CN101535494B - 含有色氨酸的肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生产组合物的工艺，所述组合物包含水溶性肽并具有多于0.15的Trp/LNAA比例，所述工艺包括水解溶菌酶(优选地为鸡卵溶菌酶)以制备具有5和45之间的DH的水解产物。

Description

含有色氨酸的肽

发明领域

本发明涉及含有色氨酸的肽。 

发明背景 

脑内的血清素(serotonine)水平已与情绪、机警、警觉、睡眠开始和质量、抗焦虑作用、抑郁、感情反应控制、食欲和性行为相关联。存在许多出版物，其中脑血清素水平的改变与天然氨基酸L-色氨酸(Trp或W)的可用度相关。因为这种关联，提高血浆色氨酸水平的方法受到大量关注。已有报道，每个个体1克/天左右的色氨酸量产生临床显著的作用(Markuset al.，Am.J Clin.Nutr 2005；81，1026-1033)。提高血浆色氨酸水平的一种方法涉及消耗富含乳清蛋白(whey protein)α-乳白蛋白(lactalbumin)的蛋白质制剂。α-乳白蛋白制剂是可容易获得的，并具有相对高的色氨酸浓度。然而，其中提供α-乳白蛋白的途径(见例如DE 4130284和JP 2279700)并未考虑脑色氨酸和血清素水平的主要决定因子不只是血浆色氨酸浓度，而是所谓的Trp/LNAA比例(Fernstrom and Wurtman.Science 1971，173，149-152)。该Trp/LNAA比例代表血浆中色氨酸相对于大中性氨基酸(LargeNeutral Amino Acid，LNAA；即酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的和)的摩尔比例。这些LNAA与色氨酸竞争摄入大脑，推测是因为使用了相同的跨越血-脑屏障的转运机制。因此，提高脑色氨酸浓度的最有效途径是供应具有高Trp/LNAA比例的制备物。大量出版物a.o.WO02/46210涉及从α-乳白蛋白制备具有提高的Trp/LNAA比例的肽级分。 

显然，游离色氨酸(即游离氨基酸)的使用会提供最简单和最便宜的途径，用于提供具有高Trp/LNAA比例的制剂。然而，在许多国家中，存在严格管制游离色氨酸供应的立法。游离色氨酸在其多种应用形式中的最大允许水平在各个国家不同。为了以更自然的方式供应额外的膳食色氨 酸，更近期的途径着眼于提供富含色氨酸的蛋白质。如所述的，α-乳白蛋白及其水解产物已作为提高血浆色氨酸水平的安全选择获得普及。然而，α-乳白蛋白作为色氨酸富集制剂起点的用途伴随着最大Trp/LNAA比例和成本方面的缺点。α-乳白蛋白和β-乳球蛋白形成组成乳清的主要蛋白质。因为在工业规模上完全分离α-乳白蛋白和β-乳球蛋白是困难的，所以意味着成本有效的α-乳白蛋白制剂会同样含有β-乳球蛋白。尽管α-乳白蛋白具有5.3％的摩尔色氨酸含量，但是β-乳球蛋白的色氨酸含量仅为2％。尽管α-乳白蛋白具有0.11的摩尔Trp/LNAA比例，但是β-乳球蛋白具有不多于0.04的摩尔Trp/LNAA比例。因此，显然β-乳球蛋白对α-乳白蛋白制剂的任何污染会显著降低最终产物的Trp/LNAA比例。 

考虑到对能够调控脑血清素水平的制剂的广泛兴趣，人们需要下述改进的生产方法，所述生产方法用于生产可在多种食物和营养药物制品中广泛应用的、具有高Trp/LNAA比例的蛋白质和肽制剂。 

发明简述 

本发明涉及生产组合物的工艺，所述组合物包含水溶性的、含色氨酸的肽，优选地含有至少两种水溶性的、含色氨酸的肽，并具有多于0.15、优选地在0.15和1.8之间的Trp/LNAA比例，所述工艺包括水解溶菌酶，优选地水解鸡卵溶菌酶(hen egg lysozyme)，以制备具有5和45之间DH的水解产物，并任选地去除含精氨酸或赖氨酸的肽中的部分。优选地，所述组合物包含AW或GNW，更优选地包含AW和GNW。所述水解产物优选地具有10和40之间的DH。 

本发明还涉及下述组合物，其包含至少两种不同的水溶性肽，并且其中组合物的摩尔Trp/LNAA比例至少为0.15，优选地在0.15和1.8之间。优选地所述组合物包含AW或GNW，优选地包含AW和GNW，最优选地包含AW和GNW，其中AW与GNW的摩尔比例在1比2到10比1之间，优选地在1比2和5比1之间。另外，本发明提供了富含色氨酸的水溶性肽的组合物。有利地，本发明还涉及包含至少两种不同的二肽或三肽的组合物，其中选自二肽或三肽的两种肽以占二肽和三肽总量至少5mol ％的量存在，且在所述组合物中，与肽结合的色氨酸中多于30mol％、优选地多于40mol％、更优选地多于50mol％、进一步更优选地多于60mol％、仍然更优选地多于70mol％和最优选地多于80mol％以二肽或三肽的形式存在，优选地所述组合物具有多于0.15、优选地在0.15和1.8之间的Trp/LNAA比例。与肽结合的色氨酸表示作为肽中的氨基酸存在的色氨酸。 

该组合物优选地是溶菌酶水解产物或经纯化的溶菌酶水解产物。在本发明的一个实施方案中，溶菌酶水解产物尤其富含精氨酸残基。精氨酸不属于大中性氨基酸(LNAA)组，但是已知其胰岛素刺激效应。我们发现根据本发明的水解产物能够体内产生高血浆Trp/LNAA比例。非常惊人的是发现在血浆中检测的Trp/LNAA比例比水解产物的Trp/LNAA比例更高。本发明的又一优点是含Trp的肽非常小，从而即便是与具有较不优良的Trp/LNAA比例的富含蛋白质的产物组合时，水解产物仍立即产生高的血浆Trp/LNAA比例。组合物还可含有游离的色氨酸。优选地，水解产物不含有多于1wt％(以干物质计)的游离色氨酸。 

本发明的另一方面是下述组合物用于改善情绪、认知、食欲、机警、警觉、睡眠开始和质量、抗焦虑作用、抑郁、感情反应控制或性行为的用途，或在用于情绪、认知、食欲、机警、警觉、睡眠开始和质量、抗焦虑作用、抑郁、感情反应控制或性行为的食物、宠物食物、饲料、膳食补剂或营养药物组合物的制备中作为成分的用途，所述组合物是通过水解溶菌酶、优选地水解鸡卵溶菌酶获得的组合物，或是根据本发明的另一组合物。除了溶菌酶水解产物以外，组合物还含有碳水化合物以及针对“脑”营养、释放压力或抑郁或改善机警、情绪、认知或睡眠模式的推荐化合物。 

另外，本发明涉及AW、SW或GNW用于改善情绪、认知、食欲、机警、警觉、睡眠开始和质量、抗焦虑作用、抑郁、感情反应控制或性行为的用途，或在用于情绪、食欲、食欲、机警、睡眠开始和质量、抗焦虑作用、抑郁、感情反应控制或性行为的食物、饲料、膳食补剂或营养药物组合物的制备中作为成分的用途。 

本发明公开了下述食物(包括婴儿配方)、宠物食物、饲料、膳食补剂或营养药物组合物，它们包含根据本发明的工艺生产的组合物或根据本发明的组合物，所述组合物包含GNW、SW或AW作为存在的肽。 

根据又一实施方案，提供了水溶性含色氨酸的肽或本发明的组合物用于在摄取肽或蛋白质后90分钟内、优选地60分钟内、最优选地30分钟内提高血浆中Trp/LNAA比例的用途，或用于制备下述营养药物组合物的用途，所述营养药物组合物用于在摄取肽后90分钟内、优选地60分钟内、最优选地30分钟内提高血浆中的Trp/LNAA比例。 

发明详述 

本发明提供了包含以肽形式存在的色氨酸的组合物，其非常适用于在非常短的时间间隔中提供血浆中Trp/LNAA比例的有效提高。我们注意到包含色氨酸的二肽和三肽有利地帮助该提高。在本发明的一个实施方案中，在工业过程中用酶(预)水解溶菌酶，优选地鸡卵溶菌酶，即(鸡卵)溶菌酶优选地以水解产物的形式提供。以水解产物形式提供时，含色氨酸的肽的胃肠吸收被大幅促进。在本申请的另一实施方案中，鸡卵溶菌酶被转化为水解产物，其中包含带正电荷的精氨酸和赖氨酸残基的肽的水平被降低。后一水解产物的特征是高于0.14的摩尔Trp/LNAA比例。还在本申请的另一实施方案中，鸡卵溶菌酶被转化为包含肽群体的水解产物，所述肽群体中多于50％、优选地多于60％、更优选地多于75％的存在的肽具有低于500Da的分子量。这具有下述条件：水解产物中存在的肽的分子量分布如本申请的材料和方法章节中所述完成。 

后一实施方案的一个重要优点是：包含在二肽和三肽中的色氨酸在口服消耗后立即跨越肠壁转运进入血流中。因此，血浆色氨酸水平提高，几乎立即伴有对脑血清素水平的直接影响。本申请实施例6中展示的数据显示，以这类二肽和三肽形式存在的色氨酸残基非常快速地导致高Trp/LNAA比例。在这一方面，以这些二肽和三肽形式存在的色氨酸残基似乎比游离的色氨酸甚至更有效。根据本工艺获得至少具有0.15的分子Trp/LNAA比例的水溶性肽级分，只要如本申请的材料和方法章节中所述 进行水解产物的氨基酸分析即可。 

以二肽和三肽形式提供色氨酸的另一重要优点还在于：这些肽的胃肠吸收迅速到使得它们能够与含有蛋白质的食物如乳制品(其天然地具有较不优良的Trp/LNAA比例)组合消耗，并仍然导致在消耗后90分钟内，优选地60分钟内，更优选地30分钟内的周期中有效提高血浆中的Trp/LNAA比例。 

因此，本发明提供了本发明组合物(例如包含色氨酸的水溶性肽)用于在摄取肽后90分钟内、优选地60分钟内、最优选地30分钟内获得提高的血浆Trp/LNAA比例的用途，或用于制备下述营养药物组合物的用途，所述营养药物组合物用于在摄取肽后90分钟内、优选地60分钟内、最优选地30分钟内获得提高的血浆Trp/LNAA比例。优选地，蛋白质或含蛋白质食物的消耗与水溶性肽同时或几乎同时。提高的Trp/LNAA比例表示与消耗或摄取本发明的组合物之前的情况相比该比例的提高。 

“蛋白质”或“多肽”在本文中被定义为包含多于30个氨基酸残基的链。 

“肽”或“寡肽”在本文中被定义为通过肽键连接的至少两个氨基酸的链。术语“肽”和“寡肽”被认为是同义的(如通常所认为的那样)，且每种术语可根据上下文的需要交换使用。 

“水溶性”肽是在5.0的pH下可溶于水的肽。 

本文中所有(寡)肽和多肽式根据通常的实践从左到右以氨基端到羧基端的方向书写。本文中使用的氨基酸的单字母密码是本领域通常已知的，并可见于Sambrook，et al.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2^nded.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989)中。 

蛋白质水解产物、水解产物或经水解的蛋白质表示通过蛋白质的酶水解形成的产物，富集的水解产物是下述蛋白质水解产物级分，其例如富含选定的肽，或其中肽或多肽已从水解产物中被去除。因此，富集的水解产物优选地是肽的混合物(或肽混合物)。因此，本发明的肽混合物是至少两种，优选地至少三种，更优选地至少四种含色氨酸的肽的混合物。更优 选地，混合物包含肽的群，所述群的多于50％、优选地甚至多于60％、最优选地多于75％的存在的肽具有低于500Da的分子量。含色氨酸的肽表示包含至少一个L-色氨酸氨基酸残基的肽。 

Trp/LNAA比例表示色氨酸相对于其它大中性氨基酸(LNAA；即酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的总和)水平的摩尔比例。除了血浆Trp/LNAA比例外，Trp/LNAA比例仅涉及与肽结合的氨基酸。因此，游离的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸不被考虑进Trp/LNAA比例中。 

与肽结合的氨基酸是属于肽部分的氨基酸，并且不是游离的氨基酸。 

Tyr/BCAA比例表示酪氨酸相对于支链氨基酸(BCAA；即亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的总和)水平的摩尔比例。优选地，Tyr/BCAA比例高于0.1，优选地高于0.12。 

优良的睡眠开始和质量被定义为在上床后45分钟内进入的静态睡眠。 

情绪被定义为精神的兴奋状态，并优选地使用情绪状态类型问卷法(Profile of Mood States questionnaire)测量(见本申请的实施例6)。 

认知被定义为与例如解决问题、学习、记忆和语言这类领域相关的组合技能。 

食欲被定义为进食的期望，其通过感觉或饥饿刺激。 

机警被定义为精神的注意或警惕状态，优选地使用Mackworth Clock测试和临界追踪任务(Critical Tracking Task)测量(见本申请的实施例9)。 

抗焦虑(anxiolytic)作用是导致释放恐惧、不安(apprehension)或担忧的感觉的作用。 

抑郁被定义为一种精神状态，特征是严重和持久的丧失愉快的感觉。 

术语性行为在本文中被用作性欲(libido)的同义词。 

在WO02/46210中描述了提高乳清蛋白水解产物中色氨酸水平的方法。在使用的方法中，首先在酸性pH下用一种或多种酸性蛋白酶水解乳清，优选地用胃蛋白酶、凝乳酶(rennin)、酸性真菌蛋白酶、凝乳酶 (chymosin)、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶或无花果蛋白酶水解乳清。优选的孵育条件在pH 1.5和3.5之间，并对其进行选择，以产生具有疏水性质的肽。水解有意地以下述方式进行，所述方式使得色氨酸残基被掺入大的疏水肽中。小的、更溶于水的肽中存在少得多的色氨酸。在随后的加工步骤中，pH被提高至4.0到6.0，以促进这些大的、含色氨酸的肽沉淀，从而便于从乳清水解产物中选择性回收它们。然而，所述工艺具有若干缺点。色氨酸作为大的酸性不溶肽中的存在被获得，这意味着例如在酸性饮品中的应用会有问题。另外，由于色氨酸存在于相对大的肽中的事实，色氨酸进入血的吸收会被延迟，从而限制了制剂作为食物或饮料成分(特别是与其它蛋白质组合)的应用可能性。使用这类大肽的另一缺点是这类肽可造成变应性反应。对于乳清蛋白的这类反应是公知的。 

本发明通过公开简单的水解工艺克服了这些缺点，所述工艺用工业可获得并且特征是高Trp/LNAA比例的蛋白质开始。本发明的工艺具有以蛋白质色氨酸为基础多于30％的色氨酸产率，并产生包含色氨酸的水溶性肽组合物。色氨酸残基的较大部分包含在二肽和三肽中这一事实意味着立即摄入血流中。如即将公开的，该特性允许在多种食物或营养药物制品中掺入所述水解产物。非常惊人地是本发明还公开了：通过口服消耗，根据本发明的水解产物能够产生比实际的水解产物Trp/LNAA比例更高的血浆Trp/LNAA比例。最后，含色氨酸的肽混合物还有低抗原性的特征。 

根据本发明，鸡卵溶菌酶被用作便利的底物，用于提供具有高Trp/LNAA比例的制剂。溶菌酶以3-4％的浓度存在于卵白中。通过利用其格外高的等电点，使用简单的阳离子色谱纯化步骤将其从卵白中工业分离。得到的产物几乎是纯的，并且该工业可获得的产物具有7.8％的分子色氨酸含量和至少0.15的分子Trp/LNAA比例。因此，纯溶菌酶具有比纯α-乳白蛋白和/或β-乳白蛋白更高的Trp/LNAA比例。因此，根据本发明的溶菌酶水解产物优选地具有高于0.15的摩尔Trp/LNAA比例，更优选地Trp/LNAA比例高于0.20，进一步更优选地Trp/LNAA比例高于0.23，仍然更优选地Trp/LNAA比例高于0.25，最优选地Trp/LNAA比例高于0.30。通常，摩尔Trp/LNAA比例低于3.0。同样，这类溶菌酶代表了含色 氨酸的肽或组合物的优选的起点。溶菌酶(EC3.2.1.17)是能够水解细菌细胞壁中特异肽聚糖键，导致细胞裂解的酶。因为其杀细菌作用，溶菌酶通过防止感染在宿主防御(host defence)中起到重要作用。在生理条件下，溶菌酶分子非常能抵抗蛋白水解攻击。该罕见的抗性可在进化基础上解释：因为入侵的细菌能够分泌多种蛋白酶，因此对这类蛋白酶易感的溶菌酶分子会被快速失活。已针对a.o.反刍动物的胃溶菌酶阐述了其蛋白酶抗性(Dobson et al，J.Biol Chem.1984，259(18)11607-11616)。从结构观点来看，分子中四个二硫键的存在可被预期增加溶菌酶的蛋白酶抗性。在本申请的实施例1中所示数据的基础上，鸡卵溶菌酶可被认为如此抵抗蛋白水解攻击，使得该分子不太可能能够在人肠道的相关部分中被有效消化。该蛋白酶抗性的结果是，尽管其具有非常吸引人的Trp/LNAA比例，但是不完整的溶菌酶不是产生血浆色氨酸水平的合适来源，仅仅因为色氨酸残基在胃肠道中存在的生理条件下不被解离。 

膳食摄取后，存在于食物中的蛋白质被逐渐水解为更小的片段，然后被转运穿过小肠壁并吸收进血中。在胃肠道中，从胃、胰和小肠产生的大量不同的蛋白酶能活性水解膳食蛋白质。内切蛋白酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶将大分子量蛋白质切割为较小的寡肽。这些寡肽随后被大量其它酶如二肽基和三肽基肽酶进一步水解，产生二肽和三肽，并被氨基肽酶和羧基肽酶水解产生游离氨基酸。特异转运游离氨基酸或二肽和三肽的运载体体系负责穿越肠壁有效转运进入血流。膳食摄取后，游离氨基酸、二肽和三肽立即被掺入血流中。比三肽更大的肽需要额外的酶切割使得能够吸收。 

我们发现，如果被掺入以例如乳制品为代表的含高蛋白质的食物基质中，根据本发明的水解产物也是有效的。这是非常惊人的，因为含蛋白质的食物基质表现出高LNAA负荷，并因此可被期望为降低具有高Trp/LNAA比例制品的作用。对这种预料之外的现象的一种可能的解释是：通常的食物制品掺入了完整的而不是充分水解的蛋白质。根据本发明的水解产物的典型大小分布在图3中展示。根据该图，大部分掺入色氨酸和酪氨酸的肽具有低于500Da的分子量。考虑到色氨酸(MW＝186)和酪 氨酸(MW＝163)的非常高的分子量和只存在非常低水平的游离色氨酸，意味着大部分这些肽应该是三肽或二肽。因为色氨酸在使用的波长下具有比酪氨酸高得多的摩尔吸光系数，所以峰值应涉及主要掺入色氨酸的肽。 

因为根据本发明的含色氨酸的二肽和三肽被吸附得比例如未经水解的基质蛋白质所代表的大量LNAA快得多，所以我们推测这是即便存在大量基质蛋白质时仍能获得高血浆Trp/LNAA比例的原因。这样的解释对掺入酪蛋白和谷蛋白的食物基质尤其适用，因为这类蛋白质在胃的酸性条件下显示差的溶解度。然而，其还适用于掺入更多可溶完整蛋白质(如乳清蛋白)的基质，因为即使这类蛋白质的胃肠消化相对低，使得与根据本发明的含色氨酸的二肽和三肽相比，得到的肽的掺入仍被显著延迟。根据实施例6中展示的数据，这样的延迟在30和60分钟之间：足够长到吸收所有含色氨酸的二肽和三肽。因此，蛋白质或含蛋白质食物的摄取可以与水溶性肽同时或几乎同时。几乎同时表示肽的摄取在摄取蛋白质后60分钟内，优选地在30分钟内。 

有趣的是，我们目前的实验数据也似乎表明，根据本发明的水解产物能够在人志愿者体内产生比水解产物的Trp/LNAA比例更高的Trp/LNAA比例。尽管这样的现象是未知的，并且根据我们最大限度的知识不存在对该作用的被接受的解释，但是我们相信，这可能是由溶菌酶分子的极高的精氨酸含量引起的。本文公开了最近提出的工作假设，以解释实施例中所示实验数据。该假设被用于给出本发明人的目前看法，但是本发明不以任何方式关联或限制于该假设。因此，本发明与该假设的正确性无关。血胰岛素的提高刺激了从血进入外周组织(特别是肌肉)的氨基酸吸收。然而，由于在血中色氨酸与血浆蛋白质白蛋白结合的事实，色氨酸在很大程度上避开了该途径。因此，提高的胰岛素水平降低了LNAA而不是色氨酸的浓度，进而提高了血中的Trp/LNAA比例。因为碳水化合物的摄食引发胰岛素分泌，并刺激外周组织和尤其是肌肉中LNAA的吸收，所以通过碳水化合物摄取提高血浆Trp/LNAA比例(Fernstrom and Wurtman，1972，Metabolism，Vol.21，No.4，337-342)。除了被碳水化合物摄食刺激外，也已知胰岛素分泌被具体的氨基酸刺激。如果灌输个体氨基酸造成的血浆氨基 氮水平非常相似，则胰岛素应答可观地变化。Floyd et al(J Clin Invest45(9)：1487-502)确立了针对氨基酸的递减的胰岛素应答：精氨酸＞赖氨酸＞亮氨酸＞苯丙氨酸＞缬氨酸＞甲硫氨酸。考虑到溶菌酶尤其富含氨基酸精氨酸的事实，倾向于推测：由精氨酸引发的胰岛素刺激作用导致高的Trp/LNAA比例。因为已知碳水化合物的胰岛素刺激作用，所以根据本发明的碳水化合物优选地被配制为与碳水化合物组合。 

在本发明的一个实施方案中，溶菌酶，优选地鸡卵溶菌酶在工业过程中被酶(预)水解，即(鸡卵)溶菌酶优选地以水解产物或富集的水解产物形势提供。以这类(富集的)水解产物形势提供时，极大地便利了含色氨酸的肽的肠吸收。在本申请的另一实施方案中，鸡卵溶菌酶被转化为包含色氨酸的水解产物或富集的水解产物，其包含下述肽群体，其中多于50％、优选地多于60％、更优选地多于75％的存在的肽具有低于500Da的分子量。优选地，这类(富集的)水解产物不含有多于1wt％(以干物质计)的游离色氨酸。存在于水解产物中包含色氨酸的肽的分子量分析如本申请的材料和方法章节中所述进行，并在图3中阐述。后一实施方案的一个重要有点是二肽和三肽中包含的色氨酸在口服消耗后立即被穿过肠壁转运进入血流中。因此，血浆色氨酸水平被提高，几乎同时伴有对脑血清素水平的直接影响。非常惊人的是本申请实施例6中所示数据显示，以这些二肽和三肽形势存在的色氨酸残基的有效性比游离的色氨酸甚至更有效。该观察结果强调了本发明提供的优点。 

还在本申请的另一实施方案中，(鸡卵)溶菌酶水解产物被分级分离，从而提高水解产物级分的色氨酸含量。该级分或富集的水解产物与分级分离前的水解产物相比优选地具有提高的Trp/LNAA比例。水解产物或具有额外的游离色氨酸的经富集的水解产物的富集，这也形成了本发明的部分。在制备这类经富集的水解产物的一个优选的选项中，利用了我们的下述观察结果：溶菌酶掺入罕见大量的碱性精氨酸和赖氨酸残基。惊人地，作为选择的酶孵育条件(即选择具有正确切割偏好的内切蛋白酶如枯草杆菌蛋白酶，与产生高粱二肽和三肽的孵育条件组合，所述二肽和三肽掺入色氨酸但是几乎没有精氨酸或赖氨酸残基)的结果，我们能够生产根 据本发明的富集的溶菌酶水解产物。因此，掺入精氨酸或赖氨酸残基的含LNAA的肽能够从不具有这类碱性残基的含色氨酸的肽中分离。例如，通过将水解产物的pH调节至4和6之间、更优选地5.0和5.5之间的数值，不具有这类碱性残基的肽会不带电荷，并因而具有降低的亲水性。这些特征可例如在色谱或其它分离过程中用于我们的优点，以选择性地去除大部分含精氨酸或赖氨酸的肽。因此，含色氨酸的肽的含量被显著提高，并任选地提高了该富集的水解产物的Trp/LNAA比例。可通过已知的技术，如离子色谱、疏水作用色谱或电渗析去除带电的掺入精氨酸或赖氨酸的肽。在相关肽的层析分离中使用这类特征的实践背景可见于a.o.the ProteinPurification Handbook(issued by Amersham Pharmacia Biotech，nowadays GEHealthcare Bio-Sciences，Diegem，Belgium)。在朝向下述制剂的进一步更先进的纯化途径中，有利地使用溶菌酶中带有酸性侧基的氨基酸如谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)残基的存在，所述制剂将高色氨酸含量与高Trp/LNAA比例结合。在该途径中，根据本发明的溶菌酶水解产物的pH首先被调节至3.0，然后在阳离子树脂上进行色谱。在该pH值下，掺入Glu或Asp的肽会通过柱，其它肽则会结合。随后用pH 5缓冲液的洗脱会解吸附如所述的不含赖氨酸或精氨酸残基的所有结合的肽。大部分含有色氨酸的肽会在经解吸附的该级分中。然后通过用具有甚至更高pH值的缓冲液洗脱，从柱上去除剩余的结合肽。该优良的途径在本申请的实施例4中阐述。 

尽管对于本发明而言，优选地使用离子交换色谱和/或疏水作用色谱，但是也可使用其它合适的色谱分离方法，包括亲和色谱和尺寸排除色谱。可通过本领域已知的方法完成从得到的水性级分中回收富含色氨酸的肽。为了获得浓缩的和保质期稳定的产物，回收优选地包括蒸发和(喷雾)干燥步骤。另外，之后是蒸发/沉淀步骤的纳米过滤和涉及有机溶剂的萃取过程代表了对期望的纯化的选项。优选地通过蒸发溶剂进行从有机溶剂中回收富含色氨酸的肽。 

WO 2006/009448提供了得自鸡卵蛋白质的具有抗高血压特性的蛋白质水解产物，以及包含这些水解产物的食物制品和食物补剂。该文件公开了 大量水解产物(包括得自鸡卵溶菌酶的水解产物)的制备。所有这些水解产物目的是在人中口服摄食后降低血压或预防血压升高。WO 2006/009448还公开了在碱性条件下使用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)(EC3.4.21.62；商品名称Alcalase或Protex)获得的溶菌酶水解产物制剂。根据获得的高水解程度，这些溶菌酶水解产物含有大比例的具有低于500Da分子量的肽。然而，在WO 2006/009448的上下文中均未涉及下述事实：溶菌酶是具有高色氨酸含量的蛋白质来源，其能够积极影响脑血清素水平。也没有提到溶菌酶水解产物包含水溶性肽，所述肽掺入了大量色氨酸和相对少量的LNAA。WO 2006/009448还未提到溶菌酶或溶菌酶水解产物任一的高精氨酸和赖氨酸含量。我们根据本申请中所示数据已经发现，溶菌酶分子的高色氨酸含量与精氨酸和赖氨酸的普遍存在组合，使得溶菌酶成为体内产生高Trp/LNAA比例的完美的起始材料。另外，WO 2006/009448的上下文未提到根据本发明的水解产物与其它含蛋白质的食物共同消耗时所提供的优点。除了膜滤器的使用以外，WO 2006/009448的上下文还没有提到从具有选定的氨基酸组成的这些水解产物中获得肽级分的方法，或使用特异方法提高色氨酸含量或提高Trp/LNAA比例的方法。另外，未记录提供高度降解的、低变应原性的溶菌酶水解产物的优点。 

尽管事实上溶菌酶在生理条件(即在酸性pH下使用胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶作为蛋白酶)下显示高度抵抗蛋白水解，但是在这类较不优良的酸性条件下也可获得根据本发明的溶菌酶水解产物。然而，在这类条件下需要相对苛刻的孵育条件，例如高得多的酶浓度、更高的温度和任选地额外的内切蛋白酶。 

本申请实施例4中所示数据表明，通过在碱性pH下用枯草杆菌蛋白酶孵育溶菌酶获得的溶菌酶水解产物尤其富含Ala-Trp(AW)二肽。该发现提出化学合成的AW二肽可能为本发明溶菌酶水解产物提供合适的备选方案。尽管合成的二肽的使用具有明显的立法缺点，但是重要的优点是其成本有效性及其理想的Trp/LNAA比例。理论上可获得二十种不同的含色氨酸的二肽，但是我们的研究显示二肽Ala-Trp(AW)和Ser-Trp(SW)代表了通过合成二肽增强血浆Trp/LNAA比例的尤其优选的选项。可能使用例如 “Peptides：Chemistry and Biology”by N.Sewald and H.D.Jakubke，Eds.Wiley-VCH Verlag GmbH，2002，Chapter 4中所述的常规技术，通过化学合成生产AW和SW二肽。适用于大规模生产的尤其成本有效的化学肽合成方法基于用于活化羧基的烷基氯甲酸酯或特戊酰氯化物的使用，与用于C-端保护的甲基酯和用于N-保护的苄氧羰基(Z)或叔丁基氧羰基的使用组合。用于二肽SW的成本有效合成的详细步骤在实施例5中提供。 

能够获得根据本发明的溶菌酶水解产物后，我们设想了具有技术和经济优点的其它新的和惊人的应用。 

一种新的应用是在多种婴儿配方制品中掺入本发明的肽。牛乳含有20％的乳清蛋白，人乳则含有40％到60％。因此，牛乳含有比人乳少的α-乳白蛋白，进而含有比人乳少的色氨酸。正常的、足月的婴儿通常被喂养基于牛乳的配方，其为不能提供等价于母乳的氨基酸构成的制品。尽管色氨酸供应不足的结果尚未完全已知，但是具有高色氨酸的婴儿配方制品可对婴儿的认知行为和睡眠开始和质量具有有益的影响。Yogman and Zeisel在N Engl J Med.1983 Nov 10；309(19)：1147-1149中提供了有力的迹象：在健康新生儿中，高血浆色氨酸水平促进了静态睡眠的快速开始。因此，本发明提供了用于婴儿配方制品的组合物，其中已使用得自(鸡卵)溶菌酶的(富集的)水解产物提高了色氨酸水平。优选地，这类婴儿配方制品中使用的(鸡卵)溶菌酶被熔解至防止变应原性问题的程度，即鸡卵溶菌酶优选地以低变应原性水解产物的形式被提供。 

根据本发明的另一方面，根据本发明的(富集的)水解产物可以在膳食替代制品中使用。例如，WO 2005/023017描述了高剂量明胶作为膳食替代制品中合适组分的优点。尽管提供了极佳的感官特性，但是明胶不提供需要的氨基酸平衡，例如其不掺入必需氨基酸色氨酸。因此，为了达成具有EC Directive 96/8/EC所要求的氨基酸适当平衡的组合物，必须向这类含明胶的组合物中添加色氨酸。在WO 2005/023017中，优选地以富含色氨酸的蛋白质(例如卵清粉或全卵粉)的形式添加色氨酸。我们目前已发现，根据本发明的含色氨酸的水解产物对该问题提供了改进的溶液，因为这些水解产物以浓缩得多的形式供应色氨酸。另外，溶菌酶自身以所需量 含有所有必需氨基酸，并同样是理想地适合膳食替代品的全营养蛋白质。 

根据本发明的又一方面，根据本发明的水解产物被用于刺激食欲。我们非常惊人地发现具有高Trp/LNAA比例的制剂会刺激血浆生长素释放肽(ghrelin)水平。生长素释放肽已知是“饥饿”激素，并且刺激生长素释放肽生产已显示在人中提高食物摄取和体重(Wren et al.，2001，J Clin EndocrinolMetab 86，5992-5995)。因为该预料之外的作用，根据本发明的水解产物在例如临床食物中提供优点，因为严重病患者(critically ill)趋向于戒除所有食物，这减缓了他们的恢复。 

根据本发明的又一方面，根据本发明的水解产物被用于在婴儿、儿童和成人中改善睡眠开始和质量。睡眠问题在属于多种年龄组的个体中非常盛行，并与医学病症相关。根据本发明的水解产物适用于治疗普遍的睡眠问题，但是他们代表了克服认知、心理、社交(social)和行为紊乱(disturbance)相关问题的一种有用工具。例子是建立良好的睡眠卫生，克服睡眠开始联合征(sleep-onset association)或昼夜节律睡眠障碍(circadianrythym sleep disorder)。所述制品还可适用于改善例如纤维肌痛患者的睡眠开始和质量和精神状态。纤维肌痛综合征是一种慢性疼痛综合征，其与严重紊乱的睡眠开始和质量和情绪紧张(emotional stress)相关。我们发现，根据本发明的富含色氨酸的水解产物的规律摄入一般改善受睡眠问题困扰的个体的睡眠开始和睡眠质量。 

根据本发明的含色氨酸的水解产物提供了额外的优点，例如供应(半)必需的氨基酸。溶菌酶不仅具有高色氨酸水平，而且同样掺入显著量的酪氨酸残基。酪氨酸是神经递质多巴胺的前体，并且已知血浆酪氨酸水平影响脑中的多巴胺水平。溶菌酶水解产物不仅比其它已知的高色氨酸肽含有更少的LNAA，而且比其它已知的高色氨酸肽含有更少的支链氨基酸(BCAA)。这是重要的，因为已知BCAA降低多巴胺前体酪氨酸的血浆可利用度。因此，其高Trp/LNAA比例与其高Tyr/BCAA比例组合，使溶菌酶成为独特的分子。因此，根据本发明的溶菌酶水解产物被非常适当地定位为“脑食物”，也就是说，用于供应适当的神经递质水平所需的必需氨基酸。已知多巴胺体系介导报酬(reward)和动机(motivation)的关键作 用，及其对集中精神(concentration)、记忆、机警、注意力、解决问题和精神运动协调的影响。如本申请实施例9中所阐述的，根据本发明的溶菌酶水解产物的摄入对警觉、机警、集中精神和精神运动协调(psychomotorcoordination)具有显著的有益影响。该发现证实根据本发明的溶菌酶水解产物可被期望为不仅刺激血清素体系，而且刺激多巴胺体系。 

若干组个体可受益于该发现。例如，绝经期的女性具有降低的解决问题能力的普遍不适(complaint)，她们将其与不能集中精神关联。因此，根据本发明的溶菌酶水解产物特别适用于在该年龄组的女性中对抗这些问题。在年轻和中年女性的范畴内，经期综合征(premenstrual syndrome)是非常普遍的。该综合征的特征是多种症状，但是关于抑郁和情绪不稳定的不适经常发生。为了对抗这些现象，经常开出选择性血清素再吸收抑制剂如氟西汀的处方，并且在具有更温和症状的女性中，经常开出饮食适应(dietary adaptation)和防止压力的处方。基于本申请实施例6和9中所述实验的结果，根据本发明的溶菌酶水解产物代表极佳的治疗，特别是对这类较温和的病例而言。另外，多巴胺不足伴随着注意力缺陷多动症(ADHD)，从而可预期通过溶菌酶水解产物减轻该病症的症状。我们的下述发现是惊人的：对压力后表现的有益影响在抗压的受试者中特别突出。可能的解释可以是：具有(过度)活动的血清素体系的有压力的人需要来自饮品的色氨酸来补充他们的血清素储备，因此不能使用该色氨酸改进他们在任务中的表现。根据这一条推理，没有过度活动的血清素能体系的抗压人群不需要色氨酸来补充他们的色氨酸储备，并且能够使用其改善他们的压力后表现。一种备选的解释可能是：这些作用事实上归因于多巴胺能过程的刺激作用。可通过富含酪氨酸的食物成分增强多巴胺合成，尤其是与低水平的支链氨基酸(BCAA)组合时。在本文中公开这些工作假设(working hypotheses)以解释实施例中所示实验数据，并用于给出本发明人的目前看法(present insight)。但是本发明不以任何方式关联或限制于这些假设。因此，本发明与这些假设的正确性无关。如别处所陈述的，溶菌酶不仅具有高色氨酸水平，而且同样包括有显著量的酪氨酸残基。 

根据本发明的(富集的)水解产物还能提高食物制品中的半胱氨酸含 量。尽管不是必需的氨基酸，但是在许多食物制品中半胱氨酸浓度是有限的。半胱氨酸的内源合成需要甲硫氨酸的存在，像半胱氨酸一样，甲硫氨酸浓度在许多食物制品中是有限的。提高的食物半胱氨酸含量的优点尤其涉及甲硫氨酸对血清高半胱氨酸提升效应的拮抗效应(antagonistic effect)。该发现在WO 03/055335中已描述。根据本发明的溶菌酶水解产物特征也是高半胱氨酸水平。事实上，溶菌酶分子含有比色氨酸残基(6)甚至更多的半胱氨酸残基(8)。在该角度中，根据本发明的水解产物形成提高某些制品半胱氨酸含量的极佳来源。发现提高的半胱氨酸含量对于例如婴儿配方的制品而言是重要的。不仅婴儿配方基于酪蛋白或酪蛋白和乳清蛋白的混合物，而且对基于大豆的制品和事实上对于所有富含蛋白质的制品而言，其中主要的蛋白质来源由含有相对低量色氨酸或半胱氨酸的蛋白质提供。除了来自牛乳和明胶的蛋白质组分以外，玉米蛋白、酵母蛋白、豌豆蛋白、大豆蛋白和水稻蛋白代表了这类蛋白质的例子。另外，含有高剂量明胶的上述膳食替代制品含有不足量的半胱氨酸。 

根据本发明的(富集的)蛋白质水解产物，或得自该蛋白质水解产物的肽级分，或包含色氨酸的二肽或三肽(特别是SW或AW)可以以任何合适的形式使用，例如食物或饮料，如用于特殊营养用途的食物(Foods forSpecial Nutritional Uses)，膳食补剂，营养药物或甚至用在饲料或宠物食物中。可在这些制品的正常过程中的任何阶段添加溶菌酶水解产物。如果在食物或饮料中使用，则具有相对低蛋白质含量的制品是优选的，从而消耗根据本发明的制品后在血中维持高的Trp/LNAA比例。另外，优选地向含溶菌酶水解产物的食物或饮料中添加碳水化合物，以进一步提高消耗后血中的高Trp/LNAA比例。合适的食物制品包括例如谷物棒、烘焙物品如蛋糕和曲奇，以及液体食物如汤或汤粉末。除了乳制品如乳和酸乳之外，其它合适的饮料包括非醇和醇饮品以及要被添加进饮用水和液体食物中的液体制剂。非醇饮品优选地为矿物质水、运动饮品、果汁、柠檬水、茶、浓缩饮品如shots、能量饮品(例如含有葡糖醛酸内酯、咖啡因或牛磺酸)和碳酸饮料(例如汽水(pops)、苏打水(sodas)和可乐饮品)。根据本发明的色氨酸水解产物的优选的组合是与被推荐用于“脑营养”的化合物例如 铁、锌、镁、维生素(特别是B2、B6、叶酸和C)、ω-3和DHA脂肪或脂肪酸、葡萄糖、GABA、胆碱、磷脂酰丝氨酸、辅酶Q10、肌酸、牛磺酸和5-HTP的组合，或与被推荐用于释放压力或抑郁的化合物如缬草(valerian)、巧克力、圣约翰草(St John′s worth)、5-HTP、磷脂酰丝氨酸、醇、香蜂叶(lemon balm)、绿茶或绿茶提取物、甘菊或S-腺苷甲硫氨酸的组合，或与被推荐用于改进机警的化合物如咖啡因、瓜拉那、人参、白果(gingko bilboa)、圣约翰草和5-HTP的组合，或与被推荐用于情绪改善的化合物如GABA、5-HTP、PEA、绿茶或绿茶提取物、白果、洋苏草(Salvia)或S-腺苷甲硫氨酸的组合，或与被推荐用于改善睡眠的化合物例如乳肽、游离色氨酸、阿片肽(opoid peptide)或褪黑素的组合。用于特殊营养用途的食物包括以下范畴：运动食物、瘦身食物、婴儿配方和临床食物。术语膳食补剂在本文中使用时表示由口摄取的制品，其含有旨在补充膳食的化合物或化合物的混合物。这些制品中的化合物或化合物的混合物可包括：维生素、矿物质、草药(herbs)或其它植物和氨基酸。膳食补剂也可以是提取物或浓缩物，并可以以例如片剂、胶囊、软胶囊(softgel)、软胶囊(gelcap)、液体或粉末的许多形式存在。在本文使用时，术语营养药物表示在营养和药物两种应用领域中的有用性。根据本发明的营养药物组合物可以是适合施用给动物体(包括人体)的任何形式，特别是口服施用的任何常规形式，例如固体形式如食物或饲料(添加剂/补剂)、食物或饲料预混合物、片剂、丸剂、颗粒、锭剂、胶囊和泡腾剂配制物如粉末和片剂，或是液体形式如溶液、乳剂或悬浮液，例如饮料、糊剂和油性悬浮液。掺入根据本发明的水解产物的受控(延迟)释放配制物也构成本发明的部分。另外，可向本发明的营养药物组合物中添加多维生素和矿物质补剂，以获得足量的必需营养素，所述必需营养素在一些膳食中缺失。多维生素和矿物质补剂也适用于疾病预防，和针对由于生活模式造成的营养丢失和不足提供保护。 

在本发明的一个优选的方面，组合物可在例如老年人以及年轻人(例如准备考试的学生)和例如玩计算机或网络游戏的人中被用作营养补剂，例如用于情绪改善或用于改善认知功能如学习、记忆、警觉和机警。如前 文所述，根据本发明的组合物尤其与绝经前和绝经后的女性相关。根据本发明的组合物还尤其与运动人群相关；具有苛刻的训练计划的职业运动员以及娱乐运动人群，如打网球或高尔夫球的人群。这表示本发明涉及根据本发明的水解产物如上文给出的和作为“条件改善者”的用途，即在患病或正常的健康个体中作为用于以下的手段：降低应激性和疲劳(最终降低过度训练的风险)，降低或防止或减轻生理和精神疲劳，保护安稳的睡眠(即作用于对抗失眠和睡眠病症并改善睡眠)和更笼统地提高能量生产，特别是提高脑能量生产。另外用于通常的认知改善，特别是用于注意力和精神集中、记忆和记忆能力、学习能力、语言处理、解决问题和智力功能的维持或改善；用于改善短期以及长期记忆；用于提高精神机警；用于增强精神警觉；用于减少精神疲劳；用于支持认知健康，用于维持平衡的认知功能。另外，本发明涉及根据本发明的水解产物用于提高食欲的用途。如果需要获得具有高Trp/LNAA比例的成本有效的制剂，根据本发明的水解产物任选地包含游离的色氨酸。 

附图图例 

图1.消耗实施例6中详述的制品后，血浆中摩尔Trp/LNAA比例对时间的函数。REF＝酪蛋白水解产物，ALAC＝完整的α-乳白蛋白，Trp＝游离色氨酸，WEPS＝富含色氨酸的溶菌酶水解产物，SYN＝合成的二肽Ser-Trp。 

图2.消耗实施例6中详述的制品后，负面情绪(用情绪状态类型测试(POMS)测量)对时间的函数。REF＝酪蛋白水解产物，ALAC＝完整的α-乳白蛋白，Trp＝游离色氨酸，WEPS＝富含色氨酸的溶菌酶水解产物，SYN＝合成的二肽Ser-Trp。 

图3.溶菌酶水解产物的水溶性肽级分的大小分布。使用材料和方法章节中详述的测定水解产物中存在的肽和蛋白质分子量分布的方法，分析了根据实施例3中所述方法制备的溶菌酶水解产物。214nm处的吸光度测量记录了肽键的存在。280nm处的吸光度测量记录了色氨酸和酪氨酸芳香族侧链的存在。因为色氨酸在该波长下具有比酪氨酸高得多的摩尔吸光系 数，所以峰值会主要涉及掺入色氨酸的肽。 

图4.实施例9中所述实验的研究设计流程图。高：压力易感的志愿者；低：抗压的志愿者；hydr：富含Trp的溶菌酶水解产物；安慰剂：酪蛋白水解产物。 

图5.实施例9中所述实验的典型研究日的流程图。饮品：消耗含有富含Trp的水解产物或安慰剂的饮品；血：采血用于评价血浆氨基酸水平；表现：不可控制的压力之前和之后的表现测试；压力：算术任务。 

图6.摄食实施例9中所述安慰剂(plc)或溶菌酶水解产物(Trp-hydr)后的血浆Trp/LNAA比例(μmol/l)。黑色符号：压力易感的受试者；空心符号：抗压的受试者。 

图7.如实施例9中所述进行的Mackworth Clock测试的结果。消耗安慰剂(plc；左侧图)或富含Trp的水解产物(Trp-hydr；右侧图)之后、算术任务之前(压力前)或之后(压力后)的正确反应数量(垂直轴)。黑色符号：压力易感的受试者；空心符号：抗压的受试者。因为在独立的日期中给予不同的干涉(intervention)制品，所以仅在相同的处理和日期内的压力前和压力后条件之间进行相应的比较。 

图8.如实施例9中所述进行的临界追踪任务(Critical Tracking Task)的结果。在摄入安慰剂(plc)或富含Trp的水解产物(Trp-hydr)后表达λCT(指出受试者达到的最终复杂性水平)。黑色符号：压力易感的受试者；空心符号：抗压的受试者。 

材料和方法

材料

商品名为“Protex 6L”的枯草杆菌蛋白酶得自Genencor(Leiden，荷兰)，胃蛋白酶来自Sigma且胰蛋白酶/糜蛋白酶(Porcine PEM)来自Novozymes(Bagsvaerd，丹麦)。溶菌酶作为Delvozyme L(22％干物质)从DSM Food Specialities(Delft，荷兰)获得。 

酪蛋白水解产物(“REF”)基本上如Edens et al(J Agric Food Chem，53(20)7950-7957，2005)所述获得。用Protex 6L充分水解酪蛋白酸钠，将 pH降低至4.5后，用脯氨酸特异的内切蛋白酶达到DH＞20％。超滤后对渗透物热处理，以失活任何剩余的酶活性，并最终将其喷雾干燥。完整的α-乳白蛋白(“ALAC”)作为“Biopure”(＞90％的α-乳白蛋白)从DaviscoFoods International，Inc.(Le Seuer，MN)获得；富含色氨酸的溶菌酶水解产物(“WEPS”)如实施例4中所述获得；合成的Ser-Trp二肽(“SYN”)如实施例5中所述获得；纯L-色氨酸(“TRP”)作为L-色氨酸-400从Orthica，Almere，荷兰获得。 

SDS-PAGE

通过SDS-PAGE检查使用的溶菌酶制剂的纯度。用于SDS-PAGE和染色的所有材料均购自Invitrogen(Carlsbad，CA，US)。使用SDS缓冲液根据制造商的说明制备样品，并使用MES-SDS缓冲体系根据制造商的说明在12％Bis-Tris凝胶上分离。使用Simply Blue Safe Stain(CollodialCoomassie G250)进行染色。水解前，溶菌酶在凝胶上作为具有约14kDa分子量的单一条带出现。 

LC/MS/MS分析

使用HPLC测定通过本发明的工艺生产的酶蛋白质水解产物中含色氨酸的肽(主要是二肽或三肽)的存在，所述HPLC使用与P4000泵(Thermo Electron，Breda，荷兰)偶联的离子阱质谱仪(Thermo Electron，Breda，荷兰)。使用Inertsil 3 ODS 3，3μm，150*2.1mm柱(VarianBelgium，Belgium)，与用于洗脱的Milli Q水(Millipore，Bedford，MA，USA)中0.1％甲酸(溶液A)和乙腈中0.1％甲酸(溶液B)的梯度组合，分离形成的肽。所述梯度从100％溶液A开始，保持10分钟，在25分钟内线性化提高至20％B，立即进入初始条件，并保持15分钟用于稳定。使用的注射体积为50微升，流速为每分钟200微升，柱温度维持在55℃。注射的样品的蛋白质浓度约为50微克/毫升。以滞留时间、质子化的分子为基础，并通过使用对感兴趣的肽专用的MS/MS，使用约30％的最适碰撞能量，鉴定感兴趣的肽。通过使用外标法进行含色氨酸的特异肽的定量。 

使用四肽VVPP(M＝410.2)调节MS模式中的最优灵敏度和MS/MS模式中的最优断裂(fragmentation)，进行5μg/ml的恒量输注，得到MS模式 中的质子化分子和MS/MS模式中约30％的最优碰撞能量，产生B-离子和Y-离子系列。 

在LC/MS/MS之前，在室温和13000rpm下将酶蛋白质水解产物离心10分钟，并用滤过Millipore水过滤装置的去矿质水(MilliQ水)1∶100稀释上清液。 

氨基酸分析

如实施例6中所述，通过HPLC根据van Eijk et al(J.Chromatogr.1993：620：143-148)分析血浆中的氨基酸谱。 

根据如Amino Acid Analysis System of Waters操作员手册(Milford MA，USA)中所述的PicoTag方法进行其它氨基酸分析。为此，将终末样品干燥并使用异硫氰酸苯酯直接衍生化。如所述使用HPLC方法定量存在的经衍生化的氨基酸。因为常规酸水解期间Trp和Cys被破坏，所以使用特殊的方法定量这两种氨基酸。为了在水解期间防止Cys降解，首先使用过氧化氢将该氨基酸氧化为磺基丙氨酸，然后定量。色氨酸的分解以经轻微修饰的Waters步骤为基础。在该步骤中，在真空下干燥肽溶液的小份试样，然后在1小时期间于150℃下氮中，在含0.2％色胺的4M甲烷磺酸中水解。使用装备有Alltech Altima C18柱和荧光检测的HPLC直接定量反应产物。 

水解程度

使用快速OPA测试(Nielsen，P.M.；Petersen，D.；Dambmann，C.Improved method for determining food protein degree of hydrolysis.Journal ofFood Science 2001，66，642-646)，监测用多种水解混合物孵育期间获得的水解程度(DH)。 

克氏定氮(Kjeldahl Nitrogen)

通过流动注射分析(Flow Injection Analysis)测量总克氏氮。使用Tecator FIASTAR 5000流动注射体系，在590nm处定量从含蛋白质的溶液中释放的氨，所述体系装备有TKN Method Cassette 5000-040、具有SOFIA软件的Pentium 4计算机，和Tecator 5027自动采样器。将对应于本发明动态范围(0.5-20mg N/l)的样品量与95-97％硫酸和Kjeltab一起置于消化管中，并进行200℃下30分钟随后360℃下90分钟的消化程序。注射 进FIASTAR 5000体系中后，测量氮峰，从中可推理出被测量的蛋白质量。 

水解产物中存在的肽和蛋白质的分子量分布

在自动HPLC体系上完成经蛋白酶处理的蛋白质样品的肽大小分布分析，所述体系装备有高压泵、能够注射10-100微升样品的注射设备，和能够在214nm监测柱流出物的UV检测器。 

用于该分析的住是用20mM磷酸钠/250mM氯化钠pH 7.0缓冲液平衡的Superdex Peptide HR 10/300GL(Amersham)。注射样品(典型地为50微升)后，在90分钟内以.5ml/min的流速用缓冲液从柱中洗脱多种组分。使用细胞色素C(Mw 13500Da)、抑肽酶(Mw 6510Da)和四甘氨酸(Mw 246Da)的混合物作为分子量标记物校准该体系。 

以下的实施例进一步阐述本发明。 

实施例 

实施例1

鸡卵溶菌酶不被胃蛋白酶或胰蛋白酶/糜蛋白酶中的任何而切割。

为了测试其在人胃肠道中的可消化性，将鸡卵溶菌酶与胃蛋白酶以及胰蛋白酶和糜蛋白酶的混合物体外孵育。两种孵育均在下述pH条件下进行，所述pH条件是胃(胃蛋白酶)和十二指肠(胰蛋白酶/糜蛋白酶)中盛行的pH。为此，将5％(w/w)溶菌酶溶液与酶(1％w/w酶比溶菌酶蛋白质)在37℃下孵育2小时。为了防止进行的蛋白质水解造成的重大pH改变，孵育在Mc Ilvane缓冲液(0.2M柠檬酸加上Na₂HPO₄)中进行。在37℃水解两小时后获得的低DH值(见表1)证明了在模拟胃中和十二指肠与空肠中消化条件的条件下溶菌酶分子不能被降解，因为可预期成功的蛋白水解导致至少10％的DH值。因此，存在于完整的鸡卵溶菌酶分子中的色氨酸残基在胃肠道中不会被解离，因此意味着存在于完整鸡卵溶菌酶中的色氨酸分子不能有助于血浆色氨酸水平。 

表1：通过胃蛋白酶和胰蛋白酶/糜蛋白酶混合物的溶菌酶水解 

实施例2

在提高的pH值下，鸡卵溶菌酶被枯草杆菌蛋白酶有效切割。

为了测试非生理pH和酶条件下溶菌酶对酶水解的易感性，在碱性pH条件下将溶菌酶溶液与微生物枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)体外孵育。为此，在pH7.0、8.0和9.0下将5％(w/w)溶菌酶溶液与12.5微升Protex 6L./克存在的溶菌酶蛋白质一起孵育。孵育在60℃下进行3小时，使用1MNaOH持续调节pH。孵育产生没有任何显著沉淀物的轻微混浊的溶液。用于失活枯草杆菌蛋白酶活性的加热步骤后，根据材料和方法章节中所述方案测量多个孵育的DH值。与生理条件下获得的结果(见实施例1)相反，使用枯草杆菌蛋白酶的碱性孵育导致完全的溶菌酶水解。pH7.0孵育得到6.3的DH，pH8.0孵育得到11.2的DH，pH9.0孵育得到16.4的DH。反应产物随后的SDS-PAGE分析表明，整个溶菌酶分子被降解，即枯草杆菌蛋白酶孵育后没有残余大分子量片段。另外，在Crownpak CR+柱(Daicel)上对水解产物的HPLC分析揭示了含有色氨酸的肽未发生显著的外消旋化，即便是在pH9.0下长时间加热后也未发生。 

实施例3

使用Protex水解溶菌酶并鉴定形成的肽。

使用NaOH将含10％(w/w)纯溶菌酶的溶液调节至pH8.2，并加热至52℃。通过添加25微升Protex/g存在的蛋白质开始水解。在连续的搅拌下 和将pH维持于8.2时，将水解持续5.5小时，得到没有可见沉淀物的几乎澄清的溶液。在用于失活Protex活性的加热步骤后，取样用于DH分析。溶液的DH显示几乎为30％。在10kDa滤器上超滤经热处理的溶液，得到完全澄清的液体。该澄清液体被用于LC/MS分析，用于存在的肽和蛋白质的分子量分布分析，以及用于离子交换色谱。 

为了得到存在的肽和蛋白质的分子量分布的印象，如材料和方法章节中所述对澄清的液体进行分子量分析。获得的结果(见图3)清楚地表明几乎所有掺入带有芳香族侧链的氨基酸(即色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)的肽具有低于500kDa的分子量。考虑到这些氨基酸的高分子量，意味着大部分这些小肽是三肽或二肽。 

根据材料和方法章节中所述步骤进行LC/MS分析。通过选择这些含有色氨酸(“W”)的肽，可以检测肽AW、GNW、WIR、NAW、WVA、VAW、AWR、SLGNW和小量WW和SRWW。孵育后水解产物中游离色氨酸的水平被确立为代表少于1％的存在的总(溶菌酶)色氨酸。 

因为二肽和三肽容易被肠壁中存在的肽运载体吸收，所以毫无疑问在口服摄入本发明的溶菌酶水解产物后，这类肽中存在的色氨酸残基会被快速吸收并导致提高的血浆色氨酸水平。 

实施例4

提高水解产物的色氨酸含量。

溶菌酶掺入了惊人的大量碱性精氨酸和赖氨酸残基。另外，溶菌酶分子掺入了显著量的酸性谷氨酸和天冬氨酸残基。该数据已被用于设计朝向具有高Trp/LNAA比例的水解产物的创新和优良的纯化途径。然而，该纯化途径的关键需求是，在还含有精氨酸或赖氨酸残基或谷氨酸或天冬氨酸残基任一的肽中，仅出现非常少的色氨酸残基。如实施例3中所示，本文使用的特异水解途径仅产生很少的含有精氨酸残基的含色氨酸的肽，并且不产生含有赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸残基的肽。 

理论预测，在pH3左右能够达到含和不含谷氨酸或天冬氨酸残基的肽之间的最大电荷差异。在pH5左右能够达到含和不含精氨酸或赖氨酸 残基的肽之间的最大电荷差异。 

为了阐述该途径的选择能力，根据实施例3中说明的步骤制备溶菌酶水解产物。然后使用乙酸将水解产物的pH调节至pH3.1，并将约0.5克蛋白质应用在用20mm柠檬酸钠pH3.1平衡的SP Sepharose FF(GEHealthcare，Diegem，Belgium)柱的15ml柱床体积上。用一倍柱体积的柠檬酸钠缓冲液洗涤柱，去除掺有谷氨酸或天冬氨酸的大部分肽后，将洗脱缓冲液变更为20mm柠檬酸钠缓冲液pH5.1。用三倍体积的后一缓冲液洗涤柱时，洗脱了一系列含有色氨酸的肽。根据LC/MS分析，二肽AW以及三肽GNW、NAW、WVA、VAW大量存在，并存在小量戊肽SLGNW。多种pH5.1级分的氨基酸分析显示，选择性合并(selective pooling)产生具有1.75的分子Trp/LNAA比例的溶液和几乎30％的色氨酸产率。更少选择性的合并产生具有0.4的分子比例的溶液和70％的色氨酸产率。随后，用三倍体积的20mM柠檬酸钠pH7.1洗涤柱。根据LC/MS数据，该步骤洗脱了含精氨酸的肽WIR、AWIR并惊人地洗脱了肽WW。用1M NaOH、水和1M乙酸最后洗涤柱制备了用于下一轮的柱。 

实施例5

二肽Ser-Trp的化学合成。

根据标准的肽技术合成二肽Ser-Trp。第一步中，通过碳酸酐方法(J.Am.Chem.Soc.1967，5012)将Z-Ser-OH和Trp-OMe偶联，产生受保护的二肽Z-Ser-Trp-OMe。为此，将Trp-OMe.HCl悬浮于四氢呋喃(THF)中，随后添加N-甲基吗啉(NMM)。将混合物搅拌1小时，随后添加至Z-Ser在四氢呋喃/二甲基酰胺(THF/DMF)中的溶液中。添加NMM的第二等价物，并将混合物冷却至-15℃。以下述速率添加氯甲酸异丁酯，所述速率使得内部温度不超过-15℃。随后，将混合物搅拌3小时，允许温度提高至室温并通过过滤去除沉淀的NMM.HCl。将滤液在4℃保持过夜，之后过滤额外的沉淀物并将滤液真空浓缩。通过柱色谱(SiO₂，乙酸乙酯/庚烷)纯化残基。将组合的级分浓缩，用水洗涤去除任何剩余的DMF并真空浓缩。 

在第二步中，使用Alcalase 2.5L DX(Int.J.Peptide Protein Res.1990，52) 完成Z-Ser-Trp-OMe的酶水解，随后的催化氢解提供了呈灰白色固体的期望的肽。为此，将纯化的Z-Ser-Trp-OMe溶于tBuOH和水中，添加Alcalase 2.5L DX(Novozymes，Bagsvaerd，丹麦)。搅拌混合物，直至(几乎)所有的起始材料被消耗。然后将混合物真空浓缩，并将残余物吸收在pH 7的水中。用乙酸乙酯萃取水性混合物以去除任何剩余的起始材料，随后酸化水相。通过用乙酸乙酯萃取分离期望的产物Z-Ser-Trp-OH；将萃取物在硫酸钠上干燥并在真空中浓缩。 

在第三步中，获得二肽Ser-Trp-OH。为此将浓缩的Z-Ser-Trp-OH溶于MeOH和水(1∶1)中，添加Pd/C，在正的氢气压(5bar)下搅拌混合物。完成反应后，通过过滤去除催化剂加上大部分产物，并弃去滤液。用milliQ水充分洗涤滤器，真空干燥滤液，得到呈白色到灰白色固体的二肽Ser-Trp-OH。如下达成额外的纯化：在丙酮-水的混合物中搅拌产物，并通过过滤分离肽。这得到了适合口服消耗的产物。 

实施例6

健康志愿者中不同色氨酸来源对血浆Trp/LNAA比例和情绪的影响

本研究的目的是在健康受试者中研究消耗含不同色氨酸的制剂后血浆Trp/LNAA谱和情绪。测试了以下的制剂： 

-完整的α-乳白蛋白(见材料和方法) 

-经水解的酪蛋白酸盐(DH＞20％；见材料和方法) 

-具有高Trp/LNAA比例的富含Trp的溶菌酶水解产物(见实施例4) 

-合成的SW二肽(实施例5) 

-游离的L-色氨酸(见材料和方法)。 

十八个健康的学生(9个男性和9个女性：年龄18-30岁之间)参与了该研究。参与的排除标准是慢性病和当前病，精神病或医学病史，使用药物或药品，醇消耗(＞2单位/天)，代谢疾病、激素-疾病或肠疾病和无规则的膳食或偏离标准的进食习惯(通过健康和生活方式调查问卷来评价)。参与实验的受试者在体重指数的正常范围内(以kg计的BMI/m²在20-25之间)，女性受试者符合避孕。女性在其卵泡期的中晚期(第4-10 天)参与，而使用避孕手段的女性当她们实际使用避孕药时参与。参与者是非吸烟者，并且在研究之前和期间不能使用任何醇。所有参与实验的受试者签署征得同意书(Informed Consent Form)。该研究根据52nd WMAGeneral Assembly，Edinburgh，苏格兰，2000年10月所采取的优良临床试验规范(Good Clinical Practice，GCP)EC原则进行。 

指导受试者禁食过夜；只允许不含糖的水和茶。在五个进行实验的清晨阶段，受试者来到实验室，摄入含有不同Trp或LNAA浓度的饮品后监测血浆Trp/LNAA浓度和情绪。平衡多种饮品的出现顺序，四个实验日通过一周的周期间隔开。在每个进行实验的清晨，提供含有不同色氨酸(Trp)或LNAA浓度的312ml饮品(表1)。所有的饮品含有0.10g甜味剂(乙酰舒泛)并用净水补充达到312ml。由不了解(blind to)膳食条件的助研人员管理不同饮品的施用。 

表1：使用的饮品的蛋白质/氨基酸组成 

蛋白质来源	酪蛋白水  解产物	完整的α- 乳白蛋白	Trp-强化的溶  菌酶水解产物	Ser-  Trp	游离  L-Trp
						使用的代码	REF	ALAC	WEPS	SYN	TRP
克	20	20	300ml溶液	1.20	0.82
						Trp(g)	0.40	0.80	0.80	0.80	0.80
Trp/LNAA(摩尔)	0.04	0.10	1.1	∞	∞

摄入之前和摄入之后15、30、60、90、120、180和210分钟时，在含肝素钠的5ml真空采血管(vacutainer)中一式两份收集血样，然后于4℃下在5000rpm离心5分钟。将得到的上清液与磺基水杨酸(4mg/100微升)混合，并直接储存于-80℃直至分析。如van Eijk et al(J.Chromatogr.1993：620：143-148)所述，利用2-3μm Bischof Spherisorb ODS II柱，用HPLC进行血浆氨基酸分析。通过用血浆摩尔色氨酸浓度除以大中性氨基酸缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的血浆摩尔浓度总和，计算血浆Trp/LNAA比例。使用普通线性模型(GLM：SPSS 12.0forWindows)，借助于变量的重复测量多变量和单变量分析(MANOVA和ANOVA)，进行统计学分析。所有的统计学在P＝0.05的显著性水平上评价。 

血浆Trp/LNAA值

以条件和时间作为对血浆Trp/LNAA比例的受试者内因素的第一种变量重复测量分析揭示了时间和条件的主要显著影响和显著的条件x时间相互作用。在提供“SYN”(60分钟后提高263％)和“WEPS”(90分钟后提高255％)后发现了血浆Trp/LNAA比例中最高的显著提高(见图1)。这两种产物后Trp/LNAA的提高比摄入“TRP”(120分钟后提高191％)或“ALAC”(120分钟后提高67％)后显著更快和更高。消耗“REF”后，从60分钟起到210分钟，存在显著的Trp/LNAA降低(-27％)。 

发现用“WEPS”得到的Trp/LNAA中255％的提高可观地超过了如先前用完整的α-乳白蛋白(Markus et al.，2000；Booij et al.，2006)所发现的50-70％的提高，和所有较早报道的使用其它食物如碳水化合物时20-45％的提高(Markus，2003)。尽管血浆Trp/LNAA中40-50％的变异被认为足以改变脑中的Trp水平和5-HT合成和释放(Markus et al.，2000)，但是该提高被预期为引起可获得的脑Trp和5-HT的高得多的提高，因此也可导致功能活性脑5-HT的更大释放。 

情绪状态类型(POMS)。

使用情绪状态类型调查问卷(Wald and Mellenbergh，Ned TijdschrPsychol 1990：45：86-90)的Dutch缩短版的纸-笔版本测量多个参与者的情绪改变，直观类比标度(VAS scale)范围从“强烈不同意”到“强烈同意”POMS包括物种不同的情绪亚刻度；范围从愤怒、抑郁、疲劳和紧张(表示消极的情绪状态)到有活力(涉及积极的情绪)。 

以条件和时间作为对总情绪分数的受试者内因素的变量重复测量分析揭示了时间的显著影响和显著的条件x时间相互作用；表明跨越时间的情绪改变在多个条件之间显著不同。摄入“WEPS”和“TRP”后60分钟发现相当的情绪改善，但是与“TRP”相比，只有“WEPS”直到摄入后210分钟仍进一步改善情绪。相反，摄入“REF”和“ALAC”后未发现情绪改变。完整的α-乳白蛋白后情绪效应的缺失与先前的研究相当，所述研究显示完整的α-乳白蛋白后和仅在急性压力暴露下的压力易感受试者中，对情绪温和的有益影响(Markus et al.，2000；Markus et al.，2000，Markus，2003)。尽管摄入 “SYN”后情绪似乎改善，但是在该实验设定中该影响并不显著。 

这些目前的结果提出血浆Trp/LNAA中255％的巨大提高可能足以在正常的非压力易感的受试者中改善情绪。基于先前的发现，预期Trp-增强的溶菌酶水解产物对情绪的这些有益影响在处于高精神压力条件下的压力易感受试者中甚至会更大(Markus，2003)。与我们的预期相反，摄入合成的二肽后不存在显著的情绪改善。该预料之外的结果可能归因于目前的实验设定，或归因于来自这些多种来源的色氨酸生物可利用度的差异。 

表2：摄入酪蛋白水解产物(“REF”)、完整的α-乳白蛋白(“ALAC”)或Trp-增强的溶菌酶水解产物(“WEPS”)后血浆氨基酸浓度(μmol/l)随时间的改变。 

表3：摄入游离的L-Trp(“TRP”)或合成的二肽SW(“SYN”)后，血浆氨基酸浓度(μmol/l)随时间的改变。 

实施例7

大规模溶菌酶水解。

在更大规模的溶菌酶水解步骤中，基本上遵循实施例3中所述的步骤进行一些较小的修饰。将含7.3％(w/w)纯溶菌酶的溶液加热至65℃，然后使用NaOH将pH调节至pH 8.2。通过添加25微升Protex 6L/g干物质开始水解。在连续搅拌下和将pH维持于8.2并将温度维持于53℃时，将水解持续2小时。然后将pH值提高至9.0并将孵育再继续3.5小时，得到含有一些沉淀物的溶液。然后将溶液的pH降低至4.5，并将溶液冷却至低于4℃。为了获得完全澄清的产物，将液体滤过Z 2000滤器(Pall)，随后通过纳米过滤去除过量的水和盐。然后在120℃对得到的浓缩物进行UHT处理 7秒，蒸发并最终干燥获得干燥形式的溶菌酶水解产物。由此获得的产物具有约0.19的摩尔Trp/LNAA比例。 

实施例8

制备掺入溶菌酶水解产物的饮料。

以下的配方说明了无脂肪的、含溶菌酶水解产物的草莓饮品的制备。向10克溶菌酶水解产物粉(根据实施例7制备)中添加40克葡萄糖、2.4克柠檬水、0.38克苹果酸、0.15克三氯蔗糖(sucralose)和0.5克草莓香料(Buteressence，Zaandam，荷兰)。该粉末混合物在1升水中容易地溶解，获得具有高Trp/LNAA和高Tyr/BCAA比例的即饮型饮料。粉末混合物适用于例如药囊填充。可使用多种已知的技术生产包装的液体制品。 

实施例9

压力易感和抗压的健康志愿者中溶菌酶水解产物对压力后表现的影响。

本研究的目的是：比较根据实施例7中所述步骤制备的溶菌酶水解产物与安慰剂(酪蛋白水解产物；见实施例6)对血浆Trp/LNAA水平的影响及其对压力后表现任务造成的结果。已知使用的表现任务强调个体的“警觉”和“眼-运动控制”方面。 

四十位个体参与了本研究，其中有二十个男性和二十个女性。根据研究前的调查问卷，一半该组被归类为抗压的，另一半被归类为压力易感的。个体的参与(in)和排除(exclusion)标准以及一般研究管理与实施例6中所述相同。图4中给出所述研究设计的流程图，图5中给出典型研究日的概图。 

在进行实验的清晨，受试者在禁食状态下来到实验室。抵达后，给予他们含溶菌酶水解产物或安慰剂的饮品，即含有酪蛋白水解产物的饮品。测试饮品和安慰剂饮品的组成列于表4中。 

表4：使用的饮品的组成。 

蛋白质来源	酪蛋白水解产物	溶菌酶水解产物
			缩写	plc	Trp-hydr

g粉末/300ml	13.6	14.4
			水	286g	285g
甜味剂	0.1g	0.1g
			g Trp/300ml	0.4	0.8
Trp/LNAA比例(摩尔)	0.04	0.19

消耗300ml饮品后90分钟，采取血样评价Trp/LNAA比例(见实施例6)。随后，将抗压组或压力倾向组的受试者进行表现测试，随后暴露于压力下。该压力由必须在噪音刺激下进行的算术任务组成。引导受试者相信噪音的存在或消失取决于他们在测试中的表现。事实上，算术任务以所有的受试者每个试验都不成功的方式操作。已知该设定诱导生理压力，并被认为是高度不可控制的(Peters，M.L.，Godaert，G.L.R.，Ballieux，R.E.etal.(1998).Cardiovascular and catecholamine response to experimental stress：effects of mental effort and controllability.Psychoneuroendocrinology.23，1-17)。算术任务后，重复第一种表现测试，来定量有效的血Trp/LNAA比例影响下，压力对表现的影响。 

进行的表现测试是Mackworth Clock测试(Mackworth，N(1948)Thebreakdown of vigilance during prolonged visual search.Quart J Exp Psych.1，6-21))和临界追踪任务(Jex HR et al.，(1966)A″critical″tracking task for man-machine research related to the operator′s effective delay time.NASA ContractRep NASA CR.：1-105)。 

Mackworth Clock测试是被广泛用于测量持久的时间段中“警觉”、机警和精神集中的测试。受试者坐在计算机屏幕前，所述计算机屏幕展示60个点的环状排列，所述60个点模拟时钟上的秒标记。点以每500ms一个的速率，以顺时针转向短暂照亮。通常，该转动以单个(一个点)跳跃继续。告知受试者，该靶标罕见地、以不规则的间隔通过遗漏正常顺序中的一个点，以两个(连个点)跳跃继续。这会提示受试者尽可能快地按下按钮。在45分钟的测试期间总共出现了30次这样的情况。10个情况发生在各连续的15分钟周期内，间隔范围从8秒到7.2分钟。 

临界追踪任务被用作知觉-运动表现任务(perceptual-motor performance task)，所述任务在第一命令补偿知觉-运动协调任务(first-ordercompensatory perceptual-motor coordination task)中测量控制显示的错误信号的能力。在该任务中，受试者必须通过使用灵敏的操纵杆控制计算机屏幕上不稳定的光标。错误会显示为光标与水平线性标度的中点的水平偏差。受试者必须通过持续地进行补偿性操纵杆运动，保持不稳定的光标处于轴线中心，将偏差降低至零。光标偏差的频率作为时间的随机、线性函数提高，因此要求受试者以逐渐更高的频率进行补偿性运动。受试者的补偿性应答也会以下述频率提高，从而丧失控制，所述频率随着具有提高的相位滞后(增加而不是减少错误的应答)。受试者丧失控制的频率就是临界频率。将该测试进行五次；排除最低和最高得分计算平均临界频率，作为该测试的因变量(dependent variable)。 

消耗饮品后90分钟测定血浆Trp/LNAA比例，揭示了在所应用的实验条件下，对血浆Trp/LNAA比例改变的显著影响(P＜0.0001)。溶菌酶水解产物(“Trp-hydr”)的摄入将血浆Trp/LNAA值提高至0.25μmol/l。酪蛋白水解产物(“plc”)的摄入得到0.08μmol/l的Trp/LNAA比例(图6)。各相关氨基酸的值在表5中提供。 

表5：摄入安慰剂(“plc”)或溶菌酶水解产物(“Trp-hydr”)后的氨基酸浓度(μmol/l)。 

	Tyr	Val	Ile	Phe	Leu	Trp	LNAA	Trp/LNAA
									plc	90	315	107	63	168	60	744	0,082
Trp-hydr	73	266	120	58	152	167	670	0,250

摄入酪蛋白水解产物后，通过暴露于压力下，进行Mackworth Clock测试的两组个体的表现均显著受损。然而，摄入富含Trp的溶菌酶水解产物在抗压组中防止了该受损的表现。非常惊人的是，富含Trp的水解产物在压力倾向组中未防止这类受损的表现。获得的数据在图7中图示。 

在临界追踪任务中，λCT值指出受试者达到的最终复杂度食品。λCT值越高，控制越好。本实验中获得的数据显示暴露于压力后，当消耗富含Trp的水解产物时λCT值显著更高。在抗压的个体中，能够记录相对于安慰剂处理16％的提高。非常惊人的是，也在该测试中，压力倾向组的λCT 值显示在富含Trp的水解产物和安慰剂之间无显著差异。 

Claims (17)

1.生产组合物的方法，所述组合物包含水溶性的、含色氨酸的肽并具有多于0.15的Trp/LNAA比例，所述Trp/LNAA比例是指色氨酸相对于大中性氨基酸的摩尔比例，所述方法包括：

a)在中性或碱性pH条件下用枯草杆菌蛋白酶水解鸡卵溶菌酶，

b)将水解产物的pH调节至4-6的值，

c)任选地将含有色氨酸的肽与含有大中性氨基酸的肽分离，以制备具有5和45之间的水解程度的水解产物，

其中所述大中性氨基酸是酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的和。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)包括：将pH调节至3.0左右，还包括使用阳离子树脂对得到的水解产物进行色谱法并用pH5缓冲液洗脱的步骤。

3.根据权利要求1的方法，其中所述组合物包含AW二肽或GNW三肽。

4.根据权利要求1的方法，其中所述组合物包含AW二肽和GNW三肽。

5.一种经水解的鸡卵溶菌酶组合物在制备用于改善情绪、认知、食欲、机警、警觉、睡眠开始和质量、抗焦虑作用、抑郁、感情反应控制或性行为的食物、饲料、膳食补充剂或营养药物组合物中作为成分的用途，所述经水解的鸡卵溶菌酶组合物包含至少两种不同的水溶性的、含色氨酸的肽，并且其中组合物的Trp/LNAA比例至少为0.15。

6.根据权利要求5的用途，其中组合物的Trp/LNAA比例在0.15和1.8之间。

7.根据权利要求5的用途，其包含AW二肽或GNW三肽。

8.根据权利要求5的用途，其包含AW二肽和GNW三肽。

9.根据权利要求5的用途，其中与肽结合的色氨酸中多于40mol％以二肽或三肽的形式存在。

10.根据权利要求5的用途，其中与肽结合的色氨酸中多于50mol％以二肽或三肽的形式存在。

11.根据权利要求5的用途，其中与肽结合的色氨酸中多于60mol％以二肽或三肽的形式存在。

12.根据权利要求5的用途，其中与肽结合的色氨酸中多于70mol％以二肽或三肽的形式存在。

13.根据权利要求5的用途，其中与肽结合的色氨酸中多于80mol％以二肽或三肽的形式存在。

14.根据权利要求5到13中任一项的用途，其中AW二肽与GNW三肽的摩尔比例在1比2和10比1之间。

15.根据权利要求5到13中任一项的用途，其中AW二肽与GNW三肽的摩尔比例在1比2和5比1之间。

16.根据权利要求5到13中任一项的用途，其还包含游离的色氨酸。

17.根据权利要求5到13中任一项的用途，其中所述食物是婴儿配方。

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