7,0. После введения образца (обычно 50 мкл) различные компоненты элюировались из колонки буфером в течение 90 мин при скорости протока 0,5 мл/мин. Систему калибровали с использованием в качестве маркеров молекулярного веса смеси цитохрома С (Мв 13500 Да), апротинина (Мв 6510 Да) и тетра-глицина (Мв 246 Да).
Далее настоящее изобретение иллюстрируется с помощью следующих примеров.
Пример 1. Лизоцим куриных яиц не расщепляется ни пепсином, ни смесью трипсин/химотрипсин
Для оценки его перевариваемости в желудочно-кишечном тракте человека лизоцим куриных яиц инкубировался ΐη νίΐΓο с пепсином и со смесью трипсина и химотрипсина. Обе инкубации проводились при тех значениях рН, которые преобладают в желудке (пепсин) и в двенадцатиперстной кишке (трипсин/химотрипсин). Для этого 5-процентный раствор (по весу) лизоцима инкубировался с ферментами (1 вес.% фермента по отношению к лизоциму) в течение 2 ч при 37°С. Для предотвращения значительных изменений рН в результате протекающего гидролиза белка инкубация проводилась в буфере Мс 1капе (0,2 М лимонная кислота плюс Να2ΗΡΟ4). Низкие значения 1)11, которые были получены после двухчасового гидролиза при 37°С (см. табл. 1) показывают, что молекула лизоцима не деградирует в условиях, которые имитируют условия переваривания в желудке и в двенадцатиперстной кишке и тощей кишке, поскольку эффективный протеолиз, как ожидается, должен приводить к значению 1)11 по меньшей мере 10%. Таким образом, остатки триптофана, присутствующие в молекуле интактного лизоцима куриных яиц, не высвобождаются в желудочно-кишечном тракте, подтверждая, таким образом, тот факт, что молекулы триптофана, присутствующие в интактном лизоциме куриных яиц, не могут вносить свой вклад в уровни триптофана в плазме крови вскоре после его употребления.
Таблица 1. Гидролиз лизоцима пепсином и смесью трипсин/химотрипсин
Фермент рН в начале рН в конце ЭН в начале (%) ЭН в конце (%)
Пепсин 2,8 2,4 = 0 2,4
Пепсин 3,6 3,2 < 1
Пепсин 4,6 4,3 1,0
Трипсин/химотрипсин 4,6 4,3 <1
Трипсин/химотрипсин 5,9 5,5 <1
Трипсин/химотрипсин 7,2 7,0 1,3
Пример 2. Лизоцим куриных яиц эффективно расщепляется субтилизином при повышенных значениях рН
Для оценки подверженности лизоцима ферментативному гидролизу при нефизиологических значениях рН и нефизиологических ферментативных условиях раствор лизоцима инкубировался ΐη νίΐΓο с субтилизином микробного происхождения (ЕС 3.4.21.62) при щелочных значениях рН. Для этого 5% раствор (по весу) лизоцима инкубировался при рН 7,0, 8,0 и 9,0 с 12,5 мкл Рго1ех 6Ь на 1 г присутствующего в растворе белка лизоцима. Инкубация проводилась в течение 3 ч при 60°С с постоянным поддерживанием рН на одном значении с помощью 1 М ΝαΟΗ. В конце инкубации были получены слегка мутные растворы без какого-либо значительного осадка. После стадии нагревания для инактивации субтилизина были определены значения 1)11 для разных условий инкубации согласно протоколу, описанному в разделе Материалы и Методы. В противоположность результатам, которые были получены в физиологических условиях (см. пример 1), инкубация в щелочных условиях с использованием субтилизина приводила к полному гидролизу лизоцима. Инкубация при рН 7,0 давала значение 1)11 6,3, инкубация при рН 8,0 давала значение 1)11 11,2 и инкубация при рН 9,0 давала значение 1)11 16,4. Последующий анализ продуктов реакции с помощью 8Ώ8-ΡΑΟΕ показал, что целая молекула лизоцима деградировала, то есть фрагменты молекулы с большим молекулярными весами в процессе инкубации с субтилизином не сохранились. Кроме того, анализ гидролизата с помощью ВЭЖХ на колонке Сгомнрак СК+ (Оа1се1) показал, что даже после продолжительного нагревания при рН 9,0 не происходит значительной рацемизации содержащих триптофан пептидов.
- 15 029869
Пример 3.Гидролиз лизоцима с использованием Рго1ех и идентификация образующихся пептидов
Раствор, содержащий 10% (по весу) чистого лизоцима, был доведен до рН 8,2 с помощью ΝαΟΗ и нагрет до 52°С. Гидролиз начинали добавлением 25 мкл Рго1ех/г белка, присутствующего в растворе. В условиях постоянного перемешивания и поддержания значения рН 8,2 гидролиз продолжался в течение 5,5 ч, в результате чего был получен почти прозрачный раствор, не содержащий видимого осадка. После стадии нагревания для инактивации Рго1ех были взяты образцы для анализа ΌΗ. Полученные значения ΌΗ для раствора составили почти 30%. Прогретый раствор был подвергнут ультрафильтрации через фильтр с границей пропускания 10 кДа для получения совершенно прозрачной жидкости. Прозрачная жидкость использовалась для анализа ЬС/Μδ для определения распределения по молекулярному весу присутствующих в ней пептидов и белков, а также для ионообменной хроматографии.
Для получения картины распределения по молекулярному весу присутствующих в ней пептидов и белков прозрачная жидкость была проанализирована для определения молекулярных размеров, как описано в разделе Материалы и Методы. Полученные результаты (см. фиг. 3) четко показывают, что почти все пептиды, содержащие аминокислоты с ароматической боковой цепью (то есть, триптофан, тирозин и фенилаланин), имеют молекулярный вес меньше 500 Да. С учетом высокого молекулярного веса этих аминокислот можно считать, что большинство этих маленьких пептидов представляет собой либо три-, либо дипептиды.
Анализ ЬС/Μδ был проведен согласно процедуре, описанной в разделе Материалы и Методы. Выбирая пептиды, содержащие триптофан ("Ц"), в растворе можно обнаружить пептиды АЦ, ОЫЦ, Ц1К, ΝΛ\ν. ЦУА, УАЦ, АЦК, δΕΟΝν и минорные количества пептидов ЦЦ и δΚνν. Уровень свободного триптофана в гидролизате после инкубации составил меньше чем 1% от общего содержания триптофана (в лизоциме).
Поскольку ди- и трипептиды легко всасываются с участием переносчиков пептидов, присутствующих в стенке кишечника, не остается сомнений, что остатки триптофана, имеющиеся в таких пептидах, будут быстро всасываться и обеспечивать повышенные уровни триптофана в плазме крови при пероральном употреблении гидролизатов лизоцима настоящего изобретения.
Пример 4. Повышение содержания триптофана в гидролизате
Лизоцим содержит неожиданно большое количество основных остатков аминокислот аргинина и лизина. Кроме того, молекула лизоцима содержит значительное количество кислых остатков глутамата и аспартата. Эти данные были использованы для разработки новаторского и элегантного способа для получения гидролизатов с повышенными отношениями Тгр/ΕΝ АА. Однако необходимым условием для этого способа очистки является то, что только очень незначительное количество остатков триптофана входит в состав пептидов, которые также содержат остаток аргинина или лизина, или остаток глутамата или аспартата. Как показано в примере 3, специфические условия проведения гидролиза приводят к получению только нескольких содержащих триптофан пептидов, содержащих также остаток аргинина, и к отсутствию пептидов, содержащих триптофан и остаток лизина, глутамата или аспартата.
Теория предсказывает, что максимальное различие по заряду между пептидами, содержащими и не содержащими остаток глутамата или аспартата, может быть достигнуто при значении рН около 3. Максимальное различие по заряду между пептидами, содержащими и не содержащими остаток аргинина или лизина, может быть достигнуто при значении рН около 5.
Для иллюстрации, разделяющей способности этого подхода, был получен гидролизат лизоцима по методике, описанной в примере 3. После этого рН гидролизата был доведен до рН 3,1 с помощью уксусной кислоты и примерно 0,5 г белка было нанесено на колонку с 15 мл носителя δΡ δерЬа^ο8е РР (ΟΕ НеаНЬеаге, Э1едет, Ве1дшт), уравновешенную 20 мМ цитрата натрия, рН 3,1. После промывания колонки одним объемом натрий-нитратного буфера для удаления большинства пептидов, включающих глутамат или аспартат, буфер элюции был заменен на 20 мМ натрий-цитратный буфер с рН 5,1. При промывании колонки тремя объемами последнего буфера элюировался набор пептидов, содержащих триптофан. Согласно данным анализа ЬС/Μδ, в элюате в больших количествах присутствовали дипептид АЦ и трипептиды ΟΝν, NАЦ, ЦУА, УАЦ, и в небольшом количестве пентапептид δΕΟΝν. Аминокислотный анализ разных фракций, элюируемых при рН 5,1, показал, что избирательная элюция обеспечивает получение раствора с молекулярным отношением Т^р/^NΛΛ 1,75 и выходом триптофана почти 30%. Менее избирательная элюция обеспечивает получение раствора с молекулярным отношением Тгр/ЬХАА 0,4 и выходом триптофана 70%. После этого колонку промывали тремя объемами 20 мМ цитрата натрия, рН 7,1. Согласно данным ЬС/Μδ на этой стадии элюируются содержащие аргинин пептиды Ц1К, АЦ1К и, неожиданно, пептид ЦЦ. Конечное промывание колонки 1 М ΝαΟΗ, водой и 1 М уксусной кислотой подготавливает колонку для следующего использования.
Пример 5. Химический синтез дипептида δе^-Т^р.
Дипептид δе^-Т^р был синтезирован согласно стандартному методу синтеза пептидов. На первой стадии Ζ^γ-ΟΗ и Тгр-ОМе были соединены с помощью карбоангидридного метода (1. Ат. СЬет. δοο. 1967, 5012) для получения защищенного (по концевым группам) дипептида Ζ-δе^-Т^р-ΟΜе. Для этой цели Тгр-ОМе.НС1 суспендировали в тетрагидрофуране (ТНР), после чего был добавлен Νметилморфолин (ΝΜΜ). Смесь перемешивали в течение 1 ч, после чего её добавляли к раствору Ζ^γ в
- 16 029869
смеси тетрагидрофуран/диметилформамид (ΤΗΡ/ОМР). К смеси был добавлен второй эквивалент ΝΜΜ, после чего смесь охлаждали до -15°С. К смеси добавляли изобутилхлорформ(и)ат с такой скоростью, чтобы внутренняя температура не превышала -15°С. После этого смесь перемешивали 3 ч, оставляли нагреваться до комнатной температуры и удаляли осадок ΝΜΜ.ΗΟ путем фильтрации. Фильтрат выдерживали в течение ночи при 4°С, после чего образовавшийся дополнительный преципитат удаляли фильтрованием и концентрировали фильтрат, упаривая его под вакуумом. Полученный материал очищали колоночной хроматографией (δίΟ2, этилацетат/гептан). Объединенные фракции концентрировали, промывали водой для удаления следов оставшегося ΌΜΡ и концентрировали под вакуумом.
На второй стадии был проведен ферментативный гидролиз Ζ-δβΓ-ΤΓρ-ΘΜβ с использованием Л1са1аке 2.5Ь ΌΧ (Ιηί. 1. ΡορΙίΟο Рго1ет Кек. 1990, 52) с последующим каталитическим гидрогенолизом с выходом нужного пепетида в виде беловатого твердого вещества. Для этой цели очищенный Ζ-§е^-Τ^ρ-ΟΜе растворяли в 1БиОН и воде и добавляли Α1са1а8е 2.5 Ь ΌΧ (Nονοζуте5, Вад^аегй, Эептагк). Смесь перемешивали, пока (почти) весь исходный материал не был переработан. После этого смесь концентрировали под вакуумом и экстрагировали осадок водой при рН 7. Водную смесь экстрагировали этилацетатом для удаления остатков исходного материала, после чего подкисляли водную фазу. Желаемый продукт, то есть Ζ^τ-Ττρ-ΟΗ, был выделен экстракцией этилацетатом, экстракт был высушен над сульфатом натрия и сконцентрирован под вакуумом.
На третьей стадии был получен дипептид Зег-ΤΓρ-ΟΗ. Для этого концентрированный Ζ-δοΤΓρ-ΟΗ растворяли в МеОН и воде (1:1), добавляли Ρά/С, и перемешивали смесь при избыточном давлении (5 бар) в атмосфере водорода. После завершения реакции катализатор и большинство продукта отделяли фильтрацией и отбрасывали фильтрат. Фильтр интенсивно промывали водой Μί11ίΟ и концентрировали фильтрат под вакуумом, получая дипептид 5>οΤη3-ΟΗ в виде белого или беловатого твердого вещества. Дополнительную очистку проводили путем перемешивания продукта в смеси ацетон-вода и отделения пептида фильтрацией. Полученный таким способом продукт является пригодным для перорального употребления.
Пример 6.Влияние разных источников триптофана на отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови и настроение здоровых волонтеров.
Целью настоящего исследования был анализ уровней Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови и настроения здоровых волонтеров после приема различных препаратов, содержащих триптофан. Было исследовано влияние следующих препаратов:
интактный альфа-лактальбумин (см. Материалы и Методы) гидролизованный казеинат (ΌΗ >20%; см. Материалы и Методы)
обогащенный триптофаном гидролизат лизоцима с высоким отношением Ττρ/ΕΝΑΑ (см пример 4) синтетический дипептид §А (пример 5) свободный Ь-триптофан (см. Материалы и Методы).
В исследовании участвовало 18 здоровых студентов (9 мужчин и 9 женщин: возраст от 18 до 30 лет). Критериями исключения из участия в исследовании были хронические и острые заболевания, история психиатрических и других болезней, употребление лекарств или наркотиков, употребление алкоголя (> 2 доз в день), метаболические, гормональные заболевания или заболевания кишечника и нерегулярное питание или ненормальный стиль питания (оценивались по анкетированию о состоянии здоровья и образе жизни). Участвующие в эксперименте субъекты имели нормальный Индекс Массы Тела (Βοάν-Μ;·ΐ55 1п0ех, ΒΜΙ в кг/м2 между 20-25), женщины опрашивались относительно пользования контрацептивами. Женщины принимали участие в эксперименте во время средней стадии фолликулярной фазы (дни 4-10), если участницы пользовались контрацептивами, они принимали участие в эксперименте, когда действительно принимали таблетки. Участники эксперимента были некурящими и не употребляли какой-либо алкоголь перед и во время исследования. Все участники исследования подписали Информированное Согласие (ΙηΓοηικά Сопкеп! Ротт). Исследование проводилось в соответствии с принципами Европейского Сообщества по Правилам проведения качественных клинических исследований (ЕС ρτίηΟρΚκ о£ Οοοά СНшса1 Ргасйсе, ОСР), принятыми 52-й Генеральной ассамблеей Международной медицинской ассоциации (ΑΜΑ, Е01пЬигдк, ^οί^ηά, ОсЮЬег 2000).
Участников исследования инструктировали не принимать пищу в течение ночи, разрешались только вода или чай без сахара. Во время пяти экспериментальных утренних сессий участники посещали лабораторию для мониторинга концентраций Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови и настроения после употребления напитка, содержащего разные концентрации Ττρ или ΕΝΑΑ. Порядок употребления разных напитков был взаимно сбалансирован, и четыре экспериментальных дня были разделены периодом в одну неделю. В утро каждого эксперимента участникам давали 312 мл напитка, содержащего разные концентрации триптофана (Ττρ) или ΕΝΑΑ (табл. 2). Все напитки содержали 0,10 г подсластителя (ацесульфама) и были разведены чистой водой до объема 312 мл. Проводящий исследование ассистент не знал состава напитков, употребляемых участниками.
- 17 029869
Таблица 2. Белковый/аминокислотный состав применяемых напитков
Источник белка Гидролизат казеина Интактный альфалактальбумин Гидролизат лизоцима, обогащенны й Тгр 8егТгр Свободный Ь-Тгр
Используемый код КЕР АЬАС ΨΕΡ8 8ΥΝ ТИР
граммы 20 15 300 мл раствора 1,20 0,82
Тгр (г) 0,40 0,80 0,80 0,80 0,80
Тгр/ΕΝΑΑ (молярное) 0,04 0,10 1,1 00 00
Образцы крови отбирали дважды - перед и через 15, 30, 60, 90, 120, 180 и 210 мин после приема напитков в 5 мл вакуумированные пробирки, содержащие гепарин натрия, после чего центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин при 4°С.
Полученные супернатанты смешивали с сульфосалициловой кислотой (4 мг/100 мкл) и замораживали и хранили при -80°С до проведения анализа. Аминокислотный анализ плазмы проводили методом ВЭЖХ на колонке 2-3 мкм ΒΐδοΗοί ЗрйепзогЪ ΟΌδ II, как описано уап Бук е! а1 (I. Сйгота!о§г. 1993: 620: 143-148). Отношения Тгр/ΤΝΆΆ в плазме рассчитывали путем деления молярной концентрации триптофана в плазме на сумму молярных концентраций в плазме больших нейтральный аминокислот валина, изолейцина, лейцина, тирозина и фенилаланина. Статистический анализ проводили с помощью многомерного и одномерного дисперсионного анализа (ΜΑΝΟνΑ и ΑΝΟνΑ) данных повторных измерений с использованием программного обеспечения Оепега1 Бшеаг Мобе1 (ОБМ: δΡδδ 12.0 для Штбомз). Все статичтические данные рассчитывались с уровнем значимости Р = 0,05.
Значения Тгр/ΕΝΑΑ в плазме крови
Прежде всего дисперсионный анализ повторных измерений с учетом влияния Условия и Времени для каждого субъекта на отношение Тгр/ΤΝΑΑ в плазме крови выявил достоверный эффект Времени и Условия и достоверное взаимодействие Условие х Время. Максимальные достоверные увеличения отношения Тгр/ΤΝΑΑ в плазме были обнаружены (см. фиг. 1) после употребления "δΥΝ" (увеличение на 263% через 60 мин) и "ШК1%" (увеличение на 255% через 90 мин). Увеличение отношения Тгр/ΤΝΑΑ после употребления этих двух продуктов происходило достоверно быстрее и достигало больших значений, чем после употребления "ТКР" (увеличение на 191% через 120 мин) или "ΑΤΑΟ' (увеличение 67% после 120 мин). После употребления "КБР" наблюдалось достоверное снижение отношения Тгр/ΤΝΑΑ, начиная с 60 мин и до 210 мин (-27%).
Обнаруженное нами увеличение отношения Тгр/ΤΝΑΑ на 255% после употребления "ШЕ/Ρδ" значительно превышает обнаруженное ранее увеличение на 50-70% после употребления интактного альфалактальбумина ((Магкиз е! а1., 2000; Вооу е! а1., 2006) и все обнаруживаемые ранее увеличения на 20-45% при употреблении других пищевых продуктов, подобных углеводам ((Магкиз, 2003). Поскольку считается, что 40-50% изменение отношения Тгр/ΤΝΑΑ в плазме достаточно для изменения уровней триптофана и синтеза и высовобождения 5-НТ в мозге (Магкиз е! а1., 2000), можно ожидать, что обнаруженное увеличение на 255% будет вызвыать гораздо большее увеличение доступности триптофана и 5-НТ в мозге, что, как следствие, может также приводить к более значительному высвобождению функционально активного 5-НТ в мозге.
Профиль настроения (Ргой1е оГ Μοοά 81а1е8, РОМ8)
Изменение настроения у разных участников эксперимента измеряли с применением версии "бумага-и-карандаш" - сокращенной Голландской версии анкеты Ргой1е оТ Мооб δίΗΐβδ (Ша1б апб МейепЪегдй, №б ТубзсЬт Рзусйо1 1990: 45: 86-90) в виде визуальной аналоговой шкалы (νΑδ) в диапазоне от "сильно не согласен" до "сильно согласен". Опросник ΡΟΜδ включает 5 разных подразделов для настроения, начиная от Злости, Депресии, Усталости и Напряженности, которые указывают на плохое настроение, до Бодрости, указывающей на хорошее настроение.
Дисперсионный анализ повторных измерений с учетом влияния факторов Условия и Времени для каждого субъекта на общую оценку настроения выявил достоверное влияние Времени и достоверное взаимодействие УсловиехВремя, указывая на то, что изменение настроения во времени достоверно различается в разных условиях. Сравнимое улучшение настроения было обнаружено через 60 мин после употребления "^ΕΡδ" и "ТКР", но только в случае с "^ΕΡδ" настроение и дальше улучшалось до 210 мин после употребления напитка по сравнению с "ТК/Ρ". В отличие от этого, изменений настроения после употребления "КБР" и "ΑΕΑΟ' обнаружено не было. Отсутствие влияния на настроение после приема интактного альфа-лактальбумина сравнимо с данными предшествующих исследований, в которых были обнаружены умеренные положительные эффекты на настроение после приема интактного альфа- 18 029869
лактальбумина и только у восприимчивых к стрессу субъектов в условиях острого стресса (Магкиз е! а1., 2000; Магкиз е! а1., 2000, Магкиз, 2003). Хотя похоже, что настроение также улучшается после употребления "8ΥΝ", этот эффект был недостоверным при данной постановке эксперимента.
Полученные результаты позволяют предполагать, что значительное увеличение на 255% отношения Тгр/ΕΝΆΆ в плазме может быть достаточным для улучшения настроения нормальных невосприимчивых к стрессу субъектов. Основываясь на предшествующих результатах можно ожидать, что эти положительные эффекты обогащенного триптофаном гидролизата лизоцима на настроение будут даже больше у восприимчивых к стрессу людей в условиях сильного умственного стресса (Магкиз, 2003). В противоположность нашим ожиданиям, не было обнаружено достоверных улучшений настроения после употребления синтетического дипептида. Этот неожиданный результат может быть связан с конкретной постановкой эксперимента или с различиями в биодоступности триптофана из этих разных источников.
Таблица 3. Изменения в концентрациях аминокислот (мкмоль/л) в плазме крови после употребления гидролизата казеина ("КЕР"), интактного альфа-лактальбумина ("АЕАС") или обогащенного триптофаном гидролизата лизоцима ("АЕРЗ")
Время (мин)
Аминокислота Условие 0 30 60 90 120 180 210
Изолейцин КЕР 0,07 0,10 0,18 0,15 0,12 0,09 0,08
АЬАС 0,08 0,12 0,20 0,22 0,18 0,12 0,11
ΨΕΡ8 0,07 0,09 0,09 0,14 0,09 0,08 0,09
Лейцин КЕР 0,12 0,19 0,31 0,26 0,22 0,17 0,16
АЬАС 0,13 0,22 0,37 0,38 0,28 0,21 0,20
ΨΕΡ8 0,13 0,14 0,14 0,13 0,13 0,13 0,14
Фенилаланин КЕР 0,06 0,08 0,10 0,08 0,08 0,06 0,06
АЬАС 0,07 0,09 0,11 0,10 0,09 0,07 0,07
ΨΕΡ3 0,07 0,07 0,07 0,06 0,10 0,06 0,07
Тирозин КЕР 0,06 0,07 0,12 0,11 0,09 0,07 0,07
АЬАС 0,06 0,08 0,12 0,12 0,10 0,08 0,08
ΨΕΡ8 0,06 0,07 0,07 0,06 0,06 0,06 0,06
Валин КЕР 0,24 0,28 0,45 0,42 0,38 0,32 0,30
АЬАС 0,26 0,30 0,38 0,42 0,35 0,29 0,28
АУЕРЗ 0,26 0,27 0,25 0,25 0,25 0,25 0,26
Триптофан КЕР 0,06 0,07 0,08 0,08 0,07 0,06 0,05
АЬАС 0,07 0,09 0,18 0,23 0,19 0,13 0,12
ΨΕΡ8 0,07 0,13 0,21 0,23 0,20 0,14 0,13
Ы4АА КЕР 0,52 0,67 1,14 1,01 0,86 0,73 0,65
АЬАС 0,60 0,82 1,14 1,22 1,10 0,86 0,82
АУЕРЗ 0,62 0,60 0,65 0,60 0,68 0,55 0,64
Тгр/ίΝΑΑ КЕР 0,11 0,09 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08
АЬАС 0,12 0,12 0,15 0,18 0,2 0,18 0,17
АУЕР8 0,11 0,19 0,36 0,39 0,35 0,25 0,22
Таблица 4. Изменения концентраций аминокислот (мкмоль/л) в плазме крови во времени после
употребления свободного Ь-Тгр ("ТКР") или синтетического дипептида ЗА ("8ΥΝ")
Время(мин)
Аминокислота Условие 0 30 60 90 120 180 210
Изолейцин ТКР 0,07 0,07 0,07 0,06 0,07 0,07 0,07
8ΥΝ 0,06 0,07 0,06 0,06 0,06 0,06 0,07
Лейцин ТКР 0,13 0,13 0,12 0,12 0,12 0,12 0,13
8ΥΝ 0,11 0,14 0,12 0,12 0,12 0,12 0,13
Фенилаланин ТКР 0,07 0,07 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06
5ΥΝ 0,06 0,07 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06
Тирозин ТКР 0,06 0,06 0,06 0,05 0,06 0,05 0,05
8ΥΝ 0,05 0,06 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05
Валин ТКР 0,25 0,25 0,23 0,22 0,23 0,22 0,23
3ΥΝ 0,21 0,26 0,22 0,22 0,22 0,21 0,23
Триптофан ТКР 0,07 0,07 0,17 0,18 0,18 0,13 0,11
19 029869
δΥΝ 0,06 0,13 0,21 0,18 0,15 0,11 0,10
ΕΝΑΑ тар 0,62 0,59 0,55 0,50 0,58 0,52 0,53
δΥΝ 0,50 0,58 0,48 0,47 0,45 0,48 0,54
Тгр/ΪΝΑΑ тар 0,11 0,12 0,29 0,31 0,32 0,24 0,20
8ΥΝ 0,11 0,22 0,40 0,37 0,31 0,22 0,19
Пример 7. Гидролиз больших количеств лизоцима.
При гидролизе больших количеств лизоцима использовался способ, описанный в примере 3, в который были внесены некоторые незначительные модификации. Раствор, содержащий 7,3 вес.% чистого лизоцима нагревался до 65°С, после чего значение рН доводили до 8,2 с помощью ΝαΟΗ. Гидролиз начинали добавлением 25 мкл Рго1ех 6Ь/г сухого вещества. Гидролиз продолжался в течение 2 ч при постоянном перемешивании и поддержании рН 8,2 и при температуре 53°С. После этого рН раствора увеличивали до 9,0 и проводили инкубацию еще 3,5 ч, в результате чего был получен раствор с небольшим осадком. После этого рН раствора снижали до 4,5 и раствор охлаждали до температуры ниже 4°С. Для получения полностью прозрачного раствора жидкость фильтровали через фильтр Ζ 2000 Й11ег (Ра11), после чего избыток воды и солей удаляли нанофильтрацией. Полученный концентрат подвергали ϋΗΤ обработке (сверхвысокой температурой) в течение 7 с при 120°С, выпаривали и окончательно высушивали с помощью распыления для получения гидролизата лизоцима в сухом виде. Полученный таким образом продукт имел молярное отношение Ττρ/ΓΝΑΑ около 0,19.
Пример 8. Приготовление напитка, содержащего гидролизат лизоцима.
Следующий рецепт иллюстрирует приготовление земляничного напитка, не содержащего жиров и содержащего гидролизат лизоцима. К 10 г порошка гидролизата лизоцима (полученного согласно примеру 7) были добавлены 40 г глюкозы, 2,4 г лимонной кислоты, 0,38 г яблочной кислоты, 0,15 г сукралозы и 0,15 г земляничного ароматизатора (Ви1ег姧епсе, ΖίΐίίικΙίΐΐΏ,ΤΙκ' №1йег1ап4§). Эта смесь порошков сразу растворялась в 1 л воды для получения готового к употреблению напитка с высоким отношением Ίϊρ/Ι.ΝΑΑ и высоким отношением Τуг/ВСАА. Данная смесь порошков пригодна, например, для приготовления пакетированных форм. Пакетированные жидкие продукты могут быть получены с помощью разнообразных известных способов.
Пример 9. Влияние гидролизата лизоцима на решение задач после стресса у чувствительных к стрессу и устойчивых к стрессу волонтеров
Целью данного исследования было сравнение влияния гидролизата лизоцима, полученного согласно способу, описанному в примере 7, и плацебо (гидролизат белка казеина, смотри пример 6) на уровни Ίϊρ/Ι.ΝΑΑ в плазме крови, и как следствие, на выполнение тестов после стресса. Используемые тесты известны как тесты на "бдительность (внимательность)" и на "зрительно-моторный контроль" у индивидуумов.
В данном исследовании принимало участие сорок индивидуумов, двадцать мужчин и двадцать женщин. На основе данных предварительного опроса половина группы была классифицирована как устойчивая к стрессу, а вторая половина - как чувствительная к стрессу. Критерии для участия индивидуумов в исследовании или для исключения из исследования, а также общие требования для проведения эксперимента были такими же, как описанные в примере 6. Схема проведения эксперимента представлена на фиг. 4, и схема одного типичного дня эксперимента представлена на фиг. 5.
В утро проведения исследования индивидуумы прибывали в лабораторию. После этого они получали либо напиток, содержащий гидролизат лизоцима, либо плацебо, то есть напиток, содержащий гидролизат казеина. Состав исследуемого напитка и напитка плацебо приведены в табл. 5.
Таблица 5. Состав применяемых напитков
Источник белка Гидролизат казеина Гидролизат лизоцима
сокращение р1с Тгр-Ьусй
г порошка/300 мл 13,6 14,4
Ώηπο оел г- 285 г
χ-’νΜ“ л-υυ ι
Подсластитель ОД 8 ОД §
г Тгр/300 мл ОтношениеТгр/ЬИАА 0,4 0,8
(молярное) 0,04 0,19
Через 90 мин после употребления 300 мл напитка были взяты образцы крови для определения уровней Ίϊρ/Ι.ΝΑΑ (см. пример 6). После этого как группе устойчивых к стрессу, так и группе чувствительных к стрессу волонтеров предлагали выполнить тест, после чего подвергали стрессу. Этот стресс состоял из арифметической задачи, которая должна была выполняться в условиях шума. Субъектов убеждали, что наличие или отсутствие шума зависит от выполнения ими теста. На самом деле, арифметиче- 20 029869
ские задачи были построены таким образом, чтобы все попытки всех субъектов оказались неудачными. Известно, что такая постановка эксперимента вызывает психологический стресс и воспринимается как неконтролируемая (Ре1егк М. Ь., Оойаег! О. Ь. К., ВаШеих К. Е. е! а1. (1998). Сагйюуакси1аг апй са!есИо1атте ^еδρоηδе 1о еxρе^^теηΐа1 δίϊΌδδ: ейес!к о£ теп!а1 е££ог1 апй соп!го11аЬШ1у. РкусИопеигоепйосппо1о§у. 23, 1-17). После арифметической задачи был повторно выполнен первый тест для количественной оценки влияния стресса на выполнение теста под влиянием действующих отношений Ήρ/ΕΝΑΑ в крови.
Проводимые тесты были тестом Маквортса с часами (Маскм-огШ С1оск 1ек1 (Маскм-огШ, Ν (1948) Нте Ьгеакйомп о£ У1§Папсе йипп§ ρ^о1оη§ей У1киа1 кеагсИ. (ЭиаП I Εχρ РкусИ. 1, 6-21)) и Критическим тестом на Слежение (СгШса1 Τι-асктд Τаδк (1ех НК е! а1, (1966) Α "сгШсаГ 1гаскт§ !акк £ог тап-тасЫпе гекеагсИ ге1а!ей !о !Ие оρе^аΐо^'δ еЛесЙуе йе1ау Ите. ΝΑ3Α Соп1гас1 Κ'ρ ΝΑ3Α СК.:1-105)).
Тест Маскм-огШ С1оск Τеδΐ широко применяется для оценки "бдительности", внимательности и концентрации в течение длительного периода времени. Субъекты сидят перед экраном компьютера, на котором изображено 60 расположенных по кругу точек, изображающих секундные отметки на часах. Точки вспыхивают на короткое время в направлении движения часовой стрелки со скоростью одна точка каждые 500 мс. Обычно вращение происходит по одному скачку (по одной точке). Субъектам объясняют, что изредка, с нерегулярными интервалами, движение происходит двойным скачком (через точку), то есть одна точка в нормальной последовательности пропускается. При этом субъект должен нажать на кнопку так быстро, как только возможно. В целом в течение 45-минутного теста происходит тридцать таких событий. В течение каждого следующего 15-минутного периода происходит по десять событий с интервалами от 8 с до 7,2 мин.
Тест на слежение СгШса1 ^аскт^ Τаδк применяется как тест на перцептивно-моторные способности, который позволяет количественно оценить способность контролировать появляющийся сигнал об ошибке в задаче на компенсаторную перцептивно-моторную координацию первого порядка. Во время выполнения этого теста субъект должен контролировать нестабильный курсор на экране компьютера с помощью чувствительного джойстика (ручки управления). Ошибки проявляются как горизонтальные отклонения курсора от средней точки по горизонтальной линейной шкале. Субъект должен стараться удерживать нестабильный курсор в центре оси, чтобы свести отклонение к нулю, постоянно делая компенсирующие движения джойстиком. Частота отклонений курсора увеличивается как стохастическая, линейная функция от времени, так что субъекту приходится делать компенсаторные движения с прогрессивно увеличивающейся частотой. Кроме того, компенсаторные ответы субъекта увеличиваются по частоте с увеличивающейся лаг-фазой (ответ добавляется, а не вычитается из ошибки), вследствие чего контроль теряется. Частота, при которой субъект теряет контроль является критической частотой. Тест повторяется пять раз и расчитывается средняя критическая частота без учета самого низкого и самого высокого значения как зависимая переменная данного теста.
Отношения Ήρ/ΕΝΑΑ в плазме, измеренные через 90 мин после употребления напитка, выявили достоверное (Р<0,0001) влияние используемых экспериментальных условий на изменения отношения Τφ/ΕΝΑΑ в плазме. Прием гидролизата лизоцима ("Τφ-Иуйг") увеличивал значение Ήρ/ΕΝΑΑ в плазме до 0,25 (мкмоль/л). Прием гидролизата казеина ("ρ1^') - до отношения Ήρ/ΕΝΑΑ 0,08 (мкмоль/л) (фиг. 6). Значения для концентрации каждой исследуемой аминокислоты представлены в табл. 6.
Таблица 6. Концентрации аминокислот (мкмоль/л) после употребления ("ρ1^') или гидролизата лизоцима ("Τφ-Иуйг")
Туг Уа1 Не РЬе Ьеи Тгр ΕΝΑΑ Тгр/ΕΝΑΑ
р1с 90 315 107 63 168 60 744 0,082
Тгр-НусЕ 73 266 120 58 152 167 670 0,250
После употребления гидролизата казеина выполнение обеими группами индивидуумов теста Маскм-огШ С1оск Τеδΐ достоверно ухудшилось после стресса. Однако употребление богатого триптофаном гидролизата лизоцима предотвращало такое ухудшение выполнения теста в устойчивой к стрессу группе. Совершенно неожиданно богатый триптофаном гидролизат лизоцима не предотвращал такого ухудшения выполнения теста в чувствительной к стрессу группе. Полученные данные представлены в виде графика на фиг. 7.
В тесте СгШса1 ^аскт^ Τаδк значение лямбда СТ показывает конечный уровень сложности, который был достигнут субъектами. Чем выше значение лямбда СТ, тем лучше контроль. Данные, полученные в этом исследовании, показывают, что после стресса значение лямбда СТ было достоверно выше после употребления богатого триптофаном гидролизата. Среди устойчивых к стрессу индивидуумов наблюдалось увеличение значений на 16% по сравнению со значениями, полученными при использовании плацебо. Совершенно неожиданно в этом тесте значения лямбда СТ в группе чувствительных к стрессу индивидуумов не показали достоверных различий между богатым триптофаном гидролизатом и плацебо.
Пример 10. Устойчивость к протеазам лизоцима и альфа-лактальбумина
Вместе с бета-лактоглобулином альфа-лактальбумин составляет основную массу белков молочной сыворотки. Благодаря своему высокому отношению Ήρ/ΕΝΑΑ изолированные фракции альфалактальбумина, а также гидролизаты альфа-лактальбумина являются популярными для повышения уров- 21 029869
ней триптофана в плазме крови. Хотя альфа-лактальбумин и лизоцим куриных яиц оба имеют необычно высокие отношения Ττρ/ΕΝΑΑ, в других отношениях эти две молекулы являются совершенно разными. Согласно настоящему изобретению, для поддержания высокого отношения Ττρ/ΕΝΆΛ в плазме крови в течение длительного времени молекула с высоким отношением Ττρ/ΕΝΆΛ должна быть устойчивой к пепсину. Здесь мы демонстрируем, что в отличие от лизоцима куриных яиц альфа-лактальбумин не является устойчивым к пепсину.
Это было показано в следующем эксперименте. Для имитации условий, имеющихся в желудке человека, 5% растворы (по весу) лизоцима и белка молочной сыворотки (Βίρτο от Эауйсо) инкубировались с пепсином (1 вес.% пепсина Зщта/вес лизоцима или белков молочной сыворотки) в течение 2 ч при 37°С при рН 4 в буфере Мс Пуапе (0,2 М лимонная кислота плюс Ν;·ι2ΗΡΟ4). После инкубации оба раствора нагревали в течение 5 мин при 80°С для остановки реакции и небольшие аликвоты разделяли с помощью δΌδ-ΡΛΟΕ (см. Материалы и Методы) для оценки целостности различных молекул, обработанных пепсином.
Фиг. 9 четко показывает, что количество интактного лизоцима куриных яиц недостоверно уменьшилось после инкубации с пепсином в кислой среде, Из белков молочной сыворотки беталактоглобулина и альфа-лактальбумина, бета-лактоглобулин остался практически интактным, а альфалактальбумин почти полностью деградировал. Из этого следует, что как лизоцим, так и беталактоглобулин являются "устойчивыми к протеазам" согласно данным теста, описанного в разделе Материалы и Методы, и что альфа-лактальбумин не является "устойчивым к протеазам". Это говорит о том, что в отличие от лизоцима альфа-лактальбумин не может считаться подходящим источником связанного триптофана в составе полипептидов. Несмотря на то, что бета-лактоглобулин является устойчивым к деградации пепсином, эта молекула не является подходящим донором триптофана из-за своего очень низкого отношения Ττρ/ΕΝΆΛ (0,04).
Пример 11. Пролонгирование высоких уровней Ττρ/ΕΝΑΑ с помощью комбинации гидролизата лизоцима с интактной молекулой
Для демонстрации преимущества комбинации композиции связанного триптофана в составе пептидов и связанного триптофана в составе полипептидов было проведено исследование, в котором участвовали 15 здоровых индивидуумов. Критериями для исколючения были: хронические и текущие болезни на усмотрение исследователя, история психиатрических заболеваний, прием селективных ингибиторов обратного захвата серотонина (88Ю), прием пищевых добавок, действие которых направлено на центральную нервную систему, таких как добавки, содержащие триптофан, эфедрин или зверобой, аллергия на куриные яйца, злоупотребление наркотиками, участие в любом другом исследовании, включающим употребление находящихся на стадии исследования или продвижения на рынок продуктов, непереносимость искусственных подсластителей, любое желудочно-кишечное заболевание (история болезни), которое влияет на функцию желудочно-кишечного тракта, на усмотрение исследователя, прием лекарств, мишенью которых является желудочно-кишечный тракт, таких как антациды. Наконец, для женщин критерием исключения также являлись беременность или применение не рекомендованного медициной метода контрацепции.
Процедура
Исследование было проведено согласно схеме рандомизированного двойного слепого перекрестного исследования с перерывом между приемами разных препаратов по меньшей мере в три дня.
Во время трех экспериментальных утренних сессий субъекты посещали лабораторию для мониторирования у них отношений Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови после употребления напитков, содержащих либо 6 г интактного лизоцима, либо 6 г гидролизата лизоцима, либо 6 г смеси гидролизата и интактного продукта. Напитки подавались как стерильные продукты в бутылочках с соломинками. Интактный лизоцим был получен как Эе1уо/уте С. Гидролизат был получен, как описано в примере 7, а смесь включала 30 мол.% триптофана в виде гидролизата и 70 мол.% триптофана в виде интактного лизоцима. Все напитки содержали 6 г происходящего из лизоцима белка, 0,10 г подсластителя (ацесульфама) и были разведены чистой водой до объема 300 мл. Проводящий исследование ассистент не знал состава напитков, употребляемых участниками.
Субъекты приходили в лабораторию от 8 до 9 ч утра и не ели перед этим по меньшей мере 8 ч. В недоминирующую руку субъектам вводили гибкую канюлю для взятия крови. Образцы крови брали перед (1=0)) и после употреблени одного из трех экспериментальных напитков в моменты времени ΐ = 15, 30, 60, 90 120, 180, 210 и 240 мин после употребления для измерения отношений Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови. В течение этих 240 мин запрещалось употреблять любую пищу или напитки, за исключением воды.
Измерения плазмы
Примерно 5 мл крови собирали в пробирку с гепарином лития, перемешивали и немедленно помещали на лед. После этого образцы центрифугировали и 750 мкл плазмы смешивали с 5сульфосалициловой кислотой (4 мг/100 мл плазмы).
Полученные растворы центрифугировали при 13000 об/мин в течение 5 мин и к 20 мкл супернатанта добавляли 40 мкл внутреннего стандарта (160 мг альфа-аминоадипиновой кислоты в 2 л 1,2 мМ НС1).
- 22 029869
Добавляли 50 мкл боратного буфера (из набора \Уа1сг5 АссО.Тад кН ай пг.186003836), 40 мкл 0,4 М ЫаОН и 20 мкл реагента (из набора \Уа1сг5 АссО.Тад кй ай пг.186003836), перемешивали и нагревали в течение 10 мин при 55°С. После этого 1 мкл вносили в колонку и проводили анализ, как описано уап Бук е1 а1 (I. СЬтошаЮ§г. 1993: 620: 143-148).
Результаты
Отношение Ттр/БЫАА в плазме в зависимости от времени при употреблении трех разных напитков показано на фиг. 10. Все три напитка обеспечивали увеличение отношения Ттр/БЫАА. Самое быстрое (в пределах 15 мин) и самое крутое увеличение наблюдалось после употребления гидролизата лизоцима. Интактный лизоцим обеспесивал гораздо более медленное увеличение отношения Ттр/БЫАА, но и снижение отношения Ттр/БЫАА во времени было гораздо более медленным. Смесь интактного и гидролизованного лизоцима обеспечивала промежуточную картину.
При анализе повторных измерений все три напитка демонстрируют достоверно различающуюся зависимость от времени (Р<0,001), что говорит о том, что все три кривые имеют достоверно разную форму. Следует отметить, что все три продукта обеспечивают абсолютно одинаковые значения "площади под кривой", что говорит о том, что как гидролизат лизоцима, так и интактный лизоцим полностью расщепляются и поступают в кровь.
Пример 12. Комбинирование гидролизата лизоцима и интактного лизоцима улучшает вкус конечного продукта
При смешивании гидролизата лизоцима с интактной молекулой было отмечено значительное изменение во вкусовых ощущениях от конечного продукта. Были приготовлены смеси гидролизата и интактной молекулы в следующих отношениях в конечной концентрации 4 г/200 мл воды:
100% гидролизат лизоцима
70% гидролизат лизоцима - 30% Лизоцим
50% гидролизат лизоцима - 50% Лизоцим
30% гидролизат лизоцима - 70% Лизоцим.
Во всех трех комбинациях конечная молярная концентрация триптофана была абсолютно одинаковой. Гидролизат был получен, как описано в примере 7, в качестве интактного лизоцима использовался гранулированный продукт ОеКо/уше О.
Тогда как вкус гидролизата в чистом виде был слегка горьковатым, добавление негидролизованного продукта все больше и больше маскировало горький отенок вкуса и компенсировало его продолжительным слегка сладким вкусовым ощущением. При вкусовых испытаниях опытные дегустаторы предпочитали смеси гидролизат/интактный лизоцим по сравнению с чистым гидролизатом.

Claims (3)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ получения обогащенного триптофаном гидролизата лизоцима, имеющего высокое содержание триптофана и низкое содержание больших нейтральных аминокислот (БЫЛА) и высокое содержание аргинина и лизина, включающий стадии
    ферментативного гидролиза лизоцима в щелочных условиях для получения гидролизата с выходом более чем 30% триптофана из лизоцима и имеющего уровень свободного триптофана менее чем 1 вес.% в расчете на сухое вещество от общего количества триптофана в гидролизате,
    ультрафильтрации полученного гидролизата и
    обогащения гидролизата после ультрафильтрации с помощью ионообменной хроматографии при рН около 3.
  2. 2. Способ по п.1, в котором лизоцим представляет собой лизоцим куриных яиц.
  3. 3. Композиция, содержащая обогащенный триптофаном гидролизат лизоцима, полученный способом по п.1 или 2, предназначенная для увеличения отношения триптофана к сумме тирозина, фенилаланина, лейцина, изолейцина и валина (отношение Ттр/БЫАА) в плазме крови и поддержания этого отношения в течение периода времени от 15 до 240 мин.
    - 23 029869
EA201400526A 2008-04-29 2009-04-27 Способ получения обогащенного триптофаном гидролизата лизоцима и композиция, содержащая гидролизат EA029869B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP08155315 2008-04-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201400526A1 EA201400526A1 (ru) 2014-12-30
EA029869B1 true EA029869B1 (ru) 2018-05-31

Family

ID=39811461

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201400526A EA029869B1 (ru) 2008-04-29 2009-04-27 Способ получения обогащенного триптофаном гидролизата лизоцима и композиция, содержащая гидролизат
EA201001711A EA021506B1 (ru) 2008-04-29 2009-04-27 Композиция для увеличения отношения trp/lnaa в плазме крови и способ ее получения

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201001711A EA021506B1 (ru) 2008-04-29 2009-04-27 Композиция для увеличения отношения trp/lnaa в плазме крови и способ ее получения

Country Status (10)

Country Link
US (2) US8802088B2 (ru)
EP (1) EP2268157B1 (ru)
JP (1) JP5626807B2 (ru)
KR (1) KR101698216B1 (ru)
CN (1) CN102076228B (ru)
BR (1) BRPI0911907B8 (ru)
EA (2) EA029869B1 (ru)
ES (1) ES2550463T3 (ru)
PL (1) PL2268157T3 (ru)
WO (1) WO2009133055A1 (ru)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE548462T1 (de) 2006-11-02 2012-03-15 Dsm Ip Assets Bv Verwendung von lysozymhydrolysaten enthaltend tryptophan
EP2268157B1 (en) 2008-04-29 2015-08-19 DSM IP Assets B.V. Mixture of peptide-bound tryptophan and polypeptide-bound tryptophan
PL2282641T3 (pl) * 2008-04-29 2013-01-31 Dsm Ip Assets Bv Kompozycja zawierająca węglowodany i peptydy, które zawierają tryptofan
EP2624850B1 (en) * 2010-10-05 2015-07-08 DSM IP Assets B.V. Use of tryptophan-rich lysozyme hydrolysate for decreasing appetite during or after stress
ES2651638T3 (es) 2011-04-28 2018-01-29 Dsm Ip Assets B.V. Hidrolizados de proteínas como agentes para superar la adicción
US10194674B2 (en) 2011-09-01 2019-02-05 John C. Gilkey Nutritional compositions
JP2013159591A (ja) * 2012-02-08 2013-08-19 Morinaga Milk Ind Co Ltd 多動性抑制剤
EA030683B1 (ru) * 2012-11-02 2018-09-28 ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. Применение белковых гидролизаторов, богатых триптофаном
CN111643655A (zh) * 2013-12-18 2020-09-11 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于含角蛋白的组织的包含溶菌酶水解物的组合物
US10591221B1 (en) 2017-04-04 2020-03-17 Mainstream Engineering Corporation Advanced cooling system using throttled internal cooling passage flow for a window assembly, and methods of fabrication and use thereof
JP7139727B2 (ja) * 2018-06-29 2022-09-21 キリンホールディングス株式会社 運動制御機能および運動学習機能向上用組成物
NL2022627B1 (en) * 2019-02-22 2020-08-31 Newtricious Bv Lysozyme hydrolysate for proactive inhibitory control and for attention
JP7428480B2 (ja) * 2019-06-06 2024-02-06 雪印メグミルク株式会社 睡眠改善用組成物及び組成物を含む食品、医薬品、飼料
US20220288125A1 (en) * 2021-03-15 2022-09-15 Stokely-Van Camp, Inc. Nutritional Composition for Improving Sleep

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02279700A (ja) * 1989-04-19 1990-11-15 Asahi Chem Ind Co Ltd 高トリプトファン含有ペプチド
WO2002046210A1 (en) * 2000-12-06 2002-06-13 Campina Melkunie B.V. Method for preparing tryptophan rich peptides

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2657013B1 (fr) * 1990-01-18 1992-05-15 Medgenix Group Sa Composition dietetique a base de polypeptides et acides amines.
JP4221231B2 (ja) * 2002-02-28 2009-02-12 株式会社ファーマフーズ 抗菌組成物、その製造方法及び該抗菌組成物を含有する抗菌剤
CN1968691B (zh) * 2004-04-19 2010-12-29 麒麟麦酒株式会社 用于通过葡糖异生作用加速酒精代谢或从疲劳恢复的组合物
CN101022737B (zh) 2004-07-22 2012-08-15 格罗伯斯卵类科学有限公司 抗高血压的功能性食品
EP1685764A1 (en) * 2005-01-27 2006-08-02 Globus Egg Sciences B.V. Anti-hypertensive functional food products
US7618669B2 (en) * 2005-06-01 2009-11-17 Mead Johnson Nutrition Company Low-lactose partially hydrolyzed infant formula
ATE548462T1 (de) * 2006-11-02 2012-03-15 Dsm Ip Assets Bv Verwendung von lysozymhydrolysaten enthaltend tryptophan
EP2268157B1 (en) * 2008-04-29 2015-08-19 DSM IP Assets B.V. Mixture of peptide-bound tryptophan and polypeptide-bound tryptophan
PL2282641T3 (pl) * 2008-04-29 2013-01-31 Dsm Ip Assets Bv Kompozycja zawierająca węglowodany i peptydy, które zawierają tryptofan

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02279700A (ja) * 1989-04-19 1990-11-15 Asahi Chem Ind Co Ltd 高トリプトファン含有ペプチド
WO2002046210A1 (en) * 2000-12-06 2002-06-13 Campina Melkunie B.V. Method for preparing tryptophan rich peptides

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEULENS Joline W.J. et al. Alpha-lactalbumin combined with a regular diet increases plasma Trp-LNAA ratio. Physiology & Behavior, 81, 2004, p. 585-593 *
MINE Yoshinori et al. Antimicrobial Peptides Released by Enzymatic Hydrolysis of Hen Egg White Lysozyme. J. Agric Food Chem, 2004, 52, p. 1088-1094 *

Also Published As

Publication number Publication date
PL2268157T3 (pl) 2015-12-31
BRPI0911907A2 (pt) 2015-07-28
US20110110919A1 (en) 2011-05-12
JP5626807B2 (ja) 2014-11-19
BRPI0911907B1 (pt) 2021-02-02
ES2550463T3 (es) 2015-11-10
US8802088B2 (en) 2014-08-12
KR20100135319A (ko) 2010-12-24
WO2009133055A1 (en) 2009-11-05
EP2268157B1 (en) 2015-08-19
EA021506B1 (ru) 2015-07-30
BRPI0911907B8 (pt) 2021-05-25
US9770493B2 (en) 2017-09-26
EA201400526A1 (ru) 2014-12-30
KR101698216B1 (ko) 2017-01-19
EP2268157A1 (en) 2011-01-05
JP2011523547A (ja) 2011-08-18
CN102076228A (zh) 2011-05-25
US20150037313A1 (en) 2015-02-05
EA201001711A1 (ru) 2011-06-30
CN102076228B (zh) 2016-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA029869B1 (ru) Способ получения обогащенного триптофаном гидролизата лизоцима и композиция, содержащая гидролизат
US9993515B2 (en) Methods of treatment using water-soluble tryptophan-containing peptides obtained by the hydrolysis of hens eggs lysozyme
US7648957B2 (en) Nutritional and therapeutic composition of an insulin sensitizer and a peptide fraction
JP2009517464A (ja) グルカゴン様ペプチド１の活性を増強するタンパク質加水分解物の使用
US20110263505A1 (en) Whey Protein Hydrolysate Containing Tryptophan Peptide Consisting of Alpha Lactalbumin and the Use Thereof
JP2006273850A (ja) 血中乳酸値上昇抑制組成物及びそれを含有する飲食品
US20100286034A1 (en) Uses for aqueous streams containing proteins
CN101535494B (zh) 含有色氨酸的肽
US9629890B2 (en) Peptides containing tryptophan
JP7428480B2 (ja) 睡眠改善用組成物及び組成物を含む食品、医薬品、飼料
JPH07215851A (ja) 抗アレルギー剤及びその製造法
US20240156922A1 (en) Fungal protease mixtures and uses thereof
JP2019041696A (ja) 経口用組成物
JPH02128669A (ja) アミノ酸類含有食品組成物
WO2023034592A1 (en) Fungal enzyme mixtures and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM