TWI414305B - 腎衰竭預防劑 - Google Patents

Description

腎衰竭預防劑

本發明係有關具有抑制腎臟絲球體疾病及腎動脈硬化之作用的有效成分、包含該有效成分之腎衰竭預防劑、以及含有該有效成分之可期待預防腎衰竭之效果的功能性食品。

此外，本發明係有關抑制腎臟絲球體疾病以及腎動脈硬化的方法。再者，本發明係有關於預防腎衰竭的方法。

近年來，在一部分的國家中具有被認為會引起心臟疾病或腎臟疾病之吸煙、高血壓、高血糖、高血脂症等危險因子的人變多，心衰竭或腎衰竭之患者數有增加的傾向。此外，此等病狀不只侷限於人類，在狗、貓、其他伴侶動物或寵物動物等與人類有密切關係的動物也有增加的傾向。

就於心衰竭治療有效之藥劑而言，作為可抑制從血管緊縮素I轉換成具有升壓作用之血管緊縮素II的酵素(亦即，血管緊縮素轉換酵素；ACE)之物質、且具有降壓作用之血管緊縮素轉換酵素抑制劑(ACEI)，例如，可舉出伊那拉普利(enalapril)。此外，已有報告(J.Clin.Invest,77,1993－2000,1986)指出降壓劑係在降低血壓的同時亦改善腎障礙之進展情形。可是在另一方面，相對於自各種原疾病誘發之心衰竭，ACE抑制劑並非一定對所有的病症都有效，相反地，被指出亦有伴隨降壓而造成急性腎衰竭的危 險，故必須慎重地投予(最新醫學，48:1404至1409,1993)。亦即，降壓劑不僅在心衰竭的預防方面為不充分，反而還有誘發腎衰竭的可能性。

所謂腎衰竭，通常係指腎臟變得無法在過濾血液時良好地去除血液中之代謝性廢物的狀態。

腎衰竭係因各種腎臟病而造成腎功能荒廢之病狀，就其原發疾病而言，可舉出例如糖尿病性腎病、慢性腎絲球體腎炎、腎硬化症、多發性囊胞腎(polycystic kidney disease)、慢性腎盂腎炎(chronic pyelonephritis)、快速進行性腎絲球體腎炎、全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus)腎炎、腎絲球體硬化症、腎動脈硬化所造成之腎動脈血流不全等。此外，ACE抑制劑對腎衰竭有效之事實雖經報告而受注目，但亦經指摘出有時有引起急性腎衰竭與腎障礙之惡化的可能性，且此等藥劑之有用性亦非為充分者(最新醫學，48:1404至1409,1993)。如以上所述，由於腎衰竭係由高血糖或藥物障礙等各種因素所引起，故若僅改善高血壓，對於預防源自如上述之原發疾病的所有腎衰竭並不充分。另一方面，腎絲球體疾病為腎衰竭共通的病變，此外，腎動脈硬化為與腎衰竭有關的病變。從此等事實來看，具有腎絲球體疾病之抑制作用的化合物，或者是進一步具有腎動脈硬化之抑制作用的化合物，係可認為對腎衰竭之預防與治療為有用。

另一方面，雖有報告指出源自酪蛋白(casein)等食品素材之胜肽具有ACE抑制活性，此等具有血壓降低作用為已 知，但未直接顯示是否具有腎絲球體疾病抑制作用、或腎動脈硬化抑制作用(日本國專利第2782142號公報，J.Dairy Sci.1995,78:777－783，J.Dairy Sci.1995,78：1253－1257，Am.J.Clin.Nutr.1996,64：767－771)。此外，由於以抑制ACE而進行之腎衰竭之預防或治療之效果係如前述有限定性，故期望能有無關於抑制ACE之疾病的預防或是治療。

依據本發明，提供不依賴ACE抑制活性且具有腎臟絲球體疾病之抑制作用以及腎動脈硬化之抑制作用的化合物或組成物。

此外，依據本發明，提供包含上述化合物或組成物之腎衰竭的預防劑、與可期待預防腎衰竭之效果的功能性食品。

依據本發明，提供包含將上述化合物或組成物投予於對象者之抑制腎臟絲球體疾病的方法、以及抑制腎動脈硬化的方法。

因此，依據本發明，提供包含將上述化合物或組成物投予於對象者之預防腎衰竭的方法。

此外，本發明係亦為在製造用以抑制腎臟絲球體疾病以及抑制腎動脈硬化的醫藥時使用上述化合物或組成物。尤其，本發明係亦為在製造用以預防腎衰竭之醫藥時使用上述化合物或組成物。

本發明人等發現具有所謂Xaa Pro Pro(Xaa為任意的 天然胺基酸)之特定構造的三胜肽係具有抑制腎臟絲球體疾病、與抑制腎硬化之作用，而得以發明對預防腎衰竭有功效的醫藥以及功能性食品。其具體的內容係如以下所述。

本發明係提供包含Xaa Pro Pro作為有效成分之腎臟絲球體疾病及腎動脈硬化之抑制劑。

此外，本發明係提供具備上述抑制腎臟絲球體疾病以及腎動脈硬化之作用的腎衰竭預防劑。

此外，本發明係提供包含上述之腎臟絲球體疾病以及腎動脈硬化之抑制劑的功能性食品。

再者，本發明係提供包含將Xaa Pro Pro或含有Xaa Pro Pro 之組成物投予於對象者之抑制腎臟絲球體疾病以及腎動脈硬化的方法。

因此，本發明係亦提供包含將Xaa Pro Pro或含有Xaa Pro Pro之組成物投予於對象者之預防腎衰竭的方法。

再者，本發明係亦為在製造抑制腎臟絲球體疾病以及腎動脈硬化用之醫藥時使用Xaa Pro Pro或含有Xaa Pro Pro之組成物。尤其，本發明係亦為在製造預防腎衰竭用醫藥時使用Xaa Pro Pro或含有Xaa Pro Pro之組成物。

Xaa Pro Pro係宜為Val Pro Pro及/或Ile Pro Pro。

在本發明之其他的態樣中，有效成分Xaa Pro Pro係源自獸乳酪蛋白(casein)水解物或其濃縮物。

在本發明之另外的態樣中，有效成分Xaa Pro Pro係源自藉由屬於瑞士乳酸桿菌(Lactobacillus helveticus)種之菌使含有乳蛋白質之原料發酵所得之發酵物。

屬於瑞士乳酸桿菌種之菌係宜為瑞士乳酸桿菌CM4株(CCRC 910111)。

本發明之腎臟絲球體疾病以及腎動脈硬化之抑制劑，係包含如Xaa Pro Pro之構造的三胜肽作為有效成分。在此，所謂「劑」並非限定為藥劑者，而是指例如醫藥組成物或食品組成物等組成物、或者是例如食品添加劑等化合物。在本發明中，所謂「腎臟絲球體疾病以及腎動脈硬化之抑制劑」，係指具有壓抑與阻止腎臟絲球體疾病以及腎動脈硬化病變之進行的作用、或具有改善腎臟絲球體疾病以及腎動脈硬化病變的作用、或具有預防腎臟絲球體疾病以及腎動脈硬化症之效果的化合物或組成物。此外，本發明中，所謂「絲球體疾病」係指在腎臟之絲球體發生病變之疾病，在組織學上係已演變至可確認到絲球體萎縮、絲球體之荒廢、絲球體硬化、鮑氏囊之變化等之狀態。就具體的病名而言，可舉出例如微小變化型腎病症候群、局部絲球體硬化症、管內增殖性絲球體腎炎(亦即所謂急性腎炎)、IgA腎症(系膜增殖性絲球體腎炎)、膜性腎病、膜性增殖性絲球體腎炎、以及新月體形成性絲球體腎炎等。

本發明之有效成分Xaa Pro Pro之Xaa，可為任意的天然胺基酸。具體而言，可舉出Val Pro Pro(纈胺酸－脯胺酸－脯胺酸)、Ile Pro Pro(異白胺酸－脯胺酸－脯胺酸)、Ser Pro Pro(絲胺酸－脯胺酸－脯胺酸)、Leu Pro Pro(白胺酸－脯胺酸－脯胺酸)等，宜為Val Pro Pro、Ile Pro Pro，較宜為Val Pro Pro。此外，作為有效成分，亦可包含Val Pro Pro及Ile Pro Pro等1種以上的三胜肽Xaa Pro Pro之組合。

有效成分Xaa Pro Pro係可為有機化學性合成而成的三胜肽，亦可為源自天然的三胜肽。

就三胜肽Xaa Pro Pro之有機化學性合成法而言，可使用固相法(Boc法、Fmoc法)或液相法等一般性的方法，例如，亦可為使用島津製作所製之胜肽合成裝置(PSSM－8型)等胜肽自動合成裝置所合成者。關於胜肽合成之反應條件等，可根據該業者之技術常識，配合選擇的合成方法或期望的三胜肽Xaa Pro Pro而任意地設定適當的反應條件。

或者是，就源自天然者而言，可為源自獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物者，亦可為源自藉由所謂麴菌或乳酸菌等菌類使含有乳蛋白質之原料發酵所得之發酵物者。

在使用獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物、或是令含有乳蛋白質之原料藉由屬於瑞士乳酸桿菌種之菌發酵所得之發酵物時，除了本發明之有效成分的三胜肽Xaa Pro Pro以外亦可包含游離胺基酸，再者，於上述胜肽以及游離胺基酸之外，亦可包含市面販售之獸乳酪蛋白、乳蛋白質中通常所含有的脂質、灰份、碳水化合物、食物纖維、水分等，此外，亦可因應需要而將此等中適當之成分的一部分或全部去除。

本發明之有效成分Xaa Pro Pro亦可為源自獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物者，該水解物或其濃縮物為使用可得到Xaa Pro Pro(尤其是Val Pro Pro以及Ile Pro Pro)之酵素 群、並以使獸乳酪蛋白水解的方法或使獸乳酪蛋白藉由麴菌發酵的方法而獲得者。

就獸乳酪蛋白而言，可舉出例如牛乳、馬乳、山羊乳、羊乳等之酪蛋白，尤可適合使用牛乳酪蛋白。

使獸乳酪蛋白水解或發酵時之酪蛋白濃度，雖無特別限定，但為了有效率地生產獸乳酪蛋白分解物，以1至19重量%為佳。

就上述酵素群而言，可適宜舉出例如包含可切斷Xaa Pro Pro Xaa序列之羧基末端之Pro Xaa殘基間的胜肽酶之酵素群(X)。

酵素群(X)係以包含活性中心具有絲胺酸之絲胺酸型蛋白酶、或於活性中心具有金屬之金屬蛋白酶為佳。就金屬蛋白酶而言，可舉出中性蛋白酶I、中性蛋白酶II、以及白胺酸胺基胜肽酶等，從可使期望之水解物有效率地、且於短時間內、並更進一步以1階段反應獲得之觀點來看，以復包含此等酶之至少1種為佳。此外，就可切斷上述Pro Xaa序列之胜肽酶而言，以等電點顯示為酸性區之酵素為佳。

就上述酵素群或酵素群(X)而言，可舉出例如米麴菌(Aspergillus oryzae)等源自麴菌的酵素群。如此的酵素群，係可舉出以適當的培養基培養菌體並以水萃取所生產之酵素而得的酵素群等，尤其是宜舉出源自米麴菌之酵素群中之等電點顯示為酸性區的酵素群。

就源自米麴菌之酵素群而言，可利用市面販售之 商品，例如可舉出Sumizyme FP、LP、或MP(以上，登錄商標，新日本化學(股)製)；Umamizyme(登錄商標，天野Enzyme(股)製)；Sternzyme B11024、PROHIDROXY AMPL(以上，商品名，樋口商會股份公司製)；Orientase ONS(登錄商標，阪急BIOINDUSTRY(股)製)；Denatyme AP(登錄商標，長瀨生化學公司製)等，尤以使用Sumizyme FP(登錄商標，新日本化學(股)製)為佳。

在使用此等市面販售之酵素群時，通常設定為最佳條件，但可因應所使用的酵素群而以可獲得上述酪蛋白水解物的方式來適當變更條件(例如使用酵素量和反應時間等)而進行。

在水解上述獸乳酪蛋白時之酵素群的添加量，係例如在溶解有獸乳酪蛋白之水溶液中，使酵素群/獸乳酪蛋白成為重量比在1/1000以上，宜成為在1/1000至1/10，尤宜成為在1/100至1/10，更宜成為在1/40至1/10之比例的量。

反應條件係可因應所使用之酵素群並以能獲得目的之酪蛋白水解物的方式來適當選擇，但溫度通常為25至60℃，宜為45至55℃；pH為3至10，宜為5至9，尤宜為5至8。此外，酵素反應時間通常為2至48小時，宜為7至15小時。

酵素反應的結束，係可藉由使酵素失去活性來進行，通常可在60至110℃令酵素失去活性，而使反應停止。

酵素反應停止後，以因應需要而將沉澱物藉由離心分 離去除或各種過濾器處理來去除為佳。

此外，因應需要，可從所獲得的水解物去除具有苦味或臭味的胜肽。此等苦味成分或臭味成分之去除，係可使用活性碳或疏水性樹脂等進行。例如，可藉由在所得之水解物中，相對於已使用之酪蛋白量添加活性碳1至20重量%，並反應1至10小時而實施。已使用之活性碳的去除，係可藉由離心分離或膜處理操作等公知的方法進行。

以如此方式所得之包含獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物的反應液，可直接添加至飲料等液體製品而利用作為功能性食品。此外，為了提高獸乳酪蛋白水解物之泛用性，亦可在濃縮上述反應液後，予以乾燥而製成粉末的形態。

獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物所含有之Xaa Pro Pro的含有比例，係相對於獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物中之胜肽以及游離胺基酸之合計量，通常為1重量%以上，宜為1至5重量%。藉由使該含有比例成為1重量%以上，可期待更高的功效。此外，獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物中所含之Ile Pro Pro或Val Pro Pro的含有比例，係相對於獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物中之胜肽以及游離胺基酸之合計量，不論是各別單獨為0.3重量%以上，或Ile Pro Pro以及Val Pro Pro之合計量為0.3重量%以上，皆可期待極高的功效。再者，在Ile Pro Pro以及Val Pro Pro分別含有0.3重量%以上時，可期待更高的功效。

此外，本發明之有效成分Xaa Pro Pro，係可為源自藉由屬於瑞士乳酸桿菌種之菌使含有乳蛋白質之原料發酵所 得之發酵物者。

屬於瑞士乳酸桿菌種之菌，係以單獨使用瑞士乳酸桿菌種於發酵為佳，但在不損及本發明之期望效果的範圍內，亦可包含其他乳酸菌等。

就屬於瑞士乳酸桿菌種之菌而言，以可大量生產Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro之蛋白酶生產菌為佳。例如，宜為根據以Twining等人之方法(Twining,S.Anal.Biochem.143 3410(1984))作為基礎之Yamamoto等人之方法(Yamamoto,N.等人J.Biochem.(1993)114,740)而測定之U/OD590的值顯示為400以上的菌株。

就此等適宜的菌株而言，可舉出例如瑞士乳酸桿菌CM4株(通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所，日本國茨城縣筑波市東1丁目1番3號、郵遞區號305(現今為，產業技術總合研究所特許生物寄託中心，日本國茨城縣筑波市東1－1－1筑波中心中央第6，郵遞區號305－8566)，寄存號碼：FERM BP－6060，寄存日1997.8.15)(中華民國87年9月16日寄存於食品工業發展研究所，寄存號碼CCRC910111)(以下稱為CM4株)。此CM4株係依據專利手續上關於微生物寄存之國際性承認的布達佩斯條約登錄上述寄存號碼，且此菌株已獲得專利。

藉由屬於瑞士乳酸桿菌種之菌使含有乳蛋白質之原料發酵所得之發酵物，係可藉由在含有乳蛋白質之原料中添加含有屬於瑞士乳酸桿菌種之菌株的發酵乳菌元(starter)，並適當選擇發酵溫度等發酵條件予以發酵而可獲 得。

此外，亦可將以如此方式獲得之發酵物的濃縮物等藉由凍結乾燥、噴霧乾燥等而作為粉末使用。

屬於瑞士乳酸桿菌種之菌，係以經預先進行前培養而作為充分高活性之菌元使用為佳。起始菌數係宜為10⁵ 至10⁹ 個/ml左右。

藉由屬於瑞士乳酸桿菌種之菌使含有乳蛋白質之原料發酵所得之發酵物，例如，在利用作為特定保健用食品等功能性食品時，為了使味道良好、偏好性良好，亦可於上述屬於瑞士乳酸桿菌種之菌株中併用酵母以進行發酵。酵母的菌種並無特別限定，例如，適合舉出啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等酵母菌屬酵母等。酵母的含有比例，係可因應其目的而適當選擇。

就含有乳蛋白質之原料而言，例如，可舉出牛乳、馬乳、羊乳、山羊乳等動物乳；以及豆漿等植物乳；還有為此等乳類之加工乳的脫脂乳、還原乳、奶粉、煉乳等，其中以牛乳、豆漿、以及此等乳類之加工乳為佳，而以牛乳或牛乳之加工乳為尤佳。

乳之固形物濃度並無特別限定，但例如在使用脫脂乳的情形下之無脂乳固形物濃度係一般為3至15重量%左右，就生產性而言以6至15重量%為佳。

上述發酵係通常藉由靜置或攪拌發酵，例如可藉由以發酵溫度為25至45℃、宜為30至45℃，發酵時間為3至72小時、宜為12至36小時，在乳酸酸度變成1.5%以 上的時間點停止發酵的方法來進行。

藉由屬於瑞士乳酸桿菌種之菌使含有乳蛋白質之原料發酵所得之發酵物中所含之Xaa Pro Pro(宜為Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro)的含有比例，係以在該發酵物之凍結乾燥物100g中換算為10mg以上為佳，較宜為在15mg以上。

就本發明之腎臟絲球體疾病以及腎動脈硬化之抑制劑的投予量或攝取量而言，每1日，在人的情形，係為含有有效成分Xaa Pro Pro(宜為Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro)一般為10μg至10g(宜為1mg至5g、更宜為3mg至1g左右)的用量，亦可於1日分數次投予或攝取。

腎臟絲球體疾病以及腎動脈硬化之抑制劑之投予或攝取期間，可考慮投予或攝取之人或動物的年齡、或者是相對於該人或動物之腎衰竭危險因子的環境等進行各種調整，例如一般可為1日以上，宜為7日至365日間。

此外，本發明之腎衰竭預防劑係將上述之三胜肽作為有效成分。

就本發明之腎衰竭預防劑之投予量或攝取量而言，每1日，在人的情形，為含有有效成分Xaa Pro Pro(宜為Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro)一般為10μg至10g(宜為1mg至5g、更宜為3mg至1g左右)的用量，亦可於1日分數次投予或攝取。

腎衰竭預防劑之投予或攝取期間，可考慮投予或攝取之人或動物的年齡、或者是相對於該人或動物之腎衰竭危險因子的環境等進行各種調整，例如一般可為1日以上， 宜為7日至365日間。

本發明之腎臟絲球體疾病以及腎動脈硬化之抑制劑、以及腎衰竭之預防劑的投予或攝取方法，係以經口方式為佳。

在本發明之腎臟絲球體疾病以及腎動脈硬化之抑制劑、以及腎衰竭之預防劑作為醫藥使用時的形態，係可為經口投予用之製劑的形態。例如，可舉出錠劑、丸劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、微膠囊、散劑、粒劑、液劑等。

在製造作為醫藥時，例如，可因應適當的需要，使用製藥上容許的載體、佐劑(ajduvant)、賦形劑、補形劑、防腐劑、安定劑、結合劑、pH調節劑、緩衝劑、增黏劑、膠化劑、保存劑、抗氧化劑等，以在一般經承認之製劑投予所要求之單位用量形態進行製造。

本發明之食品係含有本發明之腎臟絲球體疾病以及腎動脈硬化之抑制劑作為有效成分，可作為具有例如腎臟絲球體疾病以及腎動脈硬化之抑制作用、以及預防腎衰竭等效能之特定用保健食品等功能性食品。

為了獲得如此功效之攝取量，若有鑑於日常性、連續性、或斷續性地長期攝取食品(例如功能性食品)在人的情形，就每1日之有效成分Xaa Pro Pro的量、或Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro的量而言，一般為10μg至10g、宜為1mg至5g、更宜為3mg至1g左右，因應每1日的攝取次數，可能使食品(例如功能性食品)之每1次的攝取量較上述量更低。

在直接使用含有有效成分Xaa Pro Pro之獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物時，在人的情形，每1天一般以攝取該水解物或其濃縮物1mg至100g，尤以100mg至10g左右為佳。

在直接使用含有有效成分Xaa Pro Pro之發酵物的凍結乾燥物時，在人的情形，將該發酵物之凍結乾燥物就乾燥量而言，每1天一般以攝取1至100g，尤以2至50g左右為佳。

本發明之食品(例如功能性食品)的攝取期間並無特別限定，雖以長期攝取為佳，但為了獲得上述功效，例如一般可為1日以上，宜為7日至365日間。

本發明之食品(例如功能性食品)係包含含有本發明之有效成分Xaa Pro Pro(宜為Val Pro Pro及/或Ile Pro Pro)之腎臟絲球體疾病以及腎動脈硬化之抑制劑，並例如可將以上述方式所得之獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物、或含有乳蛋白質原料之發酵物，直接、或者是製成粉末狀或顆粒狀而添加於各種食品中。此外，因應需要，亦可添加瑞士乳酸桿菌以外之乳酸菌的發酵物、或食品所使用之其他成分，例如糖類、蛋白質、脂質、維生素、礦物質、加味劑(flavor)，例如各種碳水化合物、脂質、維生素類、礦物質類、甜味料、香料、色素、質地(texture)改進劑等、或此等之混合物等添加物，以改善營養之均衡或風味等。

本發明之食品(例如功能性食品)係可為固形物、膠狀物、液狀物之任一形態，例如，可舉出乳酸菌飲料等發酵 乳製品、各種加工飲食品、乾燥粉末、錠劑、膠囊劑、粒劑等，進一步地可為各種飲料、優格、流動食物、果凍、糖果、蒸煮袋食品(retort food)、錠型糖果、小甜餅(cookie)、蜂蜜蛋糕(castella)、麵包、餅乾(biscuit)、巧克力等。

以下使用實施例更詳細地說明本發明，但本發明的範圍不限於實施例。

(實施例) [胜肽合成例]

藉由以下所示之有機化學合成法(Fmoc法)，合成本發明之有效成分Ile Pro Pro及Val Pro Pro。合成係使用島津製作所製之胜肽自動合成裝置(PSSM－8型)以固相法進行。

就固相載體而言，使用為2－氯三苯甲基(2－Chlorotrityl)型之聚苯乙烯樹脂並結合有以茀基甲氧羰基(以下簡稱為Fmoc)保護胺基之脯胺酸的樹脂50mg(島津製作所社製 登錄商標SynProPep Resin)。依照上述胺基酸序列，使以Fmoc基保護胺基之Fmoc－Ile、Fmoc－Pro、以及Fmoc－Val各100μmol，按照通常方法，依照胜肽序列依序反應而獲得胜肽結合樹脂。

接著將此胜肽結合樹脂懸濁於1ml之反應液A(10容量%乙酸、10容量%三氟乙醇、80容量%二氯甲烷)，於室溫反應30至60分鐘並將胜肽從樹脂切離後，以玻璃過濾器過濾反應液A。減壓去除濾液的溶劑後，立刻添加1ml的反應液B(82.5容量%三氟乙酸、3容量%乙基甲基硫化 物(ethyl methyl sulfide)、5容量%純水、5容量%苯基甲基硫醚(thioanisole)、2.5容量%乙二硫醇、2容量%硫酚)，於室溫反應6小時並去除側鏈保護基。於其中加入無水乙醚10ml令胜肽沉澱，以3000迴轉離心5分鐘進行分離。以無水乙醚洗淨沉澱物數次後，噴吹氮氣而乾燥。將如此獲得之未精製之合成胜肽，全部溶解於0.1N鹽酸水溶液2ml後，以使用C18之逆層管柱的HPLC，依照以下條件精製。

泵：型號L6200智能泵(intelligent pump，日立製作所)；檢測機：以型號L4000UV檢測器(日立製作所)檢測215nm之紫外線吸收；管柱：μ Bondasphere5μC18(Waters公司製)；溶出液：A液為0.1重量%TFA水溶液、B液為含有0.1重量%TFA之乙腈；(B/A+B)×100%：0→40%(60分鐘)；流速：1ml/分鐘。分次取出顯示最大吸收之溶出部分，藉由將其乾燥凍結而分別獲得5.7mg、6.5mg的目的之合成胜肽Ile Pro Pro及Val Pro Pro。藉由全自動蛋白質一級結構分析裝置(型號PPSQ－10，島津製作所製)，從胜肽的N末端開始分析該精製胜肽，進一步地以胺基酸分析裝置(型號800系列，日本分光公司製)分析，可確認到結果係如設計。

[獸乳酪蛋白水解物之調製例]

將源自牛乳之酪蛋白(日本NZMP公司製)1g加入至經調整為約80℃之蒸餾水99g中並充分地攪拌後，添加1N氫氧化鈉(和光純藥公司製)溶液成為pH7.0，此外將溫度調 整為20℃，來調製基質溶液。

在所得之基質溶液中，以酵素/酪蛋白之重量比成為1/25的方式添加源自米粉狀麴菌之至少包含金屬蛋白酶、絲胺酸蛋白酶、中性蛋白酶I、中性蛋白酶II、以及白胺酸胺胜肽酶的市售酵素(登錄商標「Sumizyme FP」，新日本化學工業公司製)，於50℃反應14小時。接著，以110℃進行10分鐘的高壓釜處理，使酵素失去活性，獲得酪蛋白酵素分解物溶液。接著，使所得之酵素分解物溶液藉由噴式乾燥器乾燥，調製成粉末。

進行所得粉末中所含有成分之分析。蛋白質係以凱耳達(Kjeldahl)法測定，胺基酸係以胺基酸分析裝置測定。此外，將自該蛋白質量減去胺基酸的量作為胜肽量。再者，分別以酸分解法測定脂質、以直接灰化法測定灰分、以及以常壓加熱乾燥法測定水分。另外，將自100%減去各成分的殘餘量作為碳水化合物量。其結果，胺基酸為35.8重量%，胜肽為45.7重量%，水分為6.6重量%，脂質為0.2重量%，灰分為4.1重量%，碳水化合物為7.6重量%。

<胜肽構成胺基酸之測定>

使上述調製的粉末溶解於適量的蒸餾水，使用自動胜肽分析機(商品名PPSQ－10(股)島津製作所製)進行解析，調查在粉末中之自N末端側依序有何種胺基酸。另外，自動胜肽分析機不會檢測游離胺基酸。

此外，第5殘基之胺基酸的合計為120pmol，第6殘基之胺基酸的合計為100pmol。依據此等結果，判明上述 粉末中所含有之胜肽幾乎皆為二胜肽或三胜肽。此外，第2殘基之胺基酸為Pro之胜肽的比率係顯著地上升為49.5%。再者，第3殘基之胺基酸為Pro之胜肽的比率也高達29.8%。

因此，上述粉末中含有大量Xaa Pro Pro，可推測此等胜肽係對於生體內之蛋白酶所致的酵素分解作用為抵抗性高的胜肽。

<酵素分解物中所含有之胜肽的測定>

對於上述酵素分解物之粉末，使用各種化學合成標準胜肽，依照通常方法，求得該粉末所含有之顯示於表1的三胜肽量。將結果顯示於表1。

此外，在以蒸餾水稀釋溶解有上述粉末之溶液中的胜肽以及游離胺基酸量為8.15mg/ml，胜肽量為4.57 mg/ml，該胜肽中之Xaa Pro量為514.5μg，因此，相對於粉末中之胜肽以及游離胺基酸的合計量，Xaa Pro的比率為6.3重量%，再者，由於該胜肽中的Xaa Pro Pro量為116.5μg，故相對於粉末中之胜肽以及游離胺基酸的合計量，Xaa Pro Pro的比率確認為1.4重量%。

[CM4發酵乳飼料之調製例]

使用藉由CM4株使含有乳蛋白質的原料發酵所得之發酵乳，調製含有本發明之有效成分Xaa Pro Pro之動物飼料。

用蒸餾水以成為固形率9%(w/w)的方式溶解市面販售之脫脂奶粉，以高壓釜進行105℃、10分鐘的高溫加熱殺菌後，冷卻至室溫，接種3%(v/w)之CM4株菌元發酵液(菌數5×10⁸ 個/ml)，以37℃、24小時在靜置狀態使其發酵而獲得CM4發酵乳。

將所得之CM4發酵乳進行80℃瞬間加溫殺菌(亦即加溫至80℃後立即降溫之殺菌方式)後，藉由凍結乾燥而獲得粉末。將所得之凍結乾燥粉末與市面販售之粉末飼料(商品名「CE－2」，日本CLEA股份公司製)以質量比10：90混合，製成固形飼料，並作為CM4發酵乳飼料。在此飼料中，含有源自CM4發酵乳之Val Pro Pro 34.1mg/kg以及Ile Pro Pro 17.1mg/kg。

[試驗1：Val Pro Pro(VPP)之腎臟絲球體疾病以及腎臟動脈硬化的抑制效果]

為了評估三胜肽Val Pro Pro(VPP)之腎臟絲球體疾病以及腎動脈硬化的抑制效果，對於腎臟絲球體病變出現頻率、及中小動脈壁之肥厚度進行試驗。

以9至12隻為一群共計3群的7週齡Wistar系雄大鼠(日本SLC股份公司)進行試驗。在一週的馴化飼養後，令此等大鼠在8週內自由攝取以1g/L之濃度溶解有 L－NAME(Sigma公司製)的飲用水、分別以1g/L與0.3g/L之濃度溶解有L－NAME與VPP的飲用水、以及分別以1g/L與0.5mg/L之濃度溶解有L－NAME與為血管緊縮素轉換酵素(ACE)抑制劑之伊那拉普利的飲用水。在此，伊那拉普利之投予量係以使其ACE抑制活性與VPP成為相等的方式設定。

使大鼠於二乙醚麻醉下放血死亡，取出腎臟後，以10%中性緩衝福馬林液固定。從經固定之腎臟平行地於短軸以包含腎乳頭前端的方式進行切下，製作組織片。將組織進行石臘包埋後藉由切片法(microtomy)進行薄切為2.0至2.5μm之厚度。對各大鼠製作2至5個切片。將經薄切之切片進行蘇木紫．伊紅染色(hematoxylin－eosin staining)、或過碘酸六亞甲四胺銀染色(periodic acid methenamine silver staining，亦即PAM染色)。組織病理學檢查係依照Foglieni等人的方法(Chiara Foglieni,et al.,"Protective effect of EDTA preadministration on renal ischemia" BMC Nephrology 2006,7：5，[on line]，2006年3月15日，BioMed Central Ltd，http：//www.biomedcentral.com/bmcnephrol/)，由與試驗無關之病理學者在未告知樣品名之情形下進行。

依照榎本等人之著作(榎本真、林裕造、田中壽子編「實驗動物之病理組織」SOFT SIENCE公司，p.380至396)所記載之絲球體病變的定義，在顯微鏡的觀察下，將可確認到萎縮性病變、絲球體之荒廢、絲球體硬化、鮑氏囊之變化等之絲球體認定為有絲球體病變者。萎縮性病變係指因 絲球體之萎縮而使絲球體與鮑氏囊之大小之比率被改變的狀態，絲球體之荒廢係指絲球體之微血管腔消失而喪失功能的狀態，絲球體硬化係指可確認到系膜基質(mesangial matrix)之增加且不伴隨膠原纖維之增生的狀態，鮑氏囊之變化係指可確認到有上皮細胞之肥大或者是攝入脂肪滴或蛋白粒子的狀態。在1個切片之整體，將此等絲球體病變之出現頻率評分化為0至3，並決定各個體之評分。將以如此方式決定之各個體的評分進行統計處理，以決定各群的評分。

評分0：在絲球體病變為1至2個以內之由生理性變化所造成的情形。

評分1：在觀察到1至2處絲球體之病灶區域，為局部性且小範圍的情形。

評分2：在觀察到2至4處絲球體之病灶區域，為中範圍的情形

評分3：在觀察到絲球體之病灶區域為5處以上，並可確認為達廣範圍的情形

在此，病灶區域係指在1個切片之整體，於一定範圍可確認到有複數的病變。

存在於腎皮質之中小動脈壁的肥厚度，亦與絲球體病變之觀察相同地藉由組織病理學檢查來進行評估。在顯微鏡的觀察下，將在1個切片之整體可確認之所有的動脈、與同週齡之正常大鼠標本幾乎在相同位置的動脈相比較，並將中小動脈壁之肥厚度評分化為下述之0至3，決定各 個體之評分。

評分0：在1個切片之整體，只確認到與正常大鼠相同肥厚的情形

評分1：與正常大鼠相比，輕度或輕頻率地可確認到有肥厚的情形

評分2：與正常大鼠相比，中度或中頻率地可確認到有肥厚的情形

評分3：與正常大鼠相比，高度或高頻率地可確認到有肥厚的情形

將所得結果顯示於第1圖以及第2圖。如第1圖所示，與僅給予L－NAME的群集相比，由於在給予VPP時之中小動脈壁的肥厚度減少，故表示VPP有抑制腎動脈硬化的效果。再者，如第2圖所示，因VPP之攝取而使絲球體之病變的出現頻率受到抑制，故顯示出VPP之腎臟絲球體疾病的抑制效果。因此，由於VPP不但抑制絲球體病變之出現，同時並抑制中小動脈壁的肥厚，故可判明其對於預防腎衰竭為有效。此外，由於在伊那拉普利無法確認腎動脈硬化抑制效果與絲球體病變抑制效果，故可確認本效果並非因抑制ACE而造成者。

[試驗2：Ile Pro Pro(IPP)之腎臟絲球體疾病以及腎臟動脈硬化的抑制效果]

為了對於三胜肽Ile Pro Pro(IPP)亦評估其腎臟絲球體疾病以及腎臟動脈硬化的抑制效果，而進行腎臟病態試驗。

以9至12隻為一群共計3群的7週齡Wistar系雄大 鼠(日本SLC股份公司)進行試驗。在一週的馴化飼養後，令此等大鼠在8週內自由攝取以1g/L之濃度溶解有L－NAME(Sigma公司製)的飲用水、分別以1g/L與0.3g/L之濃度溶解有L－NAME與IPP的飲用水、以及分別以1g/L與0.5mg/L之濃度溶解有L－NAME與為血管緊縮素轉換酵素(ACE)抑制劑之伊那拉普利的飲用水。在此，伊那拉普利之投予量係以使其ACE抑制活性與IPP成為相等的方式設定。

令大鼠於二乙醚麻醉下放血死亡，取出腎臟後，以10%中性緩衝福馬林液固定。從經固定之腎臟平行地於短軸以包含腎乳頭前端的方式進行切下，製作組織片。將組織進行石臘包埋後藉由切片法進行薄切為2.0至2.5μm之厚度。對各大鼠製作2至5個切片。將經薄切之切片進行蘇木紫．伊紅染色或過碘酸六亞甲四胺銀染色(PAM染色)。組織病理學檢查係依照Foglieni等人的方法(Chiara Foglieni,et al.,"Protective effect of EDTA preadministration on renal ischemia" BMC Nephrology 2006,7：5，[on line]，2006年3月15日，BioMed Central Ltd，http：//www.biomedcentral.com/bmcnephrol/)，由與試驗無關之病理學者在未告知樣品名之情形下進行。

在顯微鏡的觀察下，將可確認到有萎縮性病變、絲球體之荒廢、絲球體硬化、鮑氏囊之變化等之情形認定為有絲球體病變者。各種絲球體病變的定義係依照榎本等人之著作(榎本真、林裕造、田中壽子編「實驗動物之病理組織」 SOFT SIENCE社，p.380至396)之記載，萎縮性病變係指因絲球體之萎縮而使絲球體與鮑氏囊之大小之比率被改變的狀態，絲球體之荒廢係指絲球體之微血管腔消失而喪失功能的狀態，絲球體硬化係指可確認到系膜基質之增加且不伴隨膠原纖維之增生的狀態，鮑氏囊之變化係指可確認到有上皮細胞之肥大或者是攝入脂肪滴或蛋白粒子的狀態。在1個切片之整體將此等絲球體病變之出現頻率評分化為0至3，並決定各個體之評分。

評分0：在絲球體病變為1至2個以內之由生理性變化所造成的情形。

評分1：在觀察到1至2處絲球體之病灶區域，為局部且小範圍的情形。

評分2：在觀察到2至4處絲球體之病灶區域，為中範圍的情形

評分3：在觀察到絲球體之病灶區域為5處以上，並可確認為達廣範圍的情形

在此，病灶區域係指於病理檢查所見上，在1個切片之整體，於一定範圍可確認到有複數個的病變。

存在於腎髓質之腎門部動脈壁的肥厚度、以及存在於腎皮質之中小動脈壁的肥厚度，亦與絲球體病變相同地藉由組織病理學檢查進行評估。在顯微鏡的觀察下，將在1個切片之整體可確認之所有的動脈，與同週齡之正常大鼠標本幾乎在相同位置的動脈加以比較，並將腎門部動脈壁之肥厚度以及中小動脈壁之肥厚度評分化為下述之0至 3，決定各個體之評分。

評分0：在1個切片之整體，只確認到與正常大鼠相同肥厚的情形

評分1：與正常大鼠相比，輕度或輕頻率地可確認到有肥厚的情形

評分2：與正常大鼠相比，中度或中頻率地可確認到有肥厚的情形

評分3：與正常大鼠相比，高度或高頻率地可確認到有肥厚的情形

將此等絲球體病變、與腎門部動脈壁之肥厚度以及中小動脈壁之肥厚度分別評分化，並將在3個項目全部之評分為1以上者決定為病態，從病態與非病態之大鼠的數量進行依據概度比檢定之比較。

依據此等之結果，顯示IPP亦能抑制絲球體以及腎動脈之病態的產生，因此，判明其對預防腎衰竭為有效。此外，與試驗1相同，從以伊那拉普利無法確認效果來看，可確認本效果並非由抑制ACE而造成者。

本發明之腎臟絲球體疾病以及腎動脈硬化之抑制劑， 即使在無法確認血管緊縮素轉換酵素(ACE)抑制劑之抑制作用的情形下，亦顯示有效性，因此，可作為非因ACE抑制活性所引起之腎衰竭的預防用及/或治療用之醫藥，尤其是作為預防劑係極為有用。此外，由於有效成分係源自於食品等之天然存在的三胜肽，故可期待能提供副作用的顧慮小且具有高效力之藥物。

此外，提供一種功能性食品，其係藉由將本發明之腎臟絲球體疾病以及腎動脈硬化之抑制劑使用或添加於飲料或食品中，而可安全且日常性地持續攝取，並可期待預防腎衰竭之效果。

(參考文獻)

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6. Am.J.Clin.Nutr.1996,64：767－771

第1圖係顯示對試驗1之Val Pro Pro(VPP)之大鼠腎臟中小動脈壁的肥厚抑制效果進行試驗的結果。以L－NAME投藥群為一群11隻、L－NAME以及伊那拉普利投藥群為一群9隻、L－NAME以及VPP投藥群為一群12隻進行試驗，圖表以平均值±標準誤差的方式表示。藉由Mann－Whitney檢定進行比較。圖中的記號(^＊ )係表示顯著 差(p<0.05)。

第2圖係顯示對試驗1之Val Pro Pro(VPP)之大鼠腎臟絲球體病變之出現抑制效果進行試驗的結果。藉由Mann－Whitney檢定進行比較。圖中的記號(^＊ )係表示顯著差(p<0.05)。

<110> 可爾必思股份有限公司<120> 腎衰竭預防劑<130> 0P08032－1 <150> JP2007－81638 <151> 2007－03－27 <160> 1 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 胜肽之辨認序列<220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa可為任意之天然胺基酸<220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa可為任意之天然胺基酸<400> 1

Claims (7)

1. 一種Val Pro Pro及/或Ile Pro Pro之用途，係用於製造不依賴血管緊縮素轉換酵素(ACE)抑制活性且具有腎臟絲球體疾病之抑制作用以及腎動脈硬化之抑制作用之抑制劑。
2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中，Val Pro Pro及/或Ile Pro Pro係源自獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物。
3. 如申請專利範圍第2項之用途，其中，獸乳酪蛋白水解物係為使獸乳酪蛋白藉由麴菌發酵而得之發酵物。
4. 如申請專利範圍第2項之用途，其中，獸乳酪蛋白水解物係為使獸乳酪蛋白藉由源自麴菌之酵素分解而得之分解物。
5. 如申請專利範圍第4項之用途，其中，源自麴菌之酵素係為源自米麴菌(Aspergillus oryzae)之酵素。
6. 如申請專利範圍第1項之用途，其中，Val Pro Pro及/或Ile Pro Pro係源自使含有乳蛋白質之原料藉由屬於瑞士乳酸桿菌種之菌發酵所得之發酵物者。
7. 如申請專利範圍第6項之用途，其中，屬於瑞士乳酸桿菌種之菌係為瑞士乳酸桿菌CM4株(CCRC 910111)。