ES2329316B1

ES2329316B1 - Obtencion y propiedades antihipertensivas de peptidos derivados de proteinas de clara de huevo.

Info

Publication number: ES2329316B1
Application number: ES200501246A
Authority: ES
Inventors: Marta Miguel Castro; Rosina Lopez-Alonso Fandiño; Mercedes Ramos Gonzalez; Amaya Aleixandre De Artiñano
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2005-05-23
Filing date: 2005-05-23
Publication date: 2010-10-14
Anticipated expiration: 2025-05-23
Also published as: WO2006125847A1; ES2329316A1

Abstract

Obtención y propiedades antihipertensivas de péptidos derivados de proteínas de clara de huevo.

La invención consiste en la producción de la unidades peptídicas mínimas que presentan bio-actividad como
agentes antihipertensivos a partir de clara de huevo sometida a un tratamiento enzimático. Dichos péptidos
muestran actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina (actividad IECA) in vitro y/o actividad antihipertensiva en ratas y/o actividad antioxidante. Estos ovoproductos: los hidrolizados completos, las fracciones de los mismos de bajo peso molecular, o sus péptidos constituyentes, podrían utilizarse como sustancias terapéuticas con actividad IECA y/o con actividad antihipertensiva y/o con actividad antioxidante, ya sea como productos alimentarios funcionales, aditivos o ingredientes alimentarios, o productos farmacéuticos, para el tratamiento y/o prevención de la hipertensión arterial en todas sus formas en un ser humano o en un animal y para el tratamiento y/ola prevención de cualquier desorden asociado con la hipertensión arterial en un ser humano o en un animal.

Description

Sector de la técnica

La invención consiste en la producción de péptidos con actividad antihipertensiva, derivados de proteínas de clara de huevo, que pueden aplicarse en la industria alimentaria y farmacéutica.

Estado de la técnica

Dentro de la secuencia de las proteínas alimentarias se encuentran determinadas regiones que, una vez liberadas mediante hidrólisis, pueden exhibir actividades biológicas. Dichos fragmentos, denominados péptidos bioactivos, pueden generarse in vivo, durante la hidrólisis de las proteínas por acción de las enzimas gastrointestinales, o in vitro, mediante la acción de enzimas específicas o durante los procesos de elaboración de determinados alimentos. Por su diversidad y multifuncionalidad, los péptidos bioactivos pueden emplearse como ingredientes en alimentos funcionales para producir distintos efectos beneficiosos para la salud, ya que ejercen diferentes actividades biológicas, tales como antihipertensiva, antitrombótica, opiácea, antioxidante, inmunomodulante etc. [Gobbetti, M., Stepaniak, L., de Angelis, M., Corsetti, A., di Cagno, R. Latent bioactive peptides in milk proteins: proteolytic activation and significance in dairy processing. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2002, 42:223-239].

La presión arterial se define como la fuerza ejercida por la sangre contra la pared arterial y, la hipertensión arterial se puede definir como una elevación crónica de la presión arterial sistólica (PAS) y/o de la presión arterial diastólica (PAD) por encima de los valores normales. Se trata de uno de los principales factores de riesgo de enfermedades cardiovasculares y la primera causa de mortalidad en los países desarrollados. De hecho, numerosos estudios han demostrado la estrecha relación entre la hipertensión arterial no tratada y la aparición de hipertrofia ventricular, insuficiencia renal progresiva, accidentes cerebrovasculares, retinopatías, enfermedades vasculares periféricas etc. El sistema renina-angiotensina juega un papel crucial en el control de la presión arterial y en el balance de electrolitos, y participa en las funciones renal, neuronal y endocrina. Existen fármacos con actividad antihipertensiva, como el Captopril, que actúan inhibiendo la enzima convertidora de angiotensina (ECA). La ECA cataliza la formación de angiotensina II, un octapéptido con una potente actividad vasoconstrictora y, además, inactiva la bradiquinina, que produce vasodilatación.

Se han descubierto distintos péptidos con actividad inhibidora de la ECA (IECA), derivados de hidrolizados enzimáticos de proteínas de suero lácteo, caseínas, músculo de pescado, huevo, o de origen vegetal [Yamamoto, N. Antihypertensive peptides derived from food proteins. Biopolymers, 1997, 43: 129-134; Fujita, H., Yamagami, T., Ohshima, K. Effects of an ACE-inhibitory agent, katsuobushi oligopeptide, in the spontaneously hypertensive rat and in borderline and middly hypertensive subjects. Nutr. Res. 2001, 21: 1149-1158; Vermeirssen, V., Van Camp., J., Decroos, K., Van Wijmelbeke, L., Verstraete W. The impact of fermentation and in vitro digestion on the formation of antiotensin-I-converting enzyme inhibitory activity from pea and whey protein. J. Dairy Sci. 2003, 86: 429-438]. En la mayor parte de los casos se ha probado que éstos péptidos actúan inhibiendo la ECA in vitro. En ocasiones se ha demostrado su actividad antihipertensiva, normalmente en ratas espontáneamente hipertensas (SHR), que constituyen un buen modelo animal para la evaluación de compuestos con actividad antihipertensiva, siendo los estudios en humanos mucho más escasos. Sin embargo, con frecuencia los péptidos con actividad IECA in vitro no muestran actividad antihipertensiva en ratas SHR [Fujita, H, Yokoyama, K., Yoshikawa, M. Classification and antihypertensive activity of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins. J. Food Sci. 2000, 65: 564-569]. Esto pone de manifiesto que la determinación de la actividad IECA in vitro, si bien es un buen punto de partida para estos estudios, no puede convertirse en el único criterio de selección, ya que no considera las transformaciones fisiológicas de los péptidos en el organismo que determinan su biodisponibilidad (digestión y paso a través de la barrera gastrointestinal para llegar a la sangre en forma activa).

Por otra parte, la inhibición de la ECA no es el único mecanismo que puede justificar la acción antihipertensiva de los péptidos derivados de proteínas alimentarias. La hipertensión esencial se asocia con una lipoperoxidación exagerada, y con un desequilibrio en el status antioxidante que conlleva a un exceso de formación de especies reactivas de oxígeno [Touyz, R. M., Pu, Q., He, G., Chen, X., Yao, G., Neves, M. F., Viel, E. Effects of a low dietary magnesium intake on development of hypertension in stroke-prone spontaneously hypertensive rats: role of reactive oxygen species. J. Hypertens. 2002, 20:2221-2232]. Algunos de estos péptidos tienen efecto antioxidante. Algunos también podrían ejercer una acción vasodilatadora directa. Así, se han descrito dos péptidos con actividad vasodilatadora, que provienen de la misma región de la ovoalbúmina hidrolizada con diferentes enzimas. Fujita y col. [Fujita, H., Usui, H., Kurahashi, K., Yoshikawa, M. Isolation and characterization of ovokinin, a bradykinin B1 agonist peptide derived from ovoalbumin. Peptides, 1995, 16: 785-790; Fujita, H., Sasaki, R., Yoshikawa, M. Potentiation of the antihypertensive activity of orally administered ovokinin, a vasorelaxing peptide derived from ovalbumin, by emulsification in egg phosphatidyl-choline. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995, 59: 2344-2345] encontraron que la ovokinina, un octapéptido aislado de un hidrolizado de ovoalbúmina con pepsina (FRADHPFL SEQ ID Nº 5) [Yoshikawa, M., Hasegawa, M., Fujita, H. 1993. New peptide and its production. JP5331190], mostraba actividad relajante en arterias mesentéricas caninas y actividad antihipertensiva cuando se administraba por vía oral a ratas SHR a dosis de 100 mg/kg. Matoba y col. [Matoba, N., Usui, H., Fujita, H., Yoshikawa, M. A novel anti-hypertensive peptide derived from ovalbumin induces nitric oxide-mediated vasorelaxation in an isolated SHR mesenteric artery. FEBS Lett. 1999, 452:181-184] purificaron a partir de un hidrolizado de ovoalbúmina con quimotripsina, un hexapéptido correspondiente al fragmento 2-7 de la ovokinina (RADHP SEQ ID Nº 4; ovokinina (2-7)) [Yoshikawa, M., Hasegawa, M., Yamamoto, T., Fujita, H. 1998. New peptide from egg white used for production of therapeutic for treatment of, e.g. angina pectoris. JP10036394] que ejercía una potente acción antihipertensiva en ratas SHR a dosis de 10 mg/kg.

Posteriormente, se sintetizaron análogos de la ovokinina (2-7) para aumentar su actividad antihipertensiva. Entre ellos, RPFHPF y RPLKPW, mostraron, respectivamente 10 y 100 veces más actividad que la ovokinina (2-7) tras su administración oral a SHR (dosis mínimas efectivas de 1 y 0.1 mg/kg), lo que se atribuyó a una mayor resistencia a las proteasas del tracto digestivo [Matoba, N., Yamada, Y., Usui, H., Nakagiri, R., Yoshikawa, M. Designing potent derivatives of ovokinin (2-7), an anti-hypertensive peptide derived from ovalbumin, Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001, 65: 736-739; Yamada, Y., Matoba, N., Usui, H., Onishi, K. Design of a highly potent anti-hypertensive peptide based on ovokinin (2-7), Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002, 66: 1213-1217]. De acuerdo con estos autores, la ovokinina (2-7), y sus derivados RPFHPF o RPLKPW disminuirían la presión arterial a través de su interacción con receptores del tracto gastrointestinal o debido a efectos en el sistema nervioso central.

En nuestro laboratorio hemos demostrado que la proteolisis de clara de huevo con pepsina da lugar a un hidrolizado con potente actividad IECA y neutralizadora de radicales libres in vitro, y con actividad antihipertensiva en ratas SHR, que podría dar lugar a preparados multifuncionales útiles para la prevención y el tratamiento de la hipertensión y otros desórdenes asociados [Miguel, M., López-Fandiño, R., Recio. I., Ramos, M., López-Fandiño, R., Aleixandre, A. 2003. Péptidos bioactivos derivados de proteínas de clara de huevo mediante hidrólisis enzimática. Solicitud Española de patente 200301829]. Se identificaron varias secuencias peptídicas activas, derivadas de la ovoalbúmina, mediante espectrometria de masas en tandem, síntesis química de los péptidos y confirmación de las propiedades IECA y antioxidantes de los fragmentos sintéticos [Miguel, M., Recio. I., Gómez-Ruiz, J. A., Ramos, M., López-Fandiño, R. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity of peptides derived from egg white proteins by enzymatic hydrolysis. J. Food Prot. 2004, 67:1914-1920; Dávalos, A., Miguel, M., Recio, I., Bartolomé, B., López-Fandiño, R. Antioxidant activity of peptides derived from egg white proteins by enzymatic hydrolysis. J. Food Prot. 2004, 67:1939-1944]. Además, la evaluación de los efectos antihipertensivos de algunos de los péptidos sintéticos con mayor actividad IECA in vitro, reveló que reducían eficazmente la presión arterial en ratas SHR. Así, los péptidos sintéticos YAEERYPIL SEQ ID Nº 6 y RADHPFL SEQ ID Nº 3 manifestaron un significativo efecto antihipertensivo al producir una reducción dosis-dependiente de la presión sistólica (PAS) a dosis mínimas efectivas de 2 mg/kg [Miguel, M., López-Fandiño, R., Ramos, M., Aleixandre, M.A. Blood pressure lowering effect of products derived from egg white in hypertensive rats after single oral administration. British Journal of Nutrition, (enviado, 2005)]. Sin embargo, debido a su estructura primaria, parece poco probable que las secuencias YAEERYPIL SEQ ID Nº 6 y RADHPFL SEQ ID Nº 3 resistan íntegras la digestión gastrointestinal, y los fragmentos resultantes de dicha digestión serían probablemente los responsables últimos de sus efectos fisiológicos.

Descripción de la invención - Breve descripción de la invención

La presente invención consiste en la producción de péptidos bioactivos con actividad antihipertensiva mediante hidrólisis de proteínas de huevo con diferentes enzimas. Dichos péptidos, serían las mínimas unidades peptídicas funcionales que tras la digestión gastrointestinal serían asimilables gastrointestinalmente al pasar al torrente sanguíneo. Esta propiedad abre la aplicación de estos péptidos a formas de administración distinta de la oral o aumenta su velocidad de absorción.

Los péptidos bioactivos se producen mediante la hidrólisis de uno o más péptidos o proteínas que contengan la secuencia de aminoácidos de dichos péptidos bioactivos (preferentemente ovoalbúmina o fragmentos de ovoalbúmina), empleando enzimas (preferentemente pepsina y Corolasa PP®) y condiciones de hidrólisis que permitan la ruptura de la cadena de aminoácidos en los lugares adecuados para su liberación. También pueden obtenerse mediante síntesis química o enzimática o mediante métodos recombinantes etc. Dichos péptidos pueden consumirse como tales, o a partir de los hidrolizados que los contengan, de concentrados de bajo peso molecular o de otras subfracciones activas obtenidas mediante métodos de separación por tamaño o métodos cromatográficos.

Además de formar parte de productos alimenticios, tales péptidos y los hidrolizados o sus fracciones también podrían formar parte de productos farmacéuticos. Así, podrían servir para el tratamiento y la prevención de algunas enfermedades; particularmente podrían facilitar el control de la presión arterial. La invención amplía las aplicaciones de las proteínas del huevo, contribuyendo a su aprovechamiento y revalorización.

- Descripción detallada de la invención

La invención proporciona un método para producir los péptidos bioactivos identificados con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ. ID. Nº. 1 y SEQ. ID. Nº. 2 (Tabla 1), que poseen actividad antihipertensiva. Por su estructura y resistencia a las enzimas gastrointestinales, las SEQ. ID. Nº. 1 y SEQ. ID. Nº. 2 serían las mínimas unidades peptídicas funcionales que tras la digestión gastrointestinal serían asimilables gastrointestinalmente al pasar al torrente sanguíneo.

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El material de partida de la presente invención seria cualquier sustrato apropiado que comprendiese una o más péptidos o proteínas, de origen animal, vegetal o procedentes de microorganismos, que contengan la secuencia de aminoácidos de los péptidos bioactivos de interés (SEQ. ID. Nº. 1 y SEQ. ID. Nº. 2, Tabla 1), preferiblemente los péptidos YAEERYPIL SEQ ID Nº 6, FRADHPFL SEQ ID Nº 5, RADHPFL SEQ ID Nº 3, RADHP SEQ ID Nº 4, ovoalbúmina o clara de huevo. Dado que todos ellos pertenecen a la secuencia de la ovoalbúmina, resulta obvio que podría usarse cualquier preparado que contenga ovoalbúmina, o péptidos o fragmentos de ovoalbúmina de cualquier tamaño, solos o mezclados con otras proteínas. Por ejemplo: ovoalbúmina pura, clara de huevo y huevo entero en sus diferentes formas de presentación, ovoproductos destinados a hostelería y restauración, complementos dietéticos para deportistas, ovoproductos para alimentación animal etc.

Dicho material de partida se disuelve o dispersa, a una concentración apropiada, en agua o en una disolución tampón, a un pH adecuado para la actuación de la enzima proteolítica. Puede emplearse cualquier enzima proteolítica capaz de romper la proteína presente en el material de partida y proporcionar los péptidos de interés, pero preferiblemente pepsina a pH 2.0-3.0, y a continuación corolasa PP® a pH 7.0-8.0. También podrían emplearse microorganismos proteolíticos que llevaran a cabo una fermentación del sustrato.

Las condiciones de hidrólisis: pH, temperatura, presión, relación enzima-sustrato, interrupción de la reacción etc., se optimizan con el fin de seleccionar los hidrolizados más activos. En una realización particular, se obtienen los péptidos bioactivos empleando clara de huevo como sustrato y pepsina a pH 2.0, en una relación enzima/sustrato 1/100-1/50, p/p y realizando la hidrólisis a 37ºC, durante un periodo de tiempo comprendido entre 10 min y 24 horas pero, preferiblemente, durante un tiempo aproximado de 3 horas. A continuación, se puede emplear el hidrolizado crudo o concentrar la fracción de bajo peso molecular mediante métodos tales como ultrafiltración, diálisis, electrodiálisis con membranas de tamaño de poro adecuado, cromatografia de filtración por gel, etc. En una realización particular, se obtiene la fracción de peso molecular menor de 3000 de los hidrolizados mediante ultrafiltración a través de una membrana hidrofílica de poro adecuado.

El hidrolizado de clara de huevo con pepsina y su fracción menor de 3000 Da poseen propiedades IECA, antioxidantes y antihipertensivas que, como se demostró anteriormente, se deben a la presencia de péptidos bioactivos [Miguel, M., López-Fandiño, R., Recio. I., Ramos, M., López-Fandiño, R., Aleixandre, A. 2003. Péptidos bioactivos derivados de proteínas de clara de huevo mediante hidrólisis enzimática. Solicitud de patente Española 200301829]. Sin embargo, el efecto antihipertensivo podría acelerarse sometiéndolos a una segunda hidrólisis para producir péptidos más pequeños, susceptibles de ser directamente absorbidos a través de la mucosa gastrointestinal, que serían los responsables últimos de sus propiedades. En una realización particular, esto se consigue mediante hidrólisis del hidrolizado de clara de huevo con pepsina, de la fracción del mismo menor de 3000 Da, o de los péptidos sintéticos que contiene (YAEERYPIL SEQ ID Nº 6 o RADHPFL SEQ ID Nº 3), con corolasa PP®, a pH 7-8, en una relación enzima/sustrato 1:25 p/p a 37ºC, durante un tiempo de, aproximadamente, 2.5 horas. La corolasa PP® es una preparación de enzimas proteolíticas de páncreas de cerdo que contiene, además de tripsina y quimiotripsina, amino y carboxipeptidasas.

Además del hidrolizado de clara de huevo con pepsina y corolasa PP®, los péptidos mostrados en la Tabla 1 y señalados con las SEQ. ID. Nº. 1 y SEQ. ID. Nº. 2 poseen actividad antihipertensiva en ratas SHR, y son también objeto de la presente invención. Asimismo, los péptidos bioactivos identificados (SEQ. ID. Nº. 1 y SEQ. ID. Nº. 2) pueden obtenerse por síntesis química y/o enzimática de péptidos, o por métodos recombinantes.

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TABLA 1 Secuencias de los péptidos bioactivos identificados

1

La clara de huevo resulta un sustrato proteico barato y asequible para producir péptidos bioactivos. Por otra parte, este proceso permite la obtención de los péptidos bioactivos empleando preparaciones enzimáticas y condiciones que imitan la digestión gastrointestinal. Por ello, es probable que los fragmentos que se obtienen sean los productos finales de hidrólisis, susceptibles de ser absorbidos en el tracto gastrointestinal, y de ser los responsables directos de la acción antihipertensiva. No puede, sin embargo, descartarse una hidrólisis ulterior por las peptidasas plasmáticas. La obtención de fragmentos pequeños activos es ventajosa porque estos fragmentos serían más fáciles de administrar por distintas vías, y cuando se administran por vía oral producirían el efecto antes. Debe destacarse que se trata de péptidos naturales, presentes en alimentos de uso frecuente, de los que cabe esperar pocos efectos secundarios y buena tolerancia. Su pequeño tamaño, por otra parte, abarata el coste de su obtención mediante métodos químicos o enzimáticos.

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Estos productos: el hidrolizado, o uno o más de sus péptidos bioactivos constituyentes (incluyendo sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables y sus mezclas), podrían utilizarse como sustancias terapéuticas con actividad antihipertensiva. Dichos productos pueden ser sometidos a un tratamiento térmico, como la pasteurización, o bien someterse a secado o liofilización etc., para emplearse como productos alimenticios funcionales, aditivos o ingredientes alimentarios, o productos farmacéuticos, para el tratamiento y/o prevención de la hipertensión arterial en todas sus formas, principalmente en seres humanos, aunque también en animales. La cantidad de hidrolizado, péptidos, sus derivados o sales farmaceúticamente aceptables y sus mezclas, que resultaría útil para una patología, variará dependiendo de numerosos factores, como la edad, gravedad de la misma, vía de administración y frecuencia de la dosis. Estos compuestos podrían presentarse en cualquier forma de administración, sólida o líquida, o encapsulados, y podrían administrarse, en principio, por distintas vías (oral, respiratoria, rectal, tópica, etc) aunque particularmente están diseñados para una administración sólida o líquida por vía oral y tópica.

En general, el proceso de obtención de estos productos: el hidrolizado y sus péptidos constituyentes, se podrá optimizar, dirigiéndolo a la producción de la mayor cantidad posible de péptidos bioactivos, o a controlar, en lo posible, la aparición de amargor originado normalmente por una elevada concentración de péptidos hidrófobos de peso molecular intermedio o bajo.

Procedimientos analíticos Análisis mediante RP-HPLC acoplado on-line a espectrometría de masas en tandem (RP-HPLC-MS/MS)

Se emplea un equipo Esquire-LC (Bruker Daltonik GMBH, Bremen, Alemania). El equipo de HPLC (serie 1100) está formado por una bomba cuaternaria, un inyector automático, un sistema de desgasificación de eluyentes y un detector ultravioleta de longitud de onda variable (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania) acoplado en línea a un espectrómetro de masas de trampa fónica Esquire 3000 (Bruker Daltonik). La columna es una columna Hi-Pore C_{18} (250 x 4.6 mm d.i., 5 \mum de tamaño de partícula) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EEUU). El disolvente A es una mezcla de agua y ácido trifluoroacético (1000:0.37), y el disolvente B una mezcla de acetonitrilo y ácido trifluoroacético (1000:0.27). Se inyectan 50 \mul de los péptidos sintéticos antes y después del tratamiento con pepsina y corolasa PP®, 25 \mul del hidrolizado de clara de huevo con pepsina antes y después del tratamiento con corolasa PP®, y 50 gl de la fracción menor de 3000 Da antes y después del tratamiento con corolasa PP®. Se emplea un flujo de 0.8 ml/minuto, con un gradiente lineal de disolvente B en A del 2% al 10% en 15 minutos, del 10 al 20% en 35 minutos y del 20 al 30% en 20 minutos. El eluyente se monitoriza a 214 nm, y a continuación se divide el flujo colocando una pieza en T (Valco, Houston, TX, USA), conectada a un tubo peek de 75 gm de diámetro interno, cuya longitud se ajusta para proporcionar un flujo de inyección de la muestra al espectrómetro de masas, a través del nebulizador de electrospray, de 20 gl/minuto. El equipo emplea nitrógeno como gas nebulizador y de secado, y opera con una presión de helio de 5 x 10^{-3} bares. Los espectros de masas se adquieren en un intervalo de 100-1500 m/z y a una velocidad de 13000 Da/segundo. La interpretación de los espectros de MS en tandem para la identificación de las secuencias peptídicas se realiza con el programa Biotools 2.1 (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania).

Medida de la actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina (IECA)

La actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) se mide in vitro de acuerdo con el método de Cushman y Cheung [Cushman, D. W. y Cheung, H. S. Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung. Biochem. Pharmacol. 1971, 20:1637-1648], modificado posteriormente por Kim y col. [Kim, Y. K., Yoon, S., Yu., D. Y., Lönnerdal, B., Chung, B. H. Novel angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides derived from recombinant human \alphas1-casein expressed in Escherichia coli. J. Dairy Res. 1999, 66: 431-439].

El sustrato hipuril histidil leucina (HHL, Sigma, Chemicals Co, St. Louis, MO, USA) se disuelve en tampón borato 0.1 M con NaCl 0.3 M, pH 8.3, para obtener una concentración final 5 mM. A 100 \mul de sustrato se le añaden 40 \mul de cada una de las muestras cuya actividad IECA se quiere determinar. Se adiciona la ECA (EC 3.4.15.1, Sigma), disuelta en glicerol al 50%, y diluida en el momento de realizar el ensayo 1/10 en agua bidestilada. La reacción se lleva a cabo a 37ºC, durante 30 minutos en un baño de agua. La enzima se inactiva descendiendo el pH con 150 \mul de HCl 1N. El ácido hipúrico formado se extrae con 1000 \mul de acetato de etilo. Tras agitación en vórtex durante 20 segundos, se centrifuga a 4000 rpm durante 10 minutos y a temperatura ambiente. Se toman 750 \mul de la fase orgánica que se evapora por calentamiento a 95ºC durante 10 minutos. El residuo de ácido hipúrico se redisuelve en 800 \mul de agua bidestilada y, tras agitar durante 20 segundos, se mide la absorbancia a 228 nm en un espectrofotómetro Dur-70 de Beckman Instruments, Inc., Fullerton, EEUU.

Para calcular el porcentaje de IECA se emplea la fórmula siguiente:

2

El blanco se utiliza para corregir la absorbancia de fondo. Este contiene sustrato, enzima y 20 \mul de agua bidestilada en lugar de muestra, y la reacción se para a tiempo cero. El control supone el cien por cien de la acción enzimática sobre el sustrato en ausencia de inhibidores, y contiene 20 \mul de agua en lugar de muestra y se incuba el mismo tiempo que la muestra.

Los resultados se presentan como el IC_{50} o concentración de proteína (\mug/ml) que inhibe el 50% de la actividad de la enzima. La concentración de proteína se determina mediante el ensayo del ácido bicinconinico (BCA) (Pierce, Rockford, IL, EEUU) empleando como patrón seroalbúmina bovina.

Estudio de la actividad antihipertensiva en ratas espontáneamente hipertensas (SHR)

Se estudia el efecto de varios de los péptidos identificados y productos que los contienen (por ejemplo la fracción menor de 3000 Da del hidrolizado de clara de huevo con pepsina posteriormente tratada con corolasa PP®) sobre la presión arterial de ratas SHR. Este estudio se realiza con ratas SHR macho de 17-22 semanas de edad y peso comprendido entre 300 y 350 g, procedentes de Charles River Laboratories España S.A. Las ratas se almacenan en jaulas de cinco en cinco y se mantienen a una temperatura estable de 25ºC con ciclos de luz-oscuridad de 12 horas, ingiriendo agua y comida a libre disposición.

Para realizar las medidas de presión arterial sistólica (PAS) se utiliza un equipo de "tail cuff" (método del manguito en la cola) [Buñag, R. D. Validation in awake rats of a tail-cuff meted for measuring systolic pressure. J. Appl. Physiol. 1973, 34: 279-282] (Le5001, Letica) que proporciona un valor digital de la PAS automáticamente, y registra y facilita la frecuencia cardiaca de los animales. Antes de colocar el manguito y el transductor en la cola de las ratas, éstas se exponen a una temperatura próxima a los 38ºC durante 10-15 min, para facilitar la dilatación de la arteria caudal. Para obtener el valor de la PAS en cada momento, se realizan cinco medidas, y se obtiene la media de todas ellas. Además, para asegurar la fiabilidad de la medida, los animales se acostumbran al procedimiento 2 semanas antes de llevar a cabo el ensayo en cuestión.

Las ratas SHR utilizadas para el estudio tenían valores de PAS comprendidos entre 190 y 220 mm Hg. La administración de los productos a ensayar se realiza mediante sonda intragástrica en un margen de tiempo comprendido entre las 9 y las 10 h de la mañana, y la cantidad que se administra se disuelve siempre en 1 ml de agua destilada. Se toman medidas de la PAS en los animales, antes de la administración, y después periódicamente, cada 2 horas, hasta 8 horas post-administración. Adicionalmente, se toma una medida de la PAS 24 horas después de la administración. Como control negativo (para establecer la variación circadiana de la PAS en ratas sondadas) se utilizan las medidas de la PAS obtenidas en ratas a las que se les administra mediante sonda intragástrica 1 ml de agua. Como control positivo, se utilizan las medidas de la PAS obtenidas en ratas a las que se les administra mediante sonda intragástrica 50 mg/kg de Captopril (fármaco IECA prototipo). La cantidad de fármaco que se administra se disuelve siempre en 1 ml de agua destilada.

Los resultados se agrupan y se obtiene la media \pm el error estándar de la media (ESM) para un mínimo de 5 ensayos homogéneos. Para compararlos se utiliza un análisis de varianza de una vía (ANOVA), seguido del test de Bonferroni. Se considera significativa la diferencia para valores de P<0.05.

Todos los experimentos llevados a cabo cumplen la normativa científica de experimentación con animales (Directiva Europea 86/609/CEE y el Real Decreto 223/1988 del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación).

Breve descripción del contenido de las figuras

La Figura 1 es un cromatograma obtenido utilizando cromatografia de líquidos de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC) del péptido sintético YAEERYPIL SEQ ID Nº 6, antes y después de la hidrólisis secuencial con pepsina y corolasa PP®. En el eje de ordenadas se representa la absorbancia a 214 nm y en el eje de abscisas se representa el tiempo en minutos.

La Figura 2 es un cromatograma obtenido utilizando cromatografia de líquidos de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC) del péptido sintético RADHPFL SEQ ID Nº 3, antes y después de la hidrólisis secuencial con pepsina y corolasa PP®. En el eje de ordenadas se representa la absorbancia a 214 nm y en el eje de abscisas se representa el tiempo en minutos.

La Figura 3 es un cromatograma obtenido utilizando cromatografia de líquidos de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC) del péptido sintético RADHP SEQ ID Nº 4, antes y después de la hidrólisis secuencial con pepsina y corolasa PP®. En el eje de ordenadas se representa la absorbancia a 214 nm y en el eje de abscisas se representa el tiempo en minutos.

La Figura 4 es un cromatograma obtenido utilizando cromatografia de líquidos de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC) del péptido sintético RADHP SEQ ID Nº 2, antes y después de la hidrólisis secuencial con pepsina y corolasa PP®. En el eje de ordenadas se representa la absorbancia a 214 nm y en el eje de abscisas se representa el tiempo en minutos.

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La Figura 5 es un cromatograma obtenido utilizando cromatografia de líquidos de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC) del péptido sintético FRADHPFL SEQ ID Nº 5, antes y después de la hidrólisis secuencial con pepsina y corolasa PP®. En el eje de ordenadas se representa la absorbancia a 214 nm y en el eje de abscisas se representa el tiempo en minutos.

La Figura 6 representa la disminución de la presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas espontáneamente hipertensas, tras la administración mediante sonda intragástrica de 1 ml de agua (\medcirc), 50 mg/kg de Captopril (\blacksquare), 2 mg/kg del péptido YAEER SEQ ID Nº 8 (\ding{115}), 2 mg/kg del péptido YPI SEQ ID Nº 1 (\bullet) y 2 mg/kg del péptido RADHP SEQ ID Nº 2 (\blacksquare). T(h) representa el tiempo transcurrido desde la administración expresado en horas. Los datos representan la media \pm ESM para un mínimo de 5 animales. ^{a}P<0.05 vs agua; ^{b}P<0.05 vs Captopril; ^{c}P<0.05 vs RADHP SEQ ID Nº 2; ^{d}P<0.05 vs YPI SEQ ID Nº 1.

La Figura 7 representa la disminución de la presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas espontáneamente hipertensas, tras la administración mediante sonda intragástrica de 1 ml de agua (\medcirc), 50 mg/kg de Captopril (\boxempty), 100 mg/kg de la fracción menor de 3000 Da del hidrolizado de clara de huevo con pepsina (\ding{115}), y 100 mg/kg de la fracción menor de 3000 Da del hidrolizado de clara de huevo con pepsina tratado con corolasa PP® (\blacklozenge). Los datos representan la media \pm ESM para un mínimo de 5 animales. ^{a}P<0.05 vs agua; ^{b}P<0.05 vs Captopril; ^{c}P<0.05 vs la fracción menor de 3000 Da del hidrolizado de clara de huevo con pepsina.

La Figura 8 representa los cromatogramas obtenidos utilizando cromatografia de líquidos de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC) del hidrolizado de clara de huevo con pepsina antes y después de tratar con corolasa PP® y de la fracción menor de 3000 Da del hidrolizado de clara de huevo con pepsina antes y después de tratar con corolasa PP®. Se indican los picos correspondientes a las secuencias peptídicas identificadas, que se relacionan en la tabla 3. En el eje de ordenadas se representa la absorbancia a 214 nm y en el eje de abscisas se representa el tiempo en minutos.

Ejemplos de realización de la invención

Los siguientes ejemplos ilustran la invención, aunque no deben considerarse como limitativos del alcance de la misma.

Ejemplo 1 Actividad IECA y antihipertensiva de los péptidos obtenidos tras simular la digestión gastrointestinal de los fragmentos de la ovoalbúmina YAEERYPIL SEQ ID Nº 6 y RADHP SEQ ID Nº 4

Los péptidos YAEERYPIL SEQ ID Nº 6 y RADHP SEQ ID Nº 4, que previamente se habían identificado en la fracción menor de 3000 Da de un hidrolizado de clara de huevo con pepsina y que poseían actividad IECA in vitro y actividad antihipertensiva en ratas SHR [Miguel, M., López-Fandiño, R., Recio. I., Ramos, M., López-Fandiño, R., Aleixandre, A. 2003. Péptidos bioactivos derivados de proteínas de clara de huevo mediante hidrólisis enzimática. Solicitud Española 200301829], se sintetizan químicamente mediante el método Fmoc en fase sólida con un sintetizador modelo 431A de Applied Biosystems Inc. (Überlingen, Alemania). La pureza de los péptidos sintéticos se verifica mediante RP-HPLC-MS/MS. A continuación se someten a un proceso de hidrólisis en dos etapas que simula la digestión gastrointestinal [Alting, A.C., Meijer, R.J.G.M., Van Beresteijn, E.C.H. Incomplete elimination of the ABBOS epitope of bovine serum albumin under simulated gastrointestinal conditions of infants. Diabetes Care, 1997, 20: 875-880]. Para ello, se hidrolizan disoluciones acuosas de los péptidos sintéticos (2 mg/ml), primero con pepsina (EC 3.4.4.1; 1:60,000, 3,400 U/mg) (Sigma) (relación enzima: sustrato, 1:50, p/p) a pH 2.0 y 37ºC, durante 90 minutos y, posteriormente, con corolasa PP® (relación enzima: sustrato 1:25, p/p) (Röhm, Darmstadt, Germany) a pH 7-8 y 37ºC, durante 2.5 horas. La reacción se interrumpe calentando a 95ºC durante 10 minutos en un baño de agua.

Tal y como se muestra en la Figura 1, el péptido YAEERYPIL SEQ ID Nº 6 se hidroliza totalmente tras la incubación con pepsina y el extracto pancreático. Los principales fragmentos resultantes, identificados mediante espectrometria de masas en tandem, son el pentapéptido YAEER SEQ ID Nº 8 y el tripéptido YPI SEQ ID Nº 1. Se encuentra también una pequeña proporción de YAEERYPI SEQ ID Nº 7, lo que sugiere que se trata de un fragmento intermediario tras la hidrólisis del aminoácido C-terminal. La actividad IECA de YAEERYPIL SEQ ID Nº 6 disminuye aproximadamente unas 100 veces tras la simulación de la digestión (Tabla 2). Por otra parte, ninguno de sus productos de degradación (YAEER SEQ ID Nº 8 e YPI SEQ ID Nº 1), que también se obtuvieron por síntesis química, presentan actividad como inhibidores de la ECA. El péptido sintético YPI SEQ ID Nº 1 se somete, a su vez, a la hidrólisis secuencial con pepsina y corolasa PP®, pero no se degrada, lo que hace suponer que no es susceptible a la acción de las enzimas gastrointestinales, sino que es el producto final de la proteolisis de YAEERYPIL SEQ ID Nº 6.

TABLA 2 Actividad IECA antes y después de la incubación de péptidos sintéticos con enzimas gastrointestinales y resultado de la incubación

3

La segunda secuencia estudiada, RADHPFL SEQ ID Nº 3, se hidroliza dando RADHP SEQ ID Nº 4 y RADHP SEQ ID Nº 2 (Figura 2). Ambos fragmentos pueden sintetizarse químicamente y someterse, a su vez, a la hidrólisis secuencial con pepsina y corolasa PP®. RADHP SEQ ID Nº 4 resiste parcialmente la hidrólisis con pepsina y el extracto pancreático, pero también da lugar a RADHP SEQ ID Nº 2 como principal producto de degradación (Figura 3). El péptido RADHP SEQ ID Nº 2, a su vez, no es susceptible a la acción de las enzimas gastrointestinales, lo que hace suponer que es el producto final de la proteolisis (Figura 4). Como en el caso anterior, la actividad IECA de RADHPFL SEQ ID Nº 3 disminuye considerablemente tras la digestión. De hecho, la determinación de la actividad IECA de sus productos de proteolisis: RADHP SEQ ID Nº 2 y RADHP SEQ ID Nº 4 muestra que sólo son inhibidores débiles (Tabla 2). Debe destacarse que la secuencia RADHP SEQ ID Nº 4 ya había sido descrita por Matoba y col. [Matoba, N., Usui, H., Fujita, H., Yoshikawa, M. A novel anti-hypertensive peptide derived from ovalbumin induces nitric oxide-mediated vasorelaxation in an isolated SHR mesenteric artery. FEBS Lett. 1999, 452:181-184] que la denominaron ovokinina (2-7) [Yoshikawa, M., Hasegawa, M., Yamamoto, T., Fujita, H. 1998. New peptide from egg white used for production of therapeutic for treatment of, e.g. angina pectoris. JP10036394]. La ovokinina (2-7) presentaba propiedades antihipertensivas en ratas SHR [Matoba, N., Yamada, Y., Usui, H., Nakagiri, R., Yoshikawa, M. Designing potent derivatives of ovokinin (2-7), an anti-hypertensive peptide derived from ovalbumin, Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001, 65: 736-739], posiblemente debidas a su interacción con receptores \boxempty2 [Scruggs, P., Filipeanu, C.M., Yang, J., Chang, J.K., Dun, N.J. Interaction of ovokinin(2-7) with vascular bradykinin 2 receptors. Regulatory Peptides, 2004, 120: 85-91].

Por otra parte, la secuencia RADHPFL SEQ ID Nº 3 presenta gran similitud con la secuencia de la ovokinina (FRADHPFL SEQ ID Nº 5), un octapéptido relajante vascular e inhibidor de la ECA [Yoshikawa, M., Hasegawa, M., Fujita, H. 1993. New peptide and its production. JP5331190; Fujita, H., Usui, H., Kurahashi, K., Yoshikawa, M. Isolation and characterization of ovokinin, a bradykinin B1 agonist peptide derived from ovoalbumin. Peptides, 1995, 16: 785-790], lo que hace suponer que ambas podrían degradarse durante la hidrólisis gastrointestinal dando los mismos productos finales. Como comprobación, el octapéptido FRADHPFL SEQ ID Nº 5 puede obtenerse mediante síntesis química y someterse a la simulación de la digestión. Como se muestra en la Figura 5, los principales productos de degradación son RADHP SEQ ID Nº 4 y RADHP SEQ ID Nº 2. Aparecieron también, en menor proporción, FRADHPF SEQ ID Nº 10 y ADHPF SEQ ID Nº 11. Esto indicaría que los péptidos FRADHPFL SEQ ID Nº 5, RADHPFL SEQ ID Nº 3 y RADHP SEQ ID Nº 4 se digerirían en el tracto gastrointestinal dando como producto final RADHP SEQ ID Nº 2, que posee una moderada actividad IECA (Tabla 2).

Se mide la actividad antihipertensiva de los péptidos resultantes de la hidrólisis secuencial de YAEERYPIL SEQ ID Nº 6 (el péptido YAEER SEQ ID Nº 8 y la SEQ. ID. Nº. 1, YPI), y de FRADHPFL SEQ ID Nº 5, RADHPFL SEQ ID Nº 3 y RADHP SEQ ID Nº 4 (SEQ. ID. Nº. 2, RADHP). Para ello, se administran a ratas SHR a la dosis 2 mg/kg. Los
péptidos se disuelven en agua destilada y la dosis correspondiente se administra a cada rata en un volumen de 1 ml.

La Figura 6 muestra las disminuciones de la PAS obtenidas en ratas SHR en distintos momentos, tras la administración de los péptidos YAEER SEQ ID Nº 8, SEQ. ID. Nº. 1 y SEQ. ID. Nº. 2. Se puede observar que la administración de los péptidos SEQ. ID. Nº. 1 y SEQ. ID. Nº. 2 ocasiona una disminución significativa de la PAS en estos animales. La secuencia YAEER SEQ ID Nº 8 causa un ligero y sostenido descenso durante 8 horas, pero sin mostrar diferencias significativas con el agua. La disminución de la PAS que originan las SEQ. ID. Nº. 1 y SEQ. ID. Nº. 2 es máxima a las 2-4 horas después de la administración de estos péptidos, y se recupera el valor inicial de esta variable a las 24 horas. Además, las SEQ. ID. Nº. 1 y SEQ. ID. Nº. 2 ocasionan a las 2 horas efectos similares al Captopril, que es un compuesto con potente actividad antihipertensiva. En el caso de las secuencias activas de las que procedían, YAEERYPIL SEQ ID Nº 6 y RADHPFL SEQ ID Nº 3, las máximas reducciones de la PAS (-31.6 \pm 2.6 y -34.0 \pm 1.6 mm Hg, respectivamente) se habían alcanzado 6 horas después de la administración oral de dosis de 2 mg/ml [Miguel, M., López-Fandiño, R., Recio. I., Ramos, M., López-Fandiño, R., Aleixandre, A. 2003. Péptidos bioactivos derivados de proteínas de clara de huevo mediante hidrólisis enzimática. Solicitud patente Española 200301829]. La aparición más rápida del efecto antihipertensivo en el caso de las SEQ. ID. Nº. 1 y SEQ. ID. Nº. 2 podría deberse a que cuando se administran estas secuencias se obvia el proceso enzimático que debe acontecer para su producción in vivo.

Los resultados presentados demuestran que los péptidos identificados por las secuencias SEQ. ID. Nº. 1 y SEQ. ID. Nº. 2 tienen un claro efecto antihipertensivo. Tal efecto no parece que pueda justificarse, exclusiva ni principalmente, por la inhibición de la ECA.

Ejemplo 2 Obtención de péptidos con actividad IECA y/o antihipertensiva mediante hidrólisis enzimática de clara de huevo

El hidrolizado se obtiene empleando como sustrato clara de huevo de gallina pasteurizada comercial. Como enzima, se utiliza pepsina (E.C. 3.4.23.1. tipo A, 10000 U/mg de proteína), procedente de estómago de cerdo (Sigma). El pH se ajusta a 2.0 añadiendo HCl 1N y se añade pepsina (relación enzima/sustrato 1/100, p/p). La hidrólisis se realiza a una temperatura de 37ºC durante 3 horas. La inactivación de la pepsina se consigue elevando el pH a 7.0 con NaOH 1N. A continuación se trata con corolasa PP® (Röhm, Darmstadt, Alemania) (relación enzimalsustrato 1/25, p/p) a 37ºC durante 2.5 horas. La inactivación de la corolasa PP® se efectúa calentando a 95ºC durante 10 min y enfriando posteriormente a temperatura ambiente. La medida de la actividad IECA antes y después de hidrolizar con corolasa PP® muestra que el valor de IC^{50} del hidrolizado de clara de huevo con pepsina durante 3 horas aumenta ligeramente de 44.00 \pm 1.18 \mug/ml a 67.98 \pm 2.08 \mug/ml tras el tratamiento con corolasa PP®, aunque ambos valores son indicativos de una importante inhibición.

La fracción menor de 3000 Da del hidrolizado de clara de huevo con pepsina durante 3 horas se obtiene mediante ultrafiltración a través de una membrana hidrofilica de 3000 Da (Centriprep, Amicon, Inc., Beverly, MA, EEUU), centrifugando a 1900 g durante 40 minutos. El permeado (fracción menor de 3000 Da) se trata con corolasa PP®, actuando del mismo modo que con el hidrolizado con pepsina del que procede, descrito anteriormente. Se midió la actividad IECA en el permeado antes y después de hidrolizar con corolasa PP®. Los valores de IC50 son, respectivamente, 20.48 \pm 0.75 \mug/ml y 74.40 \pm 1.16 \mug/ml ml.

Se ensayó la actividad antihipertensiva en ratas SHR de la fracción menor de 3000 Da del hidrolizado de clara de huevo con pepsina, antes y después de hidrolizar con corolasa PP®. Se administró la misma concentración de ambos productos a los animales (aproximadamente 100 mg/kg). La Figura 7 muestra la disminución de la PAS obtenida en ratas SHR en distintos momentos tras la administración. La fracción menor de 3000 Da del hidrolizado de clara de huevo con pepsina produce claros efectos antihipertensivos en estos animales antes y después de su hidrólisis con corolasa PP®. Los mayores descensos de la PAS tras la administración de la fracción menor de 3000 Da del hidrolizado de clara de huevo con pepsina tratada con corolasa PP® se obtuvieron 2-4 horas después (\sim 20 mm Hg), mientras que el máximo efecto de la fracción menor de 3000 Da del hidrolizado con pepsina se observó 6 horas después de su administración (\sim 28 mm Hg). Los valores de la PAS observados 24 horas después de ambas administraciones son semejantes a los que tenían los animales antes de las mismas.

Con objeto de identificar los péptidos responsables de la actividad IECA y/o antihipertensiva, el hidrolizado de clara de huevo con pepsina y la fracción del mismo menor de 3000 Da, antes y después del tratamiento con corolasa PP®, se analizaron mediante RP-HPLC-MS/MS tal y como se muestra en la Figura 8. Los péptidos identificados en cada uno de los productos se muestran en la Tabla 3. Las secuencias se identificaron extrayendo el ión molecular correspondiente y teniendo en cuenta el tiempo de retención al que eluye el péptido puro.

Como era de esperar, antes del tratamiento con corolasa PP®, el hidrolizado de clara de huevo con pepsina y la fracción del mismo menor de 3000 Da contenían las secuencias antihipertensivas YAEERYPIL SEQ ID Nº 6, FRADHPFL SEQ ID Nº 5 y RADHPFL SEQ ID Nº 3. Debe destacarse que tras la hidrólisis de ambos productos con corolasa PP® no se encontró ninguna de dichas secuencias. Sin embargo, se encuentran las secuencias con propiedades antihipertensivas SEQ. ID. Nº. 1 y SEQ. ID. Nº. 2, que son objeto de la presente invención. Tampoco se encontraron los péptidos: YAEERYPI SEQ ID Nº 7, YAEER SEQ ID Nº 8, FRADHPF SEQ ID Nº 10, RADHP SEQ ID Nº 4 ni ADHPF SEQ ID Nº 11. Estas observaciones demuestran que las SEQ. ID. Nº. 1 y SEQ. ID. Nº. 2 son las responsables del rápido efecto antihipertensivo del hidrolizado tras el tratamiento con corolasa PP®.

TABLA 3 Secuencias peptídicas identificadas mediante RP-HPLC-MS/MS en el hidrolizado de clara de huevo con pepsina y la fracción del mismo menor de 3000 Da antes y después del tratamiento con corolasa PP®

4

<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS

\hskip1cm

López-Alonso Fandiño, Rosina

\hskip1cm

Ramos González, Mercedes

\hskip1cm

Miguel Castro, Marta

\hskip1cm

Aleixandre de Artiñano, Amaya

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> Péptidos antihipertensivos derivados de proteínas de clara de huevo

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> BIOHCH2

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 11

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.1

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Ile}

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<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ala Asp His Pro}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ala Asp His Pro Phe Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\sa{Arg Ala Asp His Phe Leu}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 8

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Arg Ala Asp His Pro Phe Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Ala Glu Glu Arg Tyr Pro Ile Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Ala Glu Glu Arg Tyr Pro Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Ala Glu Glu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Ile Leu}

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<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Arg Ala Asp His Pro Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 11

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Asp His Pro Phe}

Claims

1. Producto bioactivo, seleccionado de entre el péptido SEQ. ID. Nº. 1 o el péptido SEQ. ID. Nº. 2, o cualquier derivado o sal farmacéuticamente aceptable, que tiene actividad antihipertensiva.

2. Composición farmacéutica que comprende el producto bioactivo según la reivindicación 1.

3. Aditivo, ingrediente o suplemento alimenticio funcional que comprende el producto bioactivo según la reivindicación 1.

4. Uso de un aditivo, ingrediente o suplemento alimenticio funcional según la reivindicación 3, en la elaboración de un producto alimenticio funcional para el tratamiento de la hipertensión.

5. Producto alimenticio funcional que comprende el producto bioactivo según la reivindicación 1.

6. Procedimiento para producir el producto bioactivo según la reivindicación 1, que comprende:

a.: obtener una muestra (material de partida) de origen animal, vegetal o de un microorganismo,

b.: disolver o dispersar el material de partida obtenido en el apartado (a),

c.: hidrolizar el producto obtenido en el apartado (b) mediante la adición de al menos una enzima proteolítica o de un microorganismo proteolítico, y

d.: mantener la reacción de hidrólisis del apartado (c) un tiempo de entre 10 minutos y 24 horas.

\vskip1.000000\baselineskip

7. Procedimiento según la reivindicación 6, donde el material de partida se selecciona de la lista que comprende ovoproductos destinados a la alimentación humana, ovoproductos destinados a la alimentación animal, huevo entero, clara de huevo u ovoalbúmina pura.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, donde en el apartado (b), el material de partida se disuelve o dispersa en una solución tampón con un pH de entre 2.0 y 3.0, y la hidrólisis del apartado (c) se lleva a cabo por medio de pepsina.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, donde se mantiene la reacción de hidrólisis del apartado (c) durante un tiempo aproximado de 3 horas.

10. Procedimiento según la reivindicación 9 que además comprende:

e.: seleccionar el producto obtenido en el apartado (d) del procedimiento,

f.: hidrolizar dicho producto seleccionado en el apartado (e) mediante la adición de la combinación enzimática corolasa PP a un pH de entre 8.0 y 9.0, y

g.: mantener la reacción de hidrólisis del apartado (f) un tiempo aproximado de 2.5 horas.

\vskip1.000000\baselineskip

11. Procedimiento para producir el producto bioactivo según la reivindicación 1, que comprende la síntesis química o enzimática de SEQ. ID. Nº. 1 o SEQ. ID. Nº. 2, o; el empleo de métodos recombinantes que contengan la secuencia SEQ. ID. Nº. 1 o SEQ. ID. Nº. 2.

12. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 2 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la hipertensión.