CN103173511B - 一种工业化生产小麦谷氨酰胺肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种工业化生产小麦谷氨酰胺肽的方法，属于食品营养和生物技术领域。本发明以小麦谷朊粉为原料，采用Alcalase和木瓜蛋白酶实现两次分步酶解，然后通过离心、超滤、浓缩和喷雾干燥等工序，制得小麦谷氨酰胺肽。其分子量小于1000Da的组分占90％以上，含有特征性谷氨酰胺肽段谷氨酰胺-精氨酸-谷氨酰胺(Gln-Arg-Gln，QRQ)，含量在2.0％以上。小麦谷氨酰胺肽主要为小分子的低聚肽，且谷氨酰胺含量非常高。经检测，谷氨酰胺肽其中的谷氨酰胺含量达到23.54％。本发明的生产方法具有生物活性高、加工成本低、处理量大、便于工业化生产的优点，以此方法制备的小麦谷氨酰胺肽可以作为新的功能性营养成分应用于普通食品、保健食品和药品的开发与生产，具有广阔的市场前景。

Description

一种工业化生产小麦谷氨酰胺肽的方法
技术领域
本发明涉及以小麦谷朊粉为原料，制备小麦谷氨酰胺肽的工业化生产方法，产品可应用于普通食品、保健食品和药品，属生物技术领域。
背景技术
小麦是小麦属植物的统称，是世界上食用人数最多，分布最广的粮食作物，被称为“世界性的粮食”。谷朊粉，又称活性小麦面筋(vital wheat gluten)，系指以小麦粉为原料，用水洗去淀粉和其它水溶性物质后剩下未变性的面筋粉体，是一种营养丰富的植物蛋白源。从小麦蛋白组成来看，谷朊粉主要成分为蛋白质，含量约70％～80％，此外还含有少量淀粉、纤维、糖、脂肪、类脂和矿物质等。其中麦醇溶蛋白占蛋白总量的40％～50％，麦谷蛋白占30％～40％，球蛋白占6％～10％，清蛋白占3％～5％。
从小麦氨基酸的组成来看，小麦蛋白中总谷氨酸Glx(Gln+Glu)约占氨基酸总含量35％，其次是脯氨酸，约占16％，而碱性氨基酸含量较少。而谷氨酰胺是动物血浆和组织中含量最丰富的游离氨基酸，约占总游离氨基酸的40％～60％。谷氨酰胺是一种十分重要的具有特殊营养作用的条件性必需氨基酸及肠道必需氨基酸。由于Gln在水中的溶解度低，在水溶液中不稳定，对酸敏感等原因，使Gln在肠内、肠外或经口营养的营养生理功能不能得到全面的体现。而蛋白质经水解制得的肽有比蛋白质更好的营养性能，实验证实肽的吸收率比氨基酸高，更容易、更快通过小肠薄膜被人体吸收利用。
随着科学技术迅速发展，人们对谷朊粉的蛋白组成和功能特性认识更深刻，使得其应用领域大大拓宽。近年来，由于谷朊粉的产量不断增加，传统的市场趋于饱和。对于谷朊粉进行精细化深加工，探索发挥谷朊粉营养最大化的高附加值食品原料的工业化道路，就显得十分迫切和必要。
通过对小麦谷朊粉进行蛋白酶酶解，将整蛋白酶解成小分子量的低聚肽，大大增加了产品的溶解性，将其中的谷氨酰胺释放出来，制备出富含谷氨酰胺的小麦谷氨酰胺肽。小麦谷氨酰胺肽的成功制备为传统食品小麦谷朊粉农产品深加工提供了一条新型工业化道路，使小麦谷朊粉这一丰富的普通食品蛋白资源得到充分利用，大大扩大了小麦谷朊粉作为一种传统普通食品原料的应用领域，提高了大宗农产品的附加值，发挥了更大的经济价值，并提高了综合的社会效益。
与原蛋白相比，小分子的小麦谷氨酰胺肽具有良好的加工性能。例如，小麦谷氨酰胺肽在酸性条件下更加稳定，不易沉淀；受热不会凝固，无蛋白变性问题。由于小麦谷氨酰胺肽的分子量较小，极性很大，故水溶性很好，作为食品原料，具有高浓度低粘度、速溶于水和无残渣等特点，即使在50％的高浓度下仍然保持良好的流动性。小麦谷氨酰胺肽具有较强的吸湿性和保湿性，可抑制蛋白质形成凝胶，从而调整蛋白质食品的硬度。
由于其一系列良好的食品加工性能，小麦谷氨酰胺肽也可与其它不同来源的蛋白质混合，以提高其营养价值，也可用于生产速溶饮品、功能饮料、肉制品、乳制品、焙烤食品等多样化的食品。另外，小麦谷氨酰胺肽可应用为中老年、运动营养、控制体重等饮食中的蛋白质补充，或作为消化吸收机能障碍病患的食品及婴儿食品的营养配方，也可添加在新兴的酒饮料产品中。
小麦谷氨酰胺肽，因其相当高的安全性和营养价值，并且具有良好的食品加工性能可以添加到许多的食品当中去，其市场前景非常看好。
发明内容
本发明的目的是拓宽小麦谷朊粉的加工利用途径并克服目前小麦肽活性不明确、特征肽段不清、生产规模不大等方面的不足，建立从小麦谷朊粉中获取具有小麦谷氨酰胺肽的工业化方法。
为实现上述目的，本发明采用碱热处理与连续酶解相结合的方法，将小麦谷朊粉以100∶6～12(L∶kg)的液料比与水混配调浆，调整pH值范围为9～11，加热至50～80℃，保温搅拌20～60min。然后将反应罐中的碱性料液泵入片式离心机中，分离成清液和渣料。收集渣料，将渣料加水稀释，加热至50～80℃，搅拌并分离。同样的处理方式重复3次。纯化后的渣料以100∶40～50的水渣比加水混合、搅拌，调pH至7～9，加热至40～60℃，按每克蛋白质2000～5000单位酶量加入Alcalase，反应3～5小时。然后，按每克蛋白质1000～2000单位酶量加入木瓜蛋白酶，温度45～55℃，酶解1～2小时。最后，将酶解液加热到120℃，灭酶10min。
小麦蛋白酶解液用管式离心机离心，转速12000～16000r/min，留用离心清液，用孔径0.05～0.1μm的微滤和超滤设备进行过滤，条件为压力0.2～0.4MPa，温度30～80℃。玉米降压活性肽透过液用双效降膜蒸发器蒸发，直到浓缩液的固含量为20～50％，条件为蒸汽压0.1±0.02MPa，温度40～80℃。按照浓缩液含量5％的比例加入活性碳粉进行脱色，加热到80℃，保温搅拌20～40min，然后采用卷式纳滤膜过滤。玉米降压活性肽浓缩液用离心喷雾干燥器进行干燥处理，条件为进口温度160～180℃，出口温度80～90℃，最后制成小麦谷氨酰胺肽粉。
制备的小麦谷氨酰胺肽经过化学成分分析确定基本的理化成分，并通过高效液相色谱检测小麦谷氨酰胺肽成分的分子量分布，发现分子量小于1000Da的组分总共占90％以上。经采用氨基酸分析和液相色谱分析，小麦谷氨酰胺肽中总谷氨酸含量为34.6％，其中谷氨酰胺肽中谷氨酰胺的含量高达23.54％。经液质联用分析，对小麦谷氨酰胺肽中的肽段进行分离及结构鉴定，其中特征性肽段谷氨酰胺-精氨酸-谷氨酰胺(Gln-Arg-Gln，QRQ)的含量在2.0％以上。
通过该方法生产的小麦谷氨酰胺肽，可应用于保健性功能食品及药品领域。
附图说明
下面对附图进行简要说明。
图1是小麦谷氨酰胺肽分子凝胶高效液相色谱分离色谱图(220nm)。
图2是小麦谷氨酰胺肽反相色谱图中QRQ(Gln-Arg-Gln：RT＝9.17min)色谱峰。
图3是QRQ标准品的高效液相色谱峰(Gln-Arg-Gln：RT＝9.17min)。
图4是小麦谷氨酰胺肽中QRQ(Gln-Arg-Gln)的二级质谱图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明的范围。其具体工艺路线由以下步骤构成：
1.小麦谷氨酰胺肽的制备
将500kg小麦谷朊粉加入反应罐I中，以100∶9(L∶kg)的液料比用水与小麦谷朊粉混配调浆，调整pH值范围为10，加热至65℃，并保温搅拌40min。将反应罐中的碱性料液泵入片式离心机中，分离成清液和渣料。收集渣料，加入到反应罐II中，弃去清液。将渣料加水稀释，加热至65℃，搅拌并分离。同样的处理方式进行3次，以便除去油、淀粉、纤维和其他非蛋白物质。纯化后的渣料以100∶45的水渣比加水混合、搅拌。然后将小麦蛋白液调pH至8，加热至50℃，按每克蛋白质3500单位酶量加入Alcalase，此条件下反应4小时。然后，按每克蛋白质1500单位酶量加入木瓜蛋白酶，温度50℃，酶解1.5小时。然后，将酶解液加热到120℃，灭酶10min。
用管式离心机将酶解液离心，转速14000r/min，分离出清液和渣料，留用离心清液。将上述清液用孔径0.06μm的微滤和超滤设备进行过滤，条件为压力0.3MPa，温度55℃，制得澄清的小麦谷氨酰胺肽透过液。用双效降膜蒸发器将上述透过液蒸发，直到浓缩液的固含量为40％，条件为蒸汽压0.1MPa，温度60℃。按照谷氨酰胺肽浓缩液总固含量5％的比例加入活性碳粉，加热到80℃，保温搅拌半小时后，过滤。然后，用离心喷雾干燥器将小麦谷氨酰胺肽浓缩液进行干燥处理。干燥条件设为进口温度170℃，出口温度85℃。最后，制得205.32Kg小麦谷氨酰胺肽。
2.小麦谷氨酰胺肽的理化组成和分子量分布分析
小麦谷氨酰胺肽的成分分析结果见表1，从中可以看出本发明制备的小麦谷氨酰胺肽总蛋白质含量高达98.3％，具有很高的产品质量。
将小麦谷氨酰胺肽样品于GEL-HPLC中进样以后，得到其凝胶色谱图，如图1所示。用液相数据处理软件将小麦谷氨酰胺肽的凝胶色谱数据代入校正曲线方程中进行计算，得到样品的肽的相对分子质量及其分布范围。分子量1000Da以下组分中的二肽、三肽的在人体内的吸收利用率极高，具有比游离氨基酸更高的营养价值和生理功能。本发明用峰面积归一化法计算了小麦谷氨酰胺肽的相对分子质量分布范围，如表2所示。由分子量分布结果可以看出，分子量小于1000Da的组分总共占92.32％，如果按氨基酸的平均分子量137Da来计算，分子量1000Da以下的组分则多是八肽以下的低聚肽，也包括部分游离氨基酸。其中分子量在140Da-500Da的占61.31％，占据了1000Da以下的绝大部分，这部分主要是二肽、三肽和四肽。
表1小麦谷氨酰胺肽的基础理化成分数据
  含量/％
  总蛋白质(干基)   98.3±0.56
  脂肪   0.05±0.01
  灰分   4.56±0.25
表2小麦谷氨酰胺肽分子量分布结果
3.小麦谷氨酰胺肽粉中谷氨酰胺含量
由于小麦谷氨酰胺肽粉的蛋白质含量非常之高，达到了98％以上。小麦谷氨酰胺肽粉中主要为蛋白质类的物质。针对小麦谷氨酰胺肽粉进行氨基酸组成分析。首先按照盐酸水解成游离氨基酸(谷氨酰胺在酸性条件下转变成谷氨酸)，经氨基酸分析仪检测的方法，测定其中的总谷氨酸Glx(Gln+Glu)含量。结果发现小麦谷氨酰胺肽粉中总谷氨酸含量高达34.60％。
采用BTI-AQC二步柱前衍生法，进一步进行有效的谷氨酰胺肽含量检测，发现小麦谷氨酰胺肽(非游离的谷氨酰胺)中Gln含量为23.54％，远远高于其它常见食源性蛋白肽类产品。
大部分的食用蛋白中小麦蛋白的总谷氨酸含量最为丰富。小麦谷氨酰胺肽粉中富含谷氨酰胺。在正常生理状态下，肠道既不合成也不储存谷氨酰胺，肠粘膜细胞增生所需要的大量谷氨酰胺来源于体内合成。谷氨酰胺是肠道粘膜上皮细胞的主要能源物质，同时也是核酸合成的重要成分，因此谷氨酰胺更是维持肠道粘膜结构完整性所不可缺少的特殊氨基酸。
表3小麦谷氨酰胺肽粉的氨基酸组成
4.小麦谷氨酰胺肽中结构鉴定与标志性谷氨酰胺肽肽段定量
根据国内外最新营养研究表明，蛋白质摄入后，并不完全水解成氨基酸，而是大部分以肽的形式被机体消化吸收。肽类物质除具有易消化、易吸收的营养功能外，更重要的生物学意义主要体现在其具有氨基酸不可比拟的生理活性功能。小麦谷氨酰胺肽作为一种混合性肽，含有许多具有各种生理功能的肽段。同时，其相对分子质量小于1000的组分占到90％以上，说明本产品基本上是由短肽组成。特殊的蛋白原料来源和独特的生产工艺，使本产品含有一定量的特征成分肽。
我们对小麦谷氨酰胺肽中的肽段进行分离及结构鉴定。通过采用高效液相色谱分离与质谱分析，对本产品中的肽段进行分离及结构鉴定，共鉴定出40个肽段的一级结构。
我们已研究出定量测定小麦谷氨酰胺肽中QRQ(Gln-Arg-Gln)的高效液相色谱分析法。将小麦谷氨酰胺肽样品经前处理后，以反相C18填料为固定相，依据样品组分分子极性大小的差别进行分离，在紫外吸收波长220nm条件下检测，采用外标法进行定量，并对色谱图及其数据进行处理(图2、图3)，计算得到QRQ的含量。鉴于不同批次的小麦谷氨酰胺肽样品中均含有2.0％以上的QRQ，故将QRQ作为小麦谷氨酰胺肽中的特征性成分。QRQ的二级质谱结构图见图4。

Claims (2)

1.一种利用小麦谷朊粉制备谷氨酰胺肽的工业化酶解方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(1)将小麦谷朊粉加入反应罐中，以100∶2～20(L∶kg)的液料比用水与小麦谷朊粉混配调浆，调整pH值范围为8～12，加热至50～90℃，保温搅拌20～90min；
(2)将反应罐中的碱性料液泵入离心机中，分离成清液和渣料，收集渣料，将渣料加水稀释，加热至50～80℃，搅拌并分离，以同样的处理方式进行3次；
(3)纯化后的渣料以100∶10～50的水渣比加水混合、搅拌，调pH至7～9，加热至40～60℃，按每克蛋白质1000～8000单位酶量加入Alcalase，反应1～5h，然后，按每克蛋白质1000～2000单位酶量加入木瓜蛋白酶，温度45～55℃，酶解1～3h，最后，将酶解液加热到120℃，灭酶10min。
2.根据权利要求1所述方法制备的小麦谷氨酰胺肽，其特征在于分子量小于1000Da的组分占90％以上，游离氨基酸含量低于5％，并至少含有2％含量的谷氨酰胺-精氨酸-谷氨酰胺(Gln-Arg-Gln，QRQ)序列肽段。
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