ES2550463T3 - Mezcla de triptófano unido a un péptido y de triptófano unido a un polipéptido - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para producir una composición que contiene triptófano, la cual comprende el proceder a reunir: - una composición de triptófano unido a un péptido, la cual, de una forma preferible, es soluble en agua, y la cual tiene un factor de relación Trp / LNAA, correspondiente a un valor de más de 0,1, de una forma preferible, de más de 0,15 y / o triptófano libre; y - una composición de triptófano unido a un polipéptido, la cual, de una forma preferible, es soluble en agua, y la cual tiene un factor de relación Trp / LNAA, correspondiente a un valor de más de 0,15.

Description

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Los efectos ansiolíticos, son efectos los cuales tienen como resultado el alivio o la mitigación de las sensaciones de los miedos o angustias, de la aprehensión, o de las inquietudes o preocupaciones. La depresión, se define como el estado de la mente, el cual se caracteriza mediante unas sensaciones graves y persistentes de la pérdida del placer.

El término comportamiento sexual, se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, como un sinónimo de líbido.

En la patente internacional WO 02 / 46 210, se describe un procedimiento para incrementar el nivel de triptófano en l los hidrolizados de proteína de suero láctico. En el método o procedimiento utilizado, se procede, en primer lugar a hidrolizar el suero láctico, a un valor pH ácido, mediante una o más proteasas ácidas, de una forma preferible, mediante una pepsina, una renina, una proteasa fúngica, una quimosina, una papaína, una bromelaína, una quimopapaína, o una ficina. Las condiciones preferidas de incubación, son las correspondientes a un valor pH comprendido dentro de unos márgenes situados entre un valor pH de 1,5 y un valor pH de 3,5, y éstas se eligen con objeto de generar péptidos, los cuales tengan una naturaleza hidrofóbica. La hidrólisis, se lleva a cabo, de una forma deliberada, de tal forma que, los residuos de triptófano, se convierten en residuos de triptófano incorporados en péptidos hidrofóbicos de cadena larga. Muchos menos residuos de triptófano, se encuentran presentes en los péptidos de cadena corta, más solubles en agua. En una etapa de procesado subsiguiente, el valor pH, se hace crecer a un valor comprendido dentro de unos márgenes que van desde un valor pH de 4,0 hasta un valor pH de 6,0, con objeto de fomentar la precipitación de estos péptidos con contenido en triptófano, de cadena larga, facilitando, con ello, su recuperación selectiva, del hidrolizado de suero láctico. El triptófano, se encuentra únicamente presente en péptidos relativamente grandes, la captación y entrada de triptófano, al interior de la sangre, se retardará, limitándose con ello las posibilidades de la preparación, como un ingrediente de producto alimenticio o como un ingrediente de una bebida, de una forma especial, en combinación con otras proteínas. Vale la pena enfatizar el hecho consistente en que, la alfa-lactoalbúmina, no se encuentra calificada como una fracción de proteína intacta en concordancia con la presente invención, ya que, ésta, no resistente a la proteasa, en concordancia con el test de ensayo especificado en la sección de Materiales y Métodos (o Procedimientos), del presente documento de solicitud de patente.

La presente invención, da a conocer un procedimiento de hidrólisis simple, en donde se parte de una proteína, la cual se encuentra industrialmente disponible en el mercado, y que se caracteriza por un alto factor de relación o cociente Trp / LNAA. El presente procedimiento de hidrólisis, tiene un rendimiento productivo de triptófano correspondiente a un porcentaje de más de un 30 %, en base a triptófano proteínico, y éste genera una composición peptídica soluble en agua, la cual comprende triptófano. El hecho consistente en que, la parte mayor de los residuos de triptófano, se encuentra englobada en di-y tri-péptidos, implica una inmediata captación y entrada al interior de la corriente sanguínea. Tal y como se revelará, esta propiedad, permite la incorporación del hidrolizado, en una mayor variedad de productos alimenticios o de productos nutracéuticos. De una forma bastantemente sorprendente, la presente invención, da también a conocer el hecho consistente en que, después del consumo oral, el hidrolizado en concordancia con la presente invención, puede generar unos factores de relación o cocientes Trp / LNAA en la sangre, más altos, que el correspondiente al factor de relación o cociente Trp / LNAA, del hidrolizado efectivo.

En concordancia con la presente invención, la lisozima de huevo de gallina, se usa como un material de partida conveniente, para la composición de la invención, con un alto factor de relación o cociente Trp / LNAA, el cual, después de la ingesta oral, conduce rápidamente a unos factores de relación o cocientes Trp / LNAA incrementados, y de larga duración, en la sangre. La lisozima, se encuentra presente en la clara de huevo, en una concentración correspondiente a un porcentaje del 3 – 4 %. Tomando ventaja de este excepcionalmente alto punto isoeléctrico, la lisozima, se aísla, de una forma industrial, a partir de la clara de huevo, mediante la utilización una simple etapa de purificación cromatográfica catiónica, seguida, de una forma opcional, de una etapa de cristalización. El producto resultante, es casi puro, y éste es un producto el cual se encuentra industrialmente disponible en el mercado, el cual tiene un contenido molecular en triptófano, correspondiente a un porcentaje del 7,8 %, y un factor de relación o cociente molecular TRP / LNAA, de por lo menos un valor de 0,15. Así, de este modo, la lisozima, a saber, la proteína intacta, tiene un factor de relación o cociente Trp / LNAA, el cual es significativamente más alto que el correspondiente a la alfa-lactoalbúmina y / o a la beta-lactoglobulina. Así, por lo tanto, los hidrolizados de lisozima en concordancia con la presente invención tienen, de una forma preferible, un factor de relación o cociente Trp / LNAA, el cual es mayor de un valor de 0,15, siendo el factor de relación o cociente Trp / LNAA, de una forma más preferible, mayor de un valor de 0,20, siendo el factor de relación o cociente Trp / LNAA, de una forma todavía más preferible, mayor de un valor de 0,23, siendo el factor de relación o cociente Trp / LNAA, de una forma aún más preferible, mayor de un valor de 0,25, y siendo el factor de relación o cociente Trp / LNAA, de la forma mayormente preferible, mayor de un valor de 0,30. De una forma general, el factor de relación o cociente Trp / LNAA, es inferior a un valor de 3,0. Como tal, la lisozima, presenta un punto de partida, para los péptidos o composiciones con contenido en triptófano, y ésta puede utilizarse como una composición de triptófano unido a un polipéptido. Las lisozima (EC 3. 2. 1. 17), es una enzima capaz de hidrolizar enlaces o eslabones específicos de peptidoglicano, en paredes celulares bacterianas, conduciendo a una lisis celular. Debido al hecho consistente en su efecto bactericida, la lisozima, juega un importante rol interpretativo, en la defensa del huésped, mediante la prevención de las infecciones. Bajo unas condiciones fisiológicas, la molécula de lisozima, es muy resistente al ataque proteolítico.

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de solicitud de patente, y éste se encuentra ilustrado en la Figura 3. Un importante ventaja de esta última forma de presentación, en concordancia con la presente invención, reside en el hecho de que, el triptófano el cual se encuentra englobado en los di-y tripéptidos, se trasporta a través de la pared intestinal, conduciéndose hacia el interior de la corriente sanguínea, inmediatamente después del consumo oral. Como consecuencia de ello, los niveles de triptófano en el plasma, se incrementan casi de una forma instantánea, con un efecto directo sobre los niveles de la serotonina en el cerebro. Es bastante sorprendente, el hecho consistente en que, los datos los cuales se presentan en el Ejemplo 6 del presente documento de solicitud de patente, muestran el hecho de que la eficacia de los residuos de triptófano, presentados en forma de estos di-y tripéptidos, es incluso más eficaz, que la del triptófano libre. Esta observación, enfatiza las ventajas ofrecidas por la presente invención.

La patente internacional WO 2006 / 009 448, proporciona hidrolizados de proteínas, los cuales se obtienen de la proteínas de huevos de gallina, y que tienen una propiedades antihipertensivas, así como productos alimenticios y suplementos alimenticios, los cuales comprenden estos hidrolizados. El documento en cuestión, divulga la preparación de un gran número de hidrolizados, incluyendo a aquéllos los cuales se obtienen a partir de lisozima de huevo de gallina. Todos estos hidrolizados, tienen como finalidad, la reducción de la presión sanguínea, o prevenir o evitar que la presión sanguínea suba, después de su ingestión oral, en humanos. La patente internacional WO 2006 / 009 448, describe así mismo, también, la preparación de hidrolizados de lisozima, obtenidos bajo unas condiciones alcalinas, mediante la utilización de subtilisina (EC 3. 4. 21. 62); nombres comerciales, Alcalase o Protex). En concordancia con los altos grados de hidrólisis los cuales se obtienen, estos hidrolizados de lisozima, contienen una gran proporción de péptidos, con un peso molecular inferior a los 500 Da. Sin embargo, no obstante, en ningún lugar del documento publicado de la patente internacional WO 2006 / 009 448, se hace referencia al hecho consistente en que, la lisozima, es un fuente de proteína, la cual tiene un alto contenido en triptófano, el cual puede afectar, de una forma positiva, a los niveles de la serotonina en el cerebro. No se menciona, tampoco, el hecho consistente en que, los hidrolizados de lisozimas, comprenden péptidos solubles en agua, los cuales incorporan una alta cantidad de triptófano y una cantidad relativamente bajo de LNAA. La patente internacional WO 2006 / 009 448, tampoco menciona el hecho consistente en el alto contenido de arginina y de lisina, de ambos, la lisozima y el hidrolizado de lisozima. Nosotros, los solicitantes, hemos encontrado el hecho consistente en que, en base a los datos presentados en el presente documento de solicitud de patente, el alto contenido en triptófano de la molécula de lisozima, en combinación con la ubicua u omnipresente presencia de la arginina y de la lisina, hace, de la lisozima, el perfecto material de partida para una generación, in vivo, de unos altos factores de relación o cocientes Trp / LNAA. De una forma adicional, el texto del documento publicado de la patente internacional WO 2006 / 009 448 no menciona, tampoco, la ventajas ofrecidas por los hidrolizados los cuales se utilizan en la presente invención, en su co-consumo con otros productos alimenticios los cuales contienen proteínas. Aparte del uso de filtros de membrana, el texto del documento publicado de la patente internacional WO 2006 / 009 448, tampoco hace mención de los métodos o procedimientos para la obtención de fracciones de péptidos de estos hidrolizados, las cuales tengan unas composiciones seleccionadas de aminoácidos, ni tampoco hacen mención de procedimientos o métodos específicos para la incrementar los contenidos de triptófanos, o para incrementar los factores de relación o cocientes Trp / LNAA. De una forma adicional, no se encuentra registrada la ventaja consistente en ofrecer un hidrolizado de lisozima altamente degradada, en combinación con una lisozima intacta, no degradada.

Los datos los cuales se presentan en el Ejemplo 4 del presente documento de solicitud de patente, indican el hecho consistente en que, el hidrolizado de lisozima obtenido mediante la incubación de la lisozima, a un valor pH alcalino, con subtilisina, es particularmente rico en el dipéptido Ala-Trp (AW). Este descubrimiento, sugiere el hecho consistente en que, unipéptido AW químicamente sintetizado, podría proporcionar una alternativa apropiada para el presente hidrolizado de lisozima. A pesar del hecho consistente en que, el uso de un dipéptido sintético, tiene unos inconvenientes legislativos obvios, las importantes ventajas que éste aporta, son las consistentes en su eficiencia en cuanto a lo referente al coste, y su factor de relación o cociente Trp / LNAA ideal. De una forma teórica, se encuentran disponibles veinte diferentes tipos de dipéptidos los cuales contienen triptófano, pero, sin embargo, no obstante, nuestras investigaciones, han mostrado el hecho consistente en que, los dipéptidos Ala-Trp (QW) y Ser-Trp (SW), representan, de una forma particular, unas opciones preferidas, para mejorar los factores de relación o cocientes Trp / LNAA, en el plasma, vía un dipéptido sintético. La producción de los dipéptidos AW y SW, vía una síntesis química, es posible, mediante la utilización de técnicas convencionales tales como las que se encuentran descritas en "Peptides: Chemistry and Biology", -Péptidos: Qímica y biología -, por N. Sewald y H.D. Jakubke, Eds. Wiley -VCH Verlag GmbH, 2002, capítulo 4. Los procedimientos y métodos efectivos en cuanto lo referente al coste, de la síntesis química de los péptidos, y los cuales son particularmente apropiados para la producción a escala industrial, se basan en el uso de cloroformiatos de alquilo, o de cloruro de pivaloílo, para la activación del grupo carboxílico, combinado con el uso de ésteres de metilo, para la protección C-terminal, y grupos de benciloxicarbonilo

o de (Z) o grupos de tert.-butoxicarbonilo, para la N-protección. Un procedimiento detallado para la síntesis efectiva en cuanto al coste, del dipéptido SW, es la que se proporciona en el Ejemplo 5 de este documento de solicitud de patente. La combinación de tal tipo de dipéptido con contenido en triptófano, químicamente sintetizado, en combinación con un triptófano unido a un polipéptido, tal como el consistente en un proteína resistente a la pepsina, con un alto factor de relación o cociente Trp / LNAA, de una forma preferible, lisozima intacta, es nueva.

Teniendo disponible la composición en concordancia con la presente invención, se prevén otras nuevas y sorprendentes aplicaciones, las cuales tienen unas ventajas técnicas y económicas.

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Un nuevo uso, sería el consistente en la incorporación de lisozima y / o de la composición de la presente invención, en varios productos de fórmula para niños pequeños lactantes. La leche de vaca, tiene un contenido de proteína de suero láctico, correspondiente a un porcentaje del 20 %, y la lecha humana, tiene un contenido de proteína de suero láctico, correspondiente a un porcentaje comprendido dentro de unos márgenes que van desde un 40 % hasta un 60 %. Como consecuencia de ello, la leche de vaca, contiene menos alfa-lactoalbúmina y así, de este modo, triptófano, que la leche humana. Los niños pequeños lactantes, no prematuros, se alimentan, de una forma usual, con fórmulas alimenticias a base de leche de vaca, productos éstos, los cuales no proporcionan un perfil de aminoácidos equivalente al de la leche materna. Si bien las consecuencias de un suministro insuficiente de triptófano, no se conocen de una forma completa, los productos de fórmulas para niños pequeños lactantes, con un alto contenido en triptófano, pueden tener unos efectos beneficiosos sobre el comportamiento consciente y el inicio y la calidad del sueño del niño pequeño lactante. Una fuerte indicación, en cuanto al hecho consistente en que, el nivel de triptófano en el plasma, fomenta un rápido inicio de un sueño tranquilo, en neonatos sanos, es la que se ha proporcionado por parte de Yogman y Zeisel en N Engl J Med., en fecha 10 de Noviembre de 1983; 309 (19): 1147 1149. De una forma correspondientemente en concordancia, la presente invención, proporciona composiciones para niños pequeños lactantes, en los cuales, se ha procedido a aumentar el nivel de triptófano.

En concordancia con otro aspecto de la presente invención, la composición en concordancia con la invención, puede utilizarse en productos que reemplazan a una comida. Así, por ejemplo, la patente internacional WO 2005 / 02 3017, describe las ventajas de la gelatina, en altas dosificaciones, como un componente apropiado en los productos que reemplazan a una comida. Al mismo tiempo que proporciona unas excelentes propiedades organolépticas, la gelatina, no proporciona el equilibrio necesario de aminoácidos, por ejemplo, ésta no incorpora el aminoácido esencial consistente en el triptófano. Así, por lo tanto, con objeto de llegar a una composición la cual tenga un equilibrio apropiado de aminoácidos, según requiere la Directiva EC 96 / 8 / EC, debe añadirse triptófano, a tales tipos de composiciones con contenido en gelatina. En la patente internacional WO 2005 / 02 3017, el triptófano, se añade, de una forma preferible, en forma de una proteína rica en triptófano, tal como, por ejemplo, la clara de huevo en polvo, o huevo entero en polvo. Nosotros, los solicitantes, hemos encontrado, ahora, el hecho consistente en que, la composición con contenido en triptófano, en concordancia con la presente invención, ofrece una solución mejorada a este problema, ya que, estos hidrolizados, proporcionan triptófano, en una forma mucho más concentrada. De una forma adicional, la lisozima, en sí misma, contiene la totalidad de aminoácidos esenciales en la cantidad requerida, y como tal, ésta es una proteína nutritivamente completa, la cual encaja de una forma ideal, en un reemplazo de una comida.

En concordancia con todavía otro aspecto de la presente invención, la lisozima y / o la composición en concordancia con la presente invención, se utilizan para mejorar el inicio y la calidad del sueño, en niños pequeños lactantes, en niños, y en adultos. Los problemas del sueño, son muy prevalentes, entre los individuos pertenecientes a varios grupos de edad, y éstos se encuentran asociados con trastornos o desórdenes médicos. La composición con contenido en triptófano en concordancia con la presente invención es de utilidad en el tratamiento de problemas del sueño en general, pero sin embargo, no obstante, ésta presenta adicionalmente, además, herramientas apropiadas para superar los problemas conectados con los trastornos cognitivos, los trastornos psicológicos, y los trastornos del comportamiento. Los ejemplos de ello, son los consistentes en el establecimiento de una buena higiene del sueño, la superación de un trastorno asociado con el inicio del sueño, o la superación de un trastorno del ritmo circadiano durante el sueño. Los productos en cuestión, pueden ser de utilidad en la mejora del inicio y de la calidad del sueño, y en el estado mental de, por ejemplo, los pacientes afectados de fibromialgia. El síndrome de la fibromialgia, es un síndrome consistente en un dolor crónico, el cual se encuentra relacionado con un inicio y una calidad del sueño gravemente alterados, y con un estrés emocional. Nosotros, los solicitantes, hemos encontrado el hecho consistente en que, la ingesta de la composición en concordancia con la presente invención y / o lisozima, mejora el inicio y la calidad del sueño, de los individuos los cuales sufren de problemas del sueño en general.

La composición en concordancia con la presente invención, ofrece unas ventajas adicionales, tales como en las consistentes en el aporte de aminoácidos (semi-) esenciales. La lisozima, no únicamente tiene un alto nivel de triptófano, sino que ésta incorpora, así miso, también, un significativo número de residuos de tirosina. La tirosina, es el precursor para la dopamina neurotransmisora, y se conoce el hecho consistente en que, los niveles de tirosina en el plasma, afectan a los niveles de dopamina en el cerebro. El hidrolizado de lisozima, no únicamente contiene menos LNAAs que otros péptidos con alto contenido de triptófano, sino que, éste contiene así mismo, también, menos aminoácidos de cadena ramificada (BCAAs), que los correspondientes a los conocidos péptidos con alto contenido de triptófano. Este hecho, es importante, debido al hecho consistente en que, según se conoce, los BCAAs, reducen la disponibilidad en el plasma del precursor de la dopamina, tirosina. Así, de este modo, su alto factor de relación o cociente Trp / LNAA, en combinación con su alto factor de relación o cociente Tyr / BCAA, convierte al lisozima en una molécula única. Así, por lo tanto, la composición en concordancia con la presente invención, el cual comprende hidrolizado de lisozima y lisozima intacta, se encuentra muy bien situado, como “alimento del cerebro”, es decir, para el suministro de los aminoácidos esenciales requeridos para unos niveles apropiados de neurotransmisores. El sistema de la dopamina, es conocido, debido a su crítico rol interpretativo en la mediación de la recompensa y la motivación y sus efectos en la acción de resolver los problemas de la concentración, de la memoria, del estado de alerta, de la atención, así como en la coordinación psicomotora. Tal y como se ilustra en el Ejemplo 9 del presente documento de solicitud de patente, la ingesta del hidrolizado de lisozima en concordancia con la presente invención, tiene unos significativos efectos beneficiosos, en la vigilancia,

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en estado de alerta, en la concentración, y en la coordinación psicomotora. Este descubrimiento, demuestra el hecho consistente en que puede esperarse el hecho consistente en que, la composición de la presente invención, no únicamente estimule el sistema de la serotonina, sino que, adicionalmente, además, ésta estimule el sistema de la dopamina. Algunos grupos de individuos, pueden beneficiarse de este descubrimiento. Así, por ejemplo, las mujeres, durante sus años de menopausia, se quejan, de una forma general, de su reducida capacidad para solucionar problemas, los cuales, según informan éstas, son problemas relacionados con la incapacidad para concentrarse. Así, por lo tanto, la composición en concordancia con la presente invención, es especialmente apropiada para luchar contra estos problemas, en las mujeres las cuales se encuentran en este grupo de edad. En la categoría correspondiente al grupo de mujeres que va desde una edad joven, hasta una edad media, el síndrome premenstrual, es bastante común. El síndrome en cuestión, se caracteriza por una gran variedad de síntomas, pero las quejas sobre la depresión y sobre la inestabilidad emocional, acontecen de una forma muy frecuente. Con objeto de luchar contra los problemas correspondientes a estas quejas, se prescriben, de una forma frecuente, inhibidores selectivos de la recaptación de la serotonina, y para las mujeres las cuales presentan unos síntomas más ligeros, se recomiendan adaptaciones dietéticas y la prevención del estrés. En base a los resultados de los experimentos los cuales se encuentran descritos en el Ejemplo 6 y en Ejemplo 9 del presente documento de solicitud de patente, la composición en concordancia con la presente invención, presenta un excelente tratamiento, de una forma especial, para tales tipos de casos más ligeros. De una forma adicional, una dopamina insuficiente, se encuentra asociada con el trastorno de hiperactividad, con déficit de atención (ADHD – [de sus siglas en idioma inglés, correspondientes a attention – déficit hyperactivity disorder] -), de tal forma que, los síntomas de este desorden o trastorno, según se espera, puede aliviarse mediante la composición en concordancia con la presente invención. Nuestro descubrimiento, en cuanto al hecho consistente en que, los efectos beneficiosos en el comportamiento o rendimiento post-estrés, son especialmente prominentes en los sujetos resistentes al estrés, es verdaderamente sorprendente. Una posible explicación para ello, puede ser el consistente en que, las personas estresadas, con un sistema de la serotonina (hiper-) activo, necesitan el triptófano, procedente de la bebida, para reponer sus reservas de serotonina y, así, de este modo, éstas no pueden utilizar este triptófano para mejorar su comportamiento o rendimiento en las tareas usuales. En concordancia con esta base o línea de razonamiento, las personas resistentes al estrés, sin un sistema serotoninérgico hiperactivo, no necesitan el triptófano para reponer sus reservas de serotonina, y pueden utilizarlo para mejorar su comportamiento o rendimiento post-estrés. Una explicación alternativa, para ello, puede ser la consistente en que, estos efectos, son debidos, de hecho, a un efecto estimulante de los procesos dopaminérgicos. Las síntesis de la dopamina, puede mejorarse mediante la utilización de ingredientes alimenticios ricos en tirosina, de una forma particular, si éstos se combinan con unos altos niveles de aminoácidos de cadena ramificada (BCAAs). Estas hipótesis de trabajo, se dan a conocer aquí, en este documento de solicitud de patente, con objeto de explicar los datos experimentales, los cuales se exhiben en los Ejemplos, facilitados más abajo, a continuación, y éstos se utilizan para proporcionar la presente visión o perspectiva de los inventores. Sin embargo, no obstante, la presente invención, no se encuentra en ningún caso vinculada a estas hipótesis, o limitadas por ellas. Así, de este modo, la presente invención, se soporta, de una forma independiente en cuanto a lo referente a la exactitud de estas hipótesis. Tal y como se ha indicado en otro lugar, la lisozima, no únicamente tiene un alto nivel de triptófano, sino que, ésta incorpora, así mismo, también, un gran número de residuos de tirosina.

La lisozima y / o la composición en concordancia con la presente invención, aumenta así mismo, también, el contenido o cisteína en los productos alimenticios. Si bien no un aminoácido esencial, las concentraciones de cisteína, se encuentran limitadas, en muchos productos alimenticios. La síntesis endógena de la cisteína, requiere la presencia de la metionina, y, de la misma forma que lo que sucede con la cisteína, las concentraciones de metionina, se encuentran limitadas, en muchos productos alimenticios. Las ventajas de un contenido incrementado de cisteína, en los productos alimenticios, se refieren, entre otras, al efecto antagonístico sobre el efecto de la elevación de la homocisteína, de la metionina. Este descubrimiento, se ha descrito en la patente internacional WO 03 / 055 335. La composición en concordancia con la presente invención, se caracteriza así mismo, también, por un alto nivel de cisteína. De hecho, la molécula de lisozima, contiene incluso más residuos de cisteína (8), que los correspondientes a los residuos de triptófano (6). En este respecto, la composición en concordancia con la presente invención, forma una excelente fuente para incrementar el contenido de cisteína de determinados productos. Se ha encontrado el hecho consistente en que, unos contenidos incrementados de cisteína, son importantes, para los productos tales como los consistentes en las fórmulas alimenticias para niños pequeños lactantes. No únicamente para las fórmulas alimenticias para niños pequeños lactantes a base de caseína, o de mezclas de caseína y de proteínas de suero láctico, sino también, así mismo, para productos a base de soja y, de hecho, para todas los productos ricos en proteínas, en los cuales, la fuente principal de proteínas se proporciona mediante una proteína la cual contenga unas cantidades relativamente bajos de triptófano o de cisteína. Aparte de los componentes proteínicos procedentes de la leche bovina y de la gelatina, la proteína de maíz, la proteína de fermentos o levaduras, la proteína de guisante, la proteína de soja, y la proteína de arroz, representan ejemplos de tales tipos de proteínas. De una forma adicional, los productos que reemplazan a una comida, anteriormente mencionados, arriba, los cuales contienen unas altas dosificaciones de gelatina, contienen unas cantidades inadecuadas de cisteína.

La lisozima y / o la composición en concordancia con la presente invención, la cual comprende, por ejemplo, un dió tripéptido, el cual comprende triptófano, especialmente SW (como dipéptido) ó AW (como dipéptido), puede utilizarse de cualquier forma apropiada, tal como la consistente en un producto alimenticio o en una bebida, como un Producto Alimenticio para Usos Nutricionales Especiales, como un suplemento dietético, como un nutracéutico, o

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incluso como un alimento o producto alimenticio para animales de compañía o domésticos. La composición con contenido en lisozima en concordancia con la presente invención, puede añadirse en cualquier etapa, durante el procesado normal de estos productos. En el caso en el que ésta se utilice en productos alimenticios, o en bebidas, se prefieren, entonces los productos con un contenido relativamente bajo de proteínas, con objeto de mantener el alto factor de relación o cociente Trp / LNAA, en la sangre, después del consumo de los productos en concordancia con la presente invención. Los productos alimenticios relevantes, incluyen, por ejemplo, a las barras de cereales, a las bebidas que contienen chocolate, a los productos de pastelería o de panadería, tales como los consistentes en los bizcochos y las galletas, y así mismo, también, a los productos alimenticios líquidos, tales como los consistentes en las sopas, o en las sopas en polvo. Aparte de los productos lácteos, tales como los consistentes en la leche y el yogurt, otras bebidas apropiadas, incluyen a las bebidas no alcohólicas y a las bebidas alcohólicas, así como también, así mismo, a las preparaciones líquidas a ser añadidas al agua potable, y a un producto alimenticio líquido. Las bebidas no alcohólicas son, de una forma preferible, las consistentes el agua mineral, en las bebidas deportivas, en los jugos o zumos de frutas, en la limonadas, en los tés, en el café, en el café descafeinado, en las bebidas concentradas, tales como las consistentes en las copitas o “chupitos” de diversos tipos de cremas o jarabes alcohólicos, en la bebidas energéticas (tales como, por ejemplo, las consistentes las bebidas, las cuales contienen glucuronolactona, cafeína o taurina), y en las bebidas carbonatadas (tales como, por ejemplo, las consistentes en las bebidas denominadas “pop”, en las sodas, o en las bebidas de cola).

Las combinaciones preferidas con lisozima y / o la composición en concordancia con la presente invención, son con los compuestos recomendados para la “nutrición cerebral, tales como los consistentes en el hierro, en el zinc, en el magnesio, en las vitaminas (de una forma especial, las vitaminas consistentes en la vitamina B2, en la vitamina B6, en ácido fólico, y en la vitamina C), en los ácidos grasos omega -3 y grasas de DHA (ácido decosahexaenóico), o en los ácido grasos, en el GABA (ácido γ-aminobutírico), en la colina, en la fosfatidilserina, en la coenzima Q10, en la creatina, en la taurina, y en la 5-HTP (5-hidroxitriptamina), o con los compuestos recomendados para aliviar el estrés o la depresión, tales como los consistentes en la valeriana, en el chocolate, en la hierba de San Juan, en el 5-HTP, en la fosfatidilserina, en el alcohol, el bálsamo de limón, en el té verde o en los extractos de té verde, en la camomila o manzanilla o en la S-adenosilmetionina, o con los compuestos recomendados para mejorar la alerta, tales como los consistentes en la cafeína, en la guarana (Paullina cupana), en el ginseng, en el gingko bilboa, en la hierba de San Juan, en la 5-HTP, o con los compuestos recomendados para mejorar el estado de ánimo, tales como los consistentes en el GABA, en la 5-HTP, en la PEA (feniletilamina), en el chocolate, en el té verde, o en los extractos de té verde, en el gingko bilboa, en la Salvia, o en la S-adenosil metionina, o con los compuestos recomendados para para mejorar el sueño, tales como los consistentes en los péptidos lácticos, en el triptófano libre, en péptidos de opioides, o en la melatonina. Los ejemplos de Productos Alimenticios para Usos Nutricionales Especiales, incluyen a las categorías de los alimentos deportivos, de los alimentos adelgazantes, de las fórmulas alimenticias para niños pequeños lactantes, y de los productos alimenticios clínicos. El término suplemento dietético, tal y como éste se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, significa un producto, el cual se toma por la boca, y el cual contiene un compuesto o una mezcla de compuestos, destinados para suplementar la dieta. El compuesto o mezcla de compuestos, en estos productos, pueden incluir a: las vitaminas, los minerales, las hierbas u otros entes botánicos, y los aminoácidos. Los suplementos dietéticos, pueden también ser extractos o concentrados, y éstos pueden encontrarse en muchas formas, tales como en forma de tabletas, en forma de cápsulas, en forma de geles blandos, en forma de cápsulas de gel, en forma de líquidos, o en forma de materias en polvo.

La composición con contenido en triptófano y / o la lisozima en concordancia con la presente invención, puede también utilizarse, así mismo, como una composición nutracéutica, o en una composición nutracéutica, o en la preparación de un nutracéutico. El término nutracéutico, tal y como éste se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, significa que éste es útil en ambos sectores, el sector nutricional y el sector farmacéutico de aplicación. La lisozima y / o las composiciones nutracéuticas en concordancia con la presente invención, pueden ser en cualquier forma la cual sea apropiada para la administración, al cuerpo del animal, incluyendo a un cuerpo humano, de una forma especial, en cualquier forma, la cual sea convencional para la administración oral, tal como, por ejemplo, en forma sólida, tal como la consistente en un producto alimenticio (o aditivos / suplementos para productos alimenticios), o alimentos en forma de piensos o forrajes, en premezclas de productos alimenticios, o de forrajes o piensos, en tabletas, en píldoras, en gránulos o granulados, el grageas, en cápsulas, y en formulaciones efervescentes, tales como los consistentes en materias en polvo y en tabletas, o en formas líquidas, tales como las consistentes en soluciones, en emulsiones o suspensiones, tal como, por ejemplo, las consistentes en bebidas, en pastas, y en suspensiones aceitosas. Las formulaciones con una liberación controlada (retardada), las cuales incorporan a los hidrolizados en concordancia con la presente invención, forman también parte, así mismo, de la presente invención. De una forma adicional, puede procederse a añadir un suplemento multivitamínico y multimineral, a las composiciones nutracéuticas de la presente invención, para obtener una cantidad apropiada de un nutriente esencial, el cual falte en algunas dietas. El suplemento multivitamínico y multimineral, puede también ser de utilidad para la prevención de enfermedades y para la protección contra las pérdidas y deficiencias nutricionales, debidas a los modelos patrón de determinados estilos de vida.

En un aspecto preferido de la presente invención, la lisozima y / la composición en concordancia con la invención, puede utilizarse como un suplemento nutracéutico o nutritivo, tal como por ejemplo, un suplemento nutracéutico o nutritivo para la mejora del estado de ánimo, para la mejora de las funciones cognitivas, tales como las consistentes en el aprendizaje, en la memoria, en la vigilancia, y en el estado de alerta, en personas mayores, pero así mismo,

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concordancia con el presente texto, si más de un porcentaje del 50 % de la proteína con el peso molecular original, se encuentra todavía presente, después de la incubación de la proteína.

SDS-PAGE

La pureza de las preparaciones de lisozima utilizadas, se verificaron mediante la técnica de SPD-PAGE. Todos los materiales utilizados para la realización de la técnica SPD-PAGE, y el tinte para el marcaje por tinción, se compraron en el marcado, de procedencia de la firma Invitrogen (Carlsbad, CA, Estados Unidos de América), las muestras, se prepararon mediante la utilización de un tampón SDS, en concordancia con las instrucciones del fabricante, y éstas se separaron en geles de Bis-Tris al 12%, mediante la utilización de un sistema tampón MES-SDS, en concordancia con las instrucciones del fabricante. La tinción, se llevó a cabo mediante la utilización de Simply Blue Safe Stain (Colllodial Coomassie G250). Previamente a la hidrólisis, la lisozima, aparecía como una banda individual, con un peso molecular de aprox. 14 kDa, en el gel.

Análisis de LC / MS / MS

Para este análisis de LC/MS/MS (Espectrometría de masas y cromatografía líquida en tándem), se realizó una HPLC (espectrometría de masas de alto rendimiento) mediante la utilización de un espectrómetro de masas (de procedencia de la firma Thermo Electron, Breda, Países Bajos), acoplado a una bomba del tipo P4000 (de procedencia de la firma Thermo Electron , Breda, Países Bajos), con objeto de determinar la presencia de péptidos con contenido en triptófano (principalmente, di-y tri-péptidos), en hidrolizados proteínicos enzimáticos, producidos mediante el procedimiento de la presente invención. Se procedió a separar los péptidos formados, mediante la utilización de una columna de Inertsil 3, ODS 3, 3 µm, 150* 2,1 mm (de procedencia de la firma Varian Belgium, Bélogica), en combinación con un gradiente del 0,1 % de ácido fórmico, en agua Milli Q (Milli Q water, de la firma Millipore, Bedford, MA, EEUU de América; Solución A) y del 0,1 % en acetonitrilo (Solución B), para la elución. El gradiente, empezó a un porcentaje del 100 % de la solución, se mantuvo ahí durante un transcurso de tiempo de 10 minutos, incrementándose, de una forma lineal, a un porcentaje del 20 % de B, en un transcurso de tiempo de 25 minutos, y llevándose, inmediatamente, a las condiciones de partida, y se mantuvo en estas condiciones, durante un transcurso de tiempo de 15 minutos, para la estabilización. El volumen de inyección utilizado era de 50 microlitros, el caudal de flujo, era de 200 microlitros por minuto, y la temperatura de la columna, se mantuvo a un valor de 55 °C. La concentración de proteína de la muestra inyectada, era de aprox. 50 microgramos / mililitro. La identificación de los péptidos de interés, se basa en el tiempo de retención, en la molécula protonada, y en la utilización de análisis de MS / MS, para los péptidos de interés. Mediante la utilización de una energía de colisión óptima, de un valor de aprox. un porcentaje del 30 %. La cuantificación de los péptidos con contenido en triptófano específicos, se realiza mediante la utilización de un procedimiento estándar externo. El tetrapéptido VVPP (M = 410,2), se utiliza para realizar el ajuste para la sensibilidad óptima, en el modo MS, y para la fragmentación óptima, en el modo MS / MS, formando una infusión constante de 5 µg / ml, dando ello como resultado un molécula protonada, en el modo MSO, y una energía de colisión óptima, de un valor de aprox. un porcentaje del 30 %, en el modo MS / MS, generando unas series de iones B y de iones Y.

Previamente al análisis de LC / MS / MS, se procedió a hidrolizar los hidrolizados de las proteínas, a la temperatura ambiente, a una velocidad angular de 1 300 r. p. m., durante un transcurso de tiempo de 10 minutos y, el sobrenadante, se diluyó a un valor un valor de relación de 1 : 100, con agua desmineralizada, se filtró a través de un equipo de filtrado de agua de la marca Millipore (MilliQ wáter – [agua Milli Q] -).

Análisis de aminoácidos

Se procedió a analizar los perfiles de aminoácidos en plasma, mediante HPLC, en concordancia con Eijk et al (J. Chromatogr. 1993: 620: 143 -148), según se encuentra descrito en el Ejemplo 6 ó en el Ejemplo 11, los cuales se facilitan más abajo, a continuación.

Se procedió a llevar a cabo otro análisis de aminoácidos, en concordancia con el método de Pico Tag, de la forma especificada en el manual de operadores del Sistema de Análisis de Aminoácidos de Water (Mitford, Ma, USA). Para llevar a cabo este análisis, se procedió a secar las muestras y éstas de derivatizaron directamente, mediante la utilización de isotiocianato de fenilo. Los aminoácidos derivatizados los cuales se encontraban presentes, se cuantificaron, mediante la utilización de procedimientos de HPLC, de la forma la cual se describe. Puesto que, durante la hidrólisis ácida de los aminoácidos Trp y Cys, se destruyeron, se procedió a utilizar procedimientos especiales, con objeto de cuantificar estos dos aminoácidos. Co objeto de evitar la degradación del Cys, durante la hidrólisis, se procede, en primer lugar, a oxidar el ácido cistéico, mediante la utilización de peróxido de hidrógeno y, a continuación, se procede a su cuantificación. El análisis del triptófano, se basa en un procedimiento de Water, ligeramente modificado. En este procedimiento, se procede a secar un alícuoto de la solución peptídica, bajo la acción del vacío, y a continuación, se procede a su hidrolización, durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a una temperatura de 150 °C, bajo atmósfera de nitrógeno, en ácido metanosulfónico 4 M, con un contenido del 0,2 % de triptamiina. El producto de reacción, se cuantifica directamente, mediante la utilización de HPLC; equipada con una columna C18, de Alltech Altima y una detección fluorescente.

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Tabla 1: Hidrólisis de la lisozima, mediante la pepsina y mediante una mezcla de tripsina / quimotripsina .

Enzima

Valor pH inicial Valor pH final DH inicial (%) DH final (%)

Pepsina

2,8 2,4 2,4

Pepsina

3,6 3,2 < 1

Pepsina

4,6 4,3 1,0

= 0

Tripsina / quimotripsina

4,6 4,3 < 1

Tripsina / quimotripsina

5,9 5,5 < 1

Tripsina / quimotripsina

7,2 7,0 1,3

Ejemplo 2

La lisozima de huevo de gallina, se segmenta, de una forma eficiente, mediante la subtilisina, a unos elevados valores del pH.

Con objeto de someter a ensayo la susceptibilidad de la lisozima, a la hidrólisis enzimática, bajo unas condiciones de un valor pH no fisiológicas y de una condiciones enzimáticas, se procede a incubar una solución de lisozimas, en vitro, con una subtilisina microbiana, (EC 3. 4. 21. 62), bajo una condiciones de un valor pH alcalino. Con esta finalidad, se procedió a incubar una solución de lisozima, al 5 % (peso / peso), a un valor pH de 7,0, de 8,0 y de 9,0, con 12,5 microlitros de Protex 6L, por gramo de proteína lisozima presente. La incubación, se llevó a cabo durante un transcurso de tiempo de 3 horas, a una temperatura de 60 °C, con un ajuste constante del valor pH, mediante la utilización de 1 M NaOH. Las incubaciones, proporcionaron unas soluciones ligeramente túrbidas, sin ningunos precipitados los cuales fueran significativos. Después de haber procedido a la etapa de calentamiento, con objeto de inactivar la actividad de la subtilisina, se procedió a medir los valores de DH de varias incubaciones, en concordancia con el protocolo establecido en la sección de Materiales y Métodos. Como contraste a los resultados obtenidos bajo unas condiciones fisiológicas (véase el Ejemplo 1), las condiciones alcalinas de incubación alcalina, mediante la utilización de subtilisina, dieron como resultado una hidrólisis completa de las lisozimas. La incubación a un valor pH de 7,0, dio como resultado un DH de 6,3, la incubación a un valor pH de 8,0, dio como resultado un DH de 11,2, y la incubación a un valor pH de 9,0, dio como resultado un DH de 16,4. Un análisis subsiguiente de SDS – PAGE de los productos de reacción, indicó el hecho consistente en que, la molécula de lisozima entera, se degradó, a saber, no sobrevivieron los fragmentos de un gran peso molecular, a la incubación con sutilisina. De una forma adicional, el análisis de HPLC del hidrolizado, en una columna del tipo “Crownpak CR+ column” (Daicel) reveló el hecho consistente en que no tuvo lugar, una racemización significativa de los péptidos con contenido en triptófano, ni siguiera después de un calentamiento durante un prolongado transcurso de tiempo, a un valor pH de 9,0.

Ejemplo 3

Hidrolización de lisozima, mediante la utilización de Protex, e identidad de los péptidos formados.

Se procedió a ajustar una solución la cual contenía un porcentaje del 10 % (peso / peso) de lisozima pura, un valor de 8,2, mediante la utilización de NaOH, y ésta se calentó, a una temperatura de 52 °C. La hidrólisis, se inició mediante la adición de 25 microlitros de Protex / g, de la proteína presente. Mediante un régimen de agitación continua y manteniendo el pH constante a un valor de 8,2, se continuó con la hidrólisis, durante un transcurso de tiempo de 5,5 horas, para proporcionar una solución, de una aspecto casi claro, sin ningún precipitado que fuera visible. Después de haber procedido a llevar a cabo una etapa de calentamiento, con objeto de inactivar la actividad del Protex, se procedió a extraer una muestra, con objeto de realizar el análisis de DH. El DH de la solución, resultó ser de un porcentaje de casi un 30 %. La solución tratada mediante calor, se sometió a proceso de ultrafiltración, sobre un filtro de 10 kDa, para proporcionar un líquido casi completamente claro. Este líquido claro, se utilizó para un análisis de LC / MS, para la distribución del peso molecular de los péptidos y para las proteínas las cuales se encontraran presentes, así como para la cromatografía de intercambio de iones.

Con objeto de conseguir una impresión sobre el peso molecular de los péptidos y de las proteínas las cuales se encuentren presentes, se procedió a someter el líquido claro, a una análisis del peso molecular, según se describe en la sección de Materiales y Métodos. Los resultados obtenidos (véase la figura 3), indica, de una forma clara, el hecho de que, la mayoría de péptidos que incorporan a aminoácidos, con una cadena lateral aromática (a saber, triptófano, tirosina y fenilalanina), tienen un peso molecular el cual es inferior a los 500 kDa. En vista del alto peso molecular de estos de estos aminoácidos, la implicación, en la mayoría de estos pequeños péptidos es la consistente en, bien ya sea dipéptidos, o bien ya sea tripéptidos.

El análisis de LC / MS, se llevó a cabo en concordancia con el procedimiento el cual se encuentra descrito en la sección de Materiales y Métodos. Mediante la selección de estos péptidos, los cuales contienen un triptófano (“W”), pudieron detectarse los péptidos AW, GNW, WIR, NAW, WVA. VAW, AWR, SLGNW, y unas cantidades menores de

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Mediciones repetitivas en análisis de variancia con Condición y Tiempo, como factores intra-sujetos, en las puntuaciones o calificaciones del estado de ánimo, revelaron un efecto significativo del Tiempo, y una significativa interacción de Condición x Tiempo; indicando el hecho consistente en que, los cambios en el estado de ánimo, a través del tiempo, difieren de una forma significativa, entre las condiciones. Se encontraron unas mejoras 5 comparables del estado de ánimo, 60 minutos después de la ingesta de “WEPS”, y “TRP “, pero únicamente con WEPS, el estado de ánimo, aumentó de una forma adicional, hasta los 210 minutos después de la ingesta, si se comparara con el TRP. Como contraste de ello, no se encontraron ningunos cambios, después de la ingesta de “REF” y de “ALAC”. La ausencia de un efecto sobre el estado de ánimo, después de la ingesta de la alfalactoalbúmina, es comparable con los estudios previos, los cuales muestran unos ligeros beneficios en el estado de

10 ánimo, después de la ingesta de la alfa-lactoalbúmina, y únicamente en los sujetos vulnerables al estrés, bajo una exposición aguda al estrés (véase, a dicho efecto, Markus, 2003). Si bien el estado de ánimo parecía también mejorar, después de la ingesta de “SYN”, este efecto, no era significativo, en la configuración de este experimento.

Estos presentes resultados, sugieren el hecho consistente en que, un gran incremento correspondiente a un

15 porcentaje del 255 %, en el valor de Trp / LNAA en el plasma, puede ser suficiente para un estado de ánimo mejorado, en sujetos no vulnerables al estrés. En base a descubrimientos previos, se espera el hecho consistente en que, estos efectos beneficiosos del hidrolizado de lisozima mejorada con Trp, en el estado de ánimo, será incluso mayor, en sujetos vulnerables al estrés, bajo una condiciones de alto estrés mental (Markus, 2003). Contrariamente a nuestras expectativas, no existían unas mejoras significativas, en el estado de ánimo, después de la ingesta del

20 dipéptido sintético. Estos inesperados resultados, pueden ser atribuibles a la presente configuración experimental, o a las diferencias en la biodisponibilidad del triptófano, procedente de estas diversas fuentes.

Tabla 3: Cambios en las concentraciones de aminoácidos (µmol / l), en el plasma, a través tiempo, después de la

25 ingestión de hidrolizado de caseína (“REF”), alfa-lactoalbúmina (“ALAC”) o hidrolizado de lisozima, mejorado con Trp (“WEPS”).

Tempo (minutos)

Aminoácido

Condición 0 30 60 90 120 180 210

Isoleucina

REF ALAC WEPS 0,07 0,08 0,07 0,10 0,12 0,09 0,18 0,20 0,09 0,15 0,22 0,14 0,12 0,18 0,09 0,09 0,12 0,08 0,08 0,11 0,09

Leucina

REF ALAC WEPS 0,12 0,13 0,13 0,19 0,22 0,14 0,31 0,37 0,14 0,26 0,38 0,13 0,22 0,28 0,13 0,17 0,21 0,13 0,16 0,20 0,14

Fenilalanina

REF ALAC WEPS 0,06 0,07 0,07 0,08 0,09 0,07 0,10 0,11 0,07 0,08 0,10 0,06 0,08 0,09 0,10 0,06 0,07 0,06 0,06 0,07 0,07

Tirosina

REF ALAC WEPS 0,06 0,06 0,06 0,07 0,08 0,07 0,12 0,12 0,07 0,11 0,12 0,06 0,09 0,10 0,06 0,06 0,08 0,06 0,07 0,08 0,06

Valina

REF ALAC WEPS 0,24 0,26 0,26 0,28 0,30 0,27 0,45 0,38 0,25 0,42 0,42 0,25 0,38 0,35 0,25 0,32 0,29 0,25 0,30 0,28 0,26

Triptófano

REF ALAC WEPS 0,06 0,07 0,07 0,07 0,09 0,13 0,08 0,18 0,21 0,08 0,23 0,23 0,07 0,19 0,20 0,06 0,13 0,14 0,05 0,12 0,13

LNAA

REF ALAC WEPS 0,52 0,60 0,62 0,67 0,82 0,60 1,14 1,14 0,65 1,01 1,22 0,60 0,86 1,10 0,68 0,73 0,86 0,55 0,65 0,82 0,64

Trp / LNAA

REF ALAC WEPS 0,11 0,12 0,11 0,09 0,12 0,19 0,08 0,15 0,36 0,08 0,18 0,39 0,08 0,2 0,35 0,08 0,18 0,25 0,08 0,17 0,22

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La finalidad del presente estudio, era el consistente en comparar los efectos del hidrolizado de lisozima preparado en concordancia con el procedimiento el cual se encuentra descrito en el Ejemplo 7, con un placebo (hidrolizado de caseína; véase el Ejemplo 6), en término de los niveles de Trp / LNAA en el plasma, y sus consecuencias, en las tareas rendimiento post-estrés. Los tests de ensayo de rendimiento utilizados, se conocen como abordando los aspectos de la “vigilancia” y del “control motor de la observación” de los individuos.

En el presente estudio, participaron cuarenta individuos, de los cuales, veinte eran hombres, y veinte eran mujeres. En base a un cuestionario previo al estudio, la mitad de este grupo, se clasificó como siendo resistente al estrés y, la otra mitad, se clasificó como susceptible al estrés. Los criterios de inclusión, y los criterios de exclusión, para los individuos en cuestión, así como la conducción general del estudio, eran los mismos, según se encuentran éstos descritos en el Ejemplo 6. En la Figura 4, se proporciona un diagrama de flujo del diseño, y en la Figura 5, se proporciona un esquema de un estudio típico de un día.

En las mañanas experimentales, los sujetos, llegaron al estudio en ayunas. Una vez llegados, a éstos se les proporcionaba, bien ya sea una bebida la cual contenía el hidrolizado de lisozima, o bien el placebo, a saber, una bebida, la cual contenía el hidrolizado de caseína. La composición de la bebida de ensayo, y la bebida con el placebo, se encuentran descritas en la Tabla 5.

Tabla 5: Composición de las bebidas utilizadas

Fuente de proteína

Hidrolizado de caseína Hidrolizado de lisozima

Abreviación

plc Trp -hydr

g de materia en polvo / 300 ml

13,6 14,4

Agua

286 g 285 g

Edulcorante

0,1 g 0,1 g

g de Trp / 300 ml

0,4 0,8

Factor de relación Trp / LNAA (molar)

0,04 0,19

Noventa minutos después del consumo de las bebidas de 300 ml, se procedió a extraer una muestra de sangre, con objeto de valorar los factores de relación Trp / LNAA (véase, a dicho efecto, el Ejemplo 6). Subsiguientemente, se procedió a exponer bien ya sea el grupo de sujetos resistentes al estrés, o bien ya fuere el grupo de sujetos propensos al estrés, a tests de ensayo de rendimiento seguido de la exposición a un estrés. Este estrés, consistía en una tarea o tasca aritmética, la cual debía llevarse a cabo bajo una estimulación del ruido. Los sujetos se condujeron a la convicción de que, la presencia o ausencia del ruido, dependía de su rendimiento en el test de ensayo. En realidad, las tareas aritméticas, se habían manipulado de tal forma que, la totalidad de los sujetos, fallaban en cada intento. Esta configuración, se conoce como induciendo el estrés fisiológico, y ésta se percibe como siendo altamente incontrolable (véase, a dicho efecto, Peters, M. L., Godaert, G. L. R., Ballieux, R. E. et al. (1998). Cardiovascular and catecholamine response to experimental stress: effects of mental effort and controllability, -Respuesta cardiovascular y de la catecolamina al estrés experimental: efectos del esfuerzo mental y capacidad de control -. Psychoneuroendocrinology (Pisiconeuroendocrinología), 23, 1 – 17). Después de la tarea o tasca aritmética, se procedió a repetir el primer ensayo de rendimiento, con objeto de cuantificar el efecto del estrés en el rendimiento, bajo la influencia de los factores de relación Trp / LNAA en sangre, en la fuerza.

Los tests de ensayo de rendimiento, los cuales se llevaron a cabo, eran los consistentes en el “Mackworth Clock test” (Test de ensayo de reloj, de Mackworth (Mackworth, N (1948) The breakdown of vigilance during prolonged visual search, -La interrupción de la vigilancia, durante una prolongada inspección visual -. Quart J. Exp. Psych. 1 – 6 – 21), y el test consistente en “Critical Tracking Task (la Tarea del Seguimiento Crítico) (Jex HR et al., (1966) A "critical" tracking task for man-machine research related to the operator’s effective delay time, -Una tarea de seguimiento “crítico”, para la investigación hombre – máquina, relacionada con el tiempo de retardo efectivo del operador -. Nasa Contract Rep NASA CR.:1 -105).

El test de ensayo del reloj de Mackworh, se trata de un test de ensayo, el cual se usa de una forma extensa, para mejorar la “vigilancia”, el estado de alerta y la concentración, durante un período de tiempo sostenido. En la realización de este test de ensayo, los sujetos, se sientan delante de una pantalla de una computadora u ordenador, en la cual se exhibe una ordenación circular de 60 puntos, los cuales simulan las marcas de los segundos de un reloj. Los puntos en cuestión, se iluminan durante un breve transcurso de tiempo, en un movimiento de rotación en el sentido del reloj, a una tasa de uno por 500 ms. De una forma usual, el movimiento de rotación, avanza mediante un salto individual (un punto). Se les informó a los sujetos sobre el hecho de que, raramente, y a intervalos irregulares, la diana, avanza con un doble salto (dos puntos), saltándose uno de los puntos, en la secuencia normal. Este hecho provocaría el que, los sujetos, apretaran un botón, tan rápido como sea posible. En el test de ensayo de una duración de 45 minutos, se encontraban presentes un total de treinta ocasiones de este tipo. En cada período de tiempo sucesivo de 15 minutos, acontecían diez ocasiones, con unos intervalos de tiempo comprendido dentro de unos márgenes que iban desde los 8 segundos hasta los 7,2 minutos.

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una temperatura de 37 °C, a un valor pH de 4, en un tampón de Mc Ilvane (0,2 M ácido cítrico más Na2HPO4). Después de haber procedido a la incubación de ambas soluciones, éstas se calentaron, durante un transcurso de tiempo de 5 minutos, a una temperatura de 80 °C, con objeto de terminar la reacción y, pequeñas muestras, se sometieron a SDS – PAGE (véase, a dicho efecto, la sección de Materiales y Métodos), para someter a test de ensayo, las diversas moléculas tratadas con pepsina.

La figura 9, ilustra claramente el hecho consistente en que, la cantidad de lisozima de huevo de gallina, no se disminuye de una forma significativa, mediante la incubación con pepsina, bajo unas condiciones de un valor pH ácido. De entre las proteínas de suero láctico consistentes en la beta-lactoglobulina y la alfa-lactoglobulina, la betalactoglobulina, permanece ampliamente intacta, pero la alfa-lactoalbúmina, se degrada de una forma casi completa. La implicación de este hecho, es el consistente en que, la lisozima, así como también la beta-lactoglobulina, son “resistentes a la proteasa”, en concordancia con el test de ensayo el cual se encuentra especificado en la sección de Materiales y Métodos, y en que, la alfa-lactoglobulina, no es “resistente a la proteasa”. Este descubrimiento, ilustra el hecho consistente en que, de una forma distinta a la lisozima, no se califica como una fuente apropiada de triptófano unido a un polipéptido. A pesar del hecho consistente en que, la beta-lactoglobulina, es bastante resistente a la degradación por la pepsina, la molécula, no presenta un donante apropiado de triptófano, debido a un bajo factor de relación o cociente Trp / LNAA (0,04).

Ejemplo 11

Prolongación de los altos niveles de Trp / LNAA, procediendo a combinar hidrolizados de lisozima, con la molécula intacta

Con objeto de demostrar la ventaja de una combinación de la composición de triptófano unido a un péptido, y de triptófano unido a un polipéptido, se procedió a llevar a cabo un estudio, el cual involucraba a 15 individuos sanos. Los criterios de exclusión, eran: las enfermedades crónicas y corrientes, a la discreción del investigador; un historial de trastornos o desórdenes psiquiátricos; el uso de inhibidores selectivos de la recaptación de la serotonina (SSRI – [de sus iniciales en idioma inglés, correspondientes a Selective serotonine reuptake inhibitors] -), el uso de suplementos los cuales tienen como diana el sistema nervioso central, tales como los consistentes en los suplementos los cuales contienen triptófano, efedrina, o la hierba de San Juan; la alergia a los huevos; el abuso de las drogas o de los fármacos; la participación en cualquier otro estudio el cual involucre a productos de investigación

o a productos comercialmente disponibles en el mercado, de una forma concomitante o simultánea; la intolerancia a los edulcorantes artificiales; cualquier (historial de) enfermedad gastrointestinal, la cual pueda interferir con la función gastrointestinal, a la discreción del investigador; el uso de una medicación la cual tenga como objetivo el tracto gastrointestinal, tales como los antiácidos. Finalmente, en el caso de las mujeres, el embarazo o el uso de un método contraceptivo no médicamente aceptado, es así mismo, también, un criterio de exclusión. La totalidad de los sujetos los cuales participaban en el experimento, firmaron un formulario informativo de consentimiento.

Procedimiento

El estudio, se llevó a cabo en concordancia con un diseño cruzado, doble ciego, aleatorio, con un período de lavado

o enjuague, entre la ingesta de diferentes tratamientos, correspondiente a una duración de por lo menos tres días.

Durante el transcurso de tres sesiones experimentales matinales, los sujetos, visitaron el laboratorio, con objeto de controlar sus concentraciones de Trp / LNAA, en el plasma, seguido de la ingesta de una bebida, la cual contenía bien ya sea 6 gramos de lisozima intacta, bien ha sea 6 gramos de hidrolizados de lisozima, o bien ya sea 6 gramos de un mezcla de hidrolizado y de producto intacto. Las bebidas en cuestión, se presentaron como productos estériles, en botellas, provistas de pajitas. La lisozima intacta, se obtuvo en el mercado, con la marca Delvozyme G. El hidrolizado, se preparó de la forma la cual se encuentra descrita en el Ejemplo 7, y la mezcla incorporaba unas cantidades correspondientes a un porcentaje 30 % molar de Trp, como hidrolizado, y de un porcentaje del 70 % molar de Trp, como lisozima intacta. La totalidad de las bebidas, contenían una cantidad de 6 gramos de proteína derivada de la lisozima, 0,10 g de edulcorante (acesulfamo), y éstas se llenaron con agua corriente, con objeto de alcanzar una cantidad total de 300 ml de bebida. Un asistente de investigación, ciego en cuento a lo referente a las condiciones dietética, condujo la administración de las diferentes bebidas.

Los sujetos, visitaron el lugar, entre las 8 horas y las 9 horas de la mañana, habiendo ayunado durante un transcurso de tiempo de por lo menos 8 horas. Se procedió a insertar una cánula flexible para las extracciones de sangre, en su antebrazo no dominante. Después de haber procedido a la ingestión de una de las tres bebidas, se tomaron muestras de sangre, antes (t = 0) y a t = 15, 30, 60, 90, 120, 180, 210 y 240 minutos después de la ingestión, para medir los factores de relación o cocientes Trp / LNAA en el plasma. La ingesta de cualquier alimento,

o de bebidas, diferentes del agua, estaba prohibida, durante el transcurso de estos 240 minutos.

Mediciones en el plasma

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Claims (1)

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