CN103039695A - 促进钙吸收的胜肽产物及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种促进钙吸收的胜肽产物的制备方法，包括：将一含有大豆蛋白的原料与水混合，以形成一含水量约45％-65％重量百分比的混合物；将米曲霉(Aspergillus oryzae)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)或混合它们的曲菌菌群接种于上述混合物得到一培养物，其中曲菌菌群的接种量占大豆蛋白原料重量的约0.006％-0.05％；将上述培养物在相对湿度约85％-95％、发酵温度介于约摄氏23～35度的条件下，进行固态发酵得到一发酵产物；将发酵产物进行水解反应得到一大豆水解液；将大豆水解液进行澄清化处理；之后收集水解液以获得含有促进钙吸收的功效的胜肽产物。
Description
技术领域
本发明涉及一种胜肽产物，特别是，涉及一种可以促进钙吸收的胜肽产物及其制造方法。
背景技术
依据台湾地区居民营养调查显示，台湾地区男性平均钙的摄取量为520mg，女性则为542mg，而13-19岁正在发育中的青少年的平均摄取量仅达建议量的51-56％而已，相较于美国RDA(1200mg)或RDI(1300mg)的标准来衡量，不到其建议摄取量的一半。而卫生署在2002年刚修订的「国人膳食营养素参考摄取量」，从原本的成人每天600毫克，提高到800～1000毫克，青少年的提高至1200毫克。
一般较熟悉的钙来源是由乳制品提供，但许多人有乳醣不耐症，此外，在台湾地区，乳制品的人均消费量较西方国家少很多，此也是降低钙摄取总量的原因。
研究发现，乳制品中的酪蛋白(casein)在经过胃及肠的蛋白分解酶分解后会产生抑制钙离子在碱性环境下沉淀的胜肽成分，称之为酪蛋白磷酸肽(Caseinophosphopeptide，CPP)。钙离子在小肠的吸收，除了在少部份(15-20％重量百分比)在前端的十二指肠部份是需要维生素D的主动运输，大多数钙离子进入人体循环系统，靠的是空肠和回肠段的被动运输(60-65％重量百分比)(Bronner，F.1998.Calcium Absorption-A Paradigm for MineralAbsorption J.Nutr.128：917-920；Bronner，F.and Pansu，D.1999.NutritionalAspects of Calcium Absorption.J.Nutr.129：9-12)。由于小肠后段的pH值为弱碱性，因此在含有SerP-SerP-SerP-Glu-Glu序列的CPP胜肽片段存在时，就可维持钙离子的溶解状态并进行穿透肠细胞间隙的被动运输(Ferraretto，A..Signorile，A Gravaghi，C.Fiorilli，A.and Tettamanti，G.2001.CaseinPhosphopeptides Influence Calcium Uptake by Cultured Human Intestinal HT-29Tumor Cells J.Nutr.131：1655-1661)。为了避免缺乏钙导致骨质疏松等疾病的发生，除了增加钙的摄取外，增加钙的吸收率也是一好方法，然而，乳醣不耐症患者不适合利用乳制品中的酪蛋白来促进钙吸收。
过去已有学者提出以含酪蛋白磷酸肽的起司做为促进钙吸收的方法(Kato，K.，Takada，Y.，Matsuyama，H.，Kawasaki，Y.，Aoe，S.，Yano，H.，Toba，Y.2002.Milk calcium taken with cheese increases bone mineral density and bonestrength in growing rats.Biosci Biotechnol Biochem.66：2342-2346)，此方法在提供给乳糖不耐症患者食用时，会造成身体不适的问题。另外，尚有学者提出以化学合成产生单一种促钙吸收胜肽的方式(Galzigna，L.，Domergue，N.，Previero，A.1998.A synthetic calcium-chelating L-glutamyl-L-serine phosphate(Glu-Ser.P)enhances calcium absorption in the rat.J Pept Res.52(1)：15-18)，然而，其成本相当高，无法实际运用于产业界。此外，也有学者利用鳗鱼骨粉来增加钙的摄取，然而，此方法会随着钙量的增加而使吸收率下降(赖爱姬，1996，鳗骨粉与碳酸钙为钙源对老鼠钙利用效果的比较，台湾营养学会杂志，第21卷2期121-131页)。中国专利CN1101471C中揭露以大豆为原料进行液态发酵，以得到大豆蛋白胜肽产物。另外，台湾专利TW I298622公开了提高大豆蛋白营养效率的两段式发酵方法，其中，该说明书揭露了一种提高大豆蛋白营养效率的两段式发酵方法，其是将大豆原料先经预发酵工程(曲菌发酵)处理后，将所得产物再与大豆原料混合，经调整水份后，接种乳酸菌，继续进行乳酸菌发酵及酶解工序，最后可直接利用或经干燥粉碎，做成粉状制品，然而上述方法需要经过蒸煮，并且需使用乳酸菌进行后续发酵，步骤较为繁杂且成本较高，此外，该案于第二阶段发酵时，将水分控制在35-50％，其基本上是呈现一固态状态，因此水解反应无法较充分地进行，故较难获得小片段胜肽的大豆蛋白水解液。
综上所述，人们亟需一种低制造成本、并可以让乳醣不耐症患者食用的增加钙吸收率的产物。
发明内容
本发明提供一种促进钙吸收的胜肽产物的制备方法，包括：将一含有大豆蛋白的原料与水混合，以形成一含水量约45％-65％重量百分比的混合物；将一曲菌菌群接种于上述混合物得到一培养物，其中，该曲菌菌群包括：米曲霉(Aspergillus oryzae)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)或它们的混合物，且该曲菌菌群的接种量占该大豆蛋白原料重量的约0.006％-0.05％；将上述培养物进行固态发酵得到一发酵产物，其中，该固态发酵的条件包括：相对湿度约85％-95％；发酵温度介于约摄氏23～35度；将上述发酵产物进行水解反应得到一大豆水解液；将上述大豆水解液依次进行固液分离和澄清化处理；以及收集含有该促进钙吸收的胜肽产物的水解液。
本发明还提供一种作为促进钙吸收的胜肽产物，其是由上述方法制备而得。
附图说明
图1为比较大豆蛋白水解液与酪蛋白磷酸肽抑制碳酸钙结晶的效果。
图2为不同蛋白源物质抑制碳酸钙结晶的效果。
图3显示喂食促钙吸收胜肽与大豆蛋白饲料的老鼠的钙吸收率，平均值±95％信任区间，两者间具有显著差异(p＜0.05)。
具体实施方式
为了使本发明的上述和其它目的、特征以及优点能更明显易懂，下文特举优选实施例，并配合所附图示，作详细说明如下。
本方法是提供一种利用含大豆胜肽的原料来制造促进钙吸收的胜肽产物的方法，在一实施例中，将大豆粉以曲菌进行固态发酵分解后，再进行水解反应，然后进行澄清步骤，得到澄清的水解液。实验证明大豆蛋白被水解后产生的大豆胜肽具有良好的抑制钙沉淀以及提高钙吸收的效果，可以提升钙的吸收率。
本发明是利用大豆来制造大豆胜肽，其原理是利用米曲霉(Aspergillusoryzae)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)或混合上述菌种而成的曲菌菌群来处理含有大豆蛋白的原料，以进行固态发酵，其中，上述大豆蛋白的来源包括但不限于大豆粉、脱脂大豆粉、脱脂大豆片、大豆分离蛋白、大豆粕、豆饼、或上述的组合。在一实施例中，上述曲菌接种量占原料总重量的约0.006％-0.05％，优选为约0.008％～0.02％，更优选为约0.013％。在上述固态发酵中，可使用各种缓冲液，例如：柠檬酸-柠檬酸钠、乙酸-乙酸钠、K2HPO4-KH2PO4、Na2HPO4-NaH2PO4、硼酸-氢氧化钠、三羟甲基甲氨基丙磺酸、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、N-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸、3-(N-吗非啉)乙磺酸 哌嗪-N，N′-二(2-乙磺酸)、二甲基胂酸 柠檬酸钠、2-吗啉乙磺酸等，调节固态发酵所需的水分，其所需的水分占原料与水混合物总重的约45％-65％，优选为约50％-60％，更优选为约55％。在一实施例中，该固态发酵可在pH值约5～7；相对湿度约85％-95％；发酵温度介于约摄氏23～35度；发酵的时间约2～5天的条件下进行。
接着，将上述发酵产物进行水解反应，以得到大豆水解液。在一实施例中，上述水解反应的进行步骤包括：将上述发酵产物与水以重量比约1∶1～1∶3的比例混合，优选为约1∶2；水解的时间为约3-24小时，优选为约6小时；水解温度介于约摄氏30-65度，优选为约摄氏45度。之后，再提高反应温度至约摄氏90-95度以抑制酶活性。
之后再将上述大豆水解液进行固液分离等澄清化处理。例如，可先使用压榨机，以油压方式使之固液分离。然后液体加热90℃、10分钟后产生的沉淀，再以高速离心机去除沉淀，最后使用板框式压滤机或是使用微过滤膜过滤水解液，并收集含有该含有促进钙吸收的胜肽的水解液。应了解的是，本领域技术人员也可使用任何其它适当的固液分离方式，以及其它适当的过滤手段所得的大豆胜肽产物经体外(in vitro)试验证实，具有抑制碳酸钙沉淀的效果；动物喂养试验的结果也显示，在喂食含此大豆胜肽的食物，可有效提高动物的钙吸收率。
本发明所提供的促进钙吸收的胜肽产物的制备方法采用的大豆蛋白原料取得容易且成本低廉，另外，在有关大豆胜肽的生产中，液态发酵的工序虽比较容易控制，但其产率普遍较固态发酵低，且液态发酵设备成本也较高。并且在本发明所提供的实施例中，省略了高温高压灭菌的步骤，因此，本发明所得的胜肽产物具有低制造成本、且可为乳糖不耐症患者食用等优点。
【实施例】
实施例1.促进钙吸收大豆胜肽的制造
以脱脂大豆粉为原料，接种酱油曲霉(Aspergillus sojae)，其中，曲菌接种量为大豆原料总重量的0.013％，以重量百分浓度0.25％的CH3COONa/0.25％HNaSO3、pH＝5.8的缓冲液调节水分至55％，在25～30℃、相对湿度95％以上的环境下培养2天。
接着进行水解反应，将大豆曲加水混合，其中，大豆曲与水的比例为1∶2，水解时间为6小时，水解温度为45℃，再提高温度至90-95℃，维持10分钟，以抑制酶活性。
接着，进行水解液的澄清化处理，先使用压榨机，将大豆水解物置于滤袋中，平铺于压榨槽，以油压方式使之固液分离。然后液体加热90℃、10分钟后产生的沉淀，再以离心高速离心机(转速16000rpm，台中，泉泰公司制造)去除沉淀，最后使用板框式压滤机过滤(Seitz Orion，德国制造)或是使用微过滤膜(0.3μm)过滤水解液，得到澄清的大豆水解液。
实施例2.大豆水解液抑制碳酸钙沉淀的效果
根据Jin等人(J.Agnc.Food Chem.2000)碳酸钙结晶实验略加修改，将1mL样品与1mL浓度40mM的氯化钙和1.2mL蒸馏水混合，然后加入0.8mL浓度40mM碳酸氢钠后反应1小时，并使用0.1N氢氧化钠滴定，维持pH＝8.5。将结束反应的混合液进行离心(离心力为2000g)，取上清液并使用测钙试剂组(台湾默克公司产物)测量钙浓度，此为可溶钙含量。
抑制碳酸钙结晶实验中，由实施例1所得的大豆蛋白水解液对于碳酸钙结晶有抑制效果，此效果的评估是在碱性条件(pH＝8.5)下，完全抑制碳酸钙结晶的最低样品浓度，如果发生碳酸钙沉淀，上清液的钙含量则降低；反之，上清液的钙含量则不变。图1为比较大豆蛋白水解液与酪蛋白磷酸肽抑制碳酸钙结晶的效果，其结果显示有助于钙吸收的酪蛋白磷酸肽蛋白(CPP)最低抑制浓度为1.76×10-4％，而本发明的大豆蛋白水解液的蛋白最低抑制浓度为2.16×10-3％。
实施例3.大豆水解液抑制的效果
在本实施例中，选择不同蛋白来源物质做比较，将1mL样品与1mL浓度40mM的氯化钙和1.2mL蒸馏水混合，然后加入0.8mL浓度40mM碳酸氢钠后反应1小时，并使用0.1N氢氧化钠滴定，维持pH＝8.5。将结束反应的混合液进行离心(离心力为2000g)，取上清液并使用测钙试剂组(台湾默克公司产物)测量钙浓度，并在碱性条件(pH＝8.5)下，完全抑制碳酸钙结晶的最低样品浓度作为可溶钙含量的评估标准。
图2为不同蛋白源物质抑制碳酸钙结晶的效果。其中，游离氨基酸如谷氨酸钠盐(monosodium glutamate，MSG)、甘氨酸(glycine)的抑制效果较差；接着是蛋白质如大豆分离蛋白(isolated soy protein，ISP)、酪蛋白(casein)，鸡精(essence of chicken，市售产物，为鸡肉蛋白抽取物)，其抑制碳酸钙沉淀的效果优于前两类；而本发明的大豆蛋白水解液(soy hydrolysate)最佳。可见单一的游离氨基酸或者是完整蛋白质与钙离子螯合的情形不如蛋白质水解物，蛋白质经过程度不同的水解后，它们具有较好的抑制钙沉淀效果。因此，以胜肽型式的蛋白食材例如鸡精，还有本发明利用曲菌酶分解大豆蛋白水解液皆是不错的抑钙沉淀辅剂。
实施例4.促钙吸收胜肽对动物钙吸收的效果
实验方式类似赖爱姬的论文(台湾营养学会杂志，第21卷2期，1996)，但略做修改，采用成年雌性鼠(Bltw：SD；购自乐斯科生物科技股份有限公司)饲养于各自独立的代谢笼中，室温维持在23±2℃，光照12小时，禁食一天待体内食物排除后，分别提供添加大豆分离蛋白为对照组和提供促钙吸收胜肽作为实验组，每组样本数各为10只，令动物任意摄食，每日收取粪便，6天后取走饲料，秤其所吃的总量，再等待一天排除吃的饲料后，收集及分析其排出粪便中的钙含量。钙的分析法为以硝酸做硝化反应后，以原子吸光仪测定。
钙的总摄取量以吃的饲料量乘饲料中钙的含量推估。钙的吸收率为(总摄取量-粪便中的钙含量)/总摄取量。
图3显示喂食促钙吸收胜肽与大豆蛋白饲料老鼠的钙吸收率。比较大豆蛋白和促钙吸收胜肽的吸收率发现，促钙吸收胜肽的吸收率明显高于大豆蛋白，平均值±95％信任区间，两者间具有显著差异(p＜0.05)。
表1、大豆分离蛋白(对照组)及促钙吸收胜肽(实验组)的饲料配方(每2000克饲料中各成分的量，单位为克)。
| 实验组 | 对照组 | |
| 蛋白质(Protein) | ||
| 促进钙吸收的胜肽产物 | 500 | 0 |
| 大豆分离蛋白(ISP) | 0 | 334 |
| 酪蛋白(Casein) | 108 | 108 |
| 大豆油(Soy oil) | 200 | 200 |
| 蔗糖(Sucrose) | 1108 | 1108 |
| 羧甲基纤维素(CMC) | 0 | 166 |
| 矿物质(Mineral) | 60 | 60 |
| 维生素(Vitamin) | 20 | 20 |
| 胆碱(Choline) | 4 | 4 |
| 总合(Total) | 2000 | 2000 |
虽然本发明公开了如上所述的优选实施例，但这些实施例并非用以限定本发明，本领域技术人员应该理解在不脱离本发明的精神和范围内，可作些许更动与润饰，因此，本发明的保护范围应当视权利要求书要求保护的范围为准。
Claims (9)
1.一种促进钙吸收的胜肽产物的制备方法，包括：
将一含有大豆蛋白的原料与水混合，以形成一含水量约45％～65％重量百分比的混合物；
将一曲菌菌群接种于上述混合物得到一培养物，其中，该曲菌菌群包括：米曲霉、酱油曲霉或它们的混合物，且该曲菌菌群的接种量占该大豆蛋白原料重量的约0.006％～0.05％；
将上述培养物进行固态发酵得到一发酵产物，其中，该固态发酵的条件包括：
相对湿度约85％～95％、
发酵温度介于约摄氏23～35度；
将上述发酵产物进行水解反应得到一大豆水解液；
将上述大豆水解液依次进行澄清化处理和固液分离；以及
收集含有该促进钙吸收的胜肽产物的水解液。
2.如权利要求1所述的促进钙吸收的胜肽产物的制备方法，其中，该含有大豆蛋白的原料包括大豆粉、脱脂大豆粉、脱脂大豆片、大豆分离蛋白、大豆粕、豆饼或它们的组合。
3.如权利要求1所述的促进钙吸收的胜肽产物的制备方法，其中，该固态发酵是在pH值约5～7下进行。
4.如权利要求1所述的促进钙吸收的胜肽产物的制备方法，其中，该固态发酵的时间为约2～5天。
5.如权利要求1所述的促进钙吸收的胜肽产物的制备方法，其中，在该水解反应中，该发酵产物与水的混合重量比为约1∶1～1∶3。
6.如权利要求1所述的促进钙吸收的胜肽产物的制备方法，其中，该水解反应的水解时间为约3～24小时。
7.如权利要求1所述的促进钙吸收的胜肽产物的制备方法，其中，该水解反应的水解温度介于约摄氏30～65度。
8.如权利要求1所述的促进钙吸收的胜肽产物的制备方法，其中，在该水解反应完成后，还包括提高反应温度至约摄氏90～95度以抑制酶活性。
9.一种做为促进钙吸收的胜肽产物，其是由权利要求1所述的方法制备而得。
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