CN101305017B - 奶酪蛋白的酶水解产物中鉴定的生物活性肽及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及源自奶蛋白的生物活性制品的生产，该奶蛋白用于生产源自奶蛋白，特别是酪蛋白的生物活性奶制品。可以通过化学，生化或通过酶处理从含有其的蛋白质获得本发明的16个肽并产生具有抗微生物活性，体外血管紧张素转化酶抑制剂活性和/或抗高血压活性和/或抗氧化活性的肽。所述营养药物产品适用于食品和制药工业中，以水解产物或生物活性肽的形式。

Description

奶酪蛋白的酶水解产物中鉴定的生物活性肽及其生产方法
发明领域
本发明包括源自奶蛋白的生物活性制品的生产。这些蛋白在酶处理后产生具有抗微生物活性和/或体外血管紧张素转化剂抑制剂活性(ACE-抑制活性)和/或抗高血压活性和/或抗氧化活性的肽，其适用于食品和药物工业中。
现有技术
奶在人营养中的作用从出生开始就是必需的并且是高营养和功能价值的食物。新的生物分离技术的最新发展使得可以分级奶的不同成分来用于新的食品和非食品目的，新的应用有助于提高由此引起的消费。因此，致力于从奶级分生产分离蛋白的不同的公司关注提高和多样化一些成分的用途，如酪蛋白和乳清蛋白。这是涉及乳铁蛋白生产的工业的情况，乳铁蛋白用作抗微生物剂并且已经用于婴儿食品，酸奶，食物补充剂，特殊配方以及牙齿和皮肤产品中。乳铁蛋白还因为其抗微生物活性用作鲜奶中的添加剂来延长其保质期。
近几年来，由于消费者关于饮食和健康之间存在关系的提高意识，功能食品已经闯入食品工业中。将功能性配料定义为将其掺入食品中时发挥特定生物活性的那些成分，该活性超出起码的营养作用，那些中由于它们的多样性和多功能性处于突出位置的一种是生物活性肽。这些肽在前体蛋白质内是无活性片段，但是在通过体内和/或体外水解过程释放后，其在体内发挥出不同的生理功能。因为在1979发现了它们，已经描述了源自食物蛋白的具有不同生物活性的肽，这些活性为：抗微生物，抗高血压，免疫调节，抗血栓形成，阿片类(opioid)，抗氧化剂等。这些肽在食品和/或药品中具有潜在的用途并可以通过不同的策略释放出来，目前最常使用的是酶水解和微生物发酵。
一些值得特别注意的生物活性肽是发挥抗微生物特性的那些(R.Floris，I.Recio，B.Berkhout和S.Visser，Antibacterial and antiviral effectsof milk proteins and derivatives thereof，(奶蛋白及其衍生物的抗细菌 和抗病毒效果)，Current Pharmaceutical Design，2003，9：1257-1275)。已经研究奶的抗微生物活性很长时间了，并通常归因于该食品中存在的具有抗微生物活性的不同蛋白质(免疫球蛋白，乳铁蛋白，乳过氧化物酶，溶菌酶等)。然而，最近也已经证实了源自奶蛋白的肽的抗微生物活性。尽管迄今为止不存在对源自奶蛋白的抗微生物肽的作用机理的结论性研究，但主要的发现已经描述了这些生物活性序列中的一些影响和光滑细菌膜的能力(D.Chapple，D.J.Mason，C.L.Joannou，E.W.Odell，V.Grant，R.W.Evans，Structure-function relationship ofantibacterial synthetic peptides homologous to a helical surface region onhuman lactoferrin against Escherichia coli serotype 0111(抗大肠杆菌血清型0111的人乳铁蛋白上螺旋表面片段同源的抗细胞合成肽的结构-功能相关性)，Infection and Immunity，1998，66，2434-2440)。已经描述了从牛来源的酪蛋白酶水解产物获得的具有抗微生物活性的肽，如αs2-酪蛋白(EP 1114060，Process for producing cationic peptides frombiological fluids(从生物流体生产阳离子肽的方法)以及β-酪蛋白和κ-酪蛋白(WO99/26971，Antimicrobial peptides(抗微生物肽))。通过相似的水解过程，已经分离并鉴定了源自乳清蛋白的具有抗微生物特性的肽，如乳铁蛋白(WO2004/089986，Antimicrobial peptide fromtransferrin family(来自转铁蛋白家族的抗微生物肽)。
已知发达国家中与高血压相关的冠心病的高发病率，另一组很重要的生物活性肽是具有抗高血压活性的肽。这些肽中的许多通过抑制血管紧张素转化酶(ACE)调节肾素-血管紧张素系统来起作用(T.Takano，Milk derived peptides and hypertension reduction(奶严生的肽和高血压降低)，Intrnational Dairy Journal，1998，8：375-381)，尽管没有排除它们的效果可能是通过其他机理。已经发现了从酪蛋白(US6514941，Method of preparing a casein hydrolyzate enriched inantihypertensive peptides(制备富含抗高血压肽的酪蛋白水解产物的方法)和乳清蛋白(WO01/85984，Enzymatic treatment of whey proteins forthe production of antihypertensive peptides，the resulting products andtreatment of hypertension in mammals(用于生产抗高血压肽的乳清蛋白的酶处理，所得到的产物以及哺乳动物中高血压的治疗))的酶水解产物获得的不同的肽具有ACE-抑制活性(AECIa)。对具有抗高血压活性 的肽的结构-活性相关性的研究揭示了特定的疏水性氨基酸在实现该活性中的基础作用(H.-S.Cheung，F.-L.Wang，M.A.Ondetti，E.F.Sabo和D.W.Cushman.Binding of peptide substrates and inhibitors ofangiotensin-converting enzyme(肽底物和血管紧张素转化酶抑制剂的结合)。Importance of the COOH-terminal dipeptide sequence(COOH-末端二肽序列的重要性)。Journal of Biological Chemistry 1980，255：401-407)。还认为这些氨基酸中一些的存在对于发挥抗氧化活性是必需的，并且这种活性在近几年中呈现出主要的重要性(H.M.Chen，K，Muramoto，F.Yamauchi，K.Fujimoto和K.Nokihara，Antioxidativeproperties of histidine-contraining peptides designed from peptidefragments found in the digests of a soybean protein(从大豆蛋白消化液中发现的肽片段设计的含组氨酸肽的抗氧化特性)，Journal of Agriculturaland Food Chemistry，1998，46：49-53)。不同的退化性疾病，如癌症，阿尔茨海默氏病，白内障或自身老化与细胞成分，脂质，蛋白质或DNA的氧化相关。这些疾病可以作为氧化剂和生物体的抗氧化系统之间不平衡的结果而产生，出于该原因，膳食中抗氧化化合物的摄入在防止这类疾病中是有用的。此外，食物中存在的这些抗氧化化合物延迟了脂肪氧化过程，认为是脂肪氧化过程引起了腐败，并由于这些食物呈现出令人不愉快的气味和口味。最近的研究已经揭示不同奶蛋白及其衍生物通过不同的作用机理发挥抗氧化活性的能力。因此，已经描述了来自水解的酪蛋白(K.Suetsuna，H.Ukeda和H.Ochi，Isolation andcharacterization of free radical scavenging activities peptides derived fromcasein(源自酪蛋白的自由基清除活性肽的分离和表征)，Journal ofNutritional Biochemistry，2000，11：128-131；EP1188767，Isolatedantioxidant peptides from casein and methods for preparing，isolating andidentifying antioxidant peptides(从酪蛋白分离的抗氧化肽以及制备，分离和鉴定抗氧化肽的方法)和乳清蛋白(B.Hernández-Ledesma，A.Davalos，B.Bartolomé和L.Amigo，Preparation of antioxidant enzymatichydrolyzates from α-lactalbumin and β-lactoglobulin(从α-乳清蛋白和β-乳球蛋白制备抗氧化酶水解产物)。Identification of active peptides byHPLC-MS/MS(通过HPLC-MS/MS鉴定活性肽)，Journal of Agriculturaland Food chemistry 2005，53，588-593)的具有螯合自由基能力的肽。 此外，酪蛋白已经成为具有酶催化脂肪氧化过程抑制活性的蛋白质的主要来源(S.G.Rival，S.Formaroli，C.G.Boeriu和H.J.Wichers，Caseinsand casein hydrolyzates.I.Lipooxygenase inhibitory properties(酪蛋白和酪蛋白水解产物。I.脂氧化酶抑制特性)，Journal of Agricultural andFood Chemistry，2001，49：287-294)。
迄今为止进行的大部分研究围绕源自牛酪蛋白的肽的生物活性。然而，对通过其他类型酪蛋白如绵羊和山羊酪蛋白的肽发挥的生物活性存在很少的公开数据。J.A.Gomez-Ruiz，I.Recio和A.Pihlanto(Antimicrobial activity of ovine casein hydrolyzates(绵羊酪蛋白水解产物的抗微生物活性)。A preliminary study：Milchwissenschaft-MilkScience International 2005，60：41-45)描述了通过β-酪蛋白水解产物发挥的对大肠杆菌JM103代谢活性有效的剂量依赖性抑制效果。然而，在该研究中没有进行鉴定引起该作用的肽。相反，实际上已经鉴定了在Manchego干酪制备特征性的发酵和老化过程中从绵羊酪蛋白释放的几个序列，其中一些已经呈现出ACE-抑制活性(J.A.Gomez-Ruiz，M.Ramos和I.Recio，Identification and formation ofangiotensin-converting enzyme-inhibitory peptides in Manchego cheese byhigh-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(通过高效液相色谱串联质谱鉴定和形成Manchego干酪中血管紧张素转化酶抑制肽)，Journal of Chromatography A，2004，1054：269：277)。这些序列的IC50值(抑制50％酶活性的浓度)为24.1至1275.4μM。在该研究中，呈现出最高ACE-抑制活性的肽是VRYL序列(SEQ IDNo.11)的αs1-酪蛋白片段f(205-208)，其显示出24.1μM的IC50值(J.A.Gómez-Ruiz，M.Ramos和I.Recio，Angiotensin convertingenzyme-inhibitory activity of peptides isolated from Manchego cheese.Stability under simulated gastrointestinal digestion(从Manche go干酪分离的肽的血管紧张素转化酶抑制活性。模拟胃肠消化下的稳定性)。Int.Dairy Journal 2004，1075-1080)。然而，对这些肽穿过肠屏障的能力和在体内发挥抗高血压效果的能力不存在公开的数据。必须强调的是许多在体外呈现出ACE抑制活性的肽通常在体内测试时失去全部或部分活性，或甚至在体外没有呈现任何显著ACE-抑制活性的肽由于消化酶的作用在体内呈现出这种活性(M.Maeno，N.Yamanoto和T.takano， Indentification of an anti-hypertensive peptide from casein hydrolysateproduced by a proteinase from Lactobacillus helveticus CP790(通过来自瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CP790的蛋白酶产生的酪蛋白水解产物的抗高血压肽的鉴定)，Journal of Dairy Science，1996，79：1316-1321)。关于从不同类型的酪蛋白释放的肽发挥多种生物活性如抗高血压，抗微生物和/或抗氧化活性的多功能能力不存在任何公开的研究。
在食物蛋白的序列内存在特定的区域，其一旦通过水解释放，可以呈现出生物活性。这些片段，称为生物活性肽，可以在体内通过胃肠酶的作用在蛋白水解过程中产生，或在体外通过特定酶的作用或在制备特定食品的过程中产生。已知奶蛋白的高生物品质，主要的兴趣是从这些蛋白质获得生物活性肽，其用作膳食的一部分时，除了发挥它们基础的营养功能，能够产生用于维持健康和防止疾病的代谢或生理效果。从奶蛋白生产生物活性肽使得可以发现该食物超出常规营养价值的新用途，包括产生药物和营养药物产品。这将有助于健康，安全，高质量食品的研发，有助于最佳利用奶制品所给予的并且使它们成为更高价值的。
发明描述
-发明简述
本发明包括通过酪蛋白部分的酶水解生产源自奶蛋白的产品，该产品含有具有抗微生物和/或体外ACE-抑制活性和/或抗高血压活性和/或抗氧化活性的生物活性肽。
通过一种或多种含有所述生物活性肽氨基酸序列的蛋白，其肽或片段的水解来生产生物活性肽，使用蛋白水解酶(优选胃蛋白酶，以及在合适的情况下，还可以使用Corolase )以及使蛋白质链在用于其释放的合适位置分裂的水解条件。在使用两种酶模拟胃肠消化道情况中，获得耐胃肠吸收并通过血流的最小功能肽单位。该特征开辟了将这些肽应用于口服给药以外的其它给药形式或提高它们的吸收率。还可以通过化学合成或通过重组等方法来生产。可以按原样或从未加工的水解产物，低分子量浓缩物，或通过基于大小的分离方法或色谱方法获得的其他活性子部分摄入这些肽。
这些水解产物，其级分或肽可以形成食品的一部分，用作食品防腐剂，以及在摄入时，支持身体的天然防御，除此之外，还可以用于制备治疗疾病的药品，特别是能够有助于血压和/或细菌感染的控制。本发明通过最佳利用所有奶蛋白所给予的并且使它们成为更高价值的而扩大了奶蛋白的应用。
-发明详述
本发明提供了从奶酪蛋白生产生物活性肽的方法。这些生物活性肽是SEQ.ID No.1，SEQ.ID No.2，SEQ.ID No.3，SEQ.ID No.4，SEQ.ID No.5，SEQ.ID No.6，SEQ.ID No.7，SEQ.ID No.8，SEQ.ID No.9，SEQ.ID No.10，SEQ.ID No.12，SEQ.ID No.13，SEQ.ID No.14，SEQ.ID No.15，SEQ.ID No.16，SEQ.ID No.17，(表1)中所示氨基酸序列标识的那些，其中一些发挥抗微生物和/或体外ACE-抑制活性和/或抗高血压和/或抗氧化活性。
本发明的起始原料可以是任何合适的物质，其包括一种或多种动物或植物来源的蛋白质或肽，或其可以来自微生物，其含有目标生物活性肽的氨基酸序列。显然可以使用属于αs2-酪蛋白序列的那些，(SEQ.ID No.1，SEQ.ID No.2，SEQ.ID No.3，SEQ.ID No.4，SEQ.IDNo.5，SEQ.ID No.6，SEQ.ID No.7，SEQ.ID No.8，SEQ.ID No.9，SEQ.ID No.10，表1)，含有不同类型αs2-酪蛋白，其一部分或肽或其任何大小片段的任何制剂，单独或结合其他蛋白质。显然还可以使用属于αs1-酪蛋白(SEQ.ID No.12，SEQ.ID No.13)的那些，含有不同类型αs1-酪蛋白，其一部分或其肽或其所需大小片段的任何制剂，单独或结合其他蛋白。显然还可以使用属于β-酪蛋白(SEQ.ID No.14，SEQ.IDNo.16和SEQ.ID No.17)的那些，含有不同类型β-酪蛋白，其一部分，或其肽或其所需大小片段的任何制剂，单独或结合其他蛋白。因此，根据所需要的肽，可以使用纯αs1-酪蛋白，纯αs2-酪蛋白，纯β-酪蛋白，完整酪蛋白，酪蛋白酸盐，和不同呈现形式的奶，发酵的奶制品，奶蛋白水解产物，奶子产品，用于动物饲料的奶衍生物等。
将所述起始原料以合适的浓度溶解或分散于水中或缓冲溶液中，在适于蛋白水解酶作用的pH。可以使用任何能够分裂起始原料中存在的蛋白质并提供目标肽的蛋白水解酶，但是优选在pH2.0-3.0的胃蛋白 酶。还可以使用能够实现底物发酵和蛋白质水解的蛋白水解微生物。
为了选择最有活性水解产物的目的，最佳化水解条件：pH，温度，酶-底物比例，反应中断等。在一个特定的实施方案中，通过在pH3.0使用胃蛋白酶，以3.7／100(w／w)的酶-底物比例，以及在37℃进行水解，时间段为10分钟至24小时，但是优选少于30分钟的时间段，来生产生物活性肽。
SEQ.ID No.15，SEQ ID No.17(表1)所标识的生物活性肽，其具有体外ACE-抑制活性和／或抗高血压活性，由于它们的结构和对胃肠酶的抗性，在胃肠消化后，将是最小的功能肽单位，其将是耐胃肠吸收的并通过血流。起始原料将是任何合适的底物，其包括一种或多种动物或植物来源的蛋白质或肽或其来自微生物，其含有目标生物活性肽氨基酸序列(SEQ.ID No.15，SEQ.ID.No.17(表1)，优选αS2-酪蛋白和β-酪蛋白。显然可以使用含有不同类型的αS2-酪蛋白或β-酪蛋白或其肽或其任何大小片段的任何制剂。例如：纯αs2-酪蛋白，纯β-酪蛋白，完整酪蛋白，酪蛋白酸盐，和不同呈现形式的奶，发酵的奶制品，奶蛋白水解产物，奶子产品，用于动物饲料的奶衍生物等。
为了选择最有活性水解产物的目的，最佳化水解条件：pH，温度，酶-底物比例，反应中断等。在一个特定的实施方案中，通过使用 水解胃蛋白酶水解的酪蛋白或其小于3000Da的部分或含有(PVYRYL SEQ.ID No.7，HLPLPLL SEQ.ID.No.14)的合成肽来实现这，在pH7-8，以1∶25的酶-底物w／w比例，在37℃持续大约2.5小时。通过在95℃水浴中加热10分钟来中断反应。是蛋白水解猪胰腺酶的制剂，除了胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其含有氨基和羧基肽酶。
接着，理想的是浓缩生物活性肽，并且已知具有抗微生物活性的肽本质上是阳离子，可以通过阳离子交换色谱(FPLC)进行含有生物活性肽的级分的分离。可以通过使用阳离子交换色谱，疏水性色谱等，或优选反相高效液相色谱(RP-HPLC)来进一步搜索，将活性子部分从更高阳离子级分中分离出来。或者，可以通过如超滤，透析，具有合适膜孔的电透析，凝胶过滤色谱等方法从水解产物浓缩生物活性肽。
除了完整的水解产物及其一部分，表1中所示的标记为SEQ.IDNo.1，SEQ.ID No.2，SEQ.ID No.3，SEQ.ID No.4，SEQ.ID No.5，SEQ. ID No.6，SEQ.ID No.7，SEQ.ID No.8，SEQ.ID No.9，SEQ.ID No.10，SEQ.ID No.12，SEQ.ID No.13，SEQ.ID No.14的肽呈现出生物活性特征，主要是抗微生物活性和/或ACE-抑制活性和/或抗高血压活性和/或抗氧化活性，并且这也是本发明的一个目的。特别地，用序列SEQ.IDNo.1，SEQ.ID No.2，SEQ.ID No.3，SEQ.ID No.4，SEQ.ID No.5，SEQ.ID No.6，SEQ.ID No.7，SEQ.ID No.8，SEQ.ID No.9，SEQ.ID No.10标示的肽呈现出革兰氏阳性细菌的抗微生物活性，和至少序列SEQ.ID.No.3另外发挥出抗大肠杆菌的有效抗微生物作用。除此之外，序列SEQ.ID No.1和SEQ.ID No.7标识的肽呈现出有效的体外ACE-抑制活性，并且在口服给药于这些动物时，序列SEQ.ID No.7在自发性高血压大鼠(SHR)中呈现出抗高血压活性。除此之外，至少SEQ.ID No.7标识的肽通过氧自由基螯合机理具有理想的抗氧化活性。相似地，来自β-酪蛋白的基于修改证明标识为SEQ.ID.No.14的肽，也呈现出高的ACE-抑制活性。除了胃蛋白酶水解的酪蛋白和Corolase 表1中所示并标记为SEQ.ID.No.15和SEQ.ID No.17的肽在自发高血压大鼠(SHR)中具有抗高血压活性，并且也是本发明的一个目的。必须特别注意的事实是这些是来自各种食用产品的天然肽，可以预期其副作用少并且耐受性良好。
相似地，胃蛋白酶水解产物中鉴定的生物活性肽(SEQ.ID No.1，SEQ.ID No.2，SEQ.ID No.3，SEQ.ID No.4，SEQ.ID No.5，SEQ.IDNo.6，SEQ.ID No.7，SEQ.ID No.8，SEQ.ID No.9，SEQ.ID No.10，SEQ.ID No.12，SEQ.ID No.13，SEQ.ID No.14)，以及另外的，使用Corolase 的(SEQ.ID No.15，SEQ.ID No.16，SEQ.ID No.17，表1)，一旦知道其序列，目前可用的技术可以通过化学和/或酶肽合成或通过重组方法获得这些。
表1.鉴定的生物活性肽的序列
之前没有描述过从胃蛋白酶-水解的绵羊αs2-酪蛋白生产生物活性肽，尽管源自这种牛来源蛋白的抗微生物肽实际上已经得到了描述(EP 1114060，Process for producing cationic peptides from biologicalfluid(从生物流体生产阳离子肽的方法))。之前还鉴定了源自αs2-酪蛋白的一些肽和Manchego干酪中具有ACE-抑制活性的其他绵羊酪蛋白(J.A.Gomez-Ruiz，M.Ramos和I.Recio，Identification and formationof angiotensin-converting enzyme-inhibitory peptides in Manchego cheeseby high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(通过高效液相色谱串联质谱鉴定和形成Manchego干酪中血管紧张素转化酶抑制肽)，Journal of Chromatography A，2004，1054：269：277)，尽管没有进行它们的体内抗高血压活性研究。之前鉴定的具有ACE-抑制活性的肽之一是绵羊αs2-酪蛋白的205-208片段序列VRYL(SEQ.ID.No.11)(IC5024.1μM)。然而，本发明的序列SEQ.ID.No.7，PYVRYL(IC50，1.94)具有高于之前所述那种12倍功效的ACE-抑制活性，其证明了需要本发明中发现的完整序列，以便发挥理想的抗高血压和/或抗氧化和/或抗微生物活性。为了发挥抗高血压和/或抗氧化和/或抗微生物活性，也需要完整的SEQ.ID.No.7序列。此外，还显示出，本发明的序列SEQ.ID.No.7在胃肠模拟后，最小活性片段是序列PYVSEQ.ID.No.15。
另一方面，本发明使得可以通过使用酶制剂和模拟胃肠消化的条件来获得生物活性肽(SEQ.ID.No.15，SEQ.ID No.16，SEQ.ID No.17，表1)。因此，可能的是获得的片段将是水解的终产物，能够在胃肠道 中吸收并且是直接引起抗高血压作用的那些。然而，不能排除通过血浆肽酶的进一步水解。活性小片段的产生是有利的，因为这些片段更易于通过不同途径来给药，并且当口服给药时，将快速起效。
这些奶制品：全奶，奶级分，酪蛋白，酪蛋白酸盐等，是便宜的，即可获得的物质，用于生产生物活性肽，其可以用作具有抗微生物活性和/或ACE-抑制活性和/或抗高血压和/或抗氧化活性的治疗物质。这些奶制品可以经受热处理，如巴氏杀菌，或者经受干燥或冷冻干燥处理等，以便用作功能食品，添加剂或食品配料，或药品，用于治疗和/或预防感染和/或所有形式的动脉高血压，主要是在人类中，尽管也可以在动物中。水解产物，低分子量级分，肽，其衍生物或药物学上可接受的盐及其组合的含量，以及它们用于治疗任何疾病的剂量，将根据各种因素而改变，如年龄，疾病或障碍的严重程度，给药途径和给药频率。这些化合物可以以任何给药形式呈现，固体或液体，并且通过任何合适的给药途径给药，口服，呼吸道，直肠或局部，尽管将它们特别设计成用于以固体或液体形式口服给药。
通常，可以最佳化生产这些制品：完全水解产物，其级分及其构成肽，的方法，通过聚焦于最大可能量的生物活性肽的生产或控制苦味至可能的程度，通常由高浓度培养基或低分子量疏水性肽引起的。分析方法
抗微生物活性的测量
根据A.Pellegrini，C.Deltting，U.Thomas，P.Hunziker的方法测定抗微生物活性(Isolation and characterization of four bactericidaldomains in the bovine β-lactoglobulin(牛β-乳球蛋白中四个杀菌结构域的分离和表征)Biochimica et Biophysica Acta，2001，1526：131-140)，使用微生物大肠杆菌(Escherichia coli)[美国典型微生物培养中心(ATCC)，Rockville，MD，USA]ATCC 25922，无害李斯特氏菌(Listeriainnocua)[Coleccion Espanola de Cultivos Tipo(CECT)Valencia，Spain]CECT 910T，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CECT231，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CECT 795，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)CECT 854和肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)CECT 4491T。
对于大肠杆菌，粘质沙雷氏菌和葡萄球菌属的菌株，以1％将细菌悬浮液接种于胰蛋白大豆培养液(TSB)中，或对于粪肠球菌和无害李斯特氏菌，接种于脑心浸液(BHI)培养液中。在37℃进行培养，除了粘质沙雷菌的情况中，其在30℃进行培养。
在37℃或30℃将生长于10mL TSB或BHI中TSB-琼脂或BHI-琼脂中的菌落培养过夜后，获得开始工作的细菌接种物。用相应的培养基将细菌悬浮液(1mL)稀释1/50，在对于每个菌株合适的温度下培养直至获得每mL 1-4×108菌落形成单位(CFU)的种群密度。将培养物在2000xg离心10分钟，用15mL磷酸盐缓冲液(pH7.4)将沉淀的细菌洗涤两次并将种群调节至106CFU/mL。在无菌多孔平板(GreinerLabortechnik，Frickenhausen，Germany)上，将50μL细菌悬浮液，50μL待测试的物质和100μL磷酸盐缓冲液与每种情况中2％合适的培养基混合，然后将混合物在37℃或30℃培养2小时。该时间后，将混合物稀释至10-5，将每一种100μL的稀释液加入TSB-琼脂或BHI-琼脂平板中并将平板培养24小时，该时间后进行菌落计数。
将以下等式用于计算抗微生物活性：
其中N0是开始的CFU/mL数量
Nf是最后的CFU/mL数量
血管紧张素转化酶抑制活性(ACEIa)的测量
通过D.W.Cushman和H.S.Cheung的方法在体外测量ACE-抑制活性(Spectrophotometric assay and properties of angiotensin-covertingenzyme in rabbit lung(兔子肺中血管紧张素转化酶的光谱测试和特性)。Biochemical Pharmacology，1971，20：1637-1648)，之后由Y.K.Kim，S.Yoon，D.Y.Yu，B.Lonnerdal和B.H.Chung改进(Novelangiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides derived fromrecombinant humanαs1-casein expressed in Escherichia coli.(源自大肠杆菌中表达的重组人αs1-酪蛋白的新血管紧张素-I-转化酶抑制肽)。Journal of Dairy Research 1999，66，431-439)。
将底物，马尿酰-组氨酰(hipuril histidil)亮氨酸(HHL，Sigma， Chemical Co，St.Louis，MO，USA)，溶解于含有0.3M NaCl的0.1M硼酸盐缓冲剂中，pH8.3，来获得5mM的终浓度。将每种40μL待测定ACE-抑制活性的样品加入100μL底物中。加入ACE酶(CE 3.4.5.1，Sigma)，溶解于50％甘油中并在进行测试的时间点以1/10稀释于重蒸水中。将反应在37℃的水浴中进行30分钟。通过用150μl 1N HCl降低pH来使酶灭活。用1000μL乙酸乙酯提取所形成的马尿酸(hipuricacid)。涡旋搅拌20秒后，在室温3000xg离心10分钟，从95℃热蒸发10分钟的有机相中取出750μL。将马尿酸残余物再溶解于800μL重蒸水中，并在搅拌20秒钟后，在来自Beckman Instruments，Inc.，Fullerton，USA的Dur-70光谱仪中测量228nm处的吸光值。
使用以下等式计算ACE-抑制活性的百分比：
％ACE-抑制活性＝(A对照-A样品)/(A对照-A空白)×100
空白用于校正背景吸光值。该空白含有底物，酶和20μL替代样品的重蒸水，并在时间零时停止反应。对照需要抑制剂不存在时对底物的100％酶反应并含有20μL替代样品的水并培养与样品相同长的时间。
将结果显示为IC50(μM)或50％酶活性得到抑制的浓度。通过双辛丁酸(bicinchoninic acid)测试测定蛋白质浓度(Pierce-Rockord，IL，USA)，使用牛血清白蛋白作为模式。
抗氧化活性的测量
通过B.X.Ou.M.Hampsh-Woodill，RL.Prior产生的方法(Development and validation of an improved oxygen radical absorbancecapacity assay using fluorescein as the fluorescent probe(使用荧光素作为荧光探针的改进氧自由基吸收能力测试的研发和证实)，2001，49：4619-4626)测定氧自由基吸收能力(ORAC)。该方法是基于荧光素通过在λexo＝493nm和λcm＝515nm热分解2，2’偶氮-双2-脒基丙烷二盐酸盐原位产生的过氧自由基的氧化。抗氧化剂的存在防止或延迟了荧光素的分解。
每日从75nM磷酸盐缓冲液(pH7.5)中的100μM荧光素母液制备60nM浓度的荧光素工作溶液。作为对照抗氧化剂，使用6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-羧酸(Trolox)，将其在磷酸盐缓冲液中制备成20nM浓度(母液)并存储于-20℃。通过分析从母液制备的浓度12.5，25，40， 50和100μM的模式溶液来作出Trolox标准曲线。将AAPH溶解于磷酸盐缓冲液中至143mM的终浓度，保持在低温来防止其分解。
为了进行该测试，将375μL样品与375μL AAPH和2.225mL荧光素混合，将该混合物在37℃培养。每5分钟，在RF-1501荧光计(Shimadzu)中(λexo＝493nm和λcm＝515nm)测量荧光。对测试进行对照，包括含有荧光素和磷酸盐缓冲液的空白，用于检测来确保实验过程中荧光的稳定性，和含有荧光素，AAPH和磷酸盐缓冲液的阳性最大氧化对照。作为最大抗氧化活性的对照，待分析的每套样品中包括40μM trolox溶液。所有样品重复三份分析。
通过曲线下荧光素荧光的“曲线下面积”(AUC)测量的来定量抗氧化活性并在Trolox等式(ORAC曲线)中给出。使用以下等式计算AUC：
AUC＝(0.5+f5/f0+f10/f0+f15/f0+……+f30/f0
其中f0是时间零时的荧光，且fi是时间“i”时的荧光。
使用以下等式测定肽的相对ORAC值：
ORAC＝[(AUC样品-AUC空白)/(AUCtrolox-AUC空白)]X[(trolox体积摩尔浓度/样品体积摩尔浓度)]
通过离子交换色谱(FPLC)分离肽级分
通过带有一些改进的I.Recio，S.Visser的方法进行阳离子型肽级分的分离(Identification of two distinct antibacterial domains within thesequence of bovineαs2-casein(牛αs2-酪蛋白序列内两个截然不同的抗菌结构域的鉴定)，在FPLC系统内，使用HiLoadTM 26/10SP Sepharose FastFlow阳离子交换柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。A和B相各自包括10nM NH4HCO3(用HCOOH调节至pH7.0)，和1.5M NH3。将样品溶解于制备成浓度5mg/mL的A相中，通过50mL的SuperloopTM(Pharmacia)加样5mL体积。以5mL/min的流速洗脱水解产物。用100％溶剂A 20分钟后，在60分钟内使用A中0％至50％溶剂B梯度，接着20分钟使用50％溶剂B。在214nm进行吸光率的检测。柱子和移动相的温度是9℃。几次色谱分析后收集级分。
通过半制备规模的反相高效液相色谱(RF-HPLC)分离肽级分
使用包括两个可编程的泵模型Waters Delta 600的系统，Mod.966二极管阵列检测仪，Mod.717加自动加样器和自动级分收集器(WaterCorp.，Milford，MA，USA)。使用C18Prep HR柱，7.8×300mm和6μm孔大小(Waters)，C18药筒(Waters)作为保护柱。在30℃进行分析，并在214和280nm检测。用Millennium Software版本3.2(Waters)进行数据获取。将αs2-酪蛋白样品制成2.5mg/mL的浓度，并且在加样之前，在16000×g离心10分钟。为了样品的洗脱，各自使用含有0.1％和0.08％三氟醋酸的二相 水梯度(相A)和乙腈(相B)，流速为4mL/min。相B梯度在50分钟内从0％至40％，并从40％至70％持续5分钟，用70％B洗涤柱子5分钟并将柱子恢复至起始条件25分钟。加样的样品体积是300μL。制备浓度为100mg/mL总酪蛋白样品，并在加样之前，通过具有0.45μm孔径的滤器。为了样品的洗脱，各自使用含有0.1％和0.08％三氟醋酸的二相 水梯度(相A)和乙腈(相B)，流速为4mL/min。相B梯度在70分钟内从0％至35％并从35％至70％持续5分钟，用70％B洗涤柱子5分钟并将柱子恢复至起始条件20分钟。加样样品的体积是50μL。
通过串联质谱的分析(离线)
使用Esquire 3000离子捕获系统(Bruker Daltonik GmbH，Bremen，Germany)。将样品在含有0.01％甲酸(v/v)的50％(v/v)水∶乙腈溶液中制成2mg/mL的浓度。使用模型22加样泵(Havard Apparatus，SouthNatik，MA，USA)将样品以4μl/min的流速加样至电喷雾器中。系统使用氮作为喷雾和干燥气体并在5x10-3巴氦压下工作。以13000Da/秒的速率以100-2000m/z的间隔获取质谱。使用Biotools 2.1程序(BrukerDaltonik GmbH，Bremen，Germany)进行用于鉴定肽序列的串联质谱的判读。
通过在线连接串联质谱的RP-HPLC(RP-HPLC-MS/MS)的分析
使用Esquire-LC系统(Bruker Daltonik GmbH，Bremen，Germany)。HPLC(1100系列)由四联泵，自动加样器，洗脱液脱气系统和可变波长紫外线检测仪构成。(Agilent Technologies，Waldbronn，Germany) 在线连接Esquire 3000离子捕获光谱仪(Bruker Daltonik)。柱子是Hi-Pore C18柱(250x4.6mmi.d.，5μm粒径)(Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA，USA)。溶剂A是水和三氟醋酸的混合物(1000∶0.37)，溶剂B是乙腈和三氟醋酸的混合物(1000∶0.27)。加样制成4.5mg/ml浓度的50μL样品。使用0.8ml/min的流速，60分钟内A中0％至50％溶剂B的线性梯度。在上述的相同条件下通过质谱在214nm处监控洗脱液，除了通过喷雾器的样品的加样流速为275μL/min。
自发高血压大鼠(SHR)中抗高血压活性的研究
研究了所鉴定的肽对自发高血压大鼠(SHR)血压的几个作用。为了该研究，化学合成肽。
用来自Charles River Laboratories Espana S.A的17-20周大称重300至350的雄性大鼠进行研究。将大鼠饲养在笼子中，每只笼子五只，维持25℃的温度温度，使用12-小时亮-暗循环，自由饮水和进食。获得收缩压(SBP)和舒张压(DBP)测量值，为了该目的，使用tail cuff方法(R.D.Bunag，Validation in awake rats of tail-cuff method formeasuring systolic pressure(清醒大鼠中测量收缩压的tail-cuff方法的确定)，J.Appl.Physiol.，1973，34：279-282)。使用的设备(Le5001，Letica)自动提供了远端SBP和DBP值。该设备记录并且还促进动物的心率。将tail-cuff和转换器置于大鼠尾巴上之前，将大鼠暴露于接近37℃的温度，使得促进尾动脉的舒张。此外，为了确保测量的可靠性，在进行所述测试之前使动物适应程序2周。通过取3个连续的测量值来测定SBP和DBP值并对于这两个变量中的每一个来计算这三个值的平均值。
用于研究的自发高血压大鼠(SHR)具有190mm Hg至220mm Hg的SBP值，130mm Hg至180mm Hg的DBP值。
在9a.m.至10a.m.的时间跨度内通过胃内导管给药待测试的产品，并溶解于1ml蒸馏水中来给药测试的剂量。在给药之前获得SBP和DBP读数，并且在给药后每2小时还进行了这些变量的定期测量，直至给药后8小时。此外，还在给药所述产品后24小时获得SBP和DBP测量值。作为阴性对照(用于建立插管大鼠中SBP和DBP的昼夜节律变化)，使用通过胃内导管给药1ml水的大鼠，在相似的测试中获得SBP 和Dap测量值。作为阳性对照，使用已经给药50mg/kg卡托普利(captopril)(原型ACE-抑制药物)的大鼠，在相似的测试中获得SBP和DBP测量值。将该卡托普利药物溶解于1ml蒸馏水中来给药于每只大鼠。
集合结果并计算最小6个同样测试的测量值的±标准误差平均(SEM)。为了比较，使用方差的one-way分析，接着Bonferroni测试。认为p＜0.05的值差异是显著的。
附图简述
图1：使用阳离子交换色谱(FPLC)获得胃蛋白酶水解30分钟的绵羊αs2-酪蛋白的色层谱，其中选择了5个级分(FA-FE)，将其人工收集。将以分钟给出的时间绘制于X-轴上。
图2A：使用反相高效液相色谱(RP-HPLC)获取半制备规模的FC级分的色层谱，FC级分是从胃蛋白酶水解30分钟的绵羊αs2-酪蛋白收集的。选择了四(4)个人工收集的子部分(FC1-FC4)。将以分钟给出的时间绘制在X-轴上。
图2B：使用反相高效液相色谱(RP-HPLC)获取半制备规模的FD级分的色层谱，FD级分是从胃蛋白酶水解30分钟的绵羊αs2-酪蛋白收集的。选择了两(2)个人工收集的子部分(FD1-FD2)。将以分钟给出的时间绘制在X-轴上。
图3：通过半制备规模的RP-HPLC从FC和FD级分获得的不同子部分的抗微生物活性。
图4：通过胃内导管给药1ml水(○)，50mg/kg卡托普利(□)，3mg/kgPYVRYL(▲)和3mg/kg LKKISQ(◆)后，在自发高血压大鼠中发现了收缩压(SBP)降低和舒张压(DBP)降低。T(h)表示从给药开始流逝的时间长度，以小时给出。数据显示出最少6只动物的±平均SEM。 aP＜0.05vs水；bP＜0.05vs卡托普利；cP＜0.05vs PYVRYL。
图5：通过胃内导管给药1ml水(○)，50mg/kg卡托普利(□)，400mg/kg酪蛋白(▲)，400mg/kg酪蛋白水解产物(◆)和200mg/kgF＜3000Da的酪蛋白水解产物(■)后，在自发高血压大鼠中发现了收缩压(SBP)降低和舒张压(DBP)降低。T(h)表示从给药开始流逝的时间长度，以小时给出。数据显示出最少4只动物的±平均SEM。 aP＜0.05vs水；bP＜0.05vs卡托普利；cP＜0.05vs400mg/kg酪蛋白。
图6A：使用反相高效液相色谱(RP-HPLC)获取半制备规模的3000Da次要部分的色层谱，该次要部分是从胃蛋白酶水解3小时的绵羊αs2-酪蛋白获得的。将214nm处的吸光值绘制在Y-轴上，将以分钟计的时间绘制在X-轴上。图6B对应于通过RP-HPLC获得的色谱级分的血管紧张素酶抑制活性(ACEIa)。由于其有效的ACE-抑制活性，选择了人工收集的3个级分(F3，F5和F6)。
图7：在用胃蛋白酶和Corolase 按次序水解之前和之后，使用合成肽PYVRYL SEQ.ID.NO.7的反相高效液相色谱(RP-HPLC)获取色层谱。将214nm处的吸光值绘制在Y-轴上，将以分钟计的时间绘制在X-轴上。
图8：通过胃内导管给药1ml水(○)，50mg/kg卡托普利(□)，3mg/kgPYVRYL(◆)和2mg/kg PYV(■)后，在自发高血压大鼠中发现了收缩压(SBP)降低和舒张压(DBP)降低。T(h)表示从给药开始流逝的时间长度，以小时给出。数据显示出最少4只动物的±平均SEM。 aP＜0.05vs水；bP＜0.05vs卡托普利；cP＜0.05vs3mg/kgPYVRYL。
图9：在用胃蛋白酶和Corolase 按次序水解之前和之后，使用合成肽HLPLPLL SEQ.ID.No.14的反相高效液相色谱(RP-HPLC)获取色层谱。将214nm处的吸光值绘制在Y-轴上，将以分钟计的时间绘制在X-轴上。
图10：通过胃内导管给药1ml水(○)，50mg/kg卡托普利(□)，7mg/kg HLPLP(●)后，在自发高血压大鼠中获得了收缩压(SBP)降低和舒张压(DBP)降低。T(h)表示从给药开始流逝的时间长度，以小时给出。数据显示出最少4只动物的±平均SEM。aP＜0.05vs水； bP＜0.05vs卡托普利。
本发明实施方案的实施例
以下实施例说明了本发明，尽管必须不能将它们认为是限制其范围。
实施例1.从胃蛋白酶水解的绵羊αs2-酪蛋白生产具有抗微生物，ACE-抑制，抗高血压和抗氧化活性的生物活性肽。
通过使用绵羊αs2-酪蛋白作为底物来获得水解产物，底物通过H.J.Vreeman，J.A.M.van Riel的方法分离剩余酪蛋白后获得(The large-scale isolation ofαs2-casein from bovine casein(从牛酪蛋白大规模分离αs2-酪蛋白)。Netherlands Milk and Dairy Journal，1990，44：43-48)。作为酶，使用来自猪胃的猪胃蛋白酶(E.C.3.4.23.1.570U／mg蛋白质)(Sigma Chemical，St.Louis，USA)。制备0.5％的αs2-酪蛋白水溶液，并用1M HCl将pH调节至3.0。加入胃蛋白酶(酶-底物比例3.7／100，w／w)。在37℃进行水解30分钟。通过在80℃加热15分钟来获得胃蛋白酶的失活，然后用1M NaOH将pH调节至7.0。将水解产物在16000g5℃离心15分钟后收集上清液，通过HPLC来分析(图1)，已经分离五个级分(FA-FE)，将其人工收集，然后冻干。
在2.5mg／mL的浓度测量这五个级分的抗微生物活性，使用5.9×103CFU／mL大肠杆菌作为对照。结果表明FC和FD级分具有抗微生物活性，各自将微生物的数量降低了2.54和0.6个数量级。
为了鉴定负责抗微生物活性的肽的目的，通过半制备规模的RP-HPLC分析FC和FD级分。图2显示了FC级分(图2A)和FD级分(图2B)的色谱特征。从FC部分中分离出四个子部分(FC1-FC4)，从FD级分中分离出两个子部分(FD1-FD2)。收集这些子部分中的每一个，并在乙腈蒸发后，将其冻干。在2.5mg／mL浓度测量这些子部分对抗大肠杆菌(6.2×106CFU／mL)的抗微生物活性。图3显示出这些子部分对抗大肠杆菌的抗微生物活性。在所有这些子部分中，必须特意提及FC1，其是呈现出较大抗微生物活性之一，已知其在测试的浓度具有杀菌效果(logNf/N0大于6)。FC4，FD1和FD2子部分呈现中中等的抗微生物活性，各自具有1.24，1.31和1.64数量级的微生物降低值。
按照之前所述的方法，使用离子捕获分析仪，通过质谱分析FC1，FC4，FD1和FD2子部分。表1中显示了鉴定的肽。
表2.从胃蛋白酶水解30分钟的绵羊αs2-酪蛋白获得的子部分FC1，FC4，FD1和FD2中鉴定的肽。
实施例2.化学上合成的肽具有抗微生物活性。
化学合成大部分存在于从胃蛋白酶水解绵羊αs2-酪蛋白30分钟获得的子部分中的肽(SEQ.ID.No.1，SEQ.ID.No.2，SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.7)。通过Fmoc固相方法合成这些肽，并通过RP-HPLC-MS/MS证实它们的纯度。
测量.05mM浓度的合成肽对抗大肠杆菌，粘质沙雷氏菌，肉葡萄 球菌，表皮葡萄球菌，粪肠球菌和无害李斯特氏菌的抗微生物活性。活性结果显示于表2中。
表3.从胃蛋白酶水解绵羊αs2-酪蛋白30分钟获得的子部分FC1，FC4和FD1种鉴定的合成肽的抗微生物活性。
这些肽呈现出抗革兰氏阳性细菌的高度抗微生物活性，尤其是抗葡萄球菌属的测试菌株。这些肽中的三个SEQ.ID.No.1，SEQ.ID.No.2和SEQ.ID.No.3呈现出抗肉葡萄球菌的杀菌活性。然而，革兰氏阴性细菌(大肠杆菌和粘质沙雷氏菌)对所有这些肽的作用是高度抗性的，尽管必须提及SEQ.ID.No.3标识的肽呈现出抗大肠杆菌的高度抗微生物活性的事实。
实施例3.化学上合成的肽具有ACE-抑制和抗高血压活性。
测量了实施例1中提及的两种化学上合成肽的ACE-抑制活性，特别是序列SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.7。作为IC50或抑制50％酶活性需要的蛋白质浓度给出的活性结果显示于表3中。这两种肽呈现出有效的ACE-抑制活性。
表4.从胃蛋白酶水解30分钟的αs2-酪蛋白获得的FC1和FD1子部分中鉴定的合成肽的ACE-抑制活性。
测试了SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.7肽的抗高血压活性，为了该目的，将这些肽(3mg／kg)给药于自发高血压大鼠(SHR)。将肽溶解于蒸馏水中，并在1ml体积中将相应剂量给药于每只大鼠。
图4显示了在给药3mg／kg SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.7肽后不同时间点的自发高血压大鼠(SHR)中SBP和DBP的降低程度。可以看到SEQ.ID.No.7肽的给药引起这些动物中SBP和DBP的显著降低。这些变量的降低在给药这种肽后4小时达到峰值。该降低还呈现出与给药卡托普利引起的SBP和DBP降低相似的时间过程，这证明了其是具有抗高血压活性的化合物。这些结果表明基于急性基础口服给药时，SEQ.ID.No.7标识的肽具有清楚而显著的抗高血压效果。
实施例4.具有抗氧化活性的化学合成肽。
测量了实施例1中提及的SEQ.ID.No.7的抗氧化活性。以下显示了过氧自由基螯合活性：
ORACPYVRYL=1.82μmol Trolox等价物／μmol肽
因此结果显示出PYVRYL(SEQ.ID.No.7)具有比1μmol Trolox高1.82倍的抗氧化活性。
实施例5.用胃蛋白酶从牛酪蛋白生产具有ACE-抑制活性的生物活性肽。
通过从未加工的牛奶等电点沉淀来获得牛酪蛋白底物，使用该底物来进行水解。将来自猪胃的猪肽用作酶(E.C.3.4.23.1.570U／mg蛋白质)(Sigma Chemical，St.Louis，USA)。制备0.5％的牛酪蛋白水溶液并用1M HCl将pH调节至2.0。加入胃蛋白酶(酶-底物w／w比例3.7／100)。在37℃进行水解3小时。通过在80℃加热20分钟使胃蛋白酶灭活，然后用1M NaOH调节pH至7.0。将水解产物在16000×g5℃离心15分钟后收集上清液，然后将上清液通过具有3000Da孔径的疏水性膜(Centripep，Amicon Inc，Beverly，MA，USA)超滤。在SHR中测定总水解产物和透过物(分子量小于3000Da的水解产物部分)的ACE-抑制和抗高血压活性(根据之前分析方法中所述的)。表4显示出以IC50或抑制50％酶活性需要的蛋白质浓度给出的ACE-抑制活性值， 并通过凯氏法测定蛋白质含量。图5显示出给药酪蛋白水解产物后和给药具有低于3000Da分子量的酪蛋白水解产物级分后不同时间的自发高血压大鼠(SHR)中发现的SBP和DBP降低。如表中所示的，酪蛋白水解产物的给药引起这些动物中SBP和DBP的显著降低。分子量小于3000Da的酪蛋白水解产物级分的给药引起自发高血压大鼠中SBP和DBP降低至与给药酪蛋白水解产物后观察到那些相似的程度。这些变量的降低在给药这些产物后2小时达到峰值。未水解酪蛋白的给药没有显著改变自发高血压大鼠(SHR)的SBP并且比之前的化合物将这些动物中的DBP降低至更低的程度。这些结果表明基于急性基础口服给药时，酪蛋白水解产物和分子量小于300Da的酪蛋白水解产物级分具有明显的抗高血压效果。
表5：胃蛋白酶水解的牛酪蛋白以及超滤处理后获得的透过物(<300Da的部分)和截留物(F>3000Da)的ACE-抑制活性
为了鉴定负责ACE-抑制和抗高血压活性的肽的目的，超滤后，将透过物接受半制备规模RP-HPLC的分离处理，其中收集了8个级分。乙腈蒸发后，将这些色谱级分冻干，并通过二辛可宁酸方法测定蛋白质含量。图6显示了色谱特征和所获得的级分，以及对于每一种色谱级分以IC50给出的ACE-抑制活性值。图6中称为F3，F5和F6的级分是呈现出更高ACE-抑制活性的那些，换句话说，更低的IC50值。使用之前所述的方法通过在线连接串联质谱的RP-HPLC(RP-HPLC-MS／MS)分析这些级分。表5中显示了所鉴定的主要的肽。
表6：从胃蛋白酶水解3小时的牛酪蛋白的透过物获得的级分F3，F5和F6中鉴定的主要活性肽
通过固相Fmoc方法化学合成这些色谱级分中获得的主要肽，并通过RP-HPLC-MS／MS证实其纯度。测定了化学合成肽的ACE-抑制活性，尤其是序列SEQ.ID.No.12，SEQ.ID.No.13和SEQ.ID.No.3。表6中显示了以IC50或抑制50％ACE活性需要的蛋白质浓度给出的活性结果。鉴定的三种主要肽中的至少两种呈现出有效的ACE-抑制活性。
表7：级分中鉴定的合成肽的ACE-抑制活性
实施例6：水解αs2-酪蛋白获得的片段SEQ.ID.No.7的模拟胃肠消化后肽的ACE-抑制和抗高血压活性。
之前已经在αs2-酪蛋白水解产物中鉴定了PVYRYL SEQ.ID.No.7肽并化学合成，接受模拟胃肠消化的两级水解过程(Alting，A.C.，Meijer，R.J.G.M.，Van Berestijn，E.C.H.Incomplete elimination of the ABBOS epitope of bovine serum albumin under simulated gastrointestinal conditions of infants.(模拟婴儿胃肠条件下牛血清白蛋白的ABBOS抗原决定部位的不完全消除)Diabetes Care，1997，20：875-880)。为了该目的，首先用胃蛋白酶(E.C.3.4.4.1，570U／mg蛋白)(Sigma)(酶-底物比例，1∶50，w／w)在pH2.0和37℃水解合成肽的水溶液(10mg／ml)90分钟，此后用(酶-底物比例1∶25，w／w) Darmstadt，Germany)在pH7-8和37℃水解2.5小时。通过在95℃水浴中加热10分钟来中断反应。
图7显示了用胃蛋白和孵育后，PYVRYL肽SEQ.ID.No.7完全水解。通过RP-HPLC-MS／MS鉴定的主要获得片段是三肽PVY SEQ.ID.No.15。化学合成这种肽并测定其ACE-抑制活性，获得741.3μM的IC50值，换句话说，ACE-抑制活性比初始的肽低370倍。通过给药于SHR来测定该三肽PVY SEQ.ID.No.15的抗高血压活性。将肽溶解于蒸馏水中并将1ml体积中相应的剂量给药于每只大鼠。图8显示出给药2mg／kg剂量PVY SEQ.ID.No.15和3mg／kg剂量PYVRYL肽SEQ.ID.No.7后不同时间点SHR大鼠中发现的SBP和DBP降低，其中显示出这两种肽的给药引起这些动物中SBP和DBP的显著降低。同时在给药后2小时产生PVY SEQ.ID.No.15对SBP的峰值效果，直至给药后4小时也没有产生PYVRYL肽SEQ.ID.No.7的峰值效果。在SEQ.ID.No.15的情况中，抗高血压效果的较快发作可能是由于给药该序列时，消除了对于其在体内引起的必须发生的酶消化过程。这些结果证明了尽管在原理上SEQ.ID.No.15的抗高血压活性，但这不能归因于ACE-抑制活性。重要的是强调迄今为止至今还没有描述过PYV肽SEQ.ID.No.15的有效抗高血压活性。
实施例7：通过水解完整酪蛋白HLPLPLL SEQ.ID.No.14获得的片段的模拟胃肠消化后肽的ACE-抑制和抗高血压活性。
之前已经在具有低于3000Da分子量总酪蛋白水解产物部分中鉴定了HLPLPLL肽SEQ.ID.No.14并化学合成，将其接受模拟胃肠消化的两级水解过程(Alting，A.C.，Meijer，R.J.G.M.，Van Berestijn，E.C.H.Incomplete elimination of the ABBOS epitope of bovine serum albumin under simulated gastrointestinal conditions of infants.(模拟婴儿胃肠条件下牛血清白蛋白的ABBOS抗原决定部位的不完全消除)Diabetes Care，1997，20：875-880)。为了该目的，首先用胃蛋白酶(E.C.3.4.4.1，570U／mg蛋白)(Sigma)(酶-底物比例，1∶50，w／w)在pH2.0和37℃水解合成肽的水溶液(10mg／ml)90分钟，此后用(酶-底物比例1∶25，w／w)(Darmstadt，Germany)在pH7-8和37℃水解2.5小时。通过在95℃水浴中加热10分钟来中断反应。
图9显示出通过RP-HPLC-MS/MS鉴定HLPLPLL肽SEQ.ID.No.14水解后获得的肽，其对应于HLPLPL六肽SEQ.ID.No.16和HLPLP五肽SEQ.ID.No.17。HLPLPL SEQ.ID.No.16是中间片段，而五肽HLPLP SEQ.ID.No.17是对胃肠酶的作用抗性的并可能是HLPKPLL肽SEQ.ID.No.14的最终蛋白水解产物。测定HLPLP五肽SEQ.ID.No.17的ACE-抑制活性并发现21μM的IC50值。相似地，以7mg/kg剂量给药时，测定了水解HLPLP SEQ.ID.No.17获得的最后的肽在SHR大鼠中的抗高血压活性。图10中显示了SBP和DBP的降低。在这些动物中发现了SBP和DBP的显著降低，但是在这种情况中，实际上抗高血压效果至少部分可以归因于ACE-抑制活性。

Claims (12)

1.生物活性肽，其特征在于：
a.具有体外血管紧张素转化酶-抑制活性和／或体内抗高血压活性和／或抗氧化活性，
b.存在于胃蛋白酶水解的奶酪蛋白酶水解产物中，
和
c.为SEQ.ID No.12。
2.根据以上权利要求1的生物活性肽，其特征在于源自αs2-酪蛋白。
3.根据以上权利要求2的生物活性肽，其特征在于模拟胃肠消化后获得。
4.根据以上权利要求1的生物活性肽，其特征在于源自αs1-酪蛋白。
5.根据以上权利要求1的生物活性肽，其特征在于呈现出体外血管紧张素转化酶-抑制活性。
6.根据以上权利要求1的生物活性肽，其特征在于呈现出抗高血压活性。
7.根据以上权利要求1的生物活性肽，其特征在于通过氧自由基螯合呈现出抗氧化活性。
8.根据以上权利要求1的生物活性肽，其特征在于通过化学合成方法、酶水解方法或通过重组方法获得。
9.根据以上权利要求8的生物活性肽，其特征在于通过酶水解αs1-酪蛋白或αs2-酪蛋白的方法获得。
10.生产根据以上权利要求1的生物活性肽的方法，其特征在于：
a.将奶酪蛋白以合适的浓度溶解或分散于水或缓冲溶液中，以获得混合物，
b.在适于蛋白水解酶胃蛋白酶作用的pH下调节该混合物，
c.向该混合物加入所述胃蛋白酶，裂解奶酪蛋白，和
d.使蛋白水解酶胃蛋白酶与蛋白反应10分钟至24小时，以获得如权利要求1-9中任一项所述的生物活性肽。
11.根据权利要求10的方法，其特征在于：
以酶-底物w／w比例3.7／100并在37℃、pH3.0下加入胃蛋白酶；和
反应时间为30分钟至3小时。
12.生物活性制品，其特征在于其包含酶水解产物、其任何级分或其纯化物，所述酶水解产物、其任何级分或其纯化物含有由以上权利要求1至9中至少一项所述的生物活性肽组成的肽。
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Granted publication date: 20140806

Termination date: 20160608