WO2013091273A1 - 生产小麦谷氨酰胺肽的方法 - Google Patents

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谷瑞增
易维学
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马勇
董哲
潘兴昌
马永庆
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鲁军
金振涛
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刘文颖
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中国食品发酵工业研究院
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Definitions

  • Glutinous rice gluten also known as vital wheat gluten, is a nutrient-rich vegetable protein source that uses wheat flour as a raw material to wash away starch and other water-soluble substances with water and leave undenatured gluten powder.
  • the main component of gluten is protein, about 70 ° / cr ⁇ 80%, in addition to a small amount of starch, fiber, sugar, fat, lipids and minerals.
  • gliadin accounts for 40% ⁇ 50% of the total protein
  • glutenin accounts for 30% ⁇ 40%
  • globulin accounts for 6% ⁇ 10%
  • albumin accounts for 3% ⁇ 5%.
  • the total glutamic acid Glx (Gln+Glu) in wheat protein accounts for about 35% of the total amino acid content, followed by valine, which accounts for about 16%, while the basic amino acid content is less.
  • Glutamine is the most abundant free amino acid in animal plasma and tissues, accounting for about 40% to 60% of the total free amino acids.
  • Glutamine is a very important conditional essential amino acid with special nutritional effects and essential amino acids in the intestine. Due to the low solubility of Gin in water, instability in aqueous solution, sensitivity to acid, etc., the nutritional and physiological functions of Gin in the intestine, parenteral or oral nutrition cannot be fully reflected.
  • the peptide prepared by hydrolysis of the protein has better nutritional properties than the protein, and it is proved that the absorption rate of the real peptide is higher than that of the amino acid, and it is easier and faster to be absorbed and utilized by the small intestine film.
  • wheat glutamine peptides can also be mixed with other proteins from different sources to enhance their nutritional value. They can also be used to produce instant drinks, functional drinks, meat products, dairy products, baked goods, etc. A variety of food.
  • wheat glutamine peptide can be used as a protein supplement in diets for middle-aged, sports nutrition, weight control, etc., or as a nutritional formula for foods and baby foods for patients with digestive dysfunction, and can also be added to emerging beverages. In the product.
  • the invention adopts a combination of alkali heat treatment and continuous enzymatic hydrolysis, and the wheat gluten powder is mixed with water at a liquid to material ratio of 100: 6-12 (L: kg) to adjust the pH range. For 9 ⁇ 11, heat to 50 ⁇ 80 °C, keep stirring for 20 ⁇ 60 min.
  • the alkaline liquid in the reaction tank is then pumped into a chip centrifuge and separated into a clear liquid and a slag. The slag is collected, the slag is diluted with water, heated to 50-80 ° C, stirred and separated. The same treatment was repeated 3 times.
  • the wheat protein hydrolysate was centrifuged in a tube centrifuge at a speed of 12,000 to 16000 r/min.
  • the centrifuge solution was retained and filtered with a microfiltration and ultrafiltration device with a pore size of 0.05 to 0.1 ⁇ m.
  • the pressure was 0.2 to 0.4 MPa, and the temperature was 3. ( ⁇ 80'C.
  • Corn antihypertensive peptide permeate is evaporated by double-effect falling film evaporator until the solid content of the concentrate is 20 ⁇ 50%, the condition is vapor pressure 0.1 ⁇ 0.02MPa, temperature 40 ⁇ 80° C.
  • the prepared wheat glutamine peptide was analyzed by chemical composition to determine the basic physical and chemical components, and the molecular weight distribution of wheat glutamine peptide was determined by high performance liquid chromatography. It was found that the molecular weight of less than 100 OOAa accounted for more than 90%. After analysis by amino acid analysis and liquid chromatography, the total glutamic acid content of wheat glutamine peptide was 34.6%, and the content of glutamine in glutamine peptide was as high as 23.54%. The peptides in wheat glutamate were separated and identified by liquid chromatography-mass spectrometry. The characteristic peptide glutamine-arginine-glutamine (Gln-Ai3 ⁇ 4-Gln, QRQ) was isolated. The content is above 2.0%.
  • the wheat glutamine peptide produced by the method can be applied to the fields of health functional foods and medicines.
  • Figure 1 is a high performance liquid chromatographic separation chromatogram (220 nm) of wheat glutamine peptide molecular gel.
  • Figure 4 is a secondary mass spectrum of QRQ (Gln-Arg-Gln) in wheat glutamine peptide.
  • the wheat protein solution was adjusted to pH 8, and heated to 50 ° C, and Alcalase was added in an amount of 3,500 units per gram of protein, and the reaction was carried out for 4 hours under the conditions.
  • papain was added at a rate of 1500 units per gram of protein at a temperature of 50 ° C for 1.5 hours.
  • the enzymatic hydrolysate was heated to 120 ° C and the enzyme was inactivated for 10 min.
  • the activated carbon powder was added in a proportion of 5% of the total solid content of the glutamine peptide concentrate, heated to 80 ° C, and stirred for half an hour, and then filtered. Then, the wheat glutamine peptide concentrate was dried by a centrifugal spray dryer. The drying conditions were set to an inlet temperature of 170'C and an outlet temperature of 85'C. Finally, 205.32 Kg of wheat glutamine peptide was obtained.
  • the gel chromatography data of wheat glutamine peptide was substituted into the calibration curve equation by liquid phase data processing software to obtain the relative molecular mass of the peptide of the sample and its distribution range.
  • the dipeptide and tripeptide in the components below the molecular weight lOOODa have extremely high absorption utilization rate in the human body, and have higher nutritional value and physiological functions than free amino acids.
  • the present invention calculates the relative molecular mass distribution range of wheat glutamine peptide by peak area normalization method, as shown in Table 2.
  • the BTI-AQC two-step pre-column derivatization method was used to further detect the effective glutamine peptide content. It was found that the Gin content of wheat glutamine peptide (non-free glutamine) was 23.54%, which was much higher than other common foods. Source protein peptide products.
  • Wheat glutamine peptide powder is rich in glutamine. Under normal physiological conditions, the intestine neither synthesizes nor stores glutamine, and the large amount of glutamine required for intestinal mucosal cell proliferation is derived from in vivo synthesis. Glutamine is the main energy source of intestinal mucosal epithelial cells and an important component of nucleic acid synthesis. Therefore, glutamine is more important for maintaining intestinal tract. A special amino acid that is indispensable for the structural integrity of the mucosa. Table 3 Amino acid composition of wheat glutamine peptide powder
  • QRQ was used as a characteristic component in wheat glutamine peptides.
  • the secondary mass spectrometry structure of QRQ is shown in Figure 4.

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Abstract

本发明公开了一种生产小麦谷氨酰胺肽的方法，属于食品和生物技术领域。该方法包括以小麦谷阮粉为原料，采用Alcalase和木瓜蛋白酶实现两次分步酶解，然后通过离心、超滤、浓缩和喷雾干燥等工序，生产分子量小于1000Da的组分占90%以上，含有的特征性谷氨酰胺肽段谷氨酰胺-精氨酸-谷氨酰胺（Gln-Arg-Gln，QRQ）含量在2.0%以上，谷氨酰胺含量达到23.54%的小麦谷氨酰胺肽。生产的谷氨酰胺肽可以作为功能性营养成分应用于普通食品、保健食品和药品的开发与生产。

Description

生产小麦谷氨酰胺肽的方法 技术领域
本发明涉及以小麦谷朊粉为原料， 制备小麦谷氨酰胺肽的工业化生产方法， 产品可应用于普通食品、 保健食品和药品， 属生物技术领域。 背景技术
小麦是小麦属植物的统称， 是世界上食用人数最多， 分布最广的粮食作物， 被称为 "世界性的粮食"。 谷朊粉， 又称活性小麦面筋 （vital wheat gluten) , 系指以小麦粉为原料， 用水洗去淀粉和其它水溶性物质 后剩下未变性的面筋粉体， 是一种营养丰富的植物蛋白源。 从小麦蛋白组成来看， 谷朊粉主要成分为蛋白 质， 含量约 70°/cr~80%， 此外还含有少量淀粉、 纤维、 糖、 脂肪、 类脂和矿物质等。 其中麦醇溶蛋白占蛋 白总量的 40%~50%， 麦谷蛋白占 30%〜40%, 球蛋白占 6%〜10%， 清蛋白占 3%〜5%。 从小麦氨基酸的组成来看， 小麦蛋白中总谷氨酸 Glx (Gln+Glu) 约占氨基酸总含量 35%， 其次是脯 氨酸， 约占 16%， 而碱性氨基酸含量较少。 而谷氨酰胺是动物血浆和组织中含量最丰富的游离氨基酸， 约 占总游离氨基酸的 40%〜60%。 谷氨酰胺是一种十分重要的具有特殊营养作用的条件性必需氨基酸及肠道 必需氨基酸。 由于 Gin在水中的溶解度低， 在水溶液中不稳定， 对酸敏感等原因， 使 Gin在肠内、 肠外或 经口营养的营养生理功能不能得到全面的体现。 而蛋白质经水解制得的肽有比蛋白质更好的营养性能， 实 验证实肽的吸收率比氨基酸高， 更容易、 更快通过小肠薄膜被人体吸收利用。
随着科学技术迅速发展，人们对谷朊粉的蛋白组成和功能特性认识更深刻，使得其应用领域大大拓宽。 近年来， 由于谷朊粉的产量不断增加， 传统的市场趋于饱和。 对于谷朊粉进行精细化深加工， 探索发挥谷 朊粉营养最大化的高附加值食品原料的工业化道路， 就显得十分迫切和必要。
通过对小麦谷朊粉进行蛋白酶酶解， 将整蛋白酶解成小分子量的低聚肽， 大大增加了产品的溶解性， 将其中的谷氨酰胺释放出来， 制备出富含谷氨酰胺的小麦谷氨酰胺肽。 小麦谷氨酰胺肽的成功制备为传统 食品小麦谷朊粉农产品深加工提供了一条新型工业化道路， 使小麦谷朊粉这一丰富的普通食品蛋白资源得 到充分利用，大大扩大了小麦谷朊粉作为一种传统普通食品原料的应用领域，提高了大宗农产品的附加值， 发挥了更大的经济价值， 并提高了综合的社会效益。
与原蛋白相比， 小分子的小麦谷氨酰胺肽具有良好的加工性能。例如， 小麦谷氨酰胺肽在酸性条件下 更加稳定， 不易沉淀； 受热不会凝固， 无蛋白变性问题。 由于小麦谷氨酰胺肽的分子量较小， 极性很大， 故水溶性很好， 作为食品原料， 具有高浓度低粘度、速溶于水和无残渣等特点， 即使在 50%的高浓度下仍 然保持良好的流动性。小麦谷氨酰胺肽具有较强的吸湿性和保湿性， 可抑制蛋白质形成凝胶， 从而调整蛋 白质食品的硬度。 1 由于其一系列良好的食品加工性能， 小麦谷氨酰胺肽也可与其它不同来源的蛋白质混合， 以提高其营 养价值， 也可用于生产速溶饮品、 功能饮料、 肉制品、 乳制品、 焙烤食品等多样化的食品。 另外， 小麦谷 氨酰胺肽可应用为中老年、运动营养、控制体重等饮食中的蛋白质补充， 或作为消化吸收机能障碍病患的 食品及婴儿食品的营养配方， 也可添加在新兴的酒饮料产品中。
小麦谷氨酰胺肽， 因其相当高的安全性和营养价值， 并且具有良好的食品加工性能可以添加到许多的 食品当中去， 其市场前景非常看好。
发明内容
本发明的目的是拓宽小麦谷朊粉的加工利用途径并克服目前小麦肽活性不明确、 特征肽段不清、 生产 规模不大等方面的不足， 建立从小麦谷朊粉中获取具有小麦谷氨酰胺肽的工业化方法。
为实现上述目的， 本发明采用碱热处理与连续酶解相结合的方法， 将小麦谷朊粉以 100: 6-12 (L: kg)的液料比与水混配调浆， 调整 pH值范围为 9~11， 加热至 50~80°C , 保温搅拌 20~60 min。 然后将反应 罐中的碱性料液泵入片式离心机中， 分离成清液和渣料。 收集渣料， 将渣料加水稀释， 加热至 50~80'C， 搅拌并分离。 同样的处理方式重复 3次。 纯化后的渣料以 100: 40~50的水渣比加水混合、 搅拌， 调 pH至 7-9, 加热至 40~60°C， 按每克蛋白质 2000~5000单位酶量加入 Alcalase, 反应 3~5小时。 然后， 按每克蛋 白质 1000^2000单位酶量加入木瓜蛋白酶， 温度 45~55°C， 酶解 1~2小时。 最后， 将酶解液加热到 120'C， 灭酶 10 min。
小麦蛋白酶解液用管式离心机离心， 转速 12000~16000 r/min， 留用离心清液， 用孔径 0.05~0.1μηι的 微滤和超滤设备进行过滤， 条件为压力 0.2~0.4MPa， 温度 3( ~80'C。 玉米降压活性肽透过液用双效降膜蒸 发器蒸发， 直到浓縮液的固含量为 20~50%, 条件为蒸汽压 0.1 ±0.02MPa， 温度 40~80°C。 按照浓縮液含 量 5%的比例加入活性碳粉进行脱色， 加热到 80'C， 保温搅拌 20~40 min, 然后采用卷式纳滤膜过滤。 玉 米降压活性肽浓縮液用离心喷雾干燥器进行干燥处理， 条件为进口温度 160~180'C， 出口温度 80~90'C， 最后制成小麦谷氨酖胺肽粉。
制备的小麦谷氨酰胺肽经过化学成分分析确定基本的理化成分， 并通过高效液相色谱检测小麦谷氨酰 胺肽成分的分子量分布， 发现分子量小于 lOOODa的组分总共占 90%以上。 经采用氨基酸分析和液相色谱 分析， 小麦谷氨酰胺肽中总谷氨酸含量为 34.6%， 其中谷氨酰胺肽中谷氨酰胺的含量高达 23.54%。经液质 联用分析， 对小麦谷氨醜胺肽中的肽段进行分离及结构鉴定， 其中特征性肽段谷氨酰胺 -精氨酸-谷氨酰胺 (Gln-Ai¾-Gln, QRQ) 的含量在 2.0%以上。
通过该方法生产的小麦谷氨酰胺肽， 可应用于保健性功能食品及药品领域。 附图说明
下面对附图进行简要说明。 图 1是小麦谷氨酰胺肽分子凝胶高效液相色谱分离色谱图 （220nm)。
图 2是小麦谷氨酰胺肽反相色谱图中 QRQ (Gln-Arg-Gln: RT=9.17min) 色谱峰。
图 3是 QRQ标准品的髙效液相色谱峰 （Gln-Arg-Gln: RT=9.17min)。
图 4是小麦谷氨酰胺肽中 QRQ (Gln-Arg-Gln) 的二级质谱图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述， 但并不限制本发明的范围。 其具体工艺路 线由以下步骤构成：
1. 小麦谷氨酰胺肽的制备
将 500 kg小麦谷朊粉加入反应罐 I中， 以 100: 9 (L: kg) 的液料比用水与小麦谷朊粉混配调浆， 调 整 pH值范围为 10, 加热至 65'C， 并保温搅拌 40 min。将反应罐中的碱性料液泵入片式离心机中， 分离成 清液和渣料。 收集渣料， 加入到反应罐 II中， 弃去清液。 将渣料加水稀释， 加热至 65'C， 搅拌并分离。 同 样的处理方式进行 3次， 以便除去油、 淀粉、 纤维和其他非蛋白物质。 纯化后的渣料以 100: 45的水渣比 加水混合、搅拌。然后将小麦蛋白液调 pH至 8， 加热至 50'C , 按每克蛋白质 3500单位酶量加入 Alcalase, 此条件下反应 4小时。 然后， 按每克蛋白质 1500单位嗨量加入木瓜蛋白酶， 温度 50°C， 酶解 1.5小时。 然后， 将酶解液加热到 120'C , 灭酶 10 min。
用管式离心机将酶解液离心， 转速 14000 r/min, 分离出清液和渣料， 留用离心清液。 将上述清液用孔 径 0.06μτη的微滤和超滤设备进行过滤， 条件为压力 OJMPa, 温度 55°C， 制得澄清的小麦谷氨酰胺肽透过 液。用双效降膜蒸发器将上述透过液蒸发，直到浓缩液的固含量为 40%,条件为蒸汽压 O.lMPa,温度 60 ：。 按照谷氨酷胺肽浓縮液总固含量 5%的比例加入活性碳粉， 加热到 80'C , 保温搅拌半小时后， 过滤。然后， 用离心喷雾干燥器将小麦谷氨酰胺肽浓缩液进行干燥处理。干燥条件设为进口温度 170'C,出口温度 85'C。 最后， 制得 205.32 Kg小麦谷氨酰胺肽。
2. 小麦谷氨酰胺肽的理化组成和分子量分布分析
小麦谷氨酰胺肽的成分分析结果见表 1， 从中可以看出本发明制备的小麦谷氨酰胺肽总蛋白质含量高 达 98.3%， 具有很高的产品质量。
将小麦谷氨酰胺肽样品于 GEL-HPLC中进样以后， 得到其凝胶色谱图， 如图 1所示。 用液相数据处 理软件将小麦谷氨酰胺肽的凝胶色谱数据代入校正曲线方程中进行计算， 得到样品的肽的相对分子质量及 其分布范围。 分子量 lOOODa以下组分中的二肽、 三肽的在人体内的吸收利用率极高， 具有比游离氨基酸 更高的营养价值和生理功能。 本发明用峰面积归一化法计算了小麦谷氨酰胺肽的相对分子质量分布范围， 如表 2所示。 由分子量分布结果可以看出， 分子量小于 lOOODa的组分总共占 92.32%, 如果按氨基酸的平 均分子量 137Da来计算， 分子量 lOOODa以下的组分则多是八肽以下的低聚肽， 也包括部分游离氨基酸。 其中分子量在 140Da-500Da的占 61.31%， 占据了 lOOODa以下的绝大部分， 这部分主要是二肽、 三肽和四 肽。 表 1 小麦谷氨酰胺肽的基础理化成分数据
Figure imgf000005_0001
表 2 小麦谷氨酰胺肽分子量分布结果
Figure imgf000005_0002
3. 小麦谷氨酰胺肽粉中谷氨酰胺含量
由于小麦谷氨酰胺肽粉的蛋白质含量非常之高， 达到了 98。/。以上。 小麦谷氨酰胺肽粉中主要为蛋白质 类的物质。 针对小麦谷氨酰胺肽粉进行氨基酸组成分析。 首先按照盐酸水解成游离氨基酸（谷氨酷胺在酸 性条件下转变成谷氨酸）， 经氨基酸分析仪检测的方法， 测定其中的总谷氨酸 Glx (Gln+Glu) 含量。 结果 发现小麦谷氨酰胺肽粉中总谷氨酸含量高达 34.60%。
采用 BTI-AQC二步柱前衍生法， 进一步进行有效的谷氨酰胺肽含量检测， 发现小麦谷氨酰胺肽 （非 游离的谷氨酰胺） 中 Gin含量为 23.54%, 远远高于其它常见食源性蛋白肽类产品。
大部分的食用蛋白中小麦蛋白的总谷氨酸含量最为丰富。 小麦谷氨酰胺肽粉中富含谷氨酰胺。 在正常 生理状态下， 肠道既不合成也不储存谷氨酰胺， 肠粘膜细胞增生所需要的大量谷氨酰胺来源于体内合成。 谷氨酰胺是肠道粘膜上皮细胞的主要能源物质， 同时也是核酸合成的重要成分， 因此谷氨酰胺更是维持肠 道粘膜结构完整性所不可缺少的特殊氨基酸。 表 3 小麦谷氨酰胺肽粉的氨基酸组成
Figure imgf000006_0001
4. 小麦谷氨酰胺肽中结构鉴定与标志性谷氨酰胺肽肽段定量
根据国内外最新营养研究表明， 蛋白质摄入后， 并不完全水解成氨基酸， 而是大部分以肽的形式被机 体消化吸收。 肽类物质除具有易消化、 易吸收的营养功能外， 更重要的生物学意义主要体现在其具有氨基 酸不可比拟的生理活性功能。 小麦谷氨酰胺肽作为一种混合性肽， 含有许多具有各种生理功能的肽段。 同 时， 其相对分子质量小于 1000的组分占到 90%以上， 说明本产品基本上是由短肽组成。 特殊的蛋白原料 来源和独特的生产工艺， 使本产品含有一定量的特征成分肽。
我们对小麦谷氨酰胺肽中的肽段进行分离及结构鉴定。通过采用高效液相色谱分离与质谱分析，对本 产品中的肽段进行分离及结构鉴定， 共鉴定出 40个肽段的一级结构。 我们己研究出定量测定小麦谷氨酰胺肽中 QRQ (Gln-Arg- Gln) 的高效液相色谱分析法。 将小麦谷氨 酰胺肽样品经前处理后， 以反相 C18填料为固定相， 依据样品组分分子极性大小的差别进行分离， 在紫外 吸收波长 220nm条件下检测， 采用外标法进行定量， 并对色谱图及其数据进行处理（图 2、 图 3)， 计算得 到 QRQ的含量。 鉴于不同批次的小麦谷氨酰胺肽样品中均含有 2.0%以上的 QRQ， 故将 QRQ作为小麦谷 氨酰胺肽中的特征性成分。 QRQ的二级质谱结构图见图 4。

Claims

1. 一种利用小麦谷朊粉制备谷氨酰胺肽的工业化 »解方法， 其特征在于所述方法包括以下步骤-
1)将小麦谷朊粉加入反应罐中， 以 100: 2-20 (L: kg) 的液料比用水与小麦谷朊粉混配调浆， 调 整 pH值范围为 8~12, 加热至 50~90。C , 保温搅拌 20~90 min。
2)将反应罐中的碱性料液泵入离心机中， 分离成清液和渣料。 收集渣料， 将渣料加水稀释， 加热至 50~80°C , 搅拌并分离。 以同样的处理方式进行 3次。
3)纯化后的渣料以 100: 10~50的水渣比加水混合、 搅拌， 调 pH至 7~9, 加热至 40~60'C， 按每克 蛋白质 1000~8000单位酵量加入 Alcalase, 反应 l~5 h。然后， 按每克蛋白质 1000~2000单位酶量加入木瓜 蛋白酵， 温度 45~55'C， 酶解 l~3 h。 最后， 将酶解液加热到 120'C， 灭酵 10 min。
2.根据权利要求 1所述的小麦谷氨酰胺肽的工业化制备方法， 其特征在于醇解后的料液通过分离、 浓缩、 脱色和干燥等工艺制得小麦谷氨酰胺肽粉， 具体步骤如下：
1)用管式离心机将如权利要求 1所述小麦蛋白酶解液离心，转速 9000~16000 r/min,留用离心清液， 用孔径 0.05~0.1μηι的微滤和超滤设备进行过滤， 条件为压力 0.2^0.4MPa. 温度 30~80°C , 制得澄清的小麦 谷氨酰胺肽透过液， 然后采用卷式纳滤膜过滤。
2) 用双效降膜蒸发器将上述透过液蒸发， 直到浓缩液的固含量为 20~50%， 条件为蒸汽压 0.1土 0.02MPa, 温度 40~80°C。按照浓縮液含量 5~10%的比例加入活性碳粉进行脱色， 加热到 70~95'C， 保温搅 拌 20-40 min。
3) 用离心喷雾干燥器将上述小麦谷氨酰胺肽浓縮液进行干燥处理， 条件为进口温度 160~180'C， 出 口温度 80~90'C， 制成小麦谷氨酰胺肽粉。
3. 根据权利要求 1、 2所述方法制备的小麦谷氨酰胺肽， 其特征在于分子量小于 1000 Da的组分占 90%以上， 游离氨基酸含量低于 5%。
4. 根据权利要求 1、 2所述方法制备的小麦谷氨酰胺肽， 其特征在于至少含有 2%含量的谷氨酰胺- 精氨酸-谷氨酰胺 （Gln-Arg-Gln， QRQ) 序列肽段。
5. 根据权利要求 1、 2所述方法制备的小麦谷氨酰胺肽作为产品或原料在普通食品、 保健食品和药 品中的应用。
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