TWI412372B - 心衰竭預防劑 - Google Patents

Description

心衰竭預防劑

本發明係有關具有心臟壁肥厚抑制作用的有效成分、包含該有效成分之心肥大預防劑及心不全預防劑；以及含有該有效成分之可期待心肥大及心不全之預防效果的功能性食品。

此外，本發明係有關抑制心臟壁肥厚的方法。再者，本發明係有關於預防心肥大以及心不全的方法。

近年來，在一部分的國家中具有被認為會引起心臟疾病之吸煙、高血壓、高血糖、高血脂症等危險因子的人變多，心衰竭患者數有增加的傾向。此外，此等之病狀不只侷限於人類，在狗、貓、其他伴侶動物或寵物動物等與人類有密切關係的動物也有增加的傾向。

因心衰竭之病狀、分類、過程係為各式各樣，而無法簡單地定義，不過可大致區分為收縮期心衰竭與舒張期心衰竭兩大類型，也有此2種同時發生的情形。收縮期心衰竭係由於心臟變得無法正常地收縮而引起。心臟雖將血液吸入，但由於心肌變得衰弱，無法將充滿的血液充分地壓出，其結果使送到全身與肺的血液量變少，而心臟，尤其是左心室變得肥大。另一方面，舒張期心衰竭係由於心臟隔壁變硬變厚，心臟變得無法充分地儲存血液而發病。其結果，血液積蓄在左心房內或肺的血管內，會引起鬰血。如此，一般所謂之心衰竭係指由於心臟的泵功能衰竭而使 心臟變得無法送出充分量的血液，並且，因心衰竭而會產生血流量的減少、或血液滯留於肺中等令心臟功能更加下降之其他變化。

就導致心衰竭之原發病症而言，可舉出例如因高血壓、大動脈狹窄症等造成之壓力負載的增大以及瓣膜症等造成之容量負載的增大等而造成的心臟壁肥厚之心肥大。另一方面，作為在心肌梗塞發作後之損傷組織中的自動性功能恢復反應，也有形成心臟壁肥大的情形。此外，若發生心肌症等原因不明之心肌障礙也會造成心臟壁肥大。若持續對心臟之機械性負載則會造成心肌收縮力漸漸降低而使心功能下降，從而導致心室性心律不整、心臟缺血、冠狀動脈疾病、鬰血性心衰竭。

從此等事實來看，具有心臟壁肥厚抑制作用的化合物，係在心肥大與心衰竭之預防及治療為有用。

就心臟壁肥厚改善的方法而言，例如，在由高血壓等造成心肥大時，有因治療其原因所在之高血壓而使心臟壁肥厚亦被改善的情形，但其作用非可滿足者，而且有降壓劑完全無效果者(Am J Hypertens.1997 Aug；10(8)：913至20)。此外，即使在高血壓被改善時，也有許多心臟壁肥厚以沒有改善的狀態而殘留的情形，在如此的情形下，依舊有心衰竭發作的危險性。

就對於心衰竭治療有效之藥劑而言，作為可阻礙從血管緊縮素I轉換成具有升壓作用之血管緊縮素II的酵素(亦即，血管緊縮素轉換酵素；ACE)之物質、且具有降 壓作用之血管緊縮素轉換酵素抑制劑(ACEI)，例如可舉出伊那拉普利(enalapril)。此外，已有報告指出降壓劑係在降低血壓的同時亦改善腎障礙之進展情形(J.Clin.Invest, 77,1993－2000,1986)。可是在另一方面，對於從各種原發疾病誘發之心衰竭，ACE抑制劑並非一定對所有的病症有效，相反地，被指出亦有伴隨降壓而造成急性腎衰竭的危險，故必須慎重地投予(最新醫學，48：1404至1409,1993)。亦即，降壓劑不僅在心衰竭的預防方面為不充分，反而還有誘發腎衰竭的可能性。

另一方面，有報告指出源自酪蛋白(casein)等食品素材之胜肽具有ACE抑制活性，此等具有血壓降低作用為已知，但未直接顯示是否具有心臟壁肥大抑制作用(日本國專利第2782142號公報，J.Dairy Sci.1995,78：777－78，J.Dairy Sci.1995,78：1253－1257，Am.J.Clin.Nutr.1996,64：767－771)。此外，以ACE抑制而進行之心衰竭之預防或治療之效果係如前述有限定性，因此，期望能有無關於ACE抑制之疾病的預防或是治療。

依據本發明，提供不依賴ACE抑制活性且具有心臟壁肥厚抑制作用的化合物或組成物。

再者，依據本發明，提供包含上述化合物或組成物之心衰竭預防劑。

此外，依據本發明，提供包含上述化合物或組成物並且可期待心衰竭預防效果的功能性食品。

再者，依據本發明，提供包含將上述化合物或組成物投予於對象者之抑制心臟壁肥厚的方法。

此外，依據本發明，提供包含將上述化合物或組成物投予於對象者之預防心衰竭的方法。

此外，本發明係亦為在製造用以抑制心臟壁肥厚的醫藥時使用上述化合物或組成物。尤其，本發明係亦為在製造心肥大預防用醫藥時使用上述化合物或組成物。此外，本發明係亦為在製造心衰竭預防用醫藥時使用上述化合物或組成物。

本發明人等發現具有所謂Xaa Pro Pro(Xaa為任意的天然胺基酸)之特定構造的三胜肽係具有心臟壁肥厚抑制作用，而得以發明對心衰竭之預防有功效的醫藥以及功能性食品。其具體的內容係如以下所述。

本發明係提供包含Xaa Pro Pro作為有效成分之心臟壁肥厚抑制劑。

此外，本發明係提供具備上述之心臟壁肥厚抑制作用的心肥大預防劑。

此外，本發明係提供具備上述之心臟壁肥厚抑制作用的心衰竭預防劑。

此外，本發明係提供包含上述之心臟壁肥厚抑制劑的功能性食品。

本發明係提供包含將Xaa Pro Pro或含有Xaa Pro Pro之組成物投予於對象者之抑制心臟壁肥厚的方法。

此外，本發明係亦提供包含將Xaa Pro Pro或含有Xaa Pro Pro之組成物投予於對象者之預防心肥大的方法。

此外，本發明係亦提供包含將Xaa Pro Pro或含有Xaa Pro Pro之組成物投予於對象者之預防心衰竭的方法。

再者，本發明係亦為在製造抑制心臟壁肥厚的醫藥時使用Xaa Pro Pro或含有Xaa Pro Pro之組成物。尤其，本發明係亦為在製造心肥大預防用醫藥時使用Xaa Pro Pro或含有Xaa Pro Pro之組成物。此外，本發明係亦為在製造心衰竭預防用醫藥時使用Xaa Pro Pro或含有Xaa Pro Pro之組成物。

Xaa Pro Pro係宜為Val Pro Pro及/或Ile Pro Pro。

在本發明之其他的態樣中，有效成分Xaa Pro Pro係源自獸乳酪蛋白(casein)水解物或其濃縮物。

在本發明之另外的態樣中，有效成分Xaa Pro Pro係源自令含有乳蛋白質之原料藉由屬於瑞士乳酸桿菌(Lactobacillus helveticus)種之菌發酵所得之發酵物。

屬於瑞士乳酸桿菌種之菌係宜為瑞士乳酸桿菌CM4株(CCRC 910111)。

本發明之心臟壁肥厚抑制劑，係包含如Xaa Pro Pro之構造的三胜肽作為有效成分。在此，所謂「劑」並非限定為藥劑者，而是指例如醫藥組成物或食品組成物等組成物、或者是例如食品添加劑等化合物。在本發明中，所謂「心臟壁肥厚抑制劑」係指具有壓抑與阻止心臟壁肥厚病變之進行的作用、或具有改善心臟壁肥厚病變的作用、或 具有心臟壁肥厚症之預防效果的化合物或組成物。

本發明之有效成分Xaa Pro Pro之Xaa，可為任意的天然胺基酸。具體而言，可舉出Val Pro Pro(纈胺酸－脯胺酸－脯胺酸)、Ile Pro Pro(異白胺酸－脯胺酸－脯胺酸)、Ser Pro Pro(絲胺酸－脯胺酸－脯胺酸)、Leu Pro Pro(白胺酸－脯胺酸－脯胺酸)等，宜為Val Pro Pro、Ile Pro Pro，較宜為Val Pro Pro。此外，作為有效成分，亦可包含Val Pro Pro及Ile Pro Pro等1種以上的三胜肽Xaa Pro Pro之組合。

有效成分Xaa Pro Pro係可為有機化學性合成而成的三胜肽，亦可為源自天然的三胜肽。

就三胜肽Xaa Pro Pro之有機化學性合成法而言，可使用固相法(Boc法、Fmoc法)或液相法等一般性的方法，例如，亦可為使用島津製作所製之胜肽合成裝置(PSSM－8型)等胜肽自動合成裝置所合成者。關於胜肽合成之反應條件等，可根據該業者之技術常識，配合選擇的合成方法或期望的三胜肽Xaa Pro Pro而任意地設定適當的反應條件。

或者是，就源自天然者而言，可為源自獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物者，亦可為源自令含有乳蛋白質之原料藉由麴菌或乳酸菌等菌類發酵所得之發酵物者。

在使用獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物、或是令含有乳蛋白質之原料藉由屬於瑞士乳酸桿菌種之菌發酵所得之發酵物時，除了本發明之有效成分的三胜肽Xaa Pro Pro以外亦可包含游離胺基酸，再者，於上述胜肽以及游離胺基酸 之外，亦可包含市面販售之獸乳酪蛋白、乳蛋白質中通常所含有的脂質、灰份、碳水化合物、食物纖維、水分等，此外，亦可因應需要而將此等中適當之成分的一部分或全部去除。

本發明之有效成分Xaa Pro Pro，係亦可為源自使用可得到Xaa Pro Pro(尤其是Val Pro Pro以及Ile Pro Pro)之酵素群，並以令獸乳酪蛋白水解的方法或令獸乳酪蛋白藉由麴菌發酵的方法而獲得之獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物者。

就獸乳酪蛋白而言，可舉出例如牛乳、馬乳、山羊乳、羊乳等之酪蛋白，尤其可適合使用牛乳酪蛋白。

令獸乳酪蛋白水解或發酵時之酪蛋白濃度，雖無特別限定，但為了有效率地生產獸乳酪蛋白分解物，以1至19重量%為佳。

就上述酵素群而言，可適宜舉出例如包含可切斷Xaa Pro Pro Xaa序列之羧基末端之Pro Xaa殘基間的胜肽酶之酵素群(X)。

酵素群(X)係以包含活性中心具有絲胺酸之絲胺酸型蛋白酶、或活性中心具有金屬之金屬蛋白酶為佳。就金屬蛋白酶而言，可舉出中性蛋白酶I、中性蛋白酶II、以及白胺酸胺基胜肽酶等，從可令期望之水解物有效率地、且於短時間內並更進一步以1階段反應獲得之觀點來看，以復包含此等酶之至少1種為佳。此外，就可切斷上述Pro Xaa序列之胜肽酶而言，以等電點顯示為酸性區之酵素為 佳。

就上述酵素群或酵素群(X)而言，可舉出例如米麴菌(Aspergillus oryzae)等源自麴菌的酵素群。如此的酵素群，係可舉出以適當的培養基培養菌體並將生產之酵素以水萃取而得的酵素群等，尤其是宜舉出源自米麴菌之酵素群中之等電點顯示為酸性區的酵素群。

就源自米麴菌之酵素群而言，可利用市面販售之商品，例如可舉出Sumizyme FP、LP、或MP(以上，登錄商標，新日本化學(股)製)；Umamizyme(登錄商標，天野Enzyme(股)製)；Sternzyme B11024、PROHIDROXY AMPL(以上，商品名，樋口商會股份有限公司製)；Orientase ONS(登錄商標，阪急BIOINDUSTRY(股)製)；Denatyme AP(登錄商標，長瀨生化學公司製)等，尤以使用Sumizyme FP(登錄商標，新日本化學(股)製)為佳。

在使用此等市面販售之酵素群時，通常設定為最佳條件，但可因應所使用的酵素群而以可獲得上述酪蛋白水解物的方式來適當變更條件(例如使用酵素量和反應時間等)而進行。

在水解上述獸乳酪蛋白時之酵素群的添加量，係例如於溶解有獸乳酪蛋白之水溶液中，使酵素群/獸乳酪蛋白成為重量比在1/1000以上，宜成為在1/1000至1/10，尤宜成為在1/100至1/10，更宜成為在1/40至1/10之比例的量。

反應條件係可因應所使用之酵素群並以能獲得目的之酪蛋白水解物的方式來適當選擇，但溫度通常為25至60℃，宜為45至55℃；pH為3至10，宜為5至9，尤宜為5至8。此外，酵素反應時間通常為2至48小時，宜為7至15小時。

酵素反應的結束，係可藉由令酵素失去活性來進行，通常可在60至110℃令酵素失去活性，而使反應停止。

酵素反應停止後，較佳為因應需要而將沈澱物藉由離心分離或各種過濾器處理來去除。

此外，因應需要，可從所獲得的水解物去除具有苦味或臭味的胜肽。此等苦味成分或臭味成分之去除，係可使用活性碳或疏水性樹脂等進行。例如，可藉由在所得之水解物中，相對於已使用之酪蛋白量添加活性碳1至20重量%，並反應1至10小時而實施。已使用之活性碳的去除，係可藉由離心分離或膜處理操作等公知的方法進行。

以如此方式所得之包含獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物的反應液，可直接添加至飲料等液體製品而利用作為功能性食品。此外，為了提高獸乳酪蛋白水解物之泛用性，亦可在濃縮上述反應液後，予以乾燥而製成粉末的形態。

獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物所含有之Xaa Pro Pro的含有比例，係相對於獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物中之胜肽以及游離胺基酸之合計量，通常為1重量%以上，宜為1至5重量%。藉由令該含有比例成為1重量%以上，可期待更高的功效。此外，獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物 中所含有之Ile Pro Pro或Val Pro Pro的含有比例，係相對於獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物中之胜肽以及游離胺基酸之合計量，不論是各別單獨為0.3重量%以上，或Ile Pro Pro以及Val Pro Pro之合計量為0.3重量%以上，皆可期待更高的功效。再者，在Ile Pro Pro以及Val Pro Pro分別含有0.3重量%以上時，可期待更高的功效。

此外，本發明之有效成分Xaa Pro Pro，係可為源自令含有乳蛋白質之原料藉由屬於瑞士乳酸桿菌種之菌發酵所得之發酵物者。

屬於瑞士乳酸桿菌種之菌，係以單獨使用瑞士乳酸桿菌種於發酵為佳，但在不損及本發明之期望效果的範圍內，亦可包含其他乳酸菌等。

就屬於瑞士乳酸桿菌種之菌而言，以可大量生產Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro之蛋白酶生產菌為佳。例如，宜為根據以Twining等人之方法(Twining,S.Anal.Biochem.143 3410(1984))作為基礎之Yamamoto等人之方法(Yamamoto,N.等人J.Biochem.(1993)114,740)而測定之U/OD590的值顯示為400以上的菌株。

就此等適宜的菌株而言，可舉出例如瑞士乳酸桿菌CM4株(通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所，日本國茨城縣筑波市東1丁目1番3號、郵遞區號305(現今為，產業技術總合研究所特許生物寄託中心，日本國茨城縣筑波市東1－1－1筑波中心中央第6，郵遞區號305－8566)，寄存號碼：FERM BP－6060，寄存日1997.8.15) (中華民國87年9月16日寄存於食品工業發展研究所，寄存號碼CCRC910111)(以下稱為CM4株)。此CM4株係依據專利手續上關於微生物寄存之國際性承認的布達佩斯條約登錄上述寄存號碼，此菌株已獲得專利。

令含有乳蛋白質之原料藉由屬於瑞士乳酸桿菌種之菌發酵所得之發酵物，係可藉由在含有乳蛋白質之原料中添加含有屬於瑞士乳酸桿菌種之菌株的發酵乳菌元(starter)，並適當選擇發酵溫度等發酵條件予以發酵而獲得。

此外，亦可將以如此方式獲得之發酵物的濃縮物等藉由凍結乾燥、噴霧乾燥等而作為粉末使用。

屬於瑞士乳酸桿菌種之菌，係以經預先進行前培養而作為充分高活性之菌元使用為佳。起始菌數係宜為10⁵ 至10⁹ 個/ml左右。

令含有乳蛋白質之原料藉由屬於瑞士乳酸桿菌種之菌發酵所得之發酵物，例如，在利用作為特定保健用食品等功能性食品時，為了令味道良好、偏好性良好，亦可於上述屬於瑞士乳酸桿菌種之菌株中併用酵母以進行發酵。酵母的菌種並無特別限定，例如，適合舉出啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等酵母菌屬酵母等。酵母的含有比例，係可因應其目的而適當選擇。

就含有乳蛋白質之原料而言，例如，可舉出牛乳、馬乳、羊乳、山羊乳等動物乳；以及豆漿等植物乳；還有為此等乳類之加工乳的脫脂乳、還原乳、奶粉、煉乳等，其 中以牛乳、豆漿、以及此等乳類之加工乳為佳，而以牛乳或牛乳之加工乳為尤佳。

乳之固形物濃度並無特別限定，但例如在使用脫脂乳的情形下之無脂乳固形物濃度係一般為3至15重量%左右，就生產性而言以6至15重量%為佳。

上述發酵係通常藉由靜置或攪拌發酵，例如可藉由以發酵溫度為25至45℃、宜為30至45℃，發酵時間為3至72小時、宜為12至36小時，在乳酸酸度變成1.5%以上的時間點停止發酵的方法來進行。

令含有乳蛋白質之原料藉由屬於瑞士乳酸桿菌種之菌發酵所得之發酵物中所含之Xaa Pro Pro(宜為Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro)的含有比例，係以在該發酵物之凍結乾燥物100g中換算為10mg以上為佳，較宜為在15mg以上。

就本發明之心臟壁肥厚抑制劑的投予量或攝取量而言，每1日，在人的情形，為含有有效成分Xaa Pro Pro(宜為Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro)一般為10μg至10g(宜為1mg至5g、更宜為3mg至1g左右)的用量，亦可於1日分數次投予或攝取。

心臟壁肥厚抑制劑之投予或攝取期間，可考慮投予或攝取之人或動物的年齡、或者是相對於該人或動物之心衰竭危險因子的環境等進行各種調整，例如一般可為1日以上，宜為7日至365日間。

此外，本發明之心衰竭預防劑係將上述之三胜肽作為 有效成分。

就本發明之心衰竭預防劑之投予量或攝取量而言，每1日，在人的情形，為含有有效成分Xaa Pro Pro(宜為Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro)一般為10μg至10g(宜為1mg至5g、更宜為3mg至1g左右)的用量，亦可於1日分數次投予或攝取。

心衰竭預防劑之投予或攝取期間，可考慮投予或攝取之人或動物的年齡、或者是相對於該人或動物之心衰竭危險因子的環境等進行各種調整，例如一般可為1日以上，宜為7日至365日間。

此外，本發明之心肥大預防劑係將上述之三胜肽作為有效成分。

本發明之心肥大預防劑的投予量或攝取量、以及投予或攝取的期間係與本發明之心衰竭預防劑相同。

本發明之心臟壁肥厚抑制劑、心肥大預防劑、以及心衰竭預防劑的投予或攝取方法，係以經口方式為佳。

在本發明之心臟壁肥厚抑制劑、心肥大預防劑、以及心衰竭預防劑作為醫藥使用時的形態，係可為經口投予用之製劑的形態。例如，可舉出錠劑、丸劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、微膠囊、散劑、粒劑、液劑等。

在製造作為醫藥時，例如，可因應適當的需要，使用製藥上容許的載體、佐劑(ajduvant)、賦形劑、補形劑、防腐劑、安定劑、結合劑、pH調節劑、緩衝劑、增黏劑、膠化劑、保存劑、抗氧化劑等，以在一般經承認之製劑投 予所要求之單位用量形態進行製造。

本發明之食品係含有本發明之心臟壁肥厚抑制劑作為有效成分，可作為具有例如心臟壁肥厚抑制作用、心肥大之預防、以及心衰竭之預防等效能之特定用保健食品等功能性食品。

為了獲得如此功效之攝取量，食品(例如功能性食品)，若有鑑於日常性、連續性、或斷續性地長期攝取，在人的情形，就每1日之有效成分Xaa Pro Pro的量、或Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro的量而言，一般為10μg至10g、宜為1mg至5g、更宜為3mg至1g左右，因應每1日的攝取次數，可能令食品(例如功能性食品)之每1次的攝取量較上述量更低。

在直接使用含有有效成分Xaa Pro Pro之獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物時，在人的情形，每1天一般以攝取該水解物或其濃縮物1mg至100g，尤以100mg至10g左右為佳。

在直接使用含有有效成分Xaa Pro Pro之發酵物的凍結乾燥物時，在人的情形，將該發酵物之凍結乾燥物就乾燥量而言，每1天一般以攝取1至100g，尤以2至50g左右為佳。

本發明之食品(例如功能性食品)之攝取期間係無特別限定，雖然以長期間攝取為佳，但為了獲得上述效能，例如一般可為1日以上，宜為7日至365日間。

本發明之食品(例如功能性食品)係包含含有本發明之 有效成分Xaa Pro Pro(宜為Val Pro Pro及/或Ile Pro Pro)之心臟壁肥厚抑制劑，並例如可將以上述方式所得之獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物、或含有乳蛋白質原料之發酵物，直接、或者是製成粉末狀或顆粒狀而添加於各種食品中。此外，因應必要，亦可添加瑞士乳酸桿菌以外之乳酸菌的發酵物、或食品所使用之其他成分，例如糖類、蛋白質、脂質、維生素、礦物質、加味劑(flavor)、或例如各種碳水化合物、脂質、維生素類、礦物質類、甜味料、香料、色素、質地(texture)改進劑等、或此等之混合物等添加物，以改善營養之均衡或風味等。

本發明之食品(例如功能性食品)係可為固形物、膠狀物、液狀物之任一形態，例如，可舉出乳酸菌飲料等發酵乳製品、各種加工飲食品、乾燥粉末、錠劑、膠囊劑、粒劑等，進一步地可為各種飲料、優格、流動食物、果凍、糖果、蒸煮袋食品(retort food)、錠型糖果、小甜餅(cookie)、蜂蜜蛋糕(castella)、麵包、餅乾(biscuit)、巧克力等。

以下使用實施例更詳細地說明本發明，但本發明的範圍不限於實施例。

(實施例) [胜肽合成例]

藉由以下所示之有機化學合成法(Fmoc法)，合成本發明之有效成分Ile Pro Pro及Val Pro Pro。合成係使用島津製作所製之胜肽自動合成裝置(PSSM－8型)以固相 法進行。

就固相載體而言，使用為2－氯三苯甲基(2－Chlorotrityl)型之聚苯乙烯樹脂並結合有以茀基甲氧羰基(以下簡稱為Fmoc)保護胺基之脯胺酸的樹脂50mg(島津製作所社製登錄商標SynProPep Resin)。依照上述胺基酸序列，令以Fmoc基保護胺基之Fmoc－Ile、Fmoc－Pro、以及Fmoc－Val各100μmol，按照通常方法，依照胜肽序列依序反應而獲得胜肽結合樹脂。

接著將此胜肽結合樹脂懸濁於1ml之反應液A(10容量%乙酸、10容量%三氟乙醇、80容量%二氯甲烷)，於室溫反應30至60分鐘並將胜肽從樹脂切離後，以玻璃過濾器過濾反應液A。減壓去除濾液的溶劑後，立刻添加1ml的反應液B(82.5容量%三氟乙酸、3容量%乙基甲基硫化物(ethyl methyl sulfide)、5容量%純水、5容量%苯基甲基硫醚(thioanisole)、2.5容量%乙二硫醇、2容量%硫酚)，於室溫反應6小時並去除側鏈保護基。於其中加入無水乙醚10ml令胜肽沉澱，以3000迴轉離心5分鐘進行分離。以無水乙醚洗淨沉澱物數次後，噴吹氮氣而乾燥。將如此獲得之未精製之合成胜肽，全部溶解於0.1N鹽酸水溶液2ml後，以使用C18之逆層管柱的HPLC，依照以下條件精製。

泵：型號L6200智能泵(intelligent pump，日立製作所)；檢測機：以型號L4000UV檢測器(日立製作所)檢測出215nm之紫外線吸收；管柱：μ Bondasphere5μC18 (Waters公司製)；溶出液：A液為0.1重量%TFA水溶液、B液為含有0.1重量%TFA之乙腈；(B/A+B)×100%：0→40%(60分鐘)；流速：1ml/分鐘。分次取出顯示最大吸收之溶出部分，藉由將其乾燥凍結而分別獲得5.7mg、6.5mg的目的之合成胜肽Ile Pro Pro及Val Pro Pro。藉由全自動蛋白質一級結構分析裝置(型號PPSQ-10，島津製作所製)，從胜肽的N末端開始分析該精製胜肽，進一步地以胺基酸分析裝置(型號800系列，日本分光公司製)分析，可確認到結果係如設計。

[獸乳酪蛋白水解物之調製例]

將源自牛乳之酪蛋白(日本NZMP公司製)1g加入至經調整為約80℃之蒸餾水99g中並充分地攪拌後，添加1N氫氧化鈉(和光純藥公司製)溶液成為pH7.0，此外將溫度調整為20℃，來調製基質溶液。

在所得之基質溶液中，以酵素/酪蛋白之重量比成為1/25的方式添加源自米麴菌之至少包含金屬蛋白酶、絲胺酸蛋白酶、中性蛋白酶I、中性蛋白酶II、以及白胺酸胺基胜肽酶的市售酵素(登錄商標「Sumizyme FP」，新日本化學工業公司製)，於50℃反應14小時。接著，以110℃進行10分鐘的高壓釜處理，使酵素失去活性，獲得酪蛋白酵素分解物溶液。接著，使所得之酵素分解物溶液藉由噴式乾燥器乾燥，調製成粉末。

進行所得粉末中所含有成分之分析。蛋白質係以凱耳達(Kjeldahl)法測定，胺基酸係以胺基酸分析裝置測定。 此外，將自該蛋白質量減去胺基酸的量作為胜肽量。再者，分別以酸分解法測定脂質、以直接灰化法測定灰份、以及以常壓加熱乾燥法測定水分。另外，將自100%減去各成分的殘餘量作為碳水化合物量。其結果，胺基酸為35.8重量%，胜肽為45.7重量%，水分為6.6重量%，脂質為0.2重量%，灰分為4.1重量%，碳水化合物為7.6重量%。

<胜肽構成胺基酸之測定>

使上述調製的粉末溶解於適量的蒸餾水，使用自動胜肽分析機(商品名PPSQ－10(股)島津製作所製)進行解析，調查在粉末中之自N末端側依序有何種胺基酸。另外，自動胜肽分析機不會檢測出游離胺基酸。

此外，第5殘基之胺基酸的合計為120pmol，第6殘基之胺基酸的合計為100pmol。依據此等結果，判明在上述粉末中所含有之胜肽幾乎皆為二胜肽或三胜肽。此外，第2殘基之胺基酸為Pro之胜肽的比率係49.5%而為明顯地上昇。再者，第3殘基之胺基酸為Pro之胜肽的比率也高達29.8%。

因此，上述粉末中大量含有Xaa Pro Pro，可推測此等胜肽係對於生體內之蛋白酶所致的酵素分解作用為抵抗性高的胜肽。

<酵素分解物中所含有之胜肽的測定>

對於上述酵素分解物之粉末，使用各種化學合成標準胜肽，依照通常方法，求得該粉末所含有之顯示於表1的三胜肽量。將結果顯示於表1。

此外，在以蒸餾水稀釋溶解有上述粉末之溶液中的胜肽以及游離胺基酸量為8.15mg/ml，胜肽量為4.57 mg/ml，該胜肽中之Xaa Pro量為514.5μg，因此，相對於粉末中之胜肽以及游離胺基酸的合計量，Xaa Pro的比率為6.3重量%，再者，由於該胜肽中的Xaa Pro Pro量為116.5μg，故相對於粉末中之胜肽以及游離胺基酸的合計量，Xaa Pro Pro的比率確認為1.4重量%。

[CM4發酵乳飼料之調製例]

使用藉由CM4株使含有乳蛋白質的原料發酵所得之發酵乳，調製含有本發明之有效成分Xaa Pro Pro之動物飼料。

用蒸餾水以成為固形率9%(w/w)的方式溶解市面販售之脫脂奶粉，以高壓釜進行105℃、10分鐘的高溫加熱殺菌後，冷卻至室溫，接種3%(v/w)之CM4株菌元發酵液(菌數5×10⁸ 個/ml)，以37℃、24小時在靜置狀態使其發酵而獲得CM4發酵乳。

將所得之CM4發酵乳進行80℃瞬間加溫殺菌(亦即加溫至80℃後立即降溫之殺菌方式)後，藉由凍結乾燥而 獲得粉末。將所得之凍結乾燥粉末與市面販售之粉末飼料(商品名「CE－2」，日本CLEA股份有限公司製)以質量比10：90混合，製成固形飼料，並作為CM4發酵乳飼料。在此飼料中，含有源自CM4發酵乳之Val Pro Pro 34.1mg/kg以及Ile Pro Pro 17.1mg/kg。

[試驗1：Val Pro Pro(VPP)之左心室壁的肥厚抑制效果]

針對三胜肽Val Pro Pro(VPP)之左心室壁的肥厚抑制效果進行試驗。

以9至12隻為一群共計3群的7週齡Wistar系雄大鼠(日本SLC股份有限公司)進行試驗。在一週的馴化飼養後，令此等大鼠在8週內自由攝取以1g/L之濃度溶解有為一氧化氮合成抑制劑之NG－硝基－L－精胺酸甲酯鹽酸鹽(L－NAME，Sigma公司製)的飲用水、分別以1g/L與0.3g/L之濃度溶解有L－NAME與VPP的飲用水、以及分別以1g/L與0.5mg/L之濃度溶解有L－NAME與為血管緊縮素轉換酵素(ACE)抑制劑之伊那拉普利的飲用水。在此，伊那拉普利之投藥量係設定為使其ACE抑制活性與VPP成為相等。

令大鼠於二乙醚麻醉下放血死亡，取出心臟後，以10%中性緩衝福馬林液固定。以包含右心室、中隔(septal)、左心室、以及冠狀動脈的方式從經固定的心臟水平地切斷心房下部，作成輪狀的組織片。將組織包埋於石臘後藉由切片法(microtomy)進行薄切為3.0至3.5μm之厚度。對各大鼠製作2至5個切片。將經薄切之切片進行蘇木紫．伊紅染 色(hematoxylin－eosin staining)，測定左心室壁的厚度。心室壁厚度的測定，係藉由目鏡測微計(eyepiece micrometer)針對1切片在顯微鏡下被認為具有平均厚度之複數點的厚度進行實際測量，將其平均厚度作為其切片之測定值，進行統計處理。厚度之測定以及評價，係由不知道各樣品名之病理學者進行。

將所得結果顯示於第1圖。與僅給予L－NAME的群集相比，在給予L－NAME與VPP的群集中，左心室壁的厚度減少，顯示因VPP抑制左心室壁的肥厚，而於心衰竭的預防為有效。此外，在以使ACE抑制活性成為相等的方式設定投藥量的伊那拉普利無法確認效果，因此可確認本效果並非因抑制ACE而造成者。

[試驗2：Val Pro Pro(VPP)之右心室壁的肥厚抑制效果]

為了確認三胜肽Val Pro Pro(VPP)之右心室壁的肥厚抑制效果，與試驗1相同地進行試驗、測定以及評價。

將所得結果顯示於第2圖。與僅給予L－NAME的群集相比，在給予L－NAME與VPP的群集中，右心室壁的厚度減少。因此，顯示因VPP抑制右心室壁的肥厚，而於心衰竭的預防為有效。由於與試驗1同樣地在伊那拉普利無法確認效果，因此可確認本效果並非因抑制ACE而造成者。

[試驗3：Ile Pro Pro(IPP)之左心室壁的肥厚抑制效果]

對三胜肽Ile Pro Pro(IPP)之左心室壁的肥厚抑制效果進行試驗。

以9至11隻為一群共計3群的7週齡Wistar系雄大鼠(日本SLC股份有限公司)進行試驗。在一週的馴化飼養後，令此等大鼠在8週內自由攝取以1g/L之濃度溶解有L－NAME(Sigma公司製)的飲用水、分別以1g/L與0.3g/L之濃度溶解有L－NAME與IPP的飲用水、以及分別以1g/L與0.5mg/L之濃度溶解有L－NAME與為血管緊縮素轉換酵素(ACE)抑制劑之伊那拉普利的飲用水。在此，伊那拉普利之投藥量係設定為使其ACE抑制活性與IPP成為相等。

令大鼠於二乙醚麻醉下放血死亡，取出心臟後，以10%中性緩衝福馬林液固定。以包含右心室、中隔、左心室、以及冠狀動脈的方式從經固定的心臟水平地切斷心房下部，作成輪狀的組織片。將組織包埋於石臘後藉由切片法進行薄切為3.0至3.5μm之厚度。對各大鼠製作2至5個切片。將經薄切之切片進行蘇木紫．伊紅染色，測定左心室壁的厚度。心室壁厚度的測定，係藉由目鏡測微計針對1切片在顯微鏡下被認為具有平均厚度之複數點的厚度進行實際測量，將其平均厚度作為其切片之測定值，進行統計處理。厚度之測定以及評價，係由不知道各樣品名之病理學者進行。

將所得結果顯示於第3圖。與僅給予L－NAME的群集相比，在給予L－NAME與IPP的群集中，左心室壁的厚度減少，顯示因IPP抑制左心室壁的肥厚，而於心衰竭的預防為有效。此外，在以使ACE抑制活性成為相等的方式設 定投藥量的伊那拉普利無法確認效果，因此可確認本效果並非因抑制ACE而造成者。

[試驗4：Ile Pro Pro(IPP)之右心室壁的肥厚抑制效果]

為了確認三胜肽Ile Pro Pro(IPP)之右心室壁的肥厚抑制效果，與試驗3相同地進行試驗、測定以及評價。

以9至12隻為一群共計3群的7週齡Wistar系雄大鼠(日本SLC股份有限公司)進行試驗。在一週的馴化飼養後，令此等大鼠在8週內自由攝取以1g/L之濃度溶解有L－NAME(Sigma公司製)的飲用水、分別以1g/L與0.3g/L之濃度溶解有L－NAME與IPP的飲用水、以及分別以1g/L與0.5mg/L之濃度溶解有L－NAME與為血管緊縮素轉換酵素(ACE)抑制劑之伊那拉普利的飲用水。在此，伊那拉普利之投藥量係設定為使其ACE抑制活性與IPP成為相等。

令大鼠於二乙醚麻醉下放血死亡，取出心臟後，以10%中性緩衝福馬林液固定。以包含右心室、中隔、左心室、以及冠狀動脈的方式從經固定的心臟水平地切斷心房下部，作成輪狀的組織片。將組織包埋於石臘後藉由切片法進行薄切為3.0至3.5μm之厚度。對各大鼠製作2至5的切片。將經薄切之切片進行蘇木紫．伊紅染色，測定右心室壁的厚度。心室壁厚度的測定，係藉由目鏡測微計針對1切片在顯微鏡下被認為具有平均厚度之複數點的厚度進行實際測量，將其平均厚度作為其切片之測定值，決定各個體之心室壁之厚度。厚度之測定以及評價，係由不知道各 樣品名之病理學者進行。

心室壁之肥厚的判定，係測定不添加L－NAME而以一般自來水飼養之同週齡大鼠6隻之心室壁的厚度，將其平均作為基準值。令心室壁厚度較基準值大者為肥厚，相等或未達基準值者為正常，並從肥厚與正常之大鼠的數量進行依據概度比檢定(likelihood ratio test)之比較。將其結果顯示於以下之表2。

從所得之結果判明，IPP亦能抑制右心室壁之肥厚，而IPP於心衰竭的預防亦為有效。此外，在以使ACE抑制活性成為相等的方式設定投藥量的伊那拉普利無法確認效果，因此可確認本效果並非因抑制ACE而造成者。

[試驗5：Ile Pro Pro(IPP)之心臟中隔壁的肥厚抑制效果]

為了確認三胜肽Ile Pro Pro(IPP)之心臟中隔壁的肥厚抑制效果，與試驗3相同地進行試驗、測定以及評價。

將所得結果顯示於第4圖。與僅給予L－NAME的群集相比，在給予L－NAME與IPP的群集中，心臟中隔壁的厚度減少，顯示因IPP抑制心臟中隔壁的肥厚，而於心衰竭的預防為有效。此外，在以使ACE抑制活性成為相等的方 式設定投藥量的伊那拉普利無法確認效果，因此可確認本效果並非因抑制ACE而造成者。

本發明之心臟壁肥厚抑制劑，即使在無法確認血管緊縮素轉換酵素(ACE)抑制劑之抑制作用的情形下亦顯示有效性，因此可作為非因ACE抑制活性所引起之心肥大或心衰竭的預防用及/或治療用藥，尤其是作為預防劑係極為有用。此外，由於有效成分係源自於食品等之天然存在之三胜肽，故可期待能提供副作用的顧慮小且具有高效力之藥物。

此外，提供一種功能性食品，其係藉由將本發明之心臟壁肥厚抑制劑使用或添加於飲料或食品中，而可安全且日常性地持續攝取，並可期待預防心肥大以及心衰竭之效果。

(參考文獻)

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第1圖係顯示對試驗1之Val Pro Pro(VPP)之大鼠左心室壁的肥厚抑制效果進行試驗的結果。以L－NAME投 藥群為一群11隻、以L－NAME以及伊那拉普利投藥群為一群9隻、以L－NAME以及VPP投藥群為一群12隻進行試驗，圖表以平均值±標準誤差的方式表示。藉由單側t－檢定而進行比較。圖中的記號(^＊ )係表示顯著差(p<0.05)。

第2圖係顯示對試驗2之Val Pro Pro(VPP)之大鼠右心室壁的肥厚抑制效果進行試驗的結果。以L－NAME投藥群為一群11隻、以L－NAME以及伊那拉普利投藥群為一群9隻、以L－NAME以及VPP投藥群為一群12隻進行試驗，圖表以平均值±標準誤差的方式表示。藉由單側t－檢定而進行比較。圖中的記號(^＊ )係表示顯著差(p<0.05)。

第3圖係顯示對試驗3之Ile Pro Pro(IPP)之大鼠左心室壁的肥厚抑制效果進行試驗的結果。以L－NAME投藥群為一群9隻、以L－NAME以及伊那拉普利投藥群為一群9隻、以L－NAME以及VPP投藥群為一群11隻進行試驗，圖表以平均值±標準誤差的方式表示。藉由單側t－檢定而進行比較。圖中的記號(#)係表示顯著差(p<0.1)。

第4圖係顯示對試驗5之Ile Pro Pro(IPP)之大鼠心臟中隔壁的肥厚抑制效果進行試驗的結果。以L－NAME投藥群為一群9隻、以L－NAME以及伊那拉普利投藥群為一群9隻、以L－NAME以及VPP投藥群為一群11隻進行試驗，圖表以平均值±標準誤差的方式表示。藉由單側t－檢定而進行比較。圖中的記號(^＊ )係表示顯著差(p<0.05)。

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Claims (7)

1. 一種Val Pro Pro及/或Ile Pro Pro的用途，係用製造不依賴ACE抑制活性的心臟壁肥厚抑制劑。
2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中，Val Pro Pro及/或Ile Pro Pro係源自獸乳酪蛋白(casein)水解物或其濃縮物者。
3. 如申請專利範圍第2項之用途，其中，獸乳酪蛋白水解物係令獸乳酪蛋白藉由麴菌發酵而得之發酵物。
4. 如申請專利範圍第2項之用途，其中，獸乳酪蛋白水解物係令獸乳酪蛋白藉由源自麴菌之酵素分解而得之分解物。
5. 如申請專利範圍第4項之用途，其中，源自麴菌之酵素係為源自米麴菌(Aspergillus oryzae)之酵素。
6. 如申請專利範圍第1項之用途，其中，Val Pro Pro及/或Ile Pro Pro係源自令含有乳蛋白質之原料藉由屬於瑞士乳酸桿菌種之菌發酵所得之發酵物者。
7. 如申請專利範圍第6項之用途，其中，屬於瑞士乳酸桿菌種之菌係為瑞士乳酸桿菌CM4株(CCRC 910111)。