CN104073539B - 一种牛乳β‑酪蛋白多元活性肽的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛乳β‑酪蛋白多元活性肽的制备方法及其应用，属于乳制品深加工技术领域。本发明所提供的方法是利用磷酸盐缓冲溶液分别配制糜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶溶液，然后分别依次用糜蛋白酶溶液、胰蛋白酶溶液和胃蛋白酶溶液对牛乳β‑酪蛋白进行酶解，利用超滤离心机分离酶解液获得上清液，将上清液经过纯化浓缩干燥后获得牛乳β‑酪蛋白多元活性肽。通过本发明方法制备的多元活性肽具有促进骨细胞增殖和增强免疫力功能，实现了一种方法制备多种活性肽，大大降低了生产成本，具有较好的应用价值。

Description

一种牛乳β-酪蛋白多元活性肽的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种牛乳β-酪蛋白多元活性肽的制备方法及其应用，属于乳制品深加工技术领域。

背景技术

随着人类生活水平的不断提高与发展，人们对于食品的营养与健康越来越关注，尤其是新生儿和婴幼儿的食品，更是备受瞩目。人乳是婴儿最好的食品，其富含各种优质蛋白，但是来源少产量低，所以常用牛乳加工成奶粉进行取代，但是牛乳中的蛋白在婴儿体内消化后得到的活性肽与人乳中的活性物质在功能的组成上有一定的差异，牛乳β-酪蛋白消化液中除含有促进钙吸收以及免疫活性肽外，还含有抗高血压肽以及抑菌肽，所以我们可以通过模拟婴儿肠道的消化条件，分别对人乳β-酪蛋白和牛乳β-酪蛋白进行体外消化，根据人乳消化后得到的功能组成，来找出牛乳消化后与人乳功能相符合的活性肽。现有发明技术都是单一的从牛乳中分离出某一种活性肽，如酪蛋白磷酸肽、免疫活性肽等，效果单一，只具备一项生理功能，如果要想同时具备多种生理功能，则需要多次提取，这样会造成成本的极大浪费。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种牛乳β-酪蛋白多元活性肽的制备方法，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种牛乳β-酪蛋白多元活性肽的制备方法，该方法是利用磷酸盐缓冲溶液分别配制糜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶溶液，然后分别依次用糜蛋白酶溶液、胰蛋白酶溶液和胃蛋白酶溶液对牛乳β-酪蛋白进行酶解，利用超滤离心机分离酶解液获得上清液，将上清液经过纯化浓缩干燥后获得牛乳β-酪蛋白多元活性肽。

所述方法的步骤如下：

1)利用磷酸盐缓冲溶液分别配制糜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和牛乳β-酪蛋白溶液；

2)分别依次利用步骤1)配制的糜蛋白酶溶液、胰蛋白酶溶液和胃蛋白酶溶液对牛乳β-酪蛋白溶液进行酶解处理，酶解后获得酶解液；

3)利用离心分离机分离步骤2)所得的酶解液，利用凝胶层析色谱分离获得的上清液，得到多元活性肽溶液；

4)将步骤3)所得的多元活性肽溶液真空浓缩后，冷冻干燥，获得牛乳β-酪蛋白多元活性肽。

进一步，所述方法的步骤如下：

1)利用磷酸盐缓冲溶液分别配制糜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和牛乳β-酪蛋白溶液，其中牛乳β-酪蛋白溶液的浓度为1g/L；

2)将步骤1)所得糜蛋白酶溶液和牛乳β-酪蛋白溶液等体积混合调节pH后酶解处理，获得糜蛋白酶水解液；

3)调整步骤2)所得糜蛋白水解液的pH，再与步骤1)所得胰蛋白酶溶液进行等体积混合，酶解处理后获得胰蛋白酶水解液；

4)调整步骤3)所得胰蛋白酶水解液的pH，再与步骤1)所得胃蛋白酶溶液进行等体积混合，酶解处理后获得酶解液；

5)利用离心分离机分离步骤4)所得的酶解液，再利用凝胶层析色谱分离去除获得的上清液中的700Da杂质，得到多元活性肽溶液；

6)将步骤5)所得的多元活性肽溶液真空浓缩后，冷冻干燥，获得牛乳β-酪蛋白多元活性肽。

所述磷酸盐缓冲溶液为0.1M pH7.2的磷酸盐缓冲溶液。

所述糜蛋白酶，添加量为900-1100U，酶解温度为37℃，酶解时间为20-40min，pH6.5。

所述胰蛋白酶，添加量为9950-10050U，酶解温度为37℃，酶解时间为1.5-2.5h，pH7.0。

所述胃蛋白酶，添加量为10150-10350U，酶解温度为37℃，酶解时间为1.0-2.0h，pH3.0。

所述调节pH，使用0.1M的盐酸溶液或碳酸氢钠溶液；所述超滤离心，是在4℃下，利用3kDa超滤离心管，4000r/min，离心20min。

所述方法的具体步骤如下：

1)利用0.1M pH7.2的磷酸盐缓冲溶液分别配制糜蛋白酶溶液、胰蛋白酶溶液、胃蛋白酶溶液和牛乳β-酪蛋白溶液，其中牛乳β-酪蛋白溶液的浓度为1g/L；

2)将步骤1)所得1000U糜蛋白酶溶液和牛乳β-酪蛋白溶液等体积混合后，利用0.1M的盐酸溶液调节pH至6.5，在37℃下酶解处理0.5h后，获得糜蛋白酶水解液；

3)利用0.1M碳酸氢钠溶液调整步骤2)所得糜蛋白水解液的pH至7.0，再与步骤1)所得胰蛋白酶溶液进行等体积混合，在37℃下酶解处理2.0h后，获得胰蛋白酶水解液；

4)利用0.1M的盐酸溶液将步骤3)所得的胰蛋白酶水解液调整pH至3.0，再与步骤1)所得胃蛋白酶溶液进行等体积混合，在37℃下酶解处理1.5h后，获得酶解液；

5)利用配备3kDa超滤离心管的离心机，在4℃，4000r/min的条件下，离心步骤4)所得酶解液20min，再利用凝胶层析色谱分离去除获得的上清液中的700Da杂质，得到多元活性肽溶液；

6)将步骤5)所得的多元活性肽溶液真空浓缩后，冷冻干燥，获得牛乳β-酪蛋白多元活性肽。

所述方法用于制备牛乳β-酪蛋白多元活性肽。

本发明有益效果：

1.本发明采用分步水解的方法实现了牛乳β-酪蛋白多元活性肽的制备，避免了一种方法只能制备一种活性肽的问题，降低了生产成本，所得活性肽就具有促进骨骼生长和提高机体免疫力的功能。

2.所得的多元活性肽可作为功能肽添加到婴幼儿配方奶粉中，也可作为钙、铁、锌、镁等矿物质的活化因子，用于促进矿物质的吸收；同时也添加到牙膏中，起到预防龋齿的效果。

附图说明

图1为实施例1-4MTT指数和脏器指数；

(1，实施例1；2，实施例2；3，实施例3；4，实施例4)。

图2为人乳β-酪蛋白消化液的质谱检测图谱。

图3为人乳β-酪蛋白在模拟婴儿肠道条件消化后功能肽葡聚糖凝胶分离多肽图谱；

(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ为六个峰，其中Ⅰ，Ⅱ，Ⅴ为免疫活性肽，Ⅲ，Ⅳ，Ⅵ为促进钙吸收肽)。

图4为实施例1中牛乳β-酪蛋白多元活性肽的葡聚糖凝胶分离多肽图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

下面实施例中所用的试剂、设备和方法，如果没有特殊说明，均为常用方法或可从商业渠道获取。

实施例1：牛乳β-酪蛋白的体外消化及功能验证

a)预处理：将1000U糜蛋白酶溶于PH7.2的PBS中，定成1L溶液，得到糜蛋白酶溶液；将10250U胃蛋白酶溶于PH7.2的PBS中，定成1L溶液，得到胃蛋白酶溶液；将10000U胰蛋白酶溶于PH7.2的PBS中，定成1L溶液，得到胰蛋白酶溶液；将1g牛乳β-蛋白溶于PH7.2的PBS中，定成1L溶液，得到牛乳β-酪蛋白溶液；

b)将步骤a)处理的糜蛋白酶消化液酶消化液和牛乳β-酪蛋白溶液按照1:1的体积比进行酶解反应，用0.1M的HCl调节pH值至6.5，37℃条件下消化0.5h，得到消化液1；

c)将步骤b)处理的消化液1和胰蛋白酶溶液按照1:1的体积比进行酶解反应，用0.1M的NaHCO₃调节pH值至7.0，37℃条件下消化2h，得到消化液2；

d)将步骤c)处理的消化液2和胃蛋白酶溶液按照1:1的体积比进行酶解反应，用0.1M的HCl调节pH值至3.0，37℃条件下消化1.5h，得到消化液3；

e)将步骤d)获得的消化液3进入3KDa超滤离心管，4℃，4000r/min条件下离心20min，得到上清液；

f)将步骤c)得到的上清液通过G-10葡聚糖凝胶层析柱，去除700Da以下的杂质，得到牛乳β-酪蛋白多元活性肽溶液；

g)将步骤d)所得牛乳酪蛋白多元活性肽溶液进行真空浓缩及干燥，得到牛乳β-酪蛋白多元活性肽。

实施例2：牛乳β-酪蛋白的体外消化及功能验证

a)预处理：将1000U糜蛋白酶溶于PH7.2的PBS中，定成1L溶液，得到糜蛋白酶溶液；将10250U胃蛋白酶溶于PH7.2的PBS中，定成1L溶液，得到胃蛋白酶溶液；将10000U胰蛋白酶溶于PH7.2的PBS中，定成1L溶液，得到胰蛋白酶溶液；将1g牛乳β-蛋白溶于PH7.2的PBS中，定成1L溶液，得到牛乳β-酪蛋白溶液；

b)将步骤a)处理的胃蛋白酶消化液酶消化液和牛乳β-酪蛋白溶液按照1:1的体积比进行酶解反应，用0.1M的HCl调节pH值至3.0，37℃条件下消化1.5h，得到消化液4；

c)将步骤b)处理的消化液4和糜蛋白酶溶液按照1:1的体积比进行酶解反应，用0.1M的NaHCO₃调节pH值至6.5，37℃条件下消化0.5h，得到消化液5；

d)将步骤c)处理的消化液5和胰蛋白酶溶液按照1:1的体积比进行酶解反应，用0.1M的NaHCO₃调节pH值至7.0，37℃条件下消化2.0h，得到消化液6；

e)将步骤d)获得的消化液6进入3KDa超滤离心管，4℃，4000r/min条件下离心20min，得到上清液；

f)将步骤c)得到的上清液通过G-10葡聚糖凝胶层析柱，去除700Da以下的杂质，得到牛乳β-酪蛋白多元活性肽溶液；

g)将步骤d)所得牛乳酪蛋白多元活性肽溶液进行真空浓缩及干燥，得到牛乳β-酪蛋白多元活性肽。

实施例3：牛乳β-酪蛋白的体外消化及功能验证

a)预处理：将1000U糜蛋白酶溶于PH7.2的PBS中，定成1L溶液，得到糜蛋白酶溶液；将10250U胃蛋白酶溶于PH7.2的PBS中，定成1L溶液，得到胃蛋白酶溶液；将10000U胰蛋白酶溶于PH7.2的PBS中，定成1L溶液，得到胰蛋白酶溶液；将1g牛乳β-蛋白溶于PH7.2的PBS中，定成1L溶液，得到牛乳β-酪蛋白溶液；

b)将步骤a)处理的胰蛋白酶消化液酶消化液和牛乳β-酪蛋白溶液按照1:1的体积比进行酶解反应，用0.1M的HCl调节pH值至7.0，37℃条件下消化2.0h，得到消化液7；

c)将步骤b)处理的消化液7和糜蛋白酶溶液按照1:1的体积比进行酶解反应，用0.1M的HCl调节pH值至6.5，37℃条件下消化0.5h，得到消化液8；

d)将步骤c)处理的消化液8和胃蛋白酶溶液按照1:1的体积比进行酶解反应，用0.1M的HCl调节pH值至3.0，37℃条件下消化1.5h，得到消化液9；

e)将步骤d)获得的消化液9进入3KDa超滤离心管，4℃，4000r/min条件下离心20min，得到上清液；

f)将步骤c)得到的上清液通过G-10葡聚糖凝胶层析柱，去除700Da以下的杂质，得到牛乳β-酪蛋白多元活性肽溶液；

g)将步骤d)所得牛乳酪蛋白多元活性肽溶液进行真空浓缩及干燥，得到牛乳β-酪蛋白多元活性肽。

实施例4：传统牛乳β-酪蛋白的体外消化及功能验证

a)预处理：将1000U糜蛋白酶溶于PH7.2的PBS中，定成1L溶液，得到糜蛋白酶溶液；将10250U胃蛋白酶溶于PH7.2的PBS中，定成1L溶液，得到胃蛋白酶溶液；将10000U胰蛋白酶溶于PH7.2的PBS中，定成1L溶液，得到胰蛋白酶溶液；将1g牛乳β-蛋白溶于PH7.2的PBS中，定成1L溶液，得到牛乳β-酪蛋白溶液；

b)将步骤a)处理的胃蛋白酶消化液酶消化液和牛乳β-酪蛋白溶液按照1:1的体积比进行酶解反应，用0.1M的HCl调节pH值至3.0，37℃条件下消化1.5h，得到消化液10；

c)将步骤b)处理的消化液10和胰蛋白酶溶液按照1:1的体积比进行酶解反应，用0.1M的NaHCO₃调节pH值至7.0，37℃条件下消化2h，得到消化液11；

d)将步骤d)获得的消化液11进入3KDa超滤离心管，4℃，4000r/min条件下离心20min，得到上清液；

e)将步骤c)得到的上清液通过G-10葡聚糖凝胶层析柱，去除700Da以下的杂质，得到牛乳β-酪蛋白多元活性肽溶液；

f)将步骤d)所得牛乳酪蛋白多元活性肽溶液进行真空浓缩及干燥，得到牛乳β-酪蛋白多元活性肽。

实施例5：实施例1、实施例2、实施例3、实施例4实验结果对比

将人成骨细胞在DMEM-F12培养基中培养一段时间，将实施例1-4所得的消化产物作为实验组添加1mM到培养基中，将细胞在34℃培养箱中培养24小时后与空白对照组进行对比，用MTT试剂盒按照说明书中的添加量测定对照组以及实验组细胞增殖情况。

昆明白小鼠称重后随机分为8组，正常对照组，实验组。正常对照组每日用生理盐水灌胃，实验组用人乳β酪蛋白消化产物配制的溶液给小鼠灌胃，共20d。停止灌喂后次日测定脏器指数。

脏器指数(mg/g)＝(脏器重量/小鼠体重)×10

MTT试剂盒实验结果及小鼠脏器指数对比结果见图1。从图1中可以看到实施例MTT值为0.65，小鼠脾脏指数为4.2，两项指标均高出其他组50％以上，可见实施例1效果最佳。

用MALDI-TOF在离子源加速电压为20kV，激光波长337nm，激光频率200Hz，离子延迟提取时间(Pulse ion extraction，PIE)330ns，质谱信号单次扫描累加2000次的条件下，扫描质量范围m/z400～m/z6000的体外模拟胃消化的肽段。人乳β-酪蛋白在模拟婴儿肠道条件消化后得质谱图(图2)如下：

利用MAUDI-TOF测定肽段序列并经软件分析，人乳β-酪蛋白在模拟婴儿肠道条件消化后得到的序列见表1：

表1 消化肽段序列

经分离鉴定，实施例1中牛乳β-酪蛋白在体外得到有促进骨细胞增殖以及增强免疫力的功能肽段有六段。

葡聚糖凝胶分离得到的图像经分析(图3)，六个峰对应的肽段序列如下，分子量均在700D与3KD之间。

牛乳β-酪蛋白促进骨细胞增殖的序列，如表2：

表2牛乳β-酪蛋白促进骨细胞增殖序列

牛乳β-酪蛋白免疫活性肽的序列，如表3：

表3牛乳β-酪蛋白免疫活性肽序列

经分离鉴定，各实施例中纯化后活性肽含量占总肽含量的百分比分别为96％，60％，53％，58％，实施例1中活性肽含量最高，远高于其他实施例，实施例1中牛乳β-酪蛋白在体外得到有促进骨细胞增殖以及增强免疫力的功能肽段有六段(图4)。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种牛乳β-酪蛋白多元活性肽的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1)利用磷酸盐缓冲溶液分别配制糜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和牛乳β-酪蛋白溶液，其中牛乳β-酪蛋白溶液的浓度为1g/L；

2)将步骤1)所得糜蛋白酶溶液和牛乳β-酪蛋白溶液等体积混合调节pH后酶解处理，获得糜蛋白酶水解液；其中，糜蛋白酶的添加量为900-1100U，酶解温度为37℃，酶解时间为20-40min，pH6.5；

3)调整步骤2)所得糜蛋白水解液的pH，再与步骤1)所得胰蛋白酶溶液进行等体积混合，酶解处理后获得胰蛋白酶水解液；其中，胰蛋白酶的添加量为9950-10050U，酶解温度为37℃，酶解时间为1.5-2.5h，pH7.0；

4)调整步骤3)所得胰蛋白酶水解液的pH，再与步骤1)所得胃蛋白酶溶液进行等体积混合，酶解处理后获得酶解液；其中，胃蛋白酶的添加量为10150-10350U，酶解温度为37℃，酶解时间为1.0-2.0h，pH3.0；

5)利用离心分离机分离步骤4)所得的酶解液，再利用凝胶层析色谱分离去除获得的上清液中小于700Da的杂质，得到多元活性肽溶液；

6)将步骤5)所得的多元活性肽溶液真空浓缩后，冷冻干燥，获得牛乳β-酪蛋白多元活性肽。

2.权利要求1所述方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液为0.1M pH7.2的磷酸盐缓冲溶液。

3.权利要求1所述方法，其特征在于，所述调节pH，使用0.1M的盐酸溶液或碳酸氢钠溶液；

所述超滤离心，是在4℃下，利用3kDa超滤离心管，4000r/min，离心20min。

4.权利要求1所述方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)利用0.1M pH7.2的磷酸盐缓冲溶液分别配制糜蛋白酶溶液、胰蛋白酶溶液、胃蛋白酶溶液和牛乳β-酪蛋白溶液，其中牛乳β-酪蛋白溶液的浓度为1g/L；

2)将步骤1)所得1000U糜蛋白酶溶液和牛乳β-酪蛋白溶液等体积混合后，利用0.1M的盐酸溶液调节pH至6.5，在37℃下酶解处理0.5h后，获得糜蛋白酶水解液；

3)利用0.1M碳酸氢钠溶液调整步骤2)所得糜蛋白水解液的pH至7.0，再与步骤1)所得胰蛋白酶溶液进行等体积混合，在37℃下酶解处理2.0h后，获得胰蛋白酶水解液；

4)利用0.1M的盐酸溶液将步骤3)所得的胰蛋白酶水解液调整pH至3.0，再与步骤1)所得胃蛋白酶溶液进行等体积混合，在37℃下酶解处理1.5h后，获得酶解液；

5)利用配备3kDa超滤离心管的离心机，在4℃，4000r/min的条件下，离心步骤4)所得酶解液20min，再利用凝胶层析色谱分离去除获得的上清液中的700Da杂质，得到多元活性肽溶液；

6)将步骤5)所得的多元活性肽溶液真空浓缩后，冷冻干燥，获得牛乳β-酪蛋白多元活性肽。