CN108779483A

CN108779483A - 使用烟曲霉三肽基肽酶生产蛋白水解产物的方法

Info

Publication number: CN108779483A
Application number: CN201780012993.6A
Authority: CN
Inventors: K·M·克拉格; S·哈宁; E·梅恩约翰斯; P·E·德根; S·Y·巴克; T·艾泽勒
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS; Danisco US Inc
Priority date: 2016-02-25
Filing date: 2017-02-21
Publication date: 2018-11-09
Also published as: BR112018015589A2; WO2017147060A9; EP3420097A1; CA3013383A1; MX2018009216A; US20210120845A1; WO2017147060A1

Abstract

本发明涉及用于产生水解产物的组合物和方法，所述水解产物包含至少一种内切蛋白酶和能够从在P1位置具有赖氨酸、精氨酸或甘氨酸中的一种或多种的肽和/或蛋白质的N‑末端裂解三肽的三肽基肽酶，其中所述三肽基肽酶能够在45℃与70℃之间的温度下使用。

Description

使用烟曲霉三肽基肽酶生产蛋白水解产物的方法

技术领域

本发明涉及三肽基肽酶，用于在水解产物的制备中以及在包含所述三肽基肽酶或水解产物的食品中使用。

背景技术

蛋白酶(与肽酶同义)是能够在底物肽、寡肽和/或蛋白质中的氨基酸之间裂解肽键的酶。

基于其催化反应机理和涉及催化活性位点的氨基酸残基将蛋白酶分组为7个家族。丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶是4个主要家族，而苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和未分组蛋白酶构成剩余的3个家族。

基于其底物特异性，蛋白酶通常也可以细分为两个大组。第一组是内切蛋白酶，其是能够裂解肽或蛋白质底物的内部肽键并且倾向于远离N-末端或C-末端的蛋白水解肽酶。内切蛋白酶的实例包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶。相比之下，第二组蛋白酶是外肽酶，其裂解在位于朝向蛋白质或肽底物的C-末端或N-末端的氨基酸之间的肽键。

外肽酶组的某些酶可能具有三肽基肽酶活性。因此，这样的酶能够从底物肽、寡肽和/或蛋白质的未经取代的N-末端裂解3个氨基酸片段(三肽)。已知三肽基肽酶从底物的N-末端裂解三肽序列。

外肽酶和内切蛋白酶两者在食品和饲料工业中以及在水解产物的生产中都有许多应用。

发明内容

根据第一方面，提供了一种用于生产水解产物的方法，所述方法包括：

a)将至少一种蛋白质或其一部分与三肽基肽酶混合，所述三肽基肽酶：

i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其功能片段；

ii)包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少70％同一性的氨基酸；

iii)由包含序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码；

iv)由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少约70％同一性的核苷酸序列编码；

v)由在中严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2杂交的核苷酸序列编码；或

vi)由归因于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码；

b)在45℃与70℃之间的温度下孵育，以及

c)回收所述水解产物。

在第二方面，提供了一种反应体系，所述反应体系包含至少一种蛋白质或其一部分以及三肽基肽酶，所述三肽基肽酶

a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其功能片段；

b)包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少70％同一性的氨基酸；

c)由包含序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码；

d)由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少约70％同一性的核苷酸序列编码；

e)由在中严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2杂交的核苷酸序列编码；或

f)由归因于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码；

其中将所述反应体系在45℃与70℃之间的温度下维持足够长的时间以允许产生水解产物。

在第三方面，提供了一种用于表达三肽基肽酶的方法，其中所述方法包括：

a)用核酸或载体转化木霉属宿主细胞，所述核酸或载体包含

i)核苷酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2；

ii)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少约70％同一性的核苷酸序列；

iii)在中严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2杂交的核苷酸序列；或

iv)归因于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列；

b)表达步骤a)的核酸序列或载体；以及

c)获得所述三肽基肽酶或包含所述三肽基肽酶的发酵物，并且任选地进行分离和/或纯化和/或包装。

在第四方面，提供了三肽基肽酶的用途，所述三肽基肽酶：

i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其功能片段；

ii)包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少70％同一性的氨基酸；

iii)由包含序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码；

用于在45℃与70℃之间的温度下生产水解产物。

在第五方面，提供了一种水解产物，所述水解产物可获自(优选获得自)本文提供的方法、反应体系或用途中的任一者。

在第六方面，提供了一种饲料添加剂组合物或食品添加剂组合物，其包含本文提供的水解产物。

在第七方面，提供了一种用于生产喂养料或食物的方法，所述方法包括使饲料组分或食品组分与本文提供的水解产物或如本文提供的饲料添加剂组合物或食品添加剂组合物进行接触。

在第七方面，提供了一种喂养料或食物，所述喂养料或食物包含如本文提供的水解产物或如本文提供的饲料添加剂组合物或食品添加剂组合物。

在第八方面，提供了一种非食品产品，所述非食品产品包含本文提供的水解产物，其中所述非食品产品是用于人体皮肤上的化妆品、洗剂或清洁剂。

附图说明

现将参考附图，仅通过举例的方式描述本发明的实施例，在这些附图中：

图1显示了表达载体pTTT-pyrG13-TRI039的质粒图谱。

序列

SEQ ID NO:1是编码肽酶的DNA序列。

SEQ ID NO:2是编码合成基因的DNA序列。

SEQ ID NO:3是三肽基肽酶的蛋白质序列。

SEQ ID NO:4是三肽基肽酶的蛋白质序列。

SEQ ID NO:5是氨基肽酶的蛋白质序列。

SEQ ID NO:6是编码多肽的序列。

具体实施方式

一个开创性的发现是，如本文要求保护的三肽基肽酶可以用于高温水解方法中，例如，在45℃与70℃之间。

与在室温水解相比，当使用该酶在45℃与70℃之间生产水解产物时，诸位发明人观察到显著且完全出乎意料的改善。

诸位发明人首次表明，三肽基肽酶非常有利于在高温(例如在45℃与70℃之间)制备水解产物。

可替代地或另外地，使用三肽基肽酶产生的水解产物可能在倾向于对未处理的蛋白质或其部分具有免疫反应的受试者中具有降低的免疫原性，或者当与未处理的蛋白质或水解产物相比时可能具有降低的苦味。

有利地，教导用于本发明的方法和组合物中的三肽基肽酶能够作用于宽范围的肽和/或蛋白质底物，并且归因于具有这样的广泛的底物特异性而不容易被富含某些氨基酸(例如赖氨酸和/或精氨酸和/或甘氨酸)的底物的裂解抑制。因此，此类三肽基肽酶的使用可以有效地和/或快速地分解蛋白质底物(例如存在于用于制备水解产物的底物中)。

基于这些发现，提供了一种用于生产水解产物的方法，所述方法包括：

i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其功能片段；

ii)包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少70％同一性的氨基酸；

iii)由包含序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码；

b)在45℃与70℃之间的温度下孵育，以及

c)回收所述水解产物。

合适地，所述方法可以包括将在步骤(c)中回收的水解产物与至少一种食品或饲料成分混合的另外步骤。

在一方面，三肽基肽酶与内切蛋白酶组合使用。

合适地，同时添加所述内切蛋白酶和所述三肽基肽酶。

合适地，在添加三肽基肽酶之前，可以将所述蛋白质或其部分与内切蛋白酶混合。合适地，在添加三肽基肽酶和一种或多种如本文详细说明的另外的蛋白酶之前，可以将所述蛋白质或其部分与内切蛋白酶混合。

如本文所使用的，术语“混合”是指一种或多种成分和/或酶的混合，其中该一种或多种成分或酶以任何顺序和任何组合添加。合适地，混合可以涉及同时或顺序地混合一种或多种成分和/或酶。

在一个实施例中，可以同时混合一种或多种成分和/或酶。

在另一个实施例中，可以顺序地混合一种或多种成分和/或酶。

如本文所使用的，术语“回收水解产物”是指分离水解产物。在一些实施例中，这可涉及将水解的物质与未水解的蛋白质和/或肽底物分离。在其他实施例中，可以另外地或可替代地涉及将水解物质与用于制备所述水解产物的三肽基肽酶分离。在一个实施例中，该水解产物可以包含纯度为至少90％、更合适地至少95％、并且甚至更合适地至少99％的水解物质。

在本文所述的方法和/或用途中使用的三肽基肽酶可以在至少约45℃的温度下与底物(例如蛋白质和/或肽底物)一起孵育。换句话说，所述方法可以在至少约45℃的温度下进行。

合适地，三肽基肽酶可以在至少约50℃的温度下与底物一起孵育。

在一个优选的实施例中，三肽基肽酶可以在至少约55℃的温度下与底物一起孵育。

将三肽基肽酶在约45℃至约70℃之间的温度下与底物(例如蛋白质和/或肽底物)一起孵育。换句话说，所述方法在约45℃至约70℃之间的温度下进行。

合适地，三肽基肽酶可以在约45℃至约65℃之间的温度下、更合适地在约50℃至约65℃之间的温度下与底物一起孵育。

在一个优选的实施例中，三肽基肽酶可以在约50℃至约60℃之间的温度下与底物一起孵育。

在一个优选的实施例中，三肽基肽酶可以在约55℃至约60℃之间的温度下与底物一起孵育。

如本文所使用的，术语“三肽基肽酶”涉及可以从肽、寡肽和/或蛋白质底物的N-末端裂解三肽的外肽酶。

在一个实施例中，三肽基肽酶不是内切蛋白酶。

在另一个实施例中，三肽基肽酶不是从底物的N-末端裂解四肽的酶。

在一个另外的实施例中，三肽基肽酶不是从底物的N-末端裂解二肽的酶。

在又一个另外的实施例中，三肽基肽酶不是从底物的N-末端裂解单个氨基酸的酶。

在一个实施例中，三肽基肽酶可以包含氨基酸丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸的催化三联体。

在一个实施例中，三肽基肽酶可以是热稳定性三肽基肽酶。

如本文所使用的，术语“热稳定的”意指当加热至高达约70℃的温度时酶保留其活性。在一个优选的实施例中，“热稳定的”意指当加热至约65℃、更合适地加热至约60℃时酶保留其活性。

有利地，当与非热稳定性变体相比时，热稳定性三肽基肽酶不容易变性，和/或将在更长的时期内保留其活性。

在一个实施例中，三肽基肽酶在约pH 2至约pH 7的范围内具有活性。合适地，三肽基肽酶在约pH 4至约pH 7的范围内、并且甚至更合适地在约pH 4.5至约pH 6.5的范围内具有活性。

合适地，本发明的方法(特别是水解步骤)可以在2至约7之间的pH下进行。

在一个实施例中，本发明的方法(特别是水解步骤)可以在约4至约7(例如4.5至6.5)之间的pH下进行。

使用在约pH 4至约pH 7之间的pH范围内具有活性的三肽基肽酶是有利的，因为这允许三肽基肽酶与在该pH范围内具有活性的再多一种内切蛋白酶一起使用。

当使用在约pH 4至约pH 7之间的pH范围内具有活性的三肽基肽酶时，合适地它可以与中性或碱性内切蛋白酶组合使用。

有利地，这意味着在酶处理之间不需要改变包含用于水解产物生产的蛋白质和/或肽底物的反应介质的pH。换句话说，它允许三肽基肽酶和内切蛋白酶同时添加到反应中，这可以使生产水解产物的过程更快和/或更有效和/或更具成本效益。此外，这允许更有效的反应，因为在较低的pH值下，底物可能从溶液中沉淀出来，因此不会被裂解。

可以使用任何合适的碱性内切蛋白酶。合适地，碱性内切蛋白酶可以是选自由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶组成的组中的一种或多种。

在另一个实施例中，三肽基肽酶可以在酸性pH下具有活性(合适地，三肽基肽酶在酸性pH下可能具有最佳活性)。三肽基肽酶可以在小于约pH 6、更合适地在小于约pH 5的pH下具有活性。优选地，三肽基肽酶可以在约2.5至约pH 4.0之间、更合适地在约3.0至约3.3之间的pH下具有活性。

合适地，本发明的方法(特别是水解步骤)可以在2至约4(例如3至3.3)之间的pH下进行。

在酸性pH下具有活性的三肽基肽酶可以与酸性内切蛋白酶组合使用，并且有利地不需要在酶处理之间改变包含用于水解产物生产的蛋白质和/或肽底物的反应介质的pH。换句话说，它允许三肽基肽酶和内切蛋白酶同时添加到反应中，这可以使生产水解产物的过程更快和/或更有效和/或更具成本效益。

至少一种内切蛋白酶可以与三肽基肽酶组合用于本文中的任何应用。例如，至少一种内切蛋白酶可以包括在组合物和/或食品添加剂组合物和/或非食品产品中。

如本文所使用的，术语“内切蛋白酶”与术语“内肽酶”同义，并且是指能够裂解肽或蛋白质底物的内部肽键(例如，不位于肽或蛋白质底物的C-末端或N-末端)的蛋白水解肽酶的一种酶。这样的内切蛋白酶可以定义为倾向于在远离N-末端或C-末端起作用的那些。

在一个实施例中，内切蛋白酶可以是选自由以下组成的组中的一种或多种：丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和选自未分组蛋白酶家族的蛋白酶。

在一个实施例中，内切蛋白酶可以是选自由以下组成的组中的一种或多种：酸性真菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶，或者选自商业蛋白酶产品的组，如：AFP、FP2、NP、碱性蛋白酶、PXT、PBR、30L、PHT和51FP。

在一个实施例中，内切蛋白酶可以是酸性内切蛋白酶。合适地，内切蛋白酶可以是酸性真菌蛋白酶。

有利地，使用内切蛋白酶与三肽基肽酶的组合可以增加底物裂解的效率。不希望受理论束缚，据信内切蛋白酶能够在远离C-末端或N-末端的多个区域裂解肽和/或蛋白质底物，从而产生用于三肽基肽酶的更多的N-末端以用作底物，从而有利地增加反应效率和/或减少反应时间。

反应体系

还提供了一种反应体系，所述反应体系包含至少一种蛋白质或其一部分以及三肽基肽酶，所述三肽基肽酶i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其功能片段；ii)包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少70％同一性的氨基酸；iii)由包含序列SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码；iv)由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少约70％同一性的核苷酸序列编码；v)由在中严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2杂交的核苷酸序列编码；或vi)由归因于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码；其中将所述反应体系在45℃与70℃之间的温度下维持足够长的时间以允许产生水解产物。

在一个实施例中，将反应体系温度维持在50℃与65℃之间。在一个另外的实施例中，将温度维持在55℃与65℃之间。

在一个实施例中，该反应体系进一步包含内切蛋白酶。内切蛋白酶可以在与三肽基肽酶类似的pH范围有活性。在一个实施例中，内切蛋白酶是酸性内切蛋白酶。在另一个实施例中，内切蛋白酶可以是碱性内切蛋白酶，优选地选自胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶中的一种或多种。

该反应体系中所述至少一种蛋白质或其部分是动物蛋白质或植物蛋白质，优选地其中所述蛋白质是以下中的一种或多种：麦醇溶蛋白，β-酪蛋白，β-乳球蛋白，或麦醇溶蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白的免疫原性片段，乳清蛋白，鱼蛋白，肉蛋白，卵蛋白，大豆蛋白，大麦醇溶蛋白或谷物蛋白。

水解产物

本文提供了通过本发明的方法可获得(例如获得)的水解产物。合适地，这样的水解产物可以富含三肽。

如本文所使用的，术语“水解产物”在本领域中具有其通常的含义，并且是指从用三肽基肽酶处理蛋白质或其部分产生的产物。蛋白质或其部分的蛋白水解裂解的程度可以从最小限度(例如在单个蛋白质上的单个肽键的裂解)到广泛，这取决于例如处理的条件(例如处理的长度)、温度、蛋白质的浓度、以及三肽基肽酶的纯度、浓度和活性。

“水解产物”典型地包含通过使用至少一种蛋白酶(合适地为三肽基肽酶)裂解肽和/或蛋白质底物而可获得的短肽的混合物。合适地，这类水解产物可以实质上富含三肽。

如本文所使用的，术语“实质上富含三肽”意指通过本领域已知的任何方法(例如液相色谱-质谱(LC-MS))测量的总肽浓度中，至少约20％(合适地至少约30％)的那些肽是三肽。合适地，至少约40％(更合适地至少约50％)的那些肽是三肽。

在一个实施例中，术语“实质上富含三肽”意指通过本领域已知的任何方法(例如液相色谱-质谱(LC-MS))测量的总肽浓度中，至少约70％的那些肽是三肽。

在一个实施例中，水解产物包含小于约20％、合适地小于约10％的全长起始底物(例如至少一种蛋白质)。合适地，水解产物可以包含小于约5％、更合适地小于约1％的全长起始底物(例如至少一种蛋白质)。

在一些实施例中，水解产物可以不包含或实质上不包含全长起始底物。

如在上下文中使用的，术语“实质上不”可以意指小于约0.5％，合适地小于约0.1％的全长起始底物。

在内切蛋白酶、三肽基肽酶和氨肽酶已被用于制造水解产物的情况下，据信这样的水解产物将富含单个氨基酸、二肽和三肽。

在一个实施例中，存在于这样的水解产物中的单个氨基酸、二肽和三肽可以按照所述各自的摩尔浓度进行定量。在一个实施例中，水解产物中单个氨基酸、二肽和三肽的摩尔比是至少约20％的单个氨基酸:至少约10％的二肽:至少约10％的三肽。

在另一个实施例中，水解产物中单个氨基酸、二肽和三肽的摩尔比可以是至少约10％的单个氨基酸:至少约20％的二肽:至少约20％的三肽。

根据本发明的方法可获得的或用于本文教导的任何应用的水解产物在倾向于对至少一种蛋白质或其部分具有免疫反应的受试者中可能具有降低的免疫原性，该至少一种蛋白质或其部分形成用于消化以产生水解产物的底物。

水解产物通过将至少一种蛋白质或其一部分与三肽基肽酶混合来生产。

在水解产物的制造中用作底物的蛋白质或其部分可以是动物蛋白质或植物蛋白质(例如蔬菜蛋白质)。

合适地，所述蛋白质或其部分可以是选自由以下组成的组中的一种或多种：麦醇溶蛋白，β-酪蛋白，β-乳球蛋白，或麦醇溶蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白的免疫原性片段，大豆球蛋白，β-伴大豆球蛋白，十字花科蛋白，油菜籽蛋白，胶原蛋白，乳清蛋白，鱼蛋白，肉蛋白，卵蛋白，大豆蛋白，大麦醇溶蛋白和谷物蛋白。

在一个优选的实施例中，所述蛋白质或其部分是植物蛋白质、基于奶的蛋白质、卵蛋白或其任何组合。

在一个优选的实施例中，所述蛋白质或其部分是植物蛋白质，优选地其中所述蛋白质是麦醇溶蛋白、麦醇溶蛋白的免疫原性片段、谷物蛋白、谷蛋白和大豆蛋白中的一种或多种。

在一个优选的实施例中，所述蛋白质或其部分是基于奶的蛋白质，优选地其中所述蛋白质是酪蛋白(例如β-酪蛋白)、乳球蛋白(例如β-乳球蛋白)和乳清蛋白中的一种或多种。

在一个优选的实施例中，所述蛋白质或其部分是卵蛋白。

所述蛋白质或其部分可以包含在以下中：玉米、大豆粉、玉米干酒糟及可溶物(DDGS)、小麦、小麦蛋白(包括谷蛋白)、小麦副产品、麦麸、玉米副产品(包括玉米蛋白粉)、大麦、燕麦、黑麦、黑小麦、全脂大豆、动物副产品粉、醇溶性蛋白质(优选玉米蛋白(例如玉蜀黍玉米蛋白)和/或高粱醇溶蛋白(例如来自高粱))、来自油料种子的蛋白质(优选来自大豆种子蛋白、向日葵种子蛋白、油菜籽蛋白、低芥酸菜籽种子蛋白或其组合)或其任何组合。

适合地，所述蛋白质或其部分可以是选自由小麦蛋白质、小麦蛋白质的部分、乳品蛋白质和乳品蛋白质的部分组成的组中的一种或多种。

小麦蛋白质或其部分可以是从小麦、小麦产品(例如小麦粉)、小麦副产品和/或麦麸可获得的(或获得的)。合适地，小麦蛋白质可以是选自由麦醇溶蛋白、麦醇溶蛋白的部分、谷蛋白和谷蛋白的部分组成的组中的一种或多种。

乳品蛋白质或其一部分可以是乳蛋白。合适地，乳蛋白可以是选自由β-酪蛋白、β-乳球蛋白和乳清蛋白组成的组中的一种或多种。

在一个实施例中，所述蛋白质或其部分可以是蛋白质粉。在一个实施例中，这是来自鱼的蛋白质粉或来自另一种非人动物(例如，非人哺乳动物或鸟)的蛋白质粉。

在一些实施例中，所述蛋白质或其一部分可以是动物副产品。此类副产品可以包括来自动物生产和加工的组织，其不用于人类食品并且被加工成用于动物饲料和宠物食品的大量蛋白质粉。在一个实施例中，动物蛋白副产品可以是肉和骨粉、肉粉、血粉、家禽副产品粉、家禽粉、羽毛粉和鱼粉。

在另一个实施例中，所述蛋白质或其部分可以是微生物蛋白质。微生物蛋白质，例如酵母提取物，典型地通过从微生物培养物中提取细胞内容物来制备；它们可以用作食品添加剂或调味剂，或用作微生物培养基的营养素。

在又另外的实施例中，所述蛋白质或其部分可以是无脊椎动物蛋白质，合适地是昆虫蛋白质。昆虫/无脊椎动物具有巨大的生物多样性，并且代表了大的生物量(95％的动物界)，从而提供了替代性的蛋白质来源。

如本文所使用的，关于用于制造水解产物的蛋白质或其部分的术语“其部分”可以是蛋白质的免疫原性片段。如本文所使用的，“免疫原性片段”是能够在敏感个体中引发免疫反应的任何部分。“免疫原性片段”或“其部分”是包含至少10个氨基酸，合适地至少20个氨基酸，并且更合适地至少30个氨基酸或由其组成的全长蛋白质的区域。

在一些实施例中，所述免疫原性片段或其部分可以是至少约50个氨基酸，合适地是至少约100个氨基酸，并且更合适地是至少约200个氨基酸。

如本文所使用的，术语“乳蛋白”涵盖在产后雌性哺乳动物的乳腺的正常分泌物或从其衍生的产物中任何天然存在的蛋白质(例如其部分)，或从其制备的组分或其组分。乳可以来自任何哺乳动物物种，包括但不限于母牛、山羊、绵羊、水牛、牦牛、骆驼、美洲驼、羊驼和人类。来自其乳在商业上使用或广泛地用于各种文化和国家的那些哺乳动物的乳蛋白是优选的。应当注意的是，如本文所使用的，“乳蛋白”涵盖单词“蛋白质”的单数和复数，因此术语“乳蛋白”可以是指单个蛋白质，或一种或多种蛋白质的任何混合物，除非另有说明。

如本文所使用的，术语“乳清蛋白”涵盖在“乳清”中以任何量发现的任何蛋白质；制作乳酪的、与凝乳分离的液体副产品。从许多乳酪的生产中产生的乳清的胶束乳蛋白例如酪蛋白特别低，但是可溶性蛋白质例如α乳白蛋白和β-乳球蛋白相对富集。与上述“乳蛋白”一样，如本文所使用的，术语“乳清蛋白”涵盖单词“蛋白质”的单数和复数，因此术语“乳清蛋白”也可以是指单一的蛋白质或一种或多种乳清蛋白的任何混合物，除非另有说明。本领域技术人员将理解，乳清蛋白实际上是乳蛋白的亚类，因此术语“乳蛋白”可以包括一种或多种乳清蛋白，除非另有说明。乳清组合物可以包括例如乳、奶油和乳酪乳清。可以使用来源于任何乳酪类型的乳清。乳清蛋白可以来源于任何方法，例如乳酪乳清的过滤、透析、蒸发、和反渗透，或通过产生通常被描述为“乳清蛋白”的蛋白质的任何其他方法。

在一个优选的实施例中，通过本发明的一种或多种方法可获得(例如获得)的水解产物可以是乳蛋白水解产物、小麦蛋白水解产物(例如麦醇溶蛋白和/或谷蛋白水解产物)、大豆蛋白水解产物或其任何组合。

在另一个实施例中，还提供了至少一种三肽基肽酶或包含三肽基肽酶的发酵物在45℃与70℃之间的温度下制造水解产物的用途，该三肽基肽酶(a)包含氨基酸序列SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4、或其功能片段；(b)包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少70％同一性的氨基酸；(c)由包含序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码；(d)由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少约70％同一性的核苷酸序列编码；(e)由在中严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2杂交的核苷酸序列编码；或(f)由归因于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码。

在一个实施例中，三肽基肽酶或包含三肽基肽酶的发酵物的用途是用于在倾向于对未处理的蛋白质或其部分具有免疫反应的受试者中降低水解产物的免疫原性。

如本文所使用的，“降低的免疫原性”是指可测量的免疫反应的任何降低、减少或改善。可以在体外或体内评估此类反应的测量。例如，反应可以在来自个体的生物样品中直接或间接地测量，该生物样品包括组织、细胞、或流体、或类似物、或其组合，或者可以直接或间接地在个体中进行评估。虽然在本文提供的各种实施例中，此类反应的任何数学减少(或降低)(无论是体外还是体内测量的)都将是足够的，但是优选的是该减少是更加实质性的减少。当然，本领域技术人员将会理解，诸如免疫反应的测量的生物学数据在个体内以及从个体到个体之间经受潜在的巨大变化。例如，在反应是在“敏感”个体中的情况下，免疫反应优选实质地降低(例如降低至少约50％、60％、或70％、或甚至约80％或更多)。更优选地，与来自对一种或多种蛋白质或其部分不敏感的个体的免疫反应的量度相比，在这样的敏感个体中使用本文所述的蛋白质水解产物观察到仅小的或最低限度的不同。在免疫反应被认为是不利的(例如过敏反应)的情况下，这是特别优选的。在这样的情况下，敏感个体的免疫反应(或其量度)的减少可以为至少约85％至约90％、更优选地约90％至约95％、或甚至更高。在一些情况下，敏感个体对本文所述的蛋白质水解产物的反应在统计学上与不敏感的个体的反应没有显著差异。而在其他情况下，免疫反应的降低可能是在“敏感”个体中使用未水解的蛋白质观察到的许多倍。例如，反应可能存在10倍至100倍或甚至1000倍的降低。更优选地是，与个体对未修饰的蛋白质的反应相比，来自消费或暴露于如本文披露的蛋白质水解产物组合物的个体的免疫反应的量度的约1000倍至10,000倍或甚至100,000倍的降低或更多的降低。

如本文所使用的，“敏感”个体是倾向于对处于非水解形式的蛋白质具有免疫反应或反应的个体。作为消费或暴露于例如一种或多种蛋白质或其部分的直接或间接结果的这种免疫反应或反应是那些蛋白质的免疫原性的量度。这样的蛋白质将在不倾向于对该蛋白质具有这样的免疫反应的个体中显示出很少免疫原性至不显示免疫原性，这样的个体在本文中有时被称为对一种或多种蛋白质或其部分“不敏感(insensitive)”或“无敏感(notsensitive)”。优选地，这样的个体对于暴露于或消费蛋白质将不具有显著的免疫反应(免疫学反应)。

对小麦蛋白(特别是谷蛋白和/或麦醇溶蛋白)具有反应的敏感个体可呈现乳糜泻(例如口炎性腹泻)症状。症状包括消化道的疼痛和不适、慢性便秘和腹泻、发育停滞(儿童)、贫血和疲劳，但是这些可能不存在，并且其他器官系统的症状已被描述。由于小肠适当地从食物中吸收营养素的能力下降，常常在患有乳糜泻的人中注意到维生素缺乏症。不希望受理论束缚，据信，一旦暴露于麦醇溶蛋白，酶组织转谷氨酰胺酶就修饰麦醇溶蛋白，导致免疫系统与肠组织的交叉反应，从而在受影响的个体中引起炎症反应。

对乳蛋白具有反应的敏感个体可能呈现乳过敏症状，该乳过敏是由对乳中的一种或多种蛋白质或其免疫原性片段的不良免疫反应引起的。该失调可以是抗体介导的或非抗体介导的。抗体介导的乳过敏通常发病迅速，并且可能导致个体显示胃肠的、皮肤病学的和/或呼吸的症状。此类症状可能进一步表现为：皮疹、荨麻疹、呕吐和胃部不适(例如腹泻)、鼻炎、胃痛、气喘或过敏性反应。非抗体介导的通常被认为是由T淋巴细胞介导的，而不是由抗体引起的。这种形式的症状典型地是胃肠的和皮肤病的。

其他敏感个体可能对大豆具有反应，这导致一系列症状，最严重的是过敏性反应。

水解产物和/或食品和/或饲料和/或包含此类水解产物或组合物可能特别适合于给予至患有乳糜泻、乳蛋白过敏和/或大豆蛋白过敏的受试者。

有利地，内切蛋白酶与三肽基肽酶的组合能够裂解与在患有例如乳蛋白过敏和/或大豆蛋白过敏等疾病的敏感个体中引起免疫反应相关的蛋白质底物。

在另一方面，至少一种三肽基肽酶或包含三肽基肽酶的发酵物的用途是用于降低水解产物的苦味。

当用于水解产物生产的蛋白质底物或其部分富含疏水性L-氨基酸时，蛋白质水解产物可能具有苦味。不希望受理论束缚，据信肽的苦味取决于其肽长度和其中的L-氨基酸残基的平均疏水性。

可以使用被要求评价水解产物的苦味的个体品尝小组来客观地测量水解产物的“降低的苦味”。可以使用苦味指数来评价水解产物的苦味。例如，可以使用相对于奎宁(参比指数被给定为1)评价物质的苦味指数，可替代地可以使用具有从0(不苦)到10(苦)的数值范围的苦味指数。合适地，可以使用适当的对照(例如盲试)来进行水解产物的任何品尝。另外地或可替代地，可以经由LC-MS或本领域已知的其他合适的技术来监测已知苦味肽的裂解。

三肽基肽酶可以用于裂解苦味肽。

在一个实施例中，去苦味的水解产物可以用于制备食品和/或食物。

活性和测定

在一个实施例中，所述三肽基肽酶是外肽酶。换句话说，它主要具有外肽酶活性。

如本文所使用的，术语“外肽酶”活性意指三肽基肽酶能够从底物(例如蛋白质和/或肽底物)的N-末端裂解三肽。

如本文所使用的，术语“主要具有外肽酶活性”意指三肽基肽酶没有或实质上没有内切蛋白酶活性。

如本文所使用的，“实质上没有内切蛋白酶活性”意指当与在本文教导的“外肽酶广泛特异性测定(EBSA)”中的1000nkat的外肽酶活性相比时，三肽基肽酶在本文教导的“内切蛋白酶测定”中具有少于约100U内切蛋白酶活性。合适地，“实质上没有内切蛋白酶活性”意指当与在本文教导的“外肽酶广泛特异性测定”中的1000nkat的外肽酶活性相比时，三肽基肽酶在本文教导的“内切蛋白酶测定”中具有少于约100U内切蛋白酶活性。

优选地，当与在本文教导的“外肽酶广泛特异性测定”中的1000nkat的外肽酶活性相比时，三肽基肽酶在本文教导的“内切蛋白酶测定”中可以具有少于约10U内切蛋白酶活性，更优选地当与在本文教导的“外肽酶广泛特异性测定”中的1000nkat的外肽酶活性相比时，其在本文教导的“内切蛋白酶测定”中具有少于约1U内切蛋白酶活性。甚至更优选地，当与在本文教导的“外肽酶广泛特异性测定(EBSA)”中的1000nkat的外肽酶活性相比时，三肽基肽酶在本文教导的“内切蛋白酶测定”中可以具有少于约0.1U内切蛋白酶活性。

“内切蛋白酶测定”

用于内切蛋白酶活性的偶氮酪蛋白测定

使用了由Iversen和1995(Biotechnology Techniques[生物技术工艺]9,573-576)描述的内切蛋白酶测定的改良版本。将50μL的酶样品添加到的4倍稀释的麦基尔文(McIlvaine)缓冲液(pH 5)中的250μL的偶氮酪蛋白(0.25％w/v；来自西格玛公司(Sigma))中，并且在40℃伴随振摇(800rpm)孵育持续15min。通过添加50μL的2M三氯乙酸(TCA)(来自西格玛-奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，丹麦)并以20,000xg离心持续5min来终止反应。向195μL上清液样品中添加65μL的1M NaOH，并且测量在450nm处的吸光度。将内切蛋白酶活性的一个单位定义为在40℃、在450nm处、在15min内产生0.1的吸光度增加的量。

氨基酸和核苷酸序列

三肽基肽酶可获得(例如获得)自任何来源，只要其具有本文所述的活性即可。

在一个实施例中，三肽基肽酶可以可获得(例如，获得)自曲霉属。

合适地，三肽基肽酶可以可获得(例如，获得)自烟曲霉，更合适地烟曲霉AF293。

三肽基肽酶(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其功能片段；(b)包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少70％同一性的氨基酸；(c)由包含序列SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码；(d)由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少约70％同一性的核苷酸序列编码；(e)由在中严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2杂交的核苷酸序列编码；或(f)由归因于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码。

三肽基肽酶可以表达为进一步经历转录后和/或翻译后修饰的多肽序列。

在一个实施例中，三肽基肽酶包含氨基酸序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其功能片段。

在另一个实施例中，三肽基肽酶包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。

在一个实施例中，三肽基肽酶包含氨基酸序列SEQ ID NO:3或其功能片段。

在另一个实施例中，三肽基肽酶包含与SEQ ID NO:3具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。

在另一个实施例中，三肽基肽酶可以是已经历转录后和/或翻译后修饰(例如翻译后裂解)的“成熟”三肽基肽酶。合适地，这样的修饰可能导致酶的活化。

合适地，三肽基肽酶包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或其功能片段。

在另一个实施例中，三肽基肽酶包含与SEQ ID NO:4具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。

如本文所使用的，术语“功能片段”是保留其酶活性的氨基酸序列的一部分。因此，三肽基肽酶的功能片段是三肽基肽酶的一部分，该三肽基肽酶是能够从在P1位置具有一种或多种赖氨酸、精氨酸或甘氨酸的肽和/或蛋白质的N-末端裂解三肽的外肽酶。

“部分”是仍然具有如上述所定义的活性的任何部分；合适地一部分可以是至少50个、更合适地至少100个氨基酸的长度。在其他实施例中，该部分可以为约150个或约200个氨基酸的长度。

在一个实施例中，功能片段可以是转录后和/或翻译后修饰(例如裂解)后的三肽基肽酶的部分。合适地，功能片段可以包含如SEQ ID NO:4所示的序列。

在一个实施例中，三肽基肽酶包含选自SEQ ID NO:3的一种或多种氨基酸序列或其功能片段。

在一个实施例中，三肽基肽酶包含与SEQ ID NO:3具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。

在一个实施例中，三肽基肽酶包含选自SEQ ID NO:4的一种或多种氨基酸序列或其功能片段。

在一个实施例中，三肽基肽酶包含与SEQ ID NO:4具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。

在一个实施例中，三肽基肽酶包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4具有至少80％同一性的氨基酸或其功能片段。

在一个实施例中，三肽基肽酶包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4具有至少85％同一性的氨基酸或其功能片段。

在一个实施例中，三肽基肽酶包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的氨基酸或其功能片段。

在一个实施例中，三肽基肽酶包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的氨基酸或其功能片段。

在一个实施例中，三肽基肽酶包含选自由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4组成的组中的一个或多个的氨基酸序列。

在一个实施例中，三肽基肽酶由核苷酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或与其具有至少70％同一性的核苷酸序列，合适地与其具有至少80％或与其具有至少90％同一性的序列编码。

在一个优选的实施例中，三肽基肽酶由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性，更优选地与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少99％同一性的核苷酸序列编码。

在另一个实施例中，三肽基肽酶由在中严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2杂交的核苷酸序列编码。合适地，在高严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2杂交的核苷酸序列。

在一个另外的实施例中，三肽基肽酶由归因于遗传密码的简并性而不同于SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码。

在一个实施例中，分离的多核苷酸包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，可以是DNA、cDNA、合成的DNA和/或RNA序列。

优选地该序列是DNA序列，更优选地是编码三肽基肽酶的cDNA序列。

在另一个实施例中，提供了分离的核酸，所述分离的核酸包含：

(a)如本文中显示为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列；

(b)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少约70％同一性的核苷酸序列；

(c)在中严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2杂交的序列；或

(d)归因于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。

在一个实施例中，所述核苷酸序列可以是与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少约80％同一性；优选地与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的核苷酸序列。

在一个优选的实施例中，所述核苷酸序列可以是与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少约95％同一性，合适地至少约99％同一性的核苷酸序列。

在一个实施例中，所述分离的核酸可以包含在高严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQID NO:2杂交的核苷酸序列。

合适地，所述分离的核酸可以包含在载体(例如质粒)中。

在另一个实施例中，还提供了包含分离的核酸序列或载体的木霉属宿主细胞。

优选地，所述宿主细胞可以是里氏木霉宿主细胞。

在一个优选的方面，所述氨基酸和/或核苷酸序列处于分离的形式。术语“分离的”意指该序列至少实质上不含与该序列在自然界中天然结合以及在自然界中存在的至少一种其他组分。所述氨基酸和/或核苷酸序列能以实质上不含该物质原本可能与之相结合的一种或多种污染物的形式提供。因此，例如，其可能实质上不含一种或多种潜在污染的多肽和/或核酸分子。

在一个优选的方面，所述氨基酸和/或核苷酸序列处于纯化的形式。术语“纯化的”意指给定的组分以高水平存在。理想的是该组分为组合物中存在的主要组分。优选地，其以至少约90％、或至少约95％或至少约98％的水平存在，所述水平是相对于所考虑的总组合物以干重/干重计来确定的。

酶

在一个实施例中，所述酶是包含SEQ ID NO:3、其功能片段、或与SEQ ID NO:3具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，所述酶可以与SEQ ID NO:3具有至少80％、优选至少90％的同一性。

在一个实施例中，所述酶是包含SEQ ID NO:4、其功能片段、或与SEQ ID NO:4具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，所述酶可以与SEQ ID NO:4具有至少80％、优选至少90％的同一性。

在一个实施例中，所述酶是由包含如SEQ ID NO:1所示的序列或与其具有至少70％同一性、优选地与其具有至少80％同一性、并且甚至更优选地与其具有至少90％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。

在一个实施例中，所述酶是由包含如SEQ ID NO:2所示的序列或与其具有至少70％同一性、优选地与其具有至少80％同一性、甚至更优选地与其具有至少90％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。

核苷酸序列

在另一个实施例中，提供了具有核酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有如本文所定义的特定性质的蛋白质。

如本文所使用的，术语“核苷酸序列”或“核酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物(例如其部分)。具有核酸序列的多核苷酸/寡核苷酸可为基因组起源的或者合成或重组起源的，其可以是双链的或单链的而无论是代表有义链还是反义链。

术语“核苷酸序列”或“核酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA序列。在一个优选的方面，其意指DNA序列，并且更优选cDNA序列。

在一个优选的实施例中，所述多核苷酸在其天然环境中时和当其与其天然环境中的一个或多个天然相关序列连接时不包括天然多核苷酸。为了便于参考，该优选的实施例将被称为“非天然核苷酸序列”或“非天然核酸序列”。就这一点而言，术语“天然核苷酸序列”或“天然核酸序列”意指编码处于其天然环境中并且当有效地连接至其天然与之结合的整个启动子(该启动子也处于其天然环境中)时的核酸分子的整个核酸序列。然而，具有如本文所述的氨基酸序列的多肽可以在其天然生物体中在表达多核苷酸之后被分离和/或纯化。优选地，然而，可以由在其天然生物体中的核酸序列编码所述氨基酸序列，但其中该核酸分子不在该生物体中与其天然结合的启动子的控制之下。

通常，使用重组DNA技术(即重组DNA)制备本文所述的具有核苷酸序列的多核苷酸分子。然而，在本发明的替代性实施例中，所述多核苷酸分子可以使用本领域所熟知的化学方法整体或部分地合成(参见Caruthers MH等人，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser[核酸研究研讨会系列]215-23和Horn T等人，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser[核酸研究研讨会系列]225-232)。

核苷酸序列的制备

具有编码1)具有如本文所定义的特定性质的蛋白质，或2)适合于修饰的蛋白质的核酸序列的多核苷酸可以从生产所述蛋白质的任何细胞或生物体鉴定和/或分离和/或纯化。用于核苷酸序列的鉴定和/或分离和/或纯化的各种方法是本领域内所熟知的。举例来说，一旦已鉴定和/或分离和/或纯化合适的序列就可以使用PCR扩增技术来制备更多序列。

进一步举例来说，可以使用来自生产酶的生物体的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果该酶的氨基酸序列是已知的话，可合成标记寡核苷酸探针并用于从由生物体制备的基因组文库鉴别编码酶的克隆。可替代地，可将含有与另一个已知的酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针用于鉴定编码酶的克隆。在后一种情况下，使用较低严格性的杂交和洗涤条件。

可替代地，编码酶的克隆可以通过这样来鉴定：将基因组DNA的片段插入表达载体(例如质粒)中，用所得的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，然后将转化细菌涂板于含有酶的底物(即麦芽糖)的琼脂板上，从而允许表达该酶的克隆能被鉴定出。

在又进一步的替代方案中，编码该酶的核苷酸序列可以通过已建立的标准方法(例如，由Beucage S.L.等人，(1981)Tetrahedron Letters[四面体快报]22:1859-1869描述的亚磷酰胺方法，或由Matthes等人，(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3:801-805描述的方法)合成制备。在亚磷酰胺方法中，例如在自动DNA合成仪中合成寡核苷酸，将其纯化、退火、连接并克隆到适当的载体中。

所述核酸分子可以为混合的基因组起源和合成起源、混合的合成起源和cDNA起源或混合的基因组起源和cDNA起源，根据标准技术通过连接合成起源、基因组起源或cDNA起源的片段制备(视情况而定)。每一连接的片段对应于整个核苷酸序列的各个部分。也可以使用特异性引物通过聚合酶链式反应(PCR)来制备DNA序列，例如如美国专利4,683,202或Saiki R K等人(Science[科学](1988)239:487-491)中所描述，将这些文献的教授内容通过引用并入本文。

氨基酸序列

本发明的范围还涵盖含有具有如本文所定义的特定性质的酶的氨基酸序列的多肽。

如本文所使用的，术语“蛋白质”与术语“多肽”、“寡肽”和/或术语“肽”同义。在一些情况下，术语“多肽(如通过酶活性所定义的)”与术语“酶”同义。

具有氨基酸序列的多肽可以从适合的来源制备和/或分离，或者其可以通过合成制得或者其可以通过利用重组DNA技术制备。

在本发明中涵盖的蛋白质可以与其他蛋白质(特别是酶)一起使用。因此，本发明还涵盖蛋白质的组合，其中该组合包含本发明的蛋白质/酶和另一种蛋白质/酶(其可以是根据本发明的另一种蛋白质/酶)。这个方面在后面部分讨论。

优选地，当与本文所述的本身范围有关或当由本文所述的本身范围所涵盖时，所述多肽不是天然的酶。就这一点而言，术语“天然的酶”意指处于其天然环境中并且当其已经由其天然核苷酸序列表达时的整个酶。

分离的

在一方面，优选地，本发明的一种或多种多肽、一种或多种核酸分子和/或一种或多种酶处于分离的形式。术语“分离的”意指多肽、酶、和/或核酸分子至少实质上不含与这些物质在自然界中天然结合和/或在自然界中存在的至少一种其他组分。本文所述的多肽、酶和/或核酸分子能以实质上不含该物质原本可能与之相结合的一种或多种污染物的形式提供。因此，例如，其可能实质上不含一种或多种潜在污染的多肽和/或核酸分子。

纯化的

在一方面，优选地，所述一种或多种多肽、一种或多种酶和/或核酸分子处于纯化的形式。术语“纯化的”意指给定组分以高水平存在。理想的是该组分为组合物中存在的主要组分。优选地，其以至少约80％的水平存在，所述水平是相对于所考虑的总组合物以干重/干重计来确定的。合适地，其可能以至少约90％、或至少约95％或至少约98％的水平存在，所述水平是相对于所考虑的总组合物以干重/干重计来确定的。

序列同一性或序列同源性

本发明还涵盖具有如下序列的多肽和/或核酸分子或编码这样的多肽的任何核苷酸序列(下文称为“一个或多个同源序列”)的用途，所述序列与具有本文所定义的特定特性的多肽的一个或多个氨基酸序列具有一定程度的序列同一性或序列同源性。在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可等同于“同一性”。

该同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应该提供和/或编码保留该酶的功能活性和/或增强该酶的活性的多肽。

在本发明上下文中，同源序列意在包括与主题序列可以具有至少75％、85％或90％同一性、优选至少95％或98％同一性的氨基酸或核苷酸序列。典型地，同源物将包含例如与主题氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管同源性也可以按照相似性(即氨基酸残基具有相似的化学特性/功能)来考虑，但在本发明的上下文中优选的是按照序列同一性来表达同源性。

在一个实施例中，同源序列意在包括与主题序列相比具有一个或若干个添加、缺失和/或取代的氨基酸序列或核苷酸序列。

在一个实施例中，本发明涉及其氨基酸序列在本文中被描绘的蛋白质，或通过如下方式来源于该(亲本)蛋白质并且具有亲本蛋白质的活性的蛋白质：在亲本蛋白质的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或若干个氨基酸(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个氨基酸)或更多个氨基酸(例如10个或多于10个氨基酸)。

适合地，关于氨基酸序列的同一性程度是在至少20个连续氨基酸上、优选在至少30个连续氨基酸上、优选在至少40个连续氨基酸上、优选在至少50个连续氨基酸上、优选在至少60个连续氨基酸上、优选在至少100个连续氨基酸上、优选在至少200个连续氨基酸上确定。

在一个实施例中，本发明涉及一种核酸序列(或编码序列)，该核酸序列(或编码序列)编码其氨基酸序列在本文中被描绘的蛋白质，或编码通过如下方式来源于该(亲本)蛋白质并且具有亲本蛋白质的活性的蛋白质：在亲本蛋白质的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或若干个氨基酸(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个氨基酸)或更多个氨基酸(例如10个或多于10个氨基酸)。

在本发明上下文中，同源序列意在包括可以与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)具有至少75％、85％或90％同一性、优选至少95％或98％同一性的核苷酸序列。通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可以按照相似性(即氨基酸残基具有相似的化学特性/功能)来考虑，但在本发明的上下文中优选的是按照序列同一性来表达同源性。

同源性比较可以通过眼睛，或更通常地借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些可商购的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的％同源性。

可以在连续序列上计算％同源性，即将一个序列与其他序列进行比对，并且将一个序列中的每个氨基酸与其他序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这被称为“无空位”比对。典型地，此类无空位比对仅在相对短数目的多个残基上进行。

尽管这是十分简单和可靠的方法，但其没有考虑，例如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而当进行全局比对时可能导致％同源性大大降低。因此，大多数序列比较方法被设计来产生最佳的比对，该最佳比对考虑可能的插入和缺失，从而不会不当地减损整体同源性分值。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。

然而，这些更复杂的方法给比对中出现的每一个空位赋予“空位罚分”使得，对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对-反映两个比较序列之间更高的相关性-将获得比具有许多空位的序列比对更高的分值。通常使用“仿射空位成本(affinegap cost)”，其对空位的存在索取相对高的成本，而对空位中每一个后续的残基索取较小的罚分。这是最常用的空位打分系统。当然，高的空位罚分将会产生具有较少空位的最佳比对。大多数比对程序允许待修饰的空位罚分。然而，优选的是当使用此类软件进行序列比较时使用默认值。

因此，最大％同源性或％同一性的计算首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。用于进行这种比对的合适的计算机程序是Vector(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆(Waltham)，马萨诸塞州(MA)，美国)。可以进行序列比较的软件的实例包括但不限于：例如BLAST程序包(Ausubel,F.M.等人，Short Protocols in Molecular Biology[简明分子生物学试验方案]，第5版；Current Protocols[当前试验方案]，约翰威利父子公司(John Wiley and Sons,Inc.)，纽约州，2002)、BLAST 2(FEMS Microbiol Lett[FEMS微生物通讯](1999)174(2):247-50；FEMS Microbiol Lett[FEMS微生物通讯](1999)177(1):187-8)、FASTA(Altschul等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志](1990)215:403-410)以及AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA可用于离线和在线搜索，例如像在基因组查询(GenomeQuest)搜索工具(www.genomequest.com)中。

尽管最终的％同源性可以按照同一性来度量，但比对过程本身通常不是基于全或无配对比较。相反，通常使用标度化相似性打分矩阵(scaled similarity score matrix)，该矩阵基于化学相似性或进化距离对每一成对比较赋予分值。通常使用的这样的矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(进一步的细节请参见用户手册)。对于一些应用，优选的是使用Vector NTI程序包的默认值。

可替代地，基于类似于CLUSTAL(如CLUSTALW；例如，版本1.83)的一种算法，可以使用Vector(赛默飞世尔科技公司)中的多重比对特征计算同源性百分比(Thompson等人，Nucleic Acids Research[核酸研究]，(1994)22(22):4673-4680)。

一旦软件已经产生最佳比对就可以计算％同源性，优选％序列同一性。典型地，作为序列比较的一部分，软件进行此计算，并且生成数值结果。

当确定序列同一性时应该使用空位罚分，然后优选地使用如下参数用于成对比对：

对于BLAST
		空位开放	9
空位延伸	2

对于CLUSTAL	DNA	蛋白质
			权矩阵	IUB	Gonnet 250
空位开放	15	10
			空位延伸	6.66	0.1

在一个实施例中，可使用采用上面限定的空位罚分和空位延伸组的CLUSTAL。

适合地，关于核苷酸序列的同一性程度是在至少20个连续核苷酸上、优选在至少30个连续核苷酸上、优选在至少40个连续核苷酸上、优选在至少50个连续核苷酸上、优选在至少60个连续核苷酸上、优选在至少100个连续核苷酸上确定。

适合地，关于核苷酸序列的同一性程度是在至少100个连续核苷酸上、优选在至少200个连续核苷酸上、优选在至少300个连续核苷酸上、优选在至少400个连续核苷酸上、优选在至少500个连续核苷酸上、优选在至少600个连续核苷酸上、优选在至少700个连续核苷酸上、优选在至少800个连续核苷酸上确定。

适合地，关于核苷酸序列的同一性程度可以在整个序列上确定。

适合地，关于蛋白质(氨基酸)序列的同一性程度在至少100个连续氨基酸上、优选在至少200个连续氨基酸上、优选在至少300个连续氨基酸上确定。

适合地，关于氨基酸或蛋白质序列的同一性程度可以在本文教导的整个序列上确定。

在本发明的上下文中，术语“查询序列”意指与主题序列比对以便看看其是否属于本发明的范围内的同源序列或外源序列。因此，这样的查询序列可以例如是现有技术序列或第三方序列。

在一个优选的实施例中，序列通过全局比对程序进行比对，并且通过鉴定由程序鉴定的精确匹配数除以主题序列的长度来计算序列同一性。

在一个实施例中，查询序列和主题序列之间的序列同一性程度通过如下步骤确定：1)通过任何适合的比对程序，使用默认打分矩阵和默认空位罚分，将这两个序列进行对比，2)鉴定精确匹配数，其中精确匹配是比对程序已于比对过程中在两个受比对序列中的给定位置上鉴定出相同的氨基酸或核苷酸的情况，以及3)用精确匹配数除以主题序列的长度。

在又进一步优选的实施例中，全局比对程序选自由CLUSTAL和BLAST(优选BLAST)组成的组，并且通过鉴定由程序鉴定的精确匹配数除以主题序列的长度来计算序列同一性。

序列还可以具有产生沉默改变和导致功能上等价的物质的氨基酸残基的缺失、插入或取代。只要保留物质的二级结合活性，可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行有意的氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有相似亲水性值的含不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。

例如根据下表，可以进行保守取代。第二列相同框中的氨基酸，优选第三列同行的氨基酸可以彼此替代：

本发明还涵盖可能出现的同源取代(取代和替换两者在本文中用于意指现有氨基酸残基与替代性残基的互换)，即对等取代，例如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性等。也可能发生非同源取代，即从一类残基至另一类氨基酸或可替代地包含非天然氨基酸例如鸟氨酸(以下称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(以下称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(以下称为O)、吡喃丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯基甘氨酸。

替换也可以通过合成氨基酸(如非天然氨基酸)进行，包括；α*和α-二取代*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化物衍生物例如三氟酪氨酸*、p-Cl-苯基丙氨酸*、p-Br-苯基丙氨酸*、p-I-苯基丙氨酸*、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、对硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟基脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物例如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe(4-氨基)#、L-Tyr(甲基)*、L-Phe(4-异丙基)*、L-Tic(1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸)*、L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-苄基)*。出于上面论述的目的(与同源性或非同源性取代相关)，符号*用于指衍生物的疏水性质，而#用于指衍生物的亲水性质，#*指两亲特性。

变体氨基酸序列可以包括适合的可插入在该序列的任何两个氨基酸残基之间的间隔基团，包括除了氨基酸间隔物(如甘氨酸或β-丙氨酸)之外的烷基基团，如甲基、乙基或丙基基团。变异的另外的形式(涉及存在类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基)将是本领域技术人员十分了解的。为避免疑义，“该类肽形式”用来指代变体氨基酸残基，其中该α-碳取代基在该残基的氮原子上，而不是在该α-碳上。用于制备处于该类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon Rj等人，PNAS[美国国家科学院院刊](1992)89(20),9367-9371和Horwell DC,Trends Biotechnol.[生物技术趋势](1995)13(4),132-134。

本文所述的核酸分子可在其中包括合成或修饰的核苷酸。对寡核苷酸作出的多种不同类型的修饰是本领域已知的。这包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3'和/或5'端添加吖啶或多聚赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解本文所描述的核苷酸序列可以通过本领域可用的任何方法修饰。可进行这种修饰以便增强本发明的核苷酸序列的体内活性或寿命。

本发明还涵盖与本文给出的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列的用途。如果序列与其片段互补，则该序列可用作探针来鉴别其他生物体中的相似编码序列。

与本发明序列不是100％同源的多核苷酸能以多种方式获得。本文描述的序列的其他变体可例如通过用探针探测(probing)从一系列个体(例如来自不同群体的个体)制备的DNA文库来获得。此外，可获得其他同源物并且此类同源物及其片段通常将能够选择性地与本文序列表中所示的序列杂交。此类序列可通过这样获得：从其他动物物种制备cDNA文库或基因组DNA文库，在中等至高严格条件下用包含于随附的序列表中的序列中的任一条的全部或部分的探针来探测这些文库。类似的考虑用来获得本发明的多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。

变体和株系/物种同源物还可用简并PCR获得，简并PCR将使用被设计来靶向变体和同源物内这样的序列的引物，所述序列编码本发明序列内的保守氨基酸序列。保守序列可例如通过比对来自数种变体/同源物的氨基酸序列来预测。序列比对可以用本领域已知的计算机软件来进行。例如，GCG威斯康星PileUp程序是广泛使用的。

简并PCR中使用的引物将含有一个或多个简并位置，并将在比用于以单序列引物从已知序列克隆序列的那些严格条件低的严格条件下使用。

可替代地，此类多核苷酸可通过对已表征的序列进行定点诱变来获得。在例如需要沉默密码子序列改变来优化多核苷酸序列在其中表达的特定宿主细胞的密码子偏好的情形中，这可能是有用的。其他序列改变可能是希望的以便引入限制性酶识别位点，或以便改变多核苷酸编码的多肽的特性或功能。

多核苷酸(核苷酸序列)可用于产生引物(例如PCR引物)、替代性的扩增反应的引物、探针(例如用放射性或非放射性标记通过常规手段标记上显示标记(revealing label)的探针)，或者可将多核苷酸克隆进载体中。此类引物、探针和其他片段的长度将为至少15个，优选至少20个，例如至少25个、30个或40个核苷酸，并且也为如本文所使用的术语多核苷酸所涵盖。

根据本发明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探针可重组产生、合成产生或通过本领域技术人员可用的任何手段产生。它们还可以通过标准技术克隆。

一般地，引物可以通过合成方法制备，包括一次一个核苷酸地逐步制备希望的核酸序列。利用自动化技术完成该工艺的技术是本领域轻易获得的。

较长的多核苷酸通常将使用重组手段产生，例如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术。引物可被设计为含有适合的限制性酶识别位点，使得可将扩增的DNA克隆进适合的克隆载体中。

杂交

在一个实施例中，所述组合物和方法还涵盖与本文所述的核酸序列互补的序列或能够与本文所述的序列或与与其互补的序列杂交的序列。

如本文所使用的，术语“杂交(hybridisation/hybridization)”应包括“一条核酸链与互补链通过碱基配对接合的过程”以及在聚合酶链式反应(PCR)技术中所进行的扩增过程。

在一个实施例中，还提供了能杂交至与本文给出的序列互补的序列的核苷酸序列或其任何片段或衍生物的用途。

术语“变体”还涵盖与能够杂交至本文给出的核苷酸序列的序列互补的序列。

杂交和洗涤条件是熟知的，并且例示于Sambrook,J.和Russell,D.,T.MolecularCloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，第三版，冷泉港实验室出版社，冷泉港(2001)中。温度和离子强度的条件决定了杂交的“严格性”。可以调整严格条件以筛选适度相似的分子(例如来自远缘生物体的同源序列)，至高度相似的分子(例如复制来自近缘生物体的功能性酶的基因)。典型地，杂交后的洗涤决定了严格条件。一组优选的条件使用一系列洗涤，从6X SSC、0.5％SDS开始，在室温持续15分钟，然后用2X SSC、0.5％SDS在45℃重复30分钟，并且然后用0.2X SSC、0.5％SDS在50℃持续30分钟，重复两次。一组更优选的条件使用更高的温度，其中洗涤与上述洗涤相同，除了将在0.2X SSC、0.5％SDS中最后两次30分钟的洗涤中的温度增加至60℃。另一组优选的高严格杂交条件是0.1X SSC、0.1％SDS、65℃并用2X SSC、0.1％SDS洗涤，然后是0.1X SSC、0.1％SDS、65℃的最终洗涤。

杂交需要两个核酸含有互补序列，尽管取决于杂交的严格性，但碱基之间的错配是可能的。用于杂交核酸的适当严格性取决于核酸的长度和互补程度，这些是本领域熟知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性的程度越大，具有这些序列的核酸的杂交体的Tm值越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm)按以下顺序降低：RNA:RNA，DNA:RNA，DNA:DNA。对于长度大于100个核苷酸的杂交体，已经推导出用于计算Tm的方程式(Sambrook,J.和Russell,D.,T.，同上)。对于具有较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，并且该寡核苷酸的长度决定了其特异性。在一方面，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸的长度，更优选至少约20个核苷酸的长度，甚至更优选至少30个核苷酸的长度，甚至更优选至少300个核苷酸的长度，并且最优选至少800个核苷酸的长度。此外，技术人员将认识到，可以根据诸如探针长度等因素根据需要调节温度和洗涤溶液盐浓度。

优选地，杂交在本文教导的整个序列上进行分析。

分子进化

作为非限制性实例，可能的是，在体内或体外产生许多定点的或随机的突变到核苷酸序列中，并随后通过各种方式筛选编码的多肽的改善的功能。

另外，多核苷酸序列的突变或天然变体可以与野生型或其他突变或天然变体重组以产生新的变体。也可以筛选此类新变体以改善编码的多肽的功能。新的优选变体的生产可以通过本领域已建立好的各种方法来实现，例如错误阈值诱变(WO 92/18645)、寡核苷酸介导的随机诱变(US 5,723,323)、DNA改组(US 5,605,793)、以及外显子介导的基因组装(WO 00/58517)。这些和类似的随机定向分子进化方法的应用允许鉴定和选择具有优选特征的本文所述的酶的变体，而没有蛋白质结构或功能的任何先验知识，并且允许产生不可预测但有益的突变或变体。在本领域中有许多用于优化或改变酶活性的分子进化的应用的实例，这样的实例包括但不限于以下的一个或多个：在宿主细胞中或体外优化的表达和/或活性、增加的酶活性、改变的底物和/或产物特异性、增加或降低的酶或结构稳定性、在优选的环境条件下(例如温度、pH、底物)改变的酶活性/特异性。

定点诱变

一旦已经分离出编码蛋白质的核苷酸序列，或者已经鉴定了推定的编码蛋白质的核苷酸序列，就可以希望突变该序列以制备蛋白质。

可以使用合成的寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸包括侧接希望突变的位点的核苷酸序列。

Morinaga等人(Biotechnology[生物技术](1984)2:646-649)披露了一种合适的方法。在Nelson和Long(Analytical Biochemistry[分析生物化学](1989),180:147-151)中描述了将突变引入编码酶的核苷酸序列的另一种方法。

重组体

在一方面，所述序列是重组序列–即使用重组DNA技术已经制备的序列。

这些重组DNA技术在本领域普通技术人员的能力范围内。这样的技术在以下文献中得到解释，例如，Sambrook,J.和Russell,D.,T.，Molecular Cloning:A LaboratoryManual[分子克隆：实验室手册]，第三版，冷泉港实验室出版社，冷泉港(2001)。

合成的

在一方面，所述序列是合成序列–即已经通过体外化学或酶促合成而制备的序列。它包括但不限于用宿主生物体的最佳密码子使用产生的序列，例如甲基营养酵母毕赤酵母和汉逊酵母。

蛋白质和/或肽也可以是合成来源的。

酶的表达

在一个实施例中，还提供了一种用于表达三肽基肽酶的方法，该三肽基肽酶是外切蛋白酶并且能够从在P1位置具有赖氨酸、精氨酸或甘氨酸中的一种或多种的肽和/或蛋白质的N-末端裂解三肽，并且其中所述方法包括：

(a)用核酸或载体转化木霉属宿主细胞，所述核酸或载体包含：核苷酸序列SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2；或与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少约70％同一性的核苷酸序列；或在中严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2杂交的核苷酸序列；或归因于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列；

(b)表达步骤(a)的核酸序列或载体；以及

(c)获得三肽基肽酶或包含所述三肽基肽酶的发酵物。

合适地，该方法可以进一步包括分离和/或纯化和/或包装三肽基肽酶。

核酸可以是编码具有本文详述的活性的三肽基肽酶的任何核酸。合适地，核酸分子可以是本文详述的核酸中的任何一种。合适地，核酸分子可以是如本文所述的分离的核酸。

核酸分子可以掺入重组可复制载体中。该载体可用于在相容宿主细胞中和/或从相容宿主细胞复制和表达核苷酸序列(以蛋白质/酶形式)。

可以使用控制序列(例如调控序列)控制表达。

由宿主重组细胞通过表达核苷酸序列产生的蛋白质可被分泌或者可包含在细胞内，这取决于所使用的序列和/或载体。编码序列可被设计具有信号序列，该信号序列引导编码该物质的序列穿过特定的原核或真核细胞膜分泌。

术语“表达载体”意指能够在体内或体外进行表达的构建体。

在一个实施例中，三肽基肽酶和/或内切蛋白酶可以由载体编码。换句话说，载体可以包含编码三肽基肽酶的核苷酸序列。

优选地，将表达载体掺入合适的宿主生物体的基因组中。术语“掺入”优选涵盖基因组中的稳定掺入。

所述核酸分子可存在于载体中，在该载体中所述核苷酸序列有效地连接到调控序列，这些调控序列能够由合适的宿主生物体提供所述核苷酸序列的表达。

可将用于本发明的载体转化进如下文所述的合适宿主细胞中以提供本发明的多肽的表达。

载体(例如质粒、粘粒或噬菌体载体)的选择将通常取决于待将其引入的宿主细胞。

载体可包含一种或多种可选标记基因-如赋予抗生素抗性例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。可替代地，该选择可通过共转化来完成(如WO 91/17243中所描述的)。

载体可在体外用于例如产生RNA，或用于转染、转化、转导或感染宿主细胞。

因此，在一个另外的实施例中，还提供了一种通过如下方式制备核酸分子的方法：将如本文所述的多核苷酸导入可复制载体中，将该载体引入相容宿主细胞，并在造成载体复制的条件下使该宿主细胞生长。

该载体可进一步包含使得该载体能在所考虑的宿主细胞中复制的遗传元件。此类序列的实例为质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。

编码三肽基肽酶和/或内切蛋白酶的核苷酸序列和/或载体可以被密码子优化以用于在特定宿主生物体中表达。

编码三肽基肽酶和/或内切蛋白酶的核苷酸序列和/或载体可以被密码子优化以用于在原核或真核细胞中表达。合适地，编码三肽基肽酶和/或内切蛋白酶的核苷酸序列和/或载体可以被密码子优化以用于在真菌宿主生物体(例如木霉属，优选里氏木霉)中表达。

密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁地使用的密码子代替天然序列的至少一个密码子(例如至少约多于1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、50个、60个、70个、80个或100个密码子)同时维持该天然氨基酸序列而修饰核酸序列以便增强在感兴趣宿主细胞中的表达的过程。不同的物种对于具有特定氨基酸的某些密码子表现出特定偏好性。密码子偏好性(生物体之间密码子使用的差异)常常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而该翻译效率则被认为依赖于(除其他之外)被翻译的密码子的特性和特定转移RNA(tRNA)分子的可获得性。细胞中选择的tRNA的优势度通常是肽合成中最频繁使用的密码子的反映。

因此，基因可以被定制为基于密码子优化在给定生物体中的最佳基因表达。因此，经过这种定制的核苷酸序列和/载体可以被称为“密码子优化的”核苷酸序列和/或载体。

密码子使用表可以容易地获得，例如在密码子使用数据库(“Codon UsageDatabase”)中，并且这些表能以多种方式调整适用。参见，Nakamura,Y.等人，“Codon usagetabulated from the international DNA sequence databases:status for the year2000[从国际DNA序列数据库中制表的密码子使用：2000年的状态]”Nucl.Acids Res.[核酸研究]28:292(2000)。用于密码子优化特定序以在特定宿主细胞中表达的计算机算法也是可得的，例如Gene Forge^TM(Aptagen公司；雅各布斯(Jacobus)，宾夕法尼亚州(PA)，美国)。在一些实施例中，在编码三肽基肽酶和/或内切蛋白酶的序列中的一个或多个密码子(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个、或更多个、或所有密码子)对应于对于特定氨基酸最频繁使用的密码子。

在一个实施例中，编码三肽基肽酶的核苷酸序列可以是已经密码子优化用于在里氏木霉中表达的核苷酸序列。

在一个实施例中，密码子优化的序列可以包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或与其具有至少70％同一性的核苷酸序列，合适地与其具有至少80％或至少90％的序列。

优选地，密码子优化的序列可以包含与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

在一个实施例中，三肽基肽酶可以由在中严格条件下与SEQ ID NO:2杂交的核苷酸序列编码。合适地，在高严格条件下与SEQ ID NO:2杂交的核苷酸序列。

在一个另外的实施例中，三肽基肽酶可以由归因于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码。

调控序列

在一些应用中，所述多核苷酸分子有效地连接到调控序列，该调控序列能够提供核苷酸序列的表达，例如通过所选择的宿主细胞表达。在另一个实施例中，提供了如下载体，该载体包含与这类调控序列有效地连接的如本文所述的核酸分子，即该载体是表达载体。

术语“有效地连接”指其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中的并列。调控序列“有效地连接”至编码序列是以使得该编码序列的表达能在与该控制序列相容的条件下实现的方式连接。

术语“调控序列”包括启动子和增强子以及其他表达调节信号。

术语“启动子”是以本领域的标准意义使用，例如RNA聚合酶结合位点。

编码本文所述的一种或多种酶中的至少一种的核苷酸序列的增强表达也可以通过选择异源调控区(例如，启动子、分泌前导区和终止子区)来实现。

优选地，根据本发明的核苷酸序列有效地连接到至少一个启动子。

其他启动子甚至可以用于引导本文所述的一种或多种多肽的表达。

适用于引导核苷酸序列在细菌、真菌或酵母宿主中转录的启动子的示例是本领域所熟知的。

启动子可额外包括用于确保或用于增加在合适宿主中的表达的特征物。例如，所述特征物可以是保守区，例如Pribnow盒或TATA盒。

构建体

如本文所使用的，术语“构建体”-其与术语例如“缀合物”、“盒”和“杂交体”同义-包括具有直接或间接附接至启动子的核苷酸序列的多核苷酸。

间接附接的实例是在启动子和本发明的核苷酸序列中间提供合适的间隔基团例如内含子序列，例如Sh1-内含子或ADH内含子。术语“融合的”同样如此，其包括直接或间接附接。在一些情况下，该术语不涵盖这样的编码蛋白质的核苷酸序列的天然组合：其通常与野生型基因启动子相关联并且当它们二者均处于其天然环境中时。

构建体可甚至含有或表达标记，该标记允许该遗传构建体的选择。

对于一些应用，优选地，构建体包含至少一种有效地连接至启动子的本文所述的多核苷酸。

宿主细胞

术语“宿主细胞”包括含有如以上所述的核苷酸序列或表达载体并用于重组产生具有如本文所定义的特定性质的蛋白质的任何细胞。

因此，一个另外的实施例提供了用表达至少一种本发明的蛋白质的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。可以对细胞进行选择以便和所述载体相容，并且这些细胞可以是例如原核(例如细菌)、真菌、酵母或植物细胞。

合适的细菌宿主生物体的示例是革兰氏阳性细菌物种或革兰氏阴性细菌物种。

取决于编码本发明多肽的核苷酸序列的性质和/或进一步加工表达的蛋白质的需要，可以优选真核宿主例如酵母或其他真菌。一般地，酵母比真菌细胞更为优选，这是因为它们更易于操作。然而，一些蛋白质从酵母分泌不佳，或在某些情况下不能适当地加工(例如在酵母中过度糖基化)。在这些情况下，应当选择不同的真菌宿主微生物。

合适宿主细胞-例如酵母、真菌和植物宿主细胞-的使用可提供翻译后修饰(例如豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸的磷酸化)，可能需要这些用于给本发明的重组表达产物赋予最佳的生物学活性。

宿主细胞可能是蛋白酶缺陷或蛋白酶不足的菌株。上述可以是例如蛋白酶缺陷型菌株米曲霉JaL 125，该米曲霉JaL 125具有缺失的称作“alp”的碱性蛋白酶基因。该菌株描述于WO 97/35956中。

生物体

如本文所使用的，术语“生物体”包括任何生物体，其可包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物，并且/或者其中启动子可允许当存在于该生物体中时根据本发明的核苷酸序列表达。

合适的生物体可以包括原核生物、真菌、酵母或植物。

如本文所使用的，术语“转基因生物体”包括任何生物体，其包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物，并且/或其中启动子可以允许多核苷酸在生物体内的表达。优选地，所述核苷酸序列掺入生物体的基因组中。

术语“转基因生物体”不涵盖处于其天然环境中且当它们处于它们的天然启动子(也处于其天然环境中)的控制之下时的天然核苷酸编码序列。

因此，转基因生物体包含如下生物体，该生物体包含编码本文所述的一种或多种多肽、构建体、载体、质粒、细胞、组织和/或其产物的核苷酸序列的任何一种或其组合。

例如，转基因生物体还可以包含处于异源启动子的控制下的编码本文所述的多肽的多核苷酸。

宿主细胞/生物体的转化

如先前所示，宿主生物体是木霉属，优选里氏木霉。

可用本领域已知的多种方法转化真菌细胞–例如涉及原生质体形成和原生质体转化以及随后的以已知的方式再生细胞壁的方法。

关于真菌的转化的通用教导在以下部分中提供。

转化的真菌

宿主生物体可以是真菌-例如曲霉属等。

合适地，宿主生物体是木霉属宿主生物体，例如里氏木霉宿主生物体。

培养和生产

用本发明的核苷酸序列转化的宿主细胞可在有利于产生所编码的多肽并且有利于从细胞和/或培养基回收所述多肽的条件下培养。

用于培养细胞的培养基可以是适合于培养所考虑的宿主细胞和获得所述多肽的表达的任何常规培养基。

由重组细胞产生的蛋白质可呈现在细胞的表面上。

蛋白质可从宿主细胞分泌并且可方便地用熟知的工序从培养基回收。

分泌

通常，期望蛋白质从表达宿主分泌进培养基中，从培养基可更容易回收蛋白质。可以根据所需的表达宿主选择分泌前导序列。在本发明的组合物和方法的背景下，还可以使用杂交体信号序列。

异源分泌前导序列的典型实例是源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(例如来自曲霉属的glaA-，18个和24个氨基酸型两者)、α-因子基因(酵母，例如酵母属、克鲁维酵母属和汉逊酵母属)或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌属)的那些。

举例来说，在Methods Enzymol[酶学方法](1990)182:132-43中综述了异源蛋白质在大肠杆菌中的分泌。

转录后和翻译后修饰

合适地，三肽基肽酶和/或内切蛋白酶可以由本文教导的任何一种核苷酸序列编码。

取决于所使用的宿主细胞，可以进行转录后和/或翻译后修饰。设想用于本发明方法和/或用途的酶(例如，三肽基肽酶和/或内切蛋白酶)涵盖已经经历转录后和/或翻译后修饰的酶(例如三肽基肽酶和/或内切蛋白酶)。

转录后和/或翻译后修饰的一个非限制性实例是多肽的(例如三肽基肽酶和/或内切蛋白酶的)“剪切”或“裂解”。

在一些实施例中，多肽(例如本发明的三肽基肽酶，例如三肽基肽酶和/或内切蛋白酶)可以被剪切或裂解。这可能导致三肽基肽酶和/或内切蛋白酶从无活性或实质上无活性状态转化为活性状态(即能够进行本文所述的活性)。

三肽基肽酶可以是对成熟肽进一步进行翻译后修饰的前肽，即具有三肽基肽酶活性的多肽。

仅举例来说，SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4相同，除了SEQ ID NO:3经历了翻译后和/或转录后修饰以除去一些氨基酸，更具体地自N-末端除去一些氨基酸。因此，在某些情况下(即在一些宿主细胞中)可以考虑作为前肽的如SEQ ID NO:3所示的多肽-其通过翻译后和/或转录后修饰进一步加工成成熟肽(SEQ ID NO:4)。关于翻译后和/或转录后修饰的精确的修饰，例如一个或多个裂解位点可以根据宿主物种略有不同。在一些宿主物种中可能没有翻译后和/或转录后修饰，因此前肽将等同于成熟肽(即具有本发明的三肽基肽酶活性的多肽)。不希望受理论束缚，与通过参考SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:3相比所示的裂解位点相比，一个或多个裂解位点可以在任一方向上移位几个残基(例如1个、2个或3个残基)。

转录后和/或翻译后修饰的其他实例包括但不限于肉豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化。本领域技术人员将理解，蛋白质(例如三肽基肽酶和/或内切蛋白酶)可能发生的转录后和/或翻译后修饰的类型可以取决于其中表达该蛋白质(例如，三肽基肽酶和/或内切蛋白酶)的宿主生物体。

检测

用于检测和测量氨基酸序列表达的各种方案在本领域中是已知的。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)以及荧光激活细胞分选术(FACS)。

各种标记和缀合技术是本领域技术人员已知的，并且可以用于不同的核酸和氨基酸测定中。

许多公司，例如法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech)(皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州)、普洛麦格公司(Promega)(麦迪逊(Madison)，威斯康辛州(WI))和生物化学公司(Biochemical Corp)(克利夫兰(Cleveland)，俄亥俄州(OH))提供用于这些程序的商业试剂盒和试验方案。

合适的报告分子或标记包括那些放射性核素、酶、荧光、化学发光或显色剂以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。教导使用这样的标签的专利包括但不限于美国专利号3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。

而且，可以如美国专利4,816,567所示生产重组免疫球蛋白。

融合蛋白

所述氨基酸序列可以作为融合蛋白产生，例如以帮助提取和纯化。融合蛋白伴侣的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和(β-半乳糖苷酶)。还可方便地在融合蛋白伴侣和目的蛋白序列之间包括进蛋白水解裂解位点，以允许除去融合蛋白序列。

优选地，融合蛋白将不妨碍蛋白序列的活性。

在大肠杆菌中的基因融合表达系统已经在Curr Opin Biotechnol[生物技术新见](1995)6(5):501-6中进行了综述。

在本发明的另一个实施例中，氨基酸序列可以连接到异源序列以编码融合蛋白。例如，为了筛选能够影响物质活性的试剂的肽文库，编码表达由可商购的抗体识别的异源表位的嵌合物质可能是有用的。

通用重组DNA方法技术

除非另外指明，否则本发明采用常规的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫技术，这些技术均在本领域普通技术人员的能力之内。这些技术在文献中进行了解释。参见，例如，Sambrook,J.和Russell,D.,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，第三版，冷泉港实验室出版社，冷泉港(2001)；Ausubel,F.M.等人，Short Protocols in Molecular Biology[简明分子生物学试验方案]，第5版，CurrentProtocols[当前试验方案]，约翰威利父子公司(John Wiley and Sons，Inc)，纽约州，(2002)；Silhavy,T.J.、Bennan,M.L.和Enquist,L.W.，Experiments with Gene Fusions[基因融合实验]，冷泉港实验室，冷泉港出版社，纽约州(1984)；B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn,(1996)，DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques[DNA分离和测序：基本技术]，约翰威利父子公司，纽约州；M.J.Gait(编辑)，(1984)，OligonucleotideSynthesis:A Practical Approach[寡核苷酸合成：实用方法]，Irl出版社；以及D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg(编辑)，(1992)，DNA Structure Part A:Synthesis andPhysical Analysis of DNA Volume 211[DNA结构，部分A：DNA的合成和物理分析，第211卷](Methods in Enzymology[酶学方法])，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(SanDiego)，加利福尼亚州。

剂量

用于本文所述的方法和/或用途中的三肽基肽酶和/或内切蛋白酶可以按任何合适的量给药。

在一个实施例中，三肽基肽酶能以约5mg至3g的酶/kg蛋白质底物和/或食品和/或饲料添加剂组合物的量给药。

在水解产物的制备中，合适地，所述酶三肽基肽酶能以5mg至3g的酶/kg蛋白质底物的量来给药。

在一个实施例中，合适地，所述酶三肽基肽酶能以25mg至1000mg的酶/kg蛋白质底物的量给药。

在另一个实施例中，三肽基肽酶能以约1mg至约1kg的酶/kg食品和/或饲料和/或喂养料和/或预混物的量给药。合适地，三肽基肽酶能以约1mg至约250g/kg食品和/或饲料和/或喂养料和/或预混物给药。优选地，以约1mg至约100g(更优选地约1mg至约1g)/kg食品和/或饲料和/或喂养料和/或预混物给药。

内切蛋白酶可能以约50mg至约3000mg的酶/kg蛋白质底物(例如0.05g至3g的酶/公吨(MT)蛋白质底物)的量给药。

合适地，内切蛋白酶能以小于约4.0g酶/MT蛋白质底物的量来给药。

在另一个实施例中，内切蛋白酶能以约0.5g至约5.0g之间的酶/MT蛋白质底物给药。合适地，内切蛋白酶能以约0.5g至约3.0g之间的酶/MT蛋白质底物给药。更合适地，内切蛋白酶能以约1.0g至约2.0g的酶/MT蛋白质底物给药。

在一个实施例中，氨肽酶能以约0.5mg至约2g之间的酶/kg蛋白质底物和/或食品和/或饲料添加剂组合物的量给药。合适地，氨肽酶能以约1mg至约2g之间的酶/kg蛋白质底物和/或食品和/或饲料添加剂组合物的量给药；更合适地，以约5mg至约1.5g之间的酶/kg蛋白质底物和/或食品和/或饲料添加剂组合物的量给药。

在水解产物的制备中，氨肽酶能以约0.5mg至约2g之间的酶/kg蛋白质底物的量给药。合适地，氨肽酶能以约1mg至约2g之间的酶/kg蛋白质底物的量给药；更合适地，以约5mg至约1.5g之间的酶/kg蛋白质底物的量给药。

在一个实施例中，氨肽酶能以约5mg至约500mg之间的酶/kg蛋白质底物的量给药。合适地，氨肽酶能以约50mg至约500mg之间的酶/kg蛋白质底物的量给药。合适地，氨肽酶能以约100mg至约450mg之间的酶/kg蛋白质底物的量给药。

受试者

术语“受试者”可用于指“动物”或“人类”。

合适地，受试者可以是倾向于对包含一种或多种特定蛋白质或其部分的未处理的水解产物具有免疫反应的“敏感个体”。例如，受试者可以是敏感的个体，该个体具有：谷蛋白(例如麦醇溶蛋白)过敏、乳蛋白过敏和/或大豆蛋白过敏。

如本文所使用的，术语“动物”是指要给予或已经给予根据本发明的饲料添加剂组合物或包括根据本发明的所述饲料添加剂组合物的喂养料的动物。

优选地，动物为哺乳动物、反刍动物、单胃动物、鱼或甲壳类动物，包括诸如牲畜或驯养动物(例如宠物)。

在一个实施例中，“动物”为牲畜。

如本文所使用的，术语“牲畜”是指任何农场动物。优选地，牲畜是以下中的一种或多种：母牛或公牛(包括小牛)、猪(包括仔猪、生猪、生长猪、母猪)、家禽(包括肉鸡、小鸡、蛋鸡和火鸡)、鸟、鱼(包括淡水鱼，例如鲑鱼、鳕鱼、鳟鱼和鲤鱼(例如锦鲤)和海鱼(例如黑鲈)、甲壳类动物(例如虾、贻贝和扇贝)、马(包括赛马)、绵羊(包括羔羊)。

在另一个实施例中，“动物”为驯养动物或宠物或在动物园环境中饲养的动物。

如本文所使用的，术语“驯养动物或宠物或在动物园环境中饲养的动物”是指任何相关动物，包括犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、啮齿类动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠)、鸟、鱼(包括淡水鱼和海鱼)和马。

在一个实施例中，所述动物为单胃动物。在一个优选的实施例中，所述单胃动物可为家禽或猪(或其组合)。

在另一个实施例中，所述动物为反刍动物。

术语动物不旨在是指人类。

制剂

组合物和/或食品添加剂组合物和/或饲料添加剂组合物可以包含如本文所述生产的三肽基肽酶和/或水解产物。

在另一个实施例中，提供了包含本发明的水解产物的组合物和/或食品添加剂和/或饲料添加剂组合物。合适地，这样的食品和/或饲料添加剂组合物可以进一步包含三肽基肽酶(任选地与内切蛋白酶组合)。

用于所述方法和/或用途和/或组合物和/或食品添加剂和/或饲料添加剂组合物中的三肽基肽酶能以本领域已知的任何适当方式进行配制。

食品级酶的典型液体制剂可以包括以下组分(％是以w/w计)：0.2％-30％的目的酶，优选2％-20％。

通过使用浓度从约0.1％至约20％(合适地从约0.1％至约5％)的盐，如NaCl、KCl、CaCl2、Na2SO4或其他食品级盐，也可以增加酶制剂的稳定性。不希望受理论束缚，据信高盐浓度可能再次成为单独或与另外的成分组合实现微生物稳定性的方式。作用机理可能是归因于水活度较低或某种酶和盐之间的特异性作用。因此，在一些实施例中，三肽基肽酶可以与至少一种盐混合。

合适地，防腐剂可以是苯甲酸钠和/或山梨酸钾。典型地，这些防腐剂能以约0.1％-1％(合适地约0.2％-0.5％)的组合浓度使用。苯甲酸钠在pH<5.5时是最有效的，而山梨酸钠在pH<6时是最有效的。

合适地，糖是山梨糖醇。

合适地，盐是硫酸钠。

在一个实施例中，一种或多种成分(例如用于组合物和/或食品添加剂组合物和/或饲料添加剂组合物的配制)可以选自由以下组成的组：多元醇，例如甘油或山梨糖醇；糖类，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和海藻糖；盐，例如NaCl、KCl、CaCl2、Na2SO4或其他食品级盐；防腐剂，例如苯甲酸钠和山梨酸钾；或其任何组合。

在一个优选的实施例中，提供了组合物(例如饲料添加剂组合物)或其用途及制备其的方法，该组合物包含用选自由以下组成的组中的一种或多种的化合物配制的本发明的酶：Na2SO4、NaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4、(NH4)H2PO4、K2HPO4、KH2PO4、K2SO4、KHSO4、ZnSO4、MgSO4、CuSO4、Mg(NO3)2、(NH4)2SO4、硼酸钠、乙酸镁、柠檬酸钠或其任何组合。

合适地，一种或多种成分(例如用于组合物和/或食品添加剂组合物和/或饲料添加剂组合物的配制)可以选自由小麦载体、山梨糖醇和硫酸钠组成的组。

合适地，三肽基肽酶和/或组合物和/或食品添加剂和/或饲料添加剂组合物可以与小麦载体混合。

合适地，三肽基肽酶和/或组合物和/或食品添加剂和/或饲料添加剂组合物可以与山梨糖醇混合。

合适地，三肽基肽酶和/或组合物和/或食品添加剂和/或饲料添加剂组合物可以与硫酸钠混合。

在一个优选的实施例中，组合物和/或食品添加剂和/或饲料添加剂组合物可以进一步包含本文详述的任何内切蛋白酶。

形式

能以任何合适的形式使用所述饲料添加剂组合物和其他组分和/或包含该饲料添加剂组合物和其他组分的喂养料。

所述饲料添加剂组合物能以固体或液体制剂或其替代物形式使用。固体制剂的实例包括粉剂、糊剂、大丸粒、胶囊剂、丸粒、片剂、尘剂和颗粒，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的实例包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液、混悬液和乳剂。

在一些应用中，本发明的饲料添加剂组合物可与饲料混合，或施用于饮用水中。

针对速释型、迟释型、调释型、缓释型、脉冲释放型或控释型应用，形式的合适的实例包括粉剂、糊剂、大丸剂、丸粒、片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、珠剂、溶液或悬浮液中的一种或多种，其可包含调味剂或染色剂。

举例来说，如果所述组合物以固体(例如压成丸粒的形式)使用，那么它也可以包含以下中的一种或多种：赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂，例如淀粉(优选是玉米、马铃薯、木薯淀粉)，乙醇酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复杂的硅酸盐；造粒粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯树胶；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石可以包括在内。

用于制备这些形式的营养上可接受的载体的实例包括例如水、盐溶液、醇、硅酮、蜡类、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖类、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯、石油醚(petroethral)脂肪酸酯、羟甲基-纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。

用于这些形式的优选赋形剂包括乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、乳糖(milksugar)或高分子量聚乙二醇。

对于水性悬浮液和/或酏剂，可将所述组合物与不同的甜味剂或调味剂、调色物质或染料进行组合，与乳剂和/或悬浮剂进行组合，以及与稀释剂(例如水、丙二醇和甘油)进行组合，及其组合。

与其他组分的组合

三肽基肽酶和内切蛋白酶和/或组合物和/或食品添加剂组合物和/或饲料添加剂组合物和/或水解产物可以与其他组分组合使用。

在另一个优选的实施例中，三肽基肽酶和内切蛋白酶和/或食品添加剂组合物和/或饲料添加剂组合物和/或水解产物可以其他组分组合使用，这些其他组分适合于动物或人类消耗并且能够向消费者提供医疗或生理益处。

在一个实施例中，“另一种组分”可为一种或多种酶。

合适的另外的酶可以为选自由以下组成的组中的一种或多种酶：内切葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、纤维素酶(E.C.3.2.1.74)、地衣聚糖酶(E.C.3.2.1.73)、脂肪酶(E.C.3.1.1.3)、脂质酰基转移酶(通常归类为E.C.2.3.1.x)、磷脂酶(E.C.3.1.1.4、E.C.3.1.1.32或E.C.3.1.1.5)、植酸酶(例如6-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或3-植酸酶(E.C.3.1.3.8)、α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、木聚糖酶(E.C.3.2.1.8、E.C.3.2.1.32、E.C.3.2.1.37、E.C.3.1.1.72或E.C.3.1.1.73)、葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)、蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))和/或甘露聚糖酶(例如β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78))。

合适地，所述其他组分可以是植酸酶(例如6-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或3-植酸酶(E.C.3.1.3.8))。

在一个实施例中(特别针对饲料应用)，所述其他组分可以是选自由以下组成的组中的一种或多种酶：木聚糖酶(E.C.3.2.1.8、E.C.3.2.1.32、E.C.3.2.1.37、E.C.3.1.1.72或E.C.3.1.1.73)、淀粉酶(包括α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、G4-形成淀粉酶(E.C.3.2.1.60)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(E.C.3.2.1.3))、和/或蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))。

在一个实施例(特别针对饲料应用)中，所述其他组分可以为淀粉酶(例如，α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1))和蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62))的组合。

在一个实施例(特别针对饲料应用)中，所述其他组分可以是β-葡聚糖酶，例如内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.6)。

在一个实施例(特别针对饲料应用)中，所述其他组分可以是甘露聚糖酶(例如β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78))。

在一个实施例(特别针对饲料应用)中，所述其他组分可以是脂肪酶(E.C.3.1.1.3)、脂质酰基转移酶(通常归类为E.C.2.3.1.x)、或磷脂酶(E.C.3.1.1.4、E.C.3.1.1.32或E.C.3.1.1.5)，优选脂肪酶(E.C.3.1.1.3)。

在一个实施例(特别针对饲料应用)中，所述其他组分可以是蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))。

在另一个实施例中，所述其他组分可以是另外的蛋白酶。合适地，所述另外的蛋白酶可以选自由氨肽酶和羧肽酶组成的组。

如在本发明上下文中所使用的，术语“氨肽酶”是指能够从蛋白质和/或肽底物的N-末端裂解单个氨基酸、二氨基酸或其组合的外肽酶。优选地，氨肽酶能够仅从蛋白质和/或肽底物的N-末端裂解单个氨基酸。

氨肽酶能够可获自(优选获得自)乳杆菌属，合适地可获自瑞士乳杆菌。

在一个实施例中，氨肽酶可以是氨肽酶N(例如PepN)(EC 3.4.11.2)。

在一个实施例中，氨肽酶可以包含如SEQ ID NO:5所示的序列：

MAVKRFYKTFHPEHYDLRINVNRKNKTINGTSTITGDVIENPVFINQKFM

TIDSVKVDGKNVDFDVIEKDEAIKIKTGVTGKAVIEIAYSAPLTDTMMGI

YPSYYELEGKKKQIIGTQFETTFARQAFPCVDEPEAKATFSLALKWDEQD

GEVALANMPEVEVDKDGYHHFEETVRMSSYLVAFAFGELQSKTTHTKDGV

LIGVYATKAHKPKELDFALDIAKRAIEFYEEFYQTKYPLPQSLQLALPDF

SAGAMENWGLVTYREAYLLLDPDNTSLEMKKLVATVITHELAHQWFGDLV

TMKWWDNLWLNESFANMMEYLSVDGLEPDWHIWEMFQTSEAASALNRDAT

DGVQPIQMEINDPADIDSVFDGAIVYAKGSRMLVMVRSLLGDDALRKGLK

YYFDHHKFGNATGDDLWDALSTATDLDIGKIMHSWLKQPGYPVVNAFVAE

DGHLKLTQKQFFIGEGEDKGRQWQIPLNANFDAPKIMSDKEIDLGNYKVL

REEAGHPLRLNVGNNSHFIVEYDKTLLDDILSDVNELDPIDKLQLLQDLR

LLAEGKQISYASIVPLLVKFADSKSSLVINALYTTAAKLRQFVEPESNEE

KNLKKLYDLLSKDQVARLGWEVKPGESDEDVQIRPYELSASLYAENADSI

KAAHQIFTENEDNLEALNADIRPYVLINEVKNFGNAELVDKLIKEYQRTA

DPSYKVDLRSAVTSTKDLAAIKAIVGDFENADVVKPQDLCDWYRGLLANH

YGQQAAWDWIREDWDWLDKTVGGDMEFAKFITVTAGVFHTPERLKEFKEF

FEPKINVPLLSREIKMDVKVIESKVNLIEAEKDAVNDAVAKAID如本文所使用的，术语“羧肽酶”具有在本领域中的通常含义，并且是指能够从肽和/或蛋白质底物的C-末端裂解n个氨基酸的外肽酶。在一个实施例中，n可以是至少1，合适地，n可以是至少2。在其他实施例中，n可以是至少3，合适地至少4。

在其他实施例中，三肽基肽酶(任选与内切蛋白酶组合)可以与一种或多种另外的外肽酶一起使用。

在一个实施例中，三肽基肽酶(任选与内切蛋白酶组合)不与脯氨酸特异性外肽酶组合(或组合使用)。

在一个特别优选的实施例中，三肽基肽酶可能不与具有以下多肽序列(SEQ IDNO:6)的酶组合：

MRTAAASLTLAATCLFELASALMPRAPLIPAMKAKVALPSGNATFEQYIDHNNPGLG

TFPQRYWYNPEFWAGPGSPVLLFTPGESDAADYDGFLTNKTIVGRFAEEIGGAVILLE

HRYWGASSPYPELTTETLQYLTLEQSIADLVHFAKTVNLPFDEIHSSNADNAPWVMT

GGSYSGALAAWTASIAPGTFWAYHASSAPVQAIYDFWQYFVPVVEGMPKNCSKDL

NRVVEYIDHVYESGDIERQQEIKEMFGLGALKHFDDFAAAITNGPWLWQDMNFVSG

YSRFYKFCDAVENVTPGAKSVPGPEGVGLEKALQGYASWFNSTYLPGSCAEYKYW

TDKDAVDCYDSYETNSPIYTDKAVNNTSNKQWTWFLCNEPLFYWQDGAPKDEST

IVSRIVSAEYWQRQCHAYFPEVNGYTFGSANGKTAEDVNKWTKGWDLTNTTRLIW

ANGQFDPWRDASVSSKTRPGGPLQSTEQAPVHVIPGGFHCSDQWLVYGEANAGVQ

KVIDEEVAQIKAWVAEYPKYRKP

在一个实施例中，附加组分可以是稳定剂、或乳化剂、或粘合剂、或载体、或赋形剂、或稀释剂、或崩解剂。

如本文所使用的，术语“稳定剂”被定义为保持产品(例如饲料产品)免于随时间而变化的成分或成分的组合。

如本文所使用的，术语“乳化剂”是指防止乳剂分离的成分(例如饲料成分)。乳剂是两种不混溶的物质，一种以小滴形式存在，包含于另一者中。乳剂可以由以下组成：水包油(其中液滴或分散相是油并且连续相是水)；或油包水(其中水成为分散相并且连续相是油)。也可通过使用乳化剂而使泡沫(即气体分散于液体中)和悬浮液(即固体分散于液体中)稳定。

如本文所使用的，术语“粘合剂”是指通过物理或化学反应将产品结合在一起的成分(例如饲料成分)。例如，在“凝胶化”期间，水被吸收并提供结合效果。然而，粘合剂可以吸收其他液体(例如油)，从而将它们保持在产品中。在本发明的组合物和方法的上下文中，粘合剂将通常用于固体或低水分产品(例如烘焙产品：甜点、甜甜圈、面包等)中。制粒粘合剂的实例包括以下中的一种或多种：聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、麦芽糖、明胶和阿拉伯树胶。

如本文所使用的，“载体”意指适合于给予酶的材料且包括本领域已知的任何这样的材料，例如像任何液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、稳定剂等，这些材料是无毒的并且并不以有害方式与组合物的任何组分相互作用。

提供了一种用于制备组合物(例如饲料添加剂组合物)的方法，该方法包括将本发明的饲料添加剂(以及优选地玉米或玉米副产物)与至少一种生理上可接受的载体混合，该载体选自以下中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰岩(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石、PVA、山梨糖醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐及其混合物。

“赋形剂”的实例包括以下中的一种或多种：微晶纤维素和其他纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙、甘氨酸、淀粉和高分子量聚乙二醇。

崩解剂的实例包括如下中的一种或多种：淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐。

“稀释剂”的实例包括以下中的一种或多种：水、乙醇、丙二醇、丙三醇以及其组合。

其他的组分可以与本发明的饲料添加剂同时地(例如当它们一起处于混合物中时或者甚至当它们通过不同的途径递送时)或顺序地(例如它们可通过不同的途径递送)使用。

在一个优选的实施例中，所述饲料添加剂组合物、或饲料成分、或饲料或喂养料、或预混物不包含铬或有机铬。

在一个优选的实施例中，所述饲料添加剂组合物、或饲料成分、或饲料或喂养料、或预混物不包含山梨酸。

包装

在一个实施例中，对所述三肽基肽酶和内切蛋白酶、和/或组合物、和/或食品和/或饲料添加剂组合物、和/或水解产物、和/或食物、和/或喂养料进行包装。

在一个优选的实施例中，所述三肽基肽酶和内切蛋白酶、和/或组合物、和/或食品和/或饲料添加剂组合物、和/或水解产物、和/或食物、和/或喂养料被包装在袋(例如纸袋)中。

在一个替代性实施例中，所述三肽基肽酶和内切蛋白酶、和/或组合物、和/或食品和/或饲料添加剂组合物、和/或水解产物、和/或食物、和/或喂养料可以被密封在容器中。可使用任何合适的容器。

食物

术语“食物(foodstuff)”在本文中与“食品(food)”同义。

如本文所使用的，术语“食物”习惯是指人类的食品。

食品可以处于溶液的形式或作为固体–这取决于用途和/或应用模式和/或给予模式。

当用作食品(例如功能食品)或用于食品(例如功能食品)的制备时，本发明的水解产物和/或组合物和/或食品添加剂组合物可以与以下中的一种或多种组合使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、或营养活性成分。

在一个实施例中，提供了包含根据本发明的水解产物的食物。该食物可以另外地包含三肽基肽酶(例如可通过本文的任何方法获得的)，任选地与内切蛋白酶组合。

合适地，该食物可以包含至少一种三肽基肽酶，该三肽基肽酶包含选自SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能片段或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列。

在另一个实施例中，提供了一种用于生产食物的方法，该方法包括使食品组分与本发明的水解产物或本发明的组合物和/或食品添加剂组合物接触。

在食品组分与组合物和/或食品添加剂组合物接触的情况下，合适地，食品组分也可与内切蛋白酶接触。

本发明的组合物可以用于食品产品的制备中，该食品产品例如是以下中的一种或多种：果酱、桔子酱、果冻、奶产品(例如奶或奶酪)、肉类产品、禽制品、鱼产品、和烘焙产品。

举例来说，本发明的组合物可以用作软饮料、果汁或饮料的成分，这些软饮料、果汁或饮料包括乳清蛋白、健康茶、可可饮料、乳饮料和乳酸菌饮料、酸奶和饮用酸奶、乳酪、冰淇淋、冰糕和甜点、糕点糖果、饼干蛋糕和蛋糕混合物、小吃食物、早餐谷物、方便面和杯面、速溶汤和杯汤、均衡的食物和饮料、甜味剂、质地改善的小吃棒、纤维棒、烘烤稳定的水果馅料、保健釉、巧克力面包馅料、乳酪蛋糕调味馅料、水果口味蛋糕馅料、蛋糕和甜甜圈糖衣、热稳定的面包馅料、即时面包馅料、饼干馅料、即食面包馅料、减少热量馅料、成人营养饮料、酸化大豆/果汁饮料、无菌/蒸馏巧克力饮料、酒吧混合物、饮料粉剂、钙强化大豆和巧克力奶、以及钙强化咖啡饮料。

本发明的组合物可以进一步用作食品产品中的成分，这些食品产品例如是美国奶酪酱、用于磨碎和切碎的干酪的抗结块剂、点心盘、奶油干酪、干混鞭打无脂肪酸性稀奶油、冷冻/解冻动物性鲜奶油、冷冻/解冻稳定的喷射奶油、低脂肪和清淡的自然切达干酪、低脂瑞士式酸奶、充气冷冻甜点、和新奇棒、硬盒冰淇淋、标签友好的改善经济和放纵的硬盒冰淇淋、低脂冰淇淋：软冰淇淋、烧烤酱、奶酪蘸酱、松软干酪敷料、干混阿尔弗雷多(Alfredo)酱、混合奶酪酱、干混番茄酱等。

对于某些方面，优选地食物是饮料。

优选地，食物可以是烘焙产品，例如面包、丹麦甜糕饼、小面包或饼干。

在另一个实施例中，提供了一种制备食品或食品成分的方法，该方法包括将通过本发明的方法制备的5-KGA或根据本发明的组合物与另一种食品成分混合。在另一个实施例中，还提供了一种用于制备食品成分的方法。

所述食物可以是奶产品、乳清蛋白产品、烘焙产品、发酵产品、性能食品、婴儿食品、饮料、奶昔或肠衣。

合适地，奶产品可以是基于奶的产品。这样的基于奶的产品可以包含一种或多种乳蛋白或其片段。

优选地，奶制品(例如基于奶的产品)可以是婴儿配方食品。

合适地，烘焙产品可以是面包产品。

合适地，发酵产品可以是基于大豆的发酵产品。

食品成分

本发明的水解产物和/或本发明的食品添加剂组合物可以用作食品成分。

如本文所使用的，术语“食品成分”包括作为或者可以作为营养补充剂和/或纤维补充剂添加到功能食品或食物中的制剂。如在此所使用的，术语食品成分还是指可以在需要胶凝化、组织化、稳定化、悬浮、成膜和结构化、保持多汁、和改善口感(不增加粘度)的多种产品中以低水平使用的制剂。

食品成分可以是处于溶液的形式或作为固体–这取决于用途和/或应用模式和/或给予模式。

食品补充剂

所述水解产物和/或组合物和/或食品添加剂组合物可以是食品添加剂或可以添加到食品添加剂中。

功能食品

本发明的一种或多种组合物可以是功能食品或可以添加到功能食品中。

如本文所使用的，术语“功能食品”意指不仅能够提供营养效果和/或味道满足，还能够向消费者递送另外的有益效果的食品。

因此，功能食品是具有掺入其中的组分或成分(例如本文所述的那些)的普通食品，这些组分或成分赋予该食品特定的功能性-例如医疗或生理益处-除了纯粹的营养作用之外。

虽然对于功能食品没有法律定义，但大多数对此领域感兴趣的各方都同意的是，它们是作为具有特定健康效果而面市的食品。

一些功能食品是保健营养品。如本文所使用的，术语“保健营养品”意指不仅能够提供营养效果和/或味道满足，还能够向消费者递送治疗(或其他有益)效果的食品。保健营养品跨越了在食品和药物之间的传统分界线。

调查已经表明，消费者最重视声称与心脏疾病有关的功能食品。预防癌症是营养品的另一个方面，其引起了消费者极大的兴趣，但有趣的是，这是消费者觉得他们可以最少地施加控制的区域。事实上，据世界卫生组织，至少有35％的癌症病例与饮食有关。此外，涉及骨质疏松症、肠道健康和肥胖影响的主张也是可能煽动功能食品购买和推动市场开发的关键因素。

饲料

本发明的饲料添加剂组合物可以用作饲料或用于饲料的制备中。

在一个实施例中，提供了包含如本文所述的水解产物的喂养料。喂养料可以另外地包含三肽基肽酶(例如可通过本文的任何方法获得的)，任选地与内切蛋白酶组合。

合适地，所述喂养料可以包含至少一种三肽基肽酶，该三肽基肽酶包含选自SEQID NO:3、SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其任何功能片段或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列。

在另一个实施例中，还提供了一种用于生产喂养料的方法，该方法包括使饲料组分与如本文所述的水解产物接触。

如本文所使用的，术语“饲料”与“喂养料”同义。

饲料可以处于溶液的形式或作为固体–这取决于用途和/或应用模式和/或给予模式。

当用作饲料(例如功能饲料)或用于饲料(例如功能饲料)的制备时，所述组合物可以与以下中的一种或多种组合使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养活性成分。

在一个优选的实施例中，将本发明的饲料添加剂组合物与饲料组分混合以形成喂养料。

如本文所使用的，术语“饲料组分”意指喂养料的全部或部分。喂养料的部分可意指喂养料的一种成分或喂养料的一种以上(例如2种、3种或4种)的成分。在一个实施例中，术语“饲料组分”涵盖预混物或预混物成分。

在一个实施例中，提供了饲料添加剂组合物，其包含三肽基肽酶和一种或多种选自由以下组成的组中的成分：多元醇，例如甘油和/或山梨糖醇；糖类，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和海藻糖；盐，例如NaCl、KCl、CaCl2、Na2SO4或其他食品级盐；防腐剂，例如苯甲酸钠和/或山梨酸钾；或其组合(任选地与内切蛋白酶组合)；该饲料添加剂组合物可以与至少一种蛋白质或其部分混合，该至少一种蛋白质或其部分是动物蛋白质或植物蛋白质(例如选自以下中的一种或多种：麦醇溶蛋白，β-酪蛋白，β-乳球蛋白，或麦醇溶蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白的免疫原性片段，大豆球蛋白，β-伴大豆球蛋白，十字花科蛋白，油菜籽蛋白，胶原蛋白，乳清蛋白，鱼蛋白，肉蛋白，卵蛋白，大豆蛋白，大麦醇溶蛋白或谷物蛋白)，优选地包含于以下中：玉米、大豆粉、玉米干酒糟及可溶物(DDGS)、小麦、包括谷蛋白的小麦蛋白、小麦副产品、麦麸、包括玉米蛋白粉的玉米副产品、大麦、燕麦、黑麦、黑小麦、全脂大豆、动物副产品粉、醇溶性蛋白(优选是玉米蛋白(例玉蜀黍玉米蛋白)和/或高粱醇溶蛋白(例如来自高粱))、来自油料种子的蛋白质(优选来自大豆种子蛋白、向日葵种子蛋白、油菜籽蛋白、低芥酸菜籽种子蛋白或其组合)或其任何组合)。

优选地，饲料可以是草料(fodder)或其预混物、复合饲料或其预混物。在一个实施例中，可以将所述饲料添加剂组合物与复合饲料、复合饲料组分混合或将其混合至复合饲料的预混物或混合至草料、草料组分或草料的预混物中。

如本文所使用的，术语草料(fodder)是指提供给动物的任何食物(而不是动物必须自己觅食)。草料涵盖已经切下的植物。

术语草料包括干草、秸秆、青贮饲料、压缩饲料和压成丸粒的饲料、油和混合给养，并且也包括发芽谷物和豆类。

草料可获自选自以下的植物中的一种或多种：苜蓿(紫苜蓿)、大麦、百脉根、芸苔属、Chau moellier、羽衣甘蓝、油菜籽(低芥酸菜籽)、芜菁甘蓝(瑞典甘蓝)、萝卜、三叶草、杂种三叶草、红三叶草、地下三叶草、白三叶草、草、燕麦草、羊茅草、绊根草、雀麦草、石南荒原草、草地早熟禾(来自天然混合的草原草地)、野茅、黑麦草、猫尾草、玉米(玉蜀黍)、粟、燕麦、高粱、大豆、树(用作树-干草的修剪下的树嫩枝)、小麦、和豆科植物。

术语“复合饲料”意指以粗粉、丸粒、球丸(nut)、饼或碎屑形式的商业饲料。复合饲料可由多种原料和添加剂共混而来。根据目标动物的特定需求配制这些共混物。

复合饲料可以是提供所有每日所需营养物质的完全饲料、提供口粮(蛋白质、能量)的一部分的浓缩物或仅提供另外的微量营养物质(例如矿物质和维生素)的补充剂。

用于复合饲料的主要成分是饲料谷物，其包括玉米、小麦、裸麦、玉蜀黍、大豆、高粱、燕麦、和大麦。

合适地，在此所提及的预混物可以是由微量成分构成的组合物，该微量成分为例如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其他必需成分。预混物通常是适合于共混进商业口粮内的组合物。

任何喂养料可包含一种或多种选自包含以下的组的饲料材料：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦、及其组合)和/或大粒谷物例如玉蜀黍或高粱；b)来自植物的副产物，如干酒糟谷物可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁、柑橘渣、玉米纤维、玉米胚芽粉、玉米糠、玉米粉渣、玉米蛋白饲料、谷蛋白粉、次麦粉、小麦粗粉或其组合；c)获自以下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、低芥酸菜籽、鱼粉、干血浆蛋白质、肉粉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。

喂养料可含有按重量计至少30％、至少40％、至少50％或至少60％的玉米和大豆粉或玉米及全脂大豆、或者小麦粉或向日葵粉。

另外或可替代地，喂养料可包含至少一种高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物以提供高纤维喂养料。高纤维饲料材料的实例包括：小麦、大麦、黑麦、燕麦、来自植物(例如谷类)的副产物(如干酒糟谷物可溶物(DDGS))、麦麸、小麦粗粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁、柑橘渣、玉米纤维、玉米胚芽粉、玉米糠、玉米粉渣、玉米蛋白饲料、谷蛋白粉、次麦粉、小麦粗粉或其组合。一些蛋白质源也可视为高纤维：获自诸如向日葵、羽扇豆、蚕豆和棉花等来源的蛋白质。

所述饲料可为以下中的一者或多者：复合饲料和预混物，包括丸粒、坚果或(牲畜)饼状物；作物或作物残余物：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、玉米秸秆、椰子核、稻草、谷壳、甜菜残渣；鱼粉；新割的草和其他饲用植物；肉粉和骨粉；糖蜜；油饼和滤饼；低聚糖；糖渍饲用植物：干草和青贮饲料；海草；种子和谷物，完整的或通过压碎、碾磨等制备；发芽谷物及豆类；酵母提取物。

如本文所使用的，术语“饲料”在一些实施例中还涵盖宠物食品。宠物食品是旨在由宠物消费的植物或动物材料，例如狗食品或猫食品。宠物食品(例如狗和猫食品)可以干燥形式(例如用于狗的磨碎食物)或湿罐装形式。猫食品可含有氨基酸牛磺酸。

术语“饲料”在一些实施例中还涵盖鱼食。鱼食通常含有使养殖鱼保持良好健康所需的大量营养素、痕量元素和维生素。鱼食可以呈小片、丸粒或片的形式。压成丸粒的形式(其中的一些快速沉降)经常用于较大鱼或底饲物种。一些鱼食还含有添加剂(例如β胡萝卜素或性激素)以人工增强观赏性鱼的颜色。

术语“饲料”在一些实施例中还涵盖鸟食。鸟食包括用于喂鸟器中以及用于饲喂宠物鸟的食物。典型地，鸟食由多种种子组成，但也可涵盖板油(牛肉或羊肉脂肪)。

如本文所使用的，术语“接触”指的是间接或直接将本发明的组合物应用到产品(例如饲料)中。可以使用的应用方法的实例包括但不限于：在包含饲料添加剂组合物的材料中处理产品、通过将饲料添加剂组合物与产品混合而直接应用、将饲料添加剂组合物喷涂至产品表面上或将产品浸入饲料添加剂组合物的制剂中。

在一个实施例中，优选将本发明的饲料添加剂组合物与产品(例如喂养料)混合。可替代地，喂养料的乳液或原始成分中可包括饲料添加剂组合物。

对于一些应用而言，重要的是，使组合物在待影响/处理的产品表面上可用或可用于待影响/处理的产品表面。这允许组合物能赋予如下有利特性中的一种或多种：生物物理特性选自由以下中的一种或多种组成的组：动物性能、动物生长性能、饲料转化率(FCR)、消化原料的能力(例如营养消化率，包括淀粉、脂肪、蛋白质、纤维消化率)、氮消化率(例如回肠氮消化率)和消化能(例如回肠消化能)、氮保留、屠体收率、生长速率、增重、体重、质量、饲料效率、体脂百分比、体脂分布、生长、蛋大小、蛋重、蛋质量、产蛋率、瘦肉增加、骨灰％、骨灰mg、背脂％、乳产量、乳脂％、繁殖产量例如同窝生仔数、同窝生存能力、孵化率％和环境影响，例如粪肥输出和/或氮排泄。

可将本发明的饲料添加剂组合物和受控量的一种或多种酶散布、涂布和/或浸渍产品(例如喂养料或喂养料的原材料)。

优选地，本发明的饲料添加剂组合物将是热稳定的以便进行高达约70℃、高至约85℃、或高至约95℃的热处理。热处理可以进行长达约1分钟；长达约5分钟；长达约10分钟；长达约30分钟；长达约60分钟。术语“热稳定”意指加热至特定温度之前添加剂中存在/有活性的酶组分的至少约75％在冷却至室温之后仍存在/有活性。优选地，加热至特定温度之前添加剂中存在且有活性的酶组分的至少约80％在冷却至室温之后仍存在且有活性。

在一个特别优选的实施例中，将饲料添加剂组合物均化，以制成粉末。

在一个替代性优选的实施例中，将饲料添加剂组合物配制成如WO 2007/044968中所述的颗粒(称为TPT颗粒)，该文献通过引用并入本文。

在另一个优选的实施例中，当将饲料添加剂组合物配制成颗粒时，这些颗粒包含包覆在蛋白质核心上的水合屏障盐。这样的盐包衣的优点在于使耐热性改善、使保藏稳定性改善和保护免受其他原本会不利影响该酶的饲料添加剂的影响。

优选地，用于盐包衣的盐在20℃具有大于0.25的水活度或大于60％的恒定湿度。

优选地，盐包衣包含Na2SO4。

制备饲料添加剂组合物的方法也可包括将粉末制成丸粒的进一步步骤。粉末可以与本领域已知的其他组分进行混合。可强加力使粉末、或包含粉末的混合物通过模具，并将所得线料切成适宜的不同长度的丸粒。

任选地，制粒步骤可包括在丸粒形成之前进行的蒸汽处理或调理阶段。可将包含粉末的混合物置于调节器中，例如带有蒸汽注射的搅拌器。将该混合物在达到指定温度(例如从60℃-100℃)的调节器中加热，典型的温度将是70℃、80℃、85℃、90℃或95℃。停留时间可以从几秒钟到几分钟甚至几小时变化。例如5秒钟、10秒钟、15秒钟、30秒钟、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。

应当理解，本发明的饲料添加剂组合物适合用于添加至任何适当的饲料材料中。

如本文所使用的，术语饲料材料是指由动物消费的基础饲料材料。进一步应当理解，饲料材料可以包括例如至少一种或多种未加工的谷物和/或加工过的植物和/或动物材料，如大豆粉或骨粉。

如本文所使用的，术语“喂养料”是指已添加一种或多种饲料添加剂组合物的饲料材料。

技术人员会认识到，不同的动物要求不同的喂养料，甚至同一种动物也可能要求不同的喂养料，这取决于饲养该动物的目的。

优选地，喂养料可包含如下饲料材料，其包含玉蜀黍或玉米、小麦、大麦、黑小麦、黑麦、水稻、木薯、高粱和/或任何副产物，以及富含蛋白质的组分，如大豆粉、油菜籽粉、低芥酸菜籽粉、棉籽粉、向日葵籽粉、动物副产物粉及其混合物。更优选地，喂养料可包括动物脂肪和/或植物油。

任选地，喂养料还可含有另外的矿物质(例如钙)和/或另外的维生素。

优选地，喂养料为玉米大豆粉混合物。

喂养料典型地在饲料磨机中生产，在磨机中首先将原料研磨成合适的粒度，然后与适当的添加剂混合。然后，可以将喂养料生产成糊状或丸粒；后者通常涉及这样的方法，通过该方法将温度升高至目标水平，然后使饲料通过模具从而生产出特定大小的丸粒。让丸粒冷却。随后，可添加液体添加剂例如脂肪和酶。制备喂养料也可涉及另外的步骤，该步骤包括制粒之前的挤出或膨化，尤其是通过至少可包括使用蒸汽的适宜技术进行的挤出或膨化。

喂养料可为单胃动物的喂养料，诸如家禽(例如肉鸡、蛋鸡、肉种鸡、火鸡、鸭子、鹅、和水禽)、生猪(所有年龄段)、宠物(例如狗、猫)或鱼，优选地，喂养料为家禽的喂养料。

仅举例来说，鸡(例如肉鸡)的喂养料可以由在下表中列出的一种或多种成分组成，例如在下表中以百分比(％)给出的：

成分	起始鸡(％)	成鸡(％)
			玉蜀黍	46.2	46.7
小麦粗粉	6.7	10.0
			玉蜀黍DDGS	7.0	7.0
大豆粉48％CP	32.8	26.2
			An/Veg脂肪共混物	3.0	5.8
L-赖氨酸HCl	0.3	0.3
			DL-甲硫氨酸	0.3	0.3
L-苏氨酸	0.1	0.1
			盐	0.3	0.4
石灰岩	1.1	1.1
			磷酸氢钙	1.2	1.2
家禽维生素和微量矿物质	0.3	0.3

仅举例来说，鸡(例如肉鸡)的饮食规格可以如在下表中列出：

仅举例来说，蛋鸡的喂养料可以由在下表中列出的一种或多种成分组成，例如在下表中以％给出的：

成分	下蛋阶段(％)
		玉蜀黍	10.0
小麦	53.6
		玉蜀黍DDGS	5.0
大豆粉48％CP	14.9

成分	下蛋阶段(％)
		小麦粗粉	3.0
大豆油	1.8
		L-赖氨酸HCl	0.2
DL-甲硫氨酸	0.2
		L-苏氨酸	0.1
盐	0.3
		磷酸氢钙	1.6
石灰岩	8.9
		家禽维生素和微量矿物质	0.6

仅举例来说，蛋鸡的饮食规格可以如在下表中列出：

饮食规格
		粗蛋白质(％)	16.10
家禽代谢能(kcal/kg)	2700
		赖氨酸(％)	0.85
甲硫氨酸(％)	0.42
		甲硫氨酸+半胱氨酸(％)	0.71
苏氨酸(％)	0.60
		钙(％)	3.85
有效磷(％)	0.42
		钠(％)	0.16

仅举例来说，火鸡的喂养料可以由在下表中列出的一种或多种成分组成，例如在下表中以百分比(％)给出的：

仅举例来说，火鸡的饮食规格可以如在下表中列出：

仅举例来说，仔猪的喂养料可以由在下表中列出的一种或多种成分组成，例如在下表中以百分比(％)给出的：

成分	阶段1(％)	阶段2(％)
			玉蜀黍	20.0	7.0
小麦	25.9	46.6
			黑麦	4.0	10.0
小麦粗粉	4.0	4.0
			玉蜀黍DDGS	6.0	8.0
大豆粉48％CP	25.7	19.9
			乳清粉	10.0	0.0
大豆油	1.0	0.7
			L-赖氨酸HCl	0.4	0.5
DL-甲硫氨酸	0.2	0.2
			L-苏氨酸	0.1	0.2
L-色氨酸	0.03	0.04
			石灰岩	0.6	0.7

成分	阶段1(％)	阶段2(％)
			磷酸氢钙	1.6	1.6
生猪维生素和微量矿物质	0.2	0.2
			盐	0.2	0.4

仅举例来说，仔猪的饮食规格可以如在下表中列出：

仅举例来说，生长猪/成猪的喂养料可以由在下表中列出的一种或多种成分组成，例如在下表中以百分比(％)给出的：

成分	生长猪/成猪(％)
		玉蜀黍	27.5
大豆粉48％CP	15.4
		玉蜀黍DDGS	20.0
麦麸	11.1
		米糠	12.0
低芥酸菜籽种子粉	10.0
		石灰岩	1.6
磷酸氢钙	0.01
		盐	0.4
生猪维生素和微量矿物质	0.3
		赖氨酸-HCl	0.2
植物油	0.5

仅举例来说，生长猪/成猪的饮食规格可以如在下表中列出：

基于肉类的食品/饲料产品

水解产物可以用于制造基于肉类的食品/饲料产品。

“基于肉类的食品产品”和“基于肉类的饲料产品”是基于肉类的任何产品。

基于肉类的食品产品适合作为食品和/或饲料用于人和/或动物消费。在一个实施例中，基于肉类的食品产品是用于饲喂动物的饲料产品，例如像宠物食品产品。在另一个实施例中，基于肉类的食品产品是用于人类的食品产品。

基于肉类的食品/饲料产品可以包括非肉类成分，例如像水、盐、面粉、乳蛋白、植物蛋白、淀粉、水解蛋白、磷酸盐、酸、调味料、调色剂和/或调质剂。

基于肉类的食品/饲料产品优选包含在5％-90％(重量/重量)之间的肉类。在一些实施例中，基于肉类的食品产品可以包含至少30％(重量/重量)的肉类，例如至少50％、至少60％或至少70％的肉类。

在一些实施例中，基于肉类的食品/饲料产品是熟肉，例如像火腿、里脊、猪肩肉、培根和/或五花肉。

基于肉类的食品/饲料产品可以是以下中的一种或多种：

干的或半干的腌肉，例如发酵产品(使用发酵剂的干熏和发酵的产品)，例如干香肠、意大利蒜味腊肠(salami)、意大利辣香肠和干火腿；

乳化的肉类产品(例如用于冷或热消费)，例如摩泰台拉香肚、法兰克福香肠、午餐肉和肉酱；

鱼和海鲜，例如虾、鲑鱼、再生(reformulated)鱼产品、冷冻的低温装罐鱼；

鲜肉肌肉，例如全充血的肌肉，例如里脊、肩肉火腿、卤水肉；

研磨和/或改组的新鲜肉类或再生肉类，例如通过冷凝固凝胶或粘合的升级的切割肉，例如生的、未煮熟的猪腰排、牛排、烤肉、新鲜香肠、牛肉汉堡、肉丸、俄罗斯饺子；

家禽产品-例如鸡或火鸡胸脯肉或再生家禽产品，例如鸡块和/或鸡肉香肠；

蒸煮产品-蒸压肉类产品，例如野餐火腿、午餐肉、乳化产品。

在一个实施例中，基于肉类的食品/饲料产品是加工肉类产品，例如像香肠、大腊肠、肉糜卷、碎肉产品、绞肉、培根、猪肉香肠、意大利蒜味腊肠或肉酱。

加工的肉类产品可以是例如从基于肉类的乳液制成的乳化的肉类产品，例如像摩泰台拉香肚、大腊肠、意大利辣香肠、肝肠、鸡肉香肠、维也纳香肠、法兰克福香肠、午餐肉、肉干。

基于肉类的乳液可以被煮熟、灭菌或烘烤，例如处于烘烤形式或在填充到肠衣(例如塑料、胶原、纤维素或天然肠衣)中之后。加工的肉类产品也可以是改组的肉类产品，例如像改组的火腿。本发明的肉类产品可以经历加工步骤，例如像盐析，例如干盐渍；腌制，例如盐水腌制；烘干；烟熏；发酵；烹饪；罐藏；蒸馏；切片和/或切碎。

在另一个实施例中，食品/饲料产品可以是乳化的肉类产品。

肉类

如本文所使用的，术语“肉类”意指来源于任何种类的动物的任何种类的组织。

如本文所使用的术语肉类可以是包含来源于动物的肌肉纤维的组织。肉类可以是动物肌肉，例如整个动物肌肉或从动物肌肉切下的片。

在另一个实施例中，肉类可以包括动物的内部器官，例如像心脏、肝脏、肾脏、脾脏、胸腺和脑。

术语肉类涵盖通过本领域已知的任何其他适当方法研磨、切碎或切割成较小片的肉。

肉类可以来源于任何种类的动物，例如来自母牛、猪、羔羊、绵羊、山羊、鸡、火鸡、鸵鸟、野鸡、鹿、麋鹿、驯鹿、水牛、野牛、羚羊、骆驼、袋鼠；任何种类的鱼，例如鲱属小海鱼、鳕鱼、黑线鳕、金枪鱼、海鳗、鲑鱼、鲱、沙丁鱼、鲭鱼、竹荚鱼、秋刀鱼、圆腹鲱、绿鳕、比目鱼、鳀鱼、沙丁鱼、蓝鳕鱼、太平洋鳕鱼、鳟鱼、鲶鱼、鲈鱼、毛鳞鱼、枪鱼、红鲷鱼、挪威鳕和狗鳕；任何种类的贝类，例如蛤蜊、贻贝、扇贝、鸟蛤、海螺、蜗牛、牡蛎、虾、龙虾、海螯虾、螃蟹、小龙虾、墨鱼、鱿鱼和/或章鱼。

在一个实施例中，肉类是牛肉、猪肉、鸡肉、羊肉和/或火鸡。

生物物理特性

饲喂从本发明的一种或多种方法可获得(或获得)的动物水解产物可以改善如此饲喂的动物的生物物理特性。

合适地，所述方法和/或用途可以进一步包括向动物给予至少一种饲料组分、至少一种矿物质、至少一种维生素或其任何组合。

如本文所使用的，术语“给予”可以意指在饲喂喂养料(例如动物的常规饮食)之前、之后或同时饲喂动物根据本发明的一种或多种方法所产生的水解产物。可替代地，如本文所使用的，术语“给予”可以意指饲喂动物包含所述水解产物的喂养料或预混物。

可替代地(或另外地)，所述方法和/或用途可以进一步包括向动物给予至少一种内切蛋白酶。

如本文所使用的，“生物物理特性”意指改善动物健康和/或性能以及/或者产量的动物的任何生物物理性质。

举例来说，生物物理特性可以是选自由以下组成的组中的一种或多种：动物性能、动物生长性能、饲料转化率(FCR)、消化原料的能力(例如营养消化率、包括淀粉、脂肪、蛋白质、纤维消化率)、氮消化率(例如回肠氮消化率)和消化能(例如回肠消化能)、氮保留、屠体收率、生长速率、增重、体重、质量、饲料效率、体脂百分比、体脂分布、生长、蛋大小、蛋重、蛋质量、产蛋率、瘦肉增加、骨灰％、骨灰mg、背脂％、乳产量、乳脂％、繁殖产量例如同窝生仔数、同窝生存能力、孵化率％和环境影响，例如粪肥输出和/或氮排泄。

合适地，生物物理特性可以是选自由以下组成的组中的一种或多种：饲料转化率、氮消化率(例如回肠氮消化率)和消化能(例如回肠消化能)。

在一个优选的实施例中，生物物理特性可以是消化蛋白质的能力。

在一个实施例中，动物的生物物理特性是指动物性能。

合适地，当与未饲喂饲料添加剂组合物和/或饲料和/或喂养料和/或饲料成分和/或预混物的动物相比时，向动物给予饲料添加剂组合物和/或饲料和/或喂养料和/或饲料成分和/或预混物可能不会实质上增加动物的坏死性肠炎的发病率。

如本文所使用的，术语“实质上增加坏死性肠炎的发生率”意指发病率不会增加超过约20％、合适地不会增加超过约10％。优选地，意味着坏死性肠炎的发生率不会增加超过约5％、更优选地不会增加超过约1％。

性能

如本文所使用的，“动物性能”可通过饲料效率和/或动物增重和/或饲料转化率和/或饲料中营养物的消化率(例如氨基酸消化率)和/或饲料中消化能或代谢能和/或氮保留来确定。

优选地，“动物性能”通过饲料效率和/或动物增重和/或饲料转化率来确定。

“改善的动物性能”意指与饲喂动物一种不含所述水解产物或饲料添加剂组合物的饮食相比，由使用本发明的水解产物或本发明的饲料添加剂组合物引起的在受试者中存在增加的饲料效率、和/或增加的增重、和/或降低的饲料转化率、和/或饲料中改善的营养物的消化率或能量和/或改善的氮保留。

优选地，“改善的动物性能”意指存在增加的饲料效率和/或增加的增重和/或降低的饲料转化率。

如本文所使用的，术语“饲料效率”是指当一段时间内给动物无限制地饲喂或饲喂规定量的食物时出现的动物增重的量。

“增加的饲料效率”意指与饲喂不包含本发明的水解产物或本发明的饲料添加剂组合物的饲料的动物相比，在饲料中使用本发明的水解产物或本发明的饲料添加剂组合物导致每单位饲料摄入中增加的增重。

饲料转化率(FCR)

如本文所使用的，术语“饲料转化率”是指饲喂给动物以使动物体重增加规定量的饲料量。

改善的饲料转化率意指较低的饲料转化率。

“较低的饲料转化率”或“改善的饲料转化率”，其意指当使用不包含本发明的水解产物或本发明的饲料添加剂组合物的饲料时，与以将动物体重增加相同量所需的饲料量相比，在饲料中使用本发明的饲料添加剂组合物或本发明的水解产物导致需要将更少量的饲料喂给动物，以增加动物的体重规定量。

营养物消化率

如本文所使用的，“营养物消化率”是指从胃肠道或胃肠道特定区段(例如小肠)消失的营养物的比率。营养物消化率可测量为所给予至受试者的营养物与受试者粪便中所排出来的营养物之间的差值、或给予至受试者的营养物与保留在胃肠道指定区段(例如回肠)上的消化物中的营养物之间的差值。

营养物消化率可通过在一段时间期间收集总排泄物，测量所摄入营养物与所排泄的营养物之间的差值；或利用不会被动物吸收，并允许研究者计算整个胃肠道或胃肠道区段中所消失的营养物的量的惰性标记来测量。这样的惰性标记可以是二氧化钛、氧化铬或酸不溶性灰分。消化率可以表示为在饲料中营养物的百分比，或表示为可消化的营养物的质量单位/饲料中的营养物的质量单位。

如本文所使用的，营养物消化率涵盖淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率和氨基酸消化率。

合适地，根据本发明的方法和/或用途使用三肽基肽酶(任选地与至少一种内切蛋白酶组合)增加饲喂饲料添加剂组合物和/或饲料成分和/或饲料和/或喂养料和/或预混物的动物中的蛋白质和/或氨基酸消化率。

如本文所使用的，“能量消化率”意指所消耗的饲料总能量减去粪便的总能量，或所消耗的饲料总能量减去动物胃肠道指定区段(例如回肠)上的剩余消化物的总能量。如本文所使用的，代谢能是指表观代谢能，并且意指所消耗的饲料总能量减去粪便、尿和消化的气体产物中包含的总能量。可使用与测定营养物质消化率相同的方法，通过总能量的摄入量与粪便排出的总能量之间的差值，或与胃肠道特定区段(例如回肠)中存在的消化物总能量之间的差值来测量能量消化率和代谢能，同时对氮排泄进行适当校正来计算饲料的代谢能。

氮保留

如本文所使用的，氮保留意指受试者将饮食中的氮保有为体重的能力。当氮排泄量超过每日摄入量时，会出现负的氮平衡，肌肉减少时通常会观察到此现象。正的氮平衡常常与肌肉生长相关，尤其是对于生长期动物来说。

氮保留可以测量为在一段时间内氮的摄入量与通过排泄物和尿液完全收集而得出的氮排出量之间的差值。应当理解，排出的氮包括饲料中未消化的蛋白质、内源性蛋白质的分泌物、微生物蛋白质和尿氮。

屠体收率和产肉量

如本文所使用的，术语“屠体收率”是指经过商业或实验宰杀过程之后，作为活体重量一部分的屠体的量。术语“屠体”是指为食用而已被宰杀，并去除头部、内脏、四肢部分、和羽毛或皮的动物躯体。如本文所使用的，术语产肉量是指作为活体重量一部分的可食用肉量，或作为活体重量一部分的特定肉块量。

增重

还提供了一种增加受试者(例如家禽或生猪)增重的方法，该方法包括饲喂所述受试者包含本发明的饲料添加剂组合物的喂养料。

“增加的增重”是指与饲喂不含所述水解产物或饲料添加剂组合物的饲料的动物相比，饲喂包含本发明的水解产物或本发明的饲料添加剂组合物的饲料时体重增加的动物。

非食品产品

在另一个实施例中，还提供了包含本发明的水解产物的非食品产品。

可获得的(例如获得的)本发明的水解产物可用于制造局部施用的产品，例如洗剂、霜剂、软膏剂、擦拭剂、清洁剂等。因此，本文考虑了包含本文所述的水解蛋白质组合物的这样的产品。这样的产品例如用于治疗目的，例如提供对于干性皮肤、瘙痒、不适等的缓解是有用的。

除了水解的蛋白组分之外，这些产品优选包含脂质、蜡、油、油包水乳液、水包油乳液等作为基质。典型地，它们可以进一步包含一种或多种香味成分以及其他成分，例如表面活性剂或乳化剂。

还提供了包含本文所述的乳或乳清蛋白水解产物的化妆产品和其他外用助剂或美容助剂。

在一个实施例中，化妆产品可以施用于人的面部、脸颊、嘴唇或眼睛。在另一个实施例中，产品可以用于身体的任何地方以帮助改善皮肤的美容外观，或者例如以减少皱纹痣、雀斑、疤痕、瑕疵等的外观。

优点

诸位发明人首次表明，三肽基肽酶非常有利于在更高温度下制备水解产物。

有利地，如本文所述的三肽基肽酶能够作用于宽范围的肽和/或蛋白质底物，并且归因于具有这样的广泛的底物特异性而不容易被富含某些氨基酸(例如赖氨酸和/或精氨酸和/或甘氨酸)的底物的裂解抑制。因此，此类三肽基肽酶的使用可以有效地和/或快速地分解蛋白质底物(例如存在于用于制备水解产物的底物中)。

在另一个实施例中，当与非热稳定性变体相比时，提供了不容易变性、和/或将因此在更长的时期内保留活性的热稳定性三肽基肽酶。

有利地，三肽基肽酶可以在约pH 7的pH范围内具有活性，因此可以与碱性内切蛋白酶一起使用。这意味着在酶处理之间不需要改变包含用于水解产物生产的蛋白质和/或肽底物的反应介质的pH。换句话说，它允许三肽基肽酶和内切蛋白酶同时添加到反应中，这可以使生产水解产物的过程更快和/或更有效和/或更具成本效益。此外，这允许更有效的反应，因为在较低的pH值下，底物可能从溶液中沉淀出来，因此不会被裂解。

有利地，三肽基肽酶能够裂解与在患有例如乳蛋白过敏和/或大豆蛋白过敏等疾病的敏感个体中引起免疫反应相关的蛋白质底物。

使用内切蛋白酶、三肽基肽酶和另外的组分例如羧肽酶和/或氨肽酶具有许多优点：

●它允许有效地生产可有效地被受试者吸收(例如归因于具有更好的吸收渗透势)的单个氨基酸和/或二肽和/或三肽；

●可以更有效地和/或更快地消化蛋白质和/或肽底物；

●三肽基肽酶的终点抑制(即其反应产物的抑制)降低，特别是当体外使用时，例如通过将三肽消化成单个氨基酸和/或二肽来制造水解产物；和/或

●对含有高水平的赖氨酸、精氨酸和/或甘氨酸的底物具有协同和/或加成的活性。

另外的定义

除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY[微生物学和分子生物学词典]，第20版，约翰威利父子公司(JohnWiley and Sons)，纽约(1994)，以及Hale和Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY[哈珀柯林斯生物学词典]，哈珀永久出版社(Harper Perennial)，纽约州(1991)为技术人员提供了本公开中所使用的许多术语的通用词典。

本公开并不受本文披露的示例性方法和材料的限制，并且与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本公开的实施例的实践或测试。数值范围包括限定范围的数值在内。除非另外指明，否则分别地，任何核酸序列都从左向右以5'到3'方向书写；氨基酸序列都从左向右以氨基到羧基方向书写。

本文提供的标题并不是对本公开的各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例可以通过将本说明书作为一个整体来参考而得到。因此，把说明书作为一个整体参考时，以下立即定义的术语得以更全面地定义。

在本文中使用氨基酸的名称、三字母缩写或单字母缩写来指代氨基酸。

在本公开和权利要求书中，可以使用氨基酸残基的常规一字母和三字母代码。氨基酸的3字母代码遵照IUPACIUB生物化学命名联合委员会(Joint Commission onBiochemical Nomenclature，JCBN)的定义。还应当理解，归因于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一种核苷酸序列编码。

术语的其他定义可在整个本说明书中出现。在更详细地描述示例性的实施例之前，应理解本公开并不限于所描述的具体实施例，因为这些实施例当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅是为了描述具体实施例的目的，而并不意图是限制性的，因为本公开的范围仅由所附权利要求限定。

在提供数值范围的情况中，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值(至下限的个位的十分之一，除非上下文另有清楚规定)也被具体披露。在所陈述的范围中的任何规定值或中间值与所陈述的范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围，被涵盖在本公开内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括或排除在该范围中，而且其中任一个、没有一个或两个极限值被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本公开中，但依据所陈述的范围中的任何被具体排除的极限值而定。在所陈述的范围包含极限值的一个或两个的情况下，将那些所包含的极限值的一个或两个排除在外的范围也包含在本公开中。

必须注意，除非上下文另外明确指示，否则如本文和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该”包括复数指示物。因此，例如，提及“三肽基肽酶”、“内切蛋白酶”、或“酶”)包括多种这样的候选试剂，并且提及“饲料”、“喂养料”、“预混物”或“饲料添加剂组合物”包括提及一种或多种本领域技术人员已知的饲料、喂养料、预混物及其等同物等。

本文讨论的出版物只是针对它们在本申请的提交日之前的公开而提供。本文中的内容都不应理解为承认此类出版物构成所附权利要求书中的现有技术。

实例

实例1

三肽基肽酶(TRI039)在里氏木霉中的克隆和表达。

产生了编码三肽基肽酶TRI039的合成基因作为用于在里氏木霉中表达的密码子优化基因。预测的分泌信号序列(SignalP 4.0:Discriminating signal peptides fromtransmembrane regions[鉴别来自跨膜区的信号肽]，Thomas Nordahl Petersen,Brunak,Gunnar von Heijne和Henrik Nielsen，Nature Methods[自然方法],(2011)8:785-786)被来自里氏木霉酸性真菌蛋白酶(AFP)的分泌信号序列和来自里氏木霉葡糖淀粉酶基因(TrGA1)的内含子替换。

使用LR Clonase^TM酶混合物(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆(Waltham)，马萨诸塞州)，将合成基因导入目的载体pTTT-pyrG13(如在美国专利8,592,194 B2中所述，将其教导内容通过引用以其全文并入本文)，导致用于三肽基肽酶的表达载体pTTT-pyrG13的构建。编码SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4(TRI039)的表达载体显示于图1中。

基本上如美国专利8,592,194B2所述，使用PEG介导的原生质体转化，将表达载体(5μg-10μg)单独地转化到合适的里氏木霉菌株中。将发芽孢子通过离心收获，洗涤并用45mg/mL的裂解酶溶液(哈茨木霉，西格玛奥德里奇公司，圣路易斯(St.Louis)，密苏里州(MO)；L1412)处理以裂解真菌细胞壁。通过标准方法对原生质体进行进一步制备，如通过等人(Gene[基因](1987)61:155-164)所述的。

使用0.85％NaCl、0.015％80的溶液收获孢子。将孢子悬浮液用于接种液体培养物。使培养物在28℃和80％湿度下生长持续7天，并在180rpm下振摇。通过真空过滤收集培养上清液，并使用培养上清液测定它们的性能以及表达水平。

实例2

纯化和表征

A.三肽基肽酶的纯化

在用20mM乙酸钠(pH 4.5，缓冲液A)平衡的PD10柱(通用电气医疗生命科学集团(GE Healthcare Life Sciences)，匹兹堡(Pittsburgh)，宾夕法尼亚州，美国)上进行样品脱盐。对于源S15 Hr25/5(通用电气医疗生命科学集团)上的离子交换层析，将柱用缓冲液A平衡。将脱盐样品(7mL)以6ml/min的流速应用到柱上，并且将柱用缓冲液A洗涤。用线性梯度为在20mM乙酸钠(pH 4.5)中的0-0.35M NaCl洗脱结合的蛋白质(35分钟)。在整个运行过程中，收集10mL级分。如下所述针对三肽基氨基活性对收集的样品进行测定。基于在280nm处的吸光度测量和使用ExPASy ProtParam工具计算的蛋白质的理论吸光度来计算蛋白质浓度。

实例3

在40℃和50℃使用三肽基肽酶TRI039的乳清蛋白水解(WPI)

对于WPI水解，使用9224(Arla食品成分公司，丹麦)，在H₂O_d中制备15％(w/w)WPI悬浮液，并使用氢氧化钠调节至pH 6。为了防止微生物生长，添加0.0285％(w/w)NaN₃。随后，添加0.5％(w/w，对于蛋白质底物)碱性蛋白酶和0.5％(w/w，对于蛋白质底物)PNL，并且将体积为200μL的WPI悬浮液转移到96孔微量滴定板(MTP；VWR公司，丹麦)的每一个孔中。此后，将5μL的含有0nkat/mL、2188nkat/mL或4376nkat/mL的三肽基肽酶TRI039添加到MTP的特定孔中。然后，将MTP密封并置于40℃或50℃的孵化器(iEMS孵化器/振摇器HT，赛默科技公司，丹麦)中。

在400rpm下孵育并振摇24h后，通过添加20μL的2M三氯乙酸(TCA；西格玛-奥德里奇公司，丹麦)终止水解，除了参比(0h)，在该参比中在内肽酶和外肽酶添加之前添加TCA。通过过滤(0.22μm；康宁3504过滤板，康宁公司(Corning Incorporated))除去未水解的、沉淀的WPI。将过滤的WPI水解产物用于邻苯二醛(OPA)衍生化(Nielsen,P.M.等人(2001)Journal of Food Science[食品科学杂志]66(5):642-646)。根据Nielsen等人(2001)(具有小的修改)所述进行OPA衍生化。将25μL的样品体积转移到孔中，并且随后添加175μL的溶解于磷酸三钠十二水合物中的OPA试剂。使用丝氨酸校准曲线(0-2mM)，将在MTP读数器(VersaMax，分子器件公司(Molecular Devices)，丹麦)中在340nm处测量的吸收转变为丝氨酸当量。

如表1所示，与40℃相比，三肽基氨基肽酶TRI039在50℃产生高出3.6-3.8倍的水解。

表1.归因于TRI039的添加，WPI水解产物的DH(以％计)增加的分析

参考文献

Nakadai,T.,et al.(1973)."Purification and properties of leucineamino-peptidase I from Aspergillus oryzae."Agricultural and BiologicalChemistry 37(4):757-765.

Nielsen,P.M.,et al.(2001)."Improved method for determining foodprotein degree of hydrolysis."Journal of Food Science 66(5):642-646.

Stressler,T.,et al.(2013)."Characterization of the RecombinantExopeptidases PepX and PepN from Lactobacillus helveticus ATCC 12046Importantfor Food Protein Hydrolysis."PLoS ONE 8(7).

Wang,F.,et al.(2012)."Biochemical and conformational characterizationof a leucine amino-peptidase from Geobacillus thermodenitrificans NG80-2."World Journal of Microbiology and Biotechnology 28(11):3227-3237.

Claims

1.一种用于生产水解产物的方法，所述方法包括：

i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其功能片段；

ii)包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少70％同一性的氨基酸；

iii)由包含序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码；

b)在45℃与70℃之间的温度下孵育，以及

c)回收所述水解产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述孵育温度在50℃与65℃之间。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述孵育温度在55℃与65℃之间。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述回收的水解产物与至少一种饲料或食品成分混合。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述蛋白质或其部分进一步用内切蛋白酶进行处理。

6.根据权利要求5所述的方法，其中同时添加所述内切蛋白酶和所述三肽基肽酶。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中顺序地添加所述内切蛋白酶和所述三肽基肽酶，例如，在所述内切蛋白酶之后添加所述三肽基肽酶。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中所述内切蛋白酶和三肽基肽酶在相似的pH范围有活性。

9.根据权利要求5-8中任一项所述的方法，其中所述内切蛋白酶是酸性内切蛋白酶。

10.根据权利要求5-8中任一项所述的方法，其中所述内切蛋白酶是碱性内切蛋白酶，优选地选自胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及其组合。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水解产物在倾向于对所述至少一种蛋白质或其部分具有免疫反应的受试者中具有降低的免疫原性。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种蛋白质是动物蛋白质或植物蛋白质，优选地其中所述蛋白质是以下中的一种或多种：麦醇溶蛋白，β-酪蛋白，β-乳球蛋白，或麦醇溶蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白的免疫原性片段，乳清蛋白，鱼蛋白，肉蛋白，卵蛋白，大豆蛋白，大麦醇溶蛋白或谷物蛋白。

13.一种反应体系，所述反应体系包含至少一种蛋白质或其一部分以及三肽基肽酶，所述三肽基肽酶：

a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其功能片段；

b)包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少70％同一性的氨基酸；

c)由包含序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码；

14.根据权利要求13所述的反应体系，其中将所述温度维持在50℃与65℃之间。

15.根据权利要求14所述的反应体系，其中将所述温度维持在55℃与65℃之间。

16.根据权利要求13-15中任一项所述的反应体系，所述反应体系进一步包含内切蛋白酶。

17.根据权利要求13-16中任一项所述的反应体系，其中所述内切蛋白酶和三肽基肽酶在相似的pH范围有活性。

18.根据权利要求13-17中任一项所述的反应体系，其中所述内切蛋白酶是酸性内切蛋白酶。

19.根据权利要求13-18中任一项所述的反应体系，其中所述内切蛋白酶是碱性内切蛋白酶，优选地选自胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及其组合。

20.根据权利要求13-19中任一项所述的反应体系，其中所述至少一种蛋白质是动物蛋白质或植物蛋白质，优选地其中所述蛋白质是以下中的一种或多种：麦醇溶蛋白，β-酪蛋白，β-乳球蛋白，或麦醇溶蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白的免疫原性片段，乳清蛋白，鱼蛋白，肉蛋白，卵蛋白，大豆蛋白，大麦醇溶蛋白或谷物蛋白。

21.一种用于表达三肽基肽酶的方法，其中所述方法包括：

a)用核酸或载体转化木霉属宿主细胞，所述核酸或载体包含

i)核苷酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2；

b)表达步骤a)的所述核酸序列或载体；以及

22.如权利要求21所述的方法，其中所述宿主细胞是里氏木霉宿主细胞。

23.三肽基肽酶的用途，所述三肽基肽酶：

a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其功能片段；

b)包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少70％同一性的氨基酸；

c)由包含序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码；

用于在45℃与70℃之间的温度下生产水解产物。

24.根据权利要求23所述的用途，用于在倾向于对未处理的蛋白质或其部分具有免疫反应的受试者中降低水解产物的免疫原性，或用于降低水解产物的苦味。

25.根据权利要求1-12中任一项所述的方法、根据权利要求13-20中任一项所述的反应体系或根据权利要求23-24所述的用途，其进一步包括添加一种或多种选自由氨肽酶和羧肽酶组成的组的另外的蛋白酶。

26.根据权利要求25所述的方法、反应体系或用途，其中所述至少一种另外的蛋白酶是氨肽酶，优选地是可获自乳杆菌属(Lactobacillus)、更优选地是可获自瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)的氨肽酶。

27.一种水解产物，所述水解产物可获自(优选获得自)如权利要求1-26所述的方法、反应体系或用途中的任一者。

28.一种饲料添加剂组合物或食品添加剂组合物，其包含如权利要求27所述的水解产物。

29.一种用于生产喂养料或食物的方法，所述方法包括使饲料组分或食品组分与如权利要求27所述的水解产物或根据权利要求28所述的饲料添加剂组合物或食品添加剂组合物进行接触。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述喂养料或食物是奶产品(优选基于奶的产品)、乳清蛋白产品、烘焙产品(优选面包产品)、发酵产品(优选基于大豆的发酵产品)、运动营养产品、性能食品(performance food)、饮料、婴儿食品、老年人食品、在医疗护理中的人员的食品、奶昔或肠衣(casing)(优选地用于啤酒(beer)或奶制品(dairy)的肠衣)。

31.一种喂养料或食物，所述喂养料或食物包含根据权利要求27所述的水解产物或根据权利要求28所述的饲料添加剂组合物或食品添加剂组合物。

32.一种非食品产品，所述非食品产品包含根据权利要求27所述的水解产物，其中所述非食品产品是用于人体皮肤上的化妆品、洗剂或清洁剂。

33.一种如本文中参考说明书、实例和附图所描述的方法、反应体系、用途、喂养料、食物、水解产物或非食品产品。