CN104487588A

CN104487588A - 降解角蛋白的方法以及制备的角蛋白水解产物的用途

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Publication number: CN104487588A
Application number: CN201380038593.4A
Authority: CN
Inventors: S.于; C.H.波尔森; J.G.汉斯特德
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS; Danisco US Inc
Priority date: 2012-07-20
Filing date: 2013-07-19
Publication date: 2015-04-01
Also published as: AU2013291943A1; GB201212937D0; RU2015105827A; EP2875144A2; US20150152153A1; AU2017206256A1; BR112015001226A2; IN2014DN10709A; PH12014502764A1; WO2014013081A3; WO2014013081A2; MX2015000749A; AU2013291943B2

Abstract

本发明涉及一种制备角蛋白水解产物的方法，包括以下步骤：i)使角蛋白材料与蛋白酶反应；以及ii)使角蛋白材料与化学氧化剂反应；其中步骤ii发生于：a)步骤i)之后；b)步骤i)期间，此时所述所选择的蛋白酶在用于所述化学反应的pH条件下水解，和/或c)步骤i)之前，此时所述所选择的蛋白酶在用于所述化学反应的反应条件下水解；本发明还涉及如此制备的角蛋白水解产物及其用途。

Description

降解角蛋白的方法以及制备的角蛋白水解产物的用途

序列表的引用

所附的是包括SEQ ID NO：1-4的序列表，其全部内容以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明涉及降解角蛋白或制备角蛋白水解产物的方法，以及使用降解的角蛋白的方法。

背景技术

角蛋白是存在于多种结构中的一家族坚韧蛋白的总称。它是被许多类的动物用作结构元件的蛋白，并且是纤维蛋白的经典例子。为了实现此结构功能，角蛋白分子是螺旋和纤维状的，从而围绕彼此缠绕形成称为中间丝的链。据认为，这使得许多蛋白难以在一开始就被酶消化。另外，角蛋白含有高百分比的含硫氨基酸，主要是半胱氨酸，这些氨基酸在各个分子之间形成二硫桥并有助于形成相当刚性的角蛋白结构。遗憾的是，二硫桥也使得角蛋白的消化和降解相当困难。存在两种主要类型的角蛋白：α-角蛋白和β-角蛋白。α-角蛋白主要存在于哺乳动物的毛发(包括羊毛)、兽角、指/趾甲、爪子和兽蹄中。更硬的β-角蛋白存在于爬行动物的趾甲中及鳞和爪子中，它们的壳中(龟鳖目(Testudines)，诸如乌龟、海龟、水龟)，鸟类的羽毛、鸟喙、爪子中，以及豪猪的刚毛中。β-角蛋白主要以β-折叠的形式形成，但一些β-折叠也存在于α-角蛋白中。

角蛋白的降解可具有重大的商业价值。一种特别的角蛋白来源，即羽毛，由家禽业大量产生。在2002年，家禽业中使用了大约490亿只鸡。家禽的羽毛通常含有大约90％的β-角蛋白形式的蛋白。然而，角蛋白必须在裂解后其蛋白内容物才能被动物消化(McCasland and Richardson 1966，Poult.Sci.，45：1231-1236(McCasland和Richardson，1966年，《家禽科学》，第45卷，第1231-1236页)；Moran et al.1966(Moran等人，1966年))。羽毛的降解因此可提供可消化蛋白和氨基酸的廉价来源。相应地，羽毛水解产物(即，降解的羽毛)能够以多种方式使用，诸如用于动物饲料和宠物食品中。然而，回收该营养物的现行方法是如此低效和高昂以至于绝大部分角蛋白废物流只是在垃圾填埋场处置或经由焚烧处置，这两者均可导致环境问题并降低主要商业化工艺(通常为用于人类食用的肉类生产)的可持续性。遗憾的是，用于制备角蛋白水解产物的一些当代工艺所制备的羽毛粉比鸡肉更贵。

角蛋白的降解可通过蒸汽水解、化学水解和酶水解实现。例如，蒸汽水解在M.J.Considine，2000，NEW ENZYME TECHNOLOGIES FORPOULTRY BY-PRODUCTS.Proc.Aust.Poult.Sci.Sym.2000...12，pages 163-165，ISSN No.1034-6260(M.J.Considine，2000年，“用于家禽副产品的新型酶技术”，《2000年12月澳大利亚家禽科学专题讨论会会议记录》，第163-165页，ISSN号1034-6260)中进行了公开。“羽毛粉”是家禽加工的副产品；其由家禽羽毛在高热高压下部分水解，然后研磨并干燥而制成。同义词包括“水解的羽毛蛋白”、“羽粉”和“水解的家禽副产品聚集体”。制备羽毛粉的最常见方法是通过水热工艺，其中羽毛在高压高温下蒸煮(通常在约120-140℃下保持10至90分钟)。蒸汽水解的一个严重缺点在于该工艺会使热敏性必需氨基酸如甲硫氨酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸降解，从而耗减所得的羽毛水解产物的营养含量。此外，已发现，通过蒸汽水解制备的羽毛水解产物具有相对低的可消化性和相对低的营养价值(Papadopolous et al.1986 Animal Feed Sci Technol 14：279-290(Papadopolous等人，1986年，《动物饲料科学与技术》，第14卷，第279-290页)；Ellingson T.A.Master thesis 1993，Virginia Tech(EllingsonT.A.硕士论文，1993年，弗吉尼亚理工学院)；Wang X and Parson CM1997 Poultry Sci 76：491-496(Wang X和Parson CM，1997年，《家禽科学》，第76卷，第491-496页))。这对于将羽毛水解产物用于饲料是明显不可取的，因为可供动物获取的蛋白质和氨基酸的量并不理想。

用于降解角蛋白的另一种方法是化学水解。例如，可使用酸(诸如盐酸)、碱(诸如氢氧化钠)和氧化剂(诸如过酸)来分解存在于角蛋白中的二硫键。化学水解的一个缺点在于使用此类化学试剂的成本可较高昂。另一个缺点在于与酶方法相比，氨基酸的量可减少，参见Kim等人(Poultry Science，2002，85：95-98(《家禽科学》，2002年，第85卷，第95-98页)-表2)。另一个严重的缺点在于，许多被建议用于化学水解的试剂是不适用于食品用途的含硫试剂(例如，十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇、L-半胱氨酸、亚硫酸钠、氨基磺酸铵和二甲基亚砜(DMSO))。此类刺激性化学试剂可能擅于破坏二硫桥，但它们使所得的角蛋白水解产物不适宜在食品或动物饲料产品中使用。

降解角蛋白的另一种方法是借助酶水解。多份以北卡罗莱纳州立大学(North Carolina State University)的名义授予Shih等人的专利涉及使用地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)PWD-1或从该细菌分离的角蛋白酶来降解家禽羽毛。参见US 4,908,220、US 4,959,311、US 5,063,311、US 5,171,682、US5,186,961和US 5,712,147。酶降解可以是有利的，因为与使用蒸汽水解或化学水解相比，一些工艺可导致存在更易消化的蛋白质和氨基酸。

化学水解和酶水解的组合一般不用于角蛋白水解产物的商业制备或角蛋白的商业降解。这主要是因为与该组合相关联的成本增加。例如，Kim等人(Poultry Science，2002，81：95-98(《家禽科学》，2002年，第81卷，第95-98页))公开了24小时酶处理和2小时化学处理的组合的成本是单独的24小时酶处理或24小时化学处理的成本的远不止两倍。

相应地，存在对制备角蛋白水解产物或降解角蛋白材料的具有成本效益的工艺的需要，该工艺提供了在所得水解产物的效率、成本效益和营养含量方面的所需平衡。

附图说明

图1显示了鸡羽毛的过乙酸处理，所采用的过乙酸浓度(从左到右)为0、2、4、8、12、16和20％(w/v)。

图2显示了序列ID NO 1 Protex P

图3显示了序列ID NO 2 Protex 6L

图4显示了序列ID NO 3

图5显示了序列ID NO 4

发明内容

本发明的开创性发现在于可以更具成本效益的方式将酶水解和化学水解加以组合。该发现特别令人惊讶，因为迄今为止对角蛋白水解产物的制备不涉及化学水解和酶水解的组合，这归因于涉及到高昂的成本。

本发明人首次证实，通过在酶水解之后进行化学水解、或者选择与化学水解的条件相容的蛋白酶，可以显著节省与调节酶反应的pH相关联的成本。这一令人惊讶的发现允许角蛋白以更具成本效益的方式降解以提供可消化蛋白质和氨基酸的良好来源，以及允许以更具成本效益的方式制备具有可消化蛋白质和氨基酸的良好来源的角蛋白水解产物。

发明陈述

在一个方面，本发明涉及制备角蛋白水解产物的方法或降解角蛋白材料的方法，该方法包括以下步骤：

i)使角蛋白材料与蛋白酶反应；以及

ii)使角蛋白材料与化学试剂反应；

其中步骤ii发生于：

a)步骤i)之后；

b)步骤i)期间，此时所选择的蛋白酶在用于化学反应的pH条件下水解，和/或

c)步骤i)之前，此时所选择的蛋白酶在用于化学反应的反应条件下水解。

在另一个方面，本发明提供制备动物饲料的方法，该方法包括将通过本发明的方法制备的角蛋白水解产物与一种或多种动物饲料组成组分混合。

在另一个方面，本发明提供使用酶水解和化学水解的组合来降解角蛋白，其中酶水解发生于化学水解之前和/或期间。

在又一个方面，本发明提供使用酶水解和化学水解的组合来降解角蛋白，其中化学水解将pH调节至酶水解的所需水平。

在另一个方面，本发明提供通过本发明的方法制备的角蛋白水解产物在动物饲料中的用途。

在另一个方面，本发明提供通过本发明的方法制备的角蛋白水解产物。

在又一个方面，本发明提供包含本发明的角蛋白水解产物的饲料添加剂组合物。

在另一个方面，本发明提供包含本发明的角蛋白水解产物的饲料。

本发明的这些和其他方面在下文的具体实施方式中更详细地描述。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有本公开文本所属技术领域普通技术人员通常理解的含义。Singleton，et al.，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，20 ED.，John Wiley and Sons，New York(1994)(Singleton等人，《微生物学和分子生物学词典》，第20版，约翰威利父子出版公司，纽约，1994年)以及Hale&Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)(Marham，《哈珀柯林斯生物学词典》，哈珀永久出版社，纽约，1991年)为技术人员提供本公开所使用的许多术语的通用词典。

本公开文本并不受本文公开的示例性方法和材料的限制，任何与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于本公开文本的实施例的实施或试验。数值范围包括限定该范围的数字。除非另外指明，否则分别是，任何核酸序列从左至右以5′至3′取向写出；氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向写出。

本文提供的标题并非对本公开文本的各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例可通过将说明书作为一个整体来参考而得到。相应地，下面就要定义的术语通过将说明书作为一个整体来参考会得到更完全的定义。

在更详细地描述示例性的实施例之前，应理解本公开文本并不限于所描述的具体实施例，因为这些实施例当然是可变的。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体的实施例的目的，并不意在具有限制意义，因为本发明的范围将仅受所附权利要求的限定。

在提供数值范围的情况中，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间数值(至下限的个位的十分之一，除非上下文另有清楚规定)也被具体公开。规定的范围中的任何规定值或中间值与该规定的范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围，被涵盖在本公开文本内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括或排除在该范围中，而且其中任一个、没有一个或两个界限被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本公开文本中，但依据该规定的范围中的任何被具体排除的界限而定。在规定的范围包括界限中的一个或两个的情况中，排除这些被包括的界限中的任一个或两个的范围，也被包括在本公开文本中。

必须指出，本文和所附权利要求书中用到的名词既有单数含义也有复数含义，除非上下文另有清楚规定。因此，例如，提到“蛋白酶”包括多种此类酶，而提到“饲料”包括提到一种或多种饲料以及本领域技术人员知道的它们的等同物，以此类推。

本文述及的出版物只是为了它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供。本文的任何内容都不能被解释为承认这些出版物构成本文所附权利要求的现有技术。

方法

i)使角蛋白材料与蛋白酶反应；以及

ii)使角蛋白材料与化学试剂反应；

其中步骤ii发生于：

a)步骤i)之后；

如本文所用的术语“角蛋白水解产物”是指在通过例如蛋白酶水解角蛋白材料后所得的产物。

混合可在容器或反应器中进行。在一个实施例中，容器或反应器是自由落体容器或反应器。自由落体容器的例子包括圆筒混合器和滚筒混合器。

适宜地，可将角蛋白材料和蛋白酶任选地与一种或多种另外的组分混合(同时地或依次地)。

混合角蛋白材料和蛋白酶，直至已出现期望的角蛋白材料降解程度(例如，直至角蛋白材料的可消化性升高，从而在其中富集可消化蛋白质和肽的浓度)。本领域的普通技术人员将容易地理解，所用的最佳时间段将取决于许多因素，诸如所用的温度和pH；存在于待降解的角蛋白材料中的交联度；是否在所述工艺中使用其他组分诸如不含硫的表面活性剂、化学氧化剂、酸或碱，以及例如还原剂和/或蛋白酶与角蛋白材料的比率。

在一个实施例中，可将角蛋白材料与蛋白酶混合约30分钟至约48小时。适宜地，可将角蛋白材料与蛋白酶混合约1小时至约42小时；或约2小时至约36小时；或约3小时至约30小时；或约4小时至约24小时；或约5小时至约18小时。

在一个实施例中，可将角蛋白材料与蛋白酶混合约30分钟至约16小时或约30分钟至约14小时或约1小时至约12小时或约1.5小时至约10小时或约2小时至约8小时或约3小时至约7小时。

适宜地，可将角蛋白材料与蛋白酶混合至少30分钟或至少45分钟或至少1小时或至少1.5小时或至少2小时或至少2.5小时或至少3小时或至少3.5小时或至少4小时或至少4.5小时或至少5小时或至少5.5小时或至少6小时或至少7小时或至少8小时或至少9小时或至少10小时。

在一个实施例中，将角蛋白材料与蛋白酶混合至少2小时。

适宜地，可将角蛋白材料与蛋白酶混合少于16小时、少于15.5小时、少于15小时、少于14.5小时、少于14小时、或少于13小时。

在一个实施例中，可将角蛋白材料与蛋白酶混合少于16小时。

在一个实施例中，可将角蛋白材料与蛋白酶混合少于13小时。

在一个实施例中，可将角蛋白材料与蛋白酶混合约1.5小时至约10小时。

在一个实施例中，可将角蛋白材料与蛋白酶混合直到至少50重量％的角蛋白材料降解。任选地，可将角蛋白材料与蛋白酶混合直到至少55重量％(适宜地，至少60重量％或至少70重量％或至少80重量％或至少90重量％或100重量％)的角蛋白材料降解。100％降解的羽毛材料或使羽毛材料100％降解可通过以下方式定义：羽片、羽支和后羽完全从羽轴和空心轴脱离；并且羽轴和空心轴碎片化，使得羽毛粉在一个单步骤中制得。

在一个实施例中，可将角蛋白材料(例如，湿羽毛)加工(例如，机械地加工)成小碎片。可将角蛋白材料加入容器(例如，处于环境温度)中并加热(例如，加热至50-80℃)，同时添加蛋白酶、化学试剂以及任选的还原剂(例如，亚硫酸盐)。容器可以是任选地具有减小的空气空间以控制氧气水平的封闭反应器。使角蛋白材料和蛋白酶反应合适的时间(例如，30分钟至48小时)。可将容器旋转，或可对容器内容物进行混合(例如，使用搅拌桨以1-200rpm混合)。在反应过程期间，混合可导致一些氧气被连续引入反应液体中。因此，容器的空气空间可有利地具有较低的氧气水平(例如，通过使用料流将空气驱出反应器)。所得的角蛋白材料(例如，羽毛粉)可被干燥并且可被用作饲料组分。适宜地，这种工艺具有降低与研磨角蛋白材料并利用特定高温(例如120℃)相关联的能量的优点，所述能量可导致某些氨基酸破坏。相应地，以上工艺也可加以修改，使得被添加到容器中的角蛋白材料能够被加热到高达110℃，该加热在具有此能力的一些设备中进行。角蛋白材料和蛋白酶的混合可通过将容器旋转而进行，或者可对容器内容物进行混合(例如，使用搅拌桨以1-500rpm混合)。

适宜地，反应期间的pH在所使用蛋白酶的工作范围内。本领域的普通技术人员能按常规确定所使用蛋白酶的最佳工作范围，并添加缓冲剂以将反应溶液调节到适当的pH。例如，蛋白酶Protex 30L(可得自杜邦工业生物科学公司(DuPont Industrial Biosciences ApS))的工作范围可以为约5.5至约12。当将Protex 30 L用作蛋白酶时，混合步骤期间的pH可以为约5.5至约12。适宜地，该pH范围可以为约7至约11、或约8至约10。优选地，当使用Protex 30L时，pH为约pH 9。

在一个实施例中，所用的pH为处于所使用蛋白酶的约最佳pH的pH。例如，该pH可以为所使用蛋白酶的最佳pH(例如，对于Protex 30L而言，为约8至约10的pH)的+/-约1 pH。适宜地，该pH可以为所使用蛋白酶的最佳pH的+/-约0.5 pH，或为约该最佳pH。

在另一个实施例中，所用的pH是蛋白酶的最佳pH。

适宜地，将反应期间的温度调节到所使用蛋白酶的工作范围内。本领域的普通技术人员能按常规确定所使用蛋白酶的最佳工作范围并在期望的温度下执行所述反应。例如，蛋白酶Protex 30L的工作范围可以为约30℃至约80℃。当将Protex 30L用作蛋白酶时，混合步骤期间的温度可以为约30℃至约80℃。适宜地，该温度可以为约40℃至约80℃，或约50℃至约80℃。适宜地，该温度可以为约60℃至约80℃。优选地，当使用Protex30L时，该温度为约70℃。

适宜地，所用的温度可以为所使用蛋白酶的最佳温度的+和/或-15℃或者+和/或-10℃；或者+和/或-5℃；或者+和/或-4℃；或者+和/或-3℃；或者+和/或-2℃，或者+和/或-1℃。优选地，所用的温度为所使用蛋白酶的约最佳工作温度。

在一个实施例中，所用的温度为所使用蛋白酶的最佳温度的+和/或-10℃。

在另一个实施例中，所用的温度为所使用蛋白酶的最佳温度的+和/或-5℃。

在一个实施例中，在反应(例如混合)步骤中可存在不止一种酶。适宜地，所用的温度、pH和其他反应条件被选择为在所使用酶的工作范围内。适宜地，所使用酶(例如，不止一种蛋白酶和/或其他额外的酶)被选择为具有重叠的工作范围。优选地，酶被选择为具有相容的、优选相似的工作范围。

适宜地，在将角蛋白材料与蛋白酶混合之前，可对羽毛进行灭菌，例如以减少和/或防止细菌污染。该灭菌步骤可通过任何可用的方式执行。例如，可通过使角蛋白材料与福尔马林或环氧乙烷气体接触而实现熏蒸。作为另一种选择和/或除此之外，可通过在压力下汽蒸而实现蒸汽灭菌。适宜地，为了有助于角蛋白材料的后续酶降解，蒸汽灭菌可能是优选的。

在一个实施例中，可使用蒸汽对角蛋白材料进行预处理，以便将空气从容器中排出、将容器加热至40至121℃(优选50-80℃)的温度、和/或对角蛋白材料进行灭菌。适宜地，可在这种蒸汽处理之前或之后将蛋白酶和/或亚硫酸盐与角蛋白材料混合。

在一个实施例中，可在反应步骤之前对角蛋白材料进行蒸汽灭菌。适宜地，蒸汽灭菌包括使角蛋白与蒸汽在足以促进其后续酶水解的温度下接触一段时间的步骤，即使该蒸汽处理步骤不实现角蛋白材料的完全灭菌。适宜地，蒸汽灭菌可包括使角蛋白材料与蒸汽在压力下于封闭室内在80至125℃下接触至少2分钟或至少5分钟或至少10分钟或至少15分钟或至少20分钟。适宜地，蒸汽灭菌可包括使角蛋白材料与蒸汽在压力下于封闭室内在120至125℃下接触至少2分钟，或至少5分钟，或至少10分钟，或至少15分钟，或至少20分钟。适宜地，蒸汽处理的时间和温度可小于商业蒸汽水解工艺中所采用的那些时间和温度，所述商业蒸汽水解工艺在约35p.si.或更高的蒸汽压力下采用35分钟或更长的处理时间。

在本发明的一个实施例中，本发明的方法包括可以在与蛋白酶的反应步骤之前、期间和/或之后进行的化学水解步骤。

在本发明的一个实施例中，本发明的方法可包括在与蛋白酶的反应步骤之前和/或期间进行的化学水解步骤。

在本发明的一个实施例中，本发明的方法可包括在与蛋白酶的反应步骤之后进行的化学水解步骤。

在一个实施例中，适宜地，在化学水解中使用的酸或碱可提供将pH调节到蛋白酶的最佳工作条件的手段。

在一个实施例中，化学水解可以在与蛋白酶的反应步骤之后进行。

本发明的工艺可以作为分批、分批补料或连续工艺执行。

在一个实施例中，本发明的工艺可以分批工艺执行。有利的是，分批工艺更容易适于控制氧气水平。

在一个实施例中，通过本发明的方法制得的角蛋白水解产物可以是沉淀物的形式。优选地对水解产物进行过滤。适宜地，将大于1.0cm(适宜地，大于0.1cm)的颗粒物回收，以进行预处理或水解。

在一个实施例中，通过本发明的方法制得的羽毛水解产物可以是溶液的形式。

化学水解步骤

根据本发明的方法，化学水解在与蛋白酶的反应步骤之前、期间和/或之后进行。角蛋白的化学水解方法是本领域中已知的。

有利的是，使用蛋白酶水解或降解角蛋白的方法可导致使用常规化学水解方法所需的时间和/或化学试剂的量减少。

本发明人已惊讶地发现，角蛋白的酶水解和化学水解的组合可导致快速且有效的角蛋白降解过程。

适宜地，化学反应可在酶反应步骤之前和/或期间进行，并且化学氧化剂将pH调节到蛋白酶的所需工作pH。

在一个实施例中，用于化学反应的pH是蛋白酶起作用的pH。

在一个实施例中，所使用的蛋白酶是嗜碱的，且化学氧化剂为碱。在另一个实施例中，所使用的蛋白酶是嗜酸的，且化学氧化剂为酸。

在另一个实施例中，化学试剂通过破坏角蛋白的三维结构(例如，通过破坏角蛋白结构的氢键、盐桥、和/或亲水与疏水相互作用)而将角蛋白材料软化。

适宜地，步骤ii)可在步骤i)之后进行。

适宜地，可使用化学试剂(诸如酸、碱或氧化剂)来以化学方式水解角蛋白。不希望受到理论的束缚，据信，化学氧化剂通过氧化存在于角蛋白中的二硫桥(这可能导致角蛋白溶液化)而起作用。有利的是，使用化学氧化剂可以增大角蛋白水解产物的溶解度，这可为应用于例如饲料提供便利。

如本文所用的术语“溶解度”是指水解的角蛋白溶于溶剂(例如，溶于水)的能力。

角蛋白水解产物的溶解度可通过在将反应混合物离心后测定上清液中的氮量而测得。

如本文所用的术语“化学氧化剂”是指在氧化还原化学反应中从另一种反应物移除电子的物质。化学氧化剂也称为氧化试剂或氧化剂。

可水解角蛋白的化学氧化剂的例子包括亚氯酸钠、HCl、乙酸、羟基乙酸、NaOH、过酸、HOCl、HOBr、NaClO₂、ClO₂、H₂O₂、氢氧化铵、氢氧化钠和氢氧化钙。

如本文所用，术语“过酸”(也称为过氧基酸或过氧酸)是包含酸性-OOH基团的酸。两大类过酸是衍生自常规矿物酸尤其是硫酸的那些，以及羧酸的有机衍生物。一般来讲，已知的是过酸为强氧化剂。

过酸的通式如下所示：

适宜地，过酸可以是过乙酸或过甲酸。

适宜地，可以将化学试剂添加到反应介质，或化学试剂可以在反应介质中生成。例如，过乙酸可以在反应介质中生成。这可通过用硫酸作为催化剂，使用过氧化氢处理乙酸而实现：过氧化氢可通过例如葡萄糖氧化酶和己糖氧化酶以酶法生成。过乙酸也可通过由过水解酶或芳基酯酶催化的甘油三乙酸酯与H₂O₂的反应而生成。

在一个实施例中，化学试剂可以在反应介质中生成。

混合角蛋白材料和化学试剂，直至已出现期望的角蛋白材料降解程度(例如，直至角蛋白材料的可消化性升高，诸如通过在其中富集可消化蛋白质和肽的浓度)。本领域的普通技术人员将容易地理解，所用的最佳时间段将取决于许多因素，诸如所用的温度和pH；存在于待降解的角蛋白材料中的交联度；以及是否在所述工艺中使用其他组分。

本发明涉及用于降解角蛋白材料的酶水解和化学水解的组合。当酶水解在化学水解之前进行时，提及将化学试剂与“角蛋白材料”混合是指在用蛋白酶处理角蛋白材料后将化学试剂与所得的材料混合。因此，与化学试剂混合的角蛋白材料可以是部分水解或降解的。适宜地，角蛋白材料可以是沉淀物的形式。

在一个实施例中，化学试剂以小于50mM的浓度使用。适宜地，化学试剂以小于40mM、优选小于30mM、优选小于20mM的浓度使用。适宜地，化学试剂可以小于10mM的浓度使用。

在一个实施例中，化学试剂以介于约0.1mM至约49mM之间的浓度使用。适宜地，化学试剂可以介于约0.2mM与约40mM之间的浓度，优选以介于约0.5mM与约10mM之间的浓度使用。

在一个实施例中，可将角蛋白材料与化学试剂混合约5分钟至约24小时或约10分钟至约20小时或约15分钟至约16小时或约30分钟至约10小时或约1小时至约8小时或约3小时至约7小时。

在另一个实施例中，可将角蛋白材料与化学试剂混合约30分钟至48小时。

在一个实施例中，可将角蛋白材料与化学试剂混合约1小时至约8小时。

适宜地，可将角蛋白材料与化学试剂混合至少5分钟或至少10分钟或至少15分钟或至少20分钟或至少25分钟或至少30分钟或至少45分钟或至少1小时或至少1.5小时或至少2小时或至少2.5小时或至少3小时或至少3.5小时或至少4小时或至少4.5小时或至少5小时或至少5.5小时或至少6小时或至少7小时或至少8小时或至少9小时或至少10小时。

在一个实施例中，可将角蛋白材料与化学试剂混合至少1小时。

适宜地，可将角蛋白材料与化学试剂混合少于48小时、或少于36小时、或少于24小时、或少于20小时、或少于16小时、或少于12小时、或少于10小时、或少于8小时、或少于6小时、或少于4小时、或少于2小时、或少于1小时。

在一个实施例中，可将角蛋白材料与化学试剂混合少于10小时。

在一个实施例中，可将角蛋白材料与化学氧化剂混合，直到至少50重量％的角蛋白材料降解。适宜地，至少60重量％、或至少70重量％、或至少80重量％、或至少90重量％、或至少95重量％、或100重量％的角蛋白材料降解。

适宜地，反应期间的pH将取决于所用的化学氧化剂。例如，NaOH在碱性pH下起作用，而HCl在酸性pH下起作用。

适宜地，可调节反应期间的温度以优化角蛋白材料的化学降解。

在一个实施例中，当进行化学水解时，优选的是，采用化学试剂的化学水解步骤在工艺中的某一时间点进行，这避免了与调节酶反应的pH相关联的额外成本。

如果蛋白酶是嗜碱的，则优选的是，化学试剂为碱并且化学反应在酶反应之前进行或与酶反应同时进行。如果蛋白酶是酸，则优选的是，化学试剂为酸并且化学反应在酶反应之前进行或与酶反应同时进行。如果蛋白酶是嗜碱的而化学试剂为酸，则优选的是酶反应在化学反应之前进行，使得化学反应将pH降低。如果蛋白酶是嗜酸的而化学试剂为碱，则优选的是酶反应在化学反应之前进行，使得化学反应将pH升高。以此方式，与将pH升高或降低到蛋白酶的最佳条件相关联的额外成本得以避免。

适宜地，如果化学水解步骤在与蛋白酶反应之前和/或期间(例如，和与蛋白酶反应同时)进行，则将所用的反应条件调整到所使用蛋白酶的工作范围。

在本发明的一个方面，用于化学水解的化学试剂还将pH调节到蛋白酶的最佳工作条件，从而有利地提供组合的化学和酶反应的有益效果，同时最大程度降低或避免与将化学水解步骤和酶水解结合相关联的额外成本。例如，蛋白酶Protex 30L在高碱性条件下工作。因此，可将该蛋白酶与已知用于以化学方式水解角蛋白的碱(诸如NaOH)结合。有利的是，碱随后起作用以将pH调节到蛋白酶的工作范围，同时其本身还降解角蛋白。以此方式，能够以具有成本效益的方式将化学水解和酶水解结合。显然，能够以相似的方式将在酸性条件下起作用的蛋白酶与已知用于降解角蛋白的酸(诸如HCl)结合。

在一个实施例中，本发明的方法可使用嗜酸性蛋白酶。在该实施例中，本发明的方法可包括在与蛋白酶反应之前和/或期间的化学水解步骤，其中化学水解步骤使用酸。

在一个实施例中，本发明的方法可使用嗜碱性蛋白酶。在该实施例中，本发明的方法可包括在与蛋白酶反应之前和/或期间的化学水解步骤，其中化学水解步骤使用碱。

将化学水解与酶水解结合可允许降低所用化学试剂的浓度和/或可缩短角蛋白材料暴露于化学试剂的持续时间以实现期望的角蛋白降解水平。因此，可产生这样的角蛋白水解产物，其有利地具有与单独使用酶水解或化学水解相比增强的蛋白质可消化性和/或增加的氨基酸来源。

在一个方面，蛋白质可消化性可通过在将反应混合物离心后测量上清液的凯式氮含量(例如，在氮自动分析仪中)而测得。

在一个方面，“增加的氨基酸来源”是指在体外的氨基酸可消化性的增加，其可根据Kim等人(Poultry Science，2002，85：95-98(《家禽科学》，2002年，第85卷，第95-98页))使用以下公式测得：

在一个方面，化学水解步骤可在与蛋白酶的反应步骤之后进行。这在所选的蛋白酶和所选的化学氧化剂不在重叠的pH下起作用的情形中可能是有利的。

控制工艺中的氧气水平

在本发明的方法中，可在将角蛋白材料与蛋白酶混合的步骤期间控制氧气水平。

在一个实施例中，至少将角蛋白材料与蛋白酶和乳化剂混合的步骤在受控的氧气水平下进行。

在添加还原剂作为另外的组分时，这可能特别有利。不希望受理论的束缚，据认为，通过控制和/或降低可用的氧气的量(诸如在开放系统中)，可降低还原剂的量，从而节省成本和/或提供更安全的最终产品。

所谓“在受控的氧气水平下”，意指反应不能无限制地获得氧气(诸如在开放系统中)。控制氧气水平的各种手段是本领域已知的。例如，使用封闭系统(例如，密封的容器或反应器)导致受控的氧气水平存在于反应溶液上方的顶部空间中。作为另一种选择，可采用降低可用氧气水平的手段，诸如加热反应介质、蒸汽冲洗、真空泵送和/或添加氮气(例如，氮气鼓泡)。

在一个实施例中，至少使角蛋白材料与蛋白酶和还原剂反应的步骤可在封闭系统中(例如，在密封的容器或反应器中)进行。

在一个方面，控制氧气的水平，使得在反应器空气空间中的氧气水平少于反应器中空气的50％，优选地少于该空气的30％，优选地少于该空气的5％。

角蛋白材料

角蛋白是存在于例如羽毛、毛发、毛皮、兽蹄、指/趾甲、羊毛、爪子和鳞中的纤维结构蛋白。角蛋白可被分成两个独立的组：α-角蛋白和β-角蛋白。β-角蛋白通常比α-角蛋白更硬，因为它们含有更多的半胱氨酸键。

用于本发明的方法和用途的角蛋白材料可以是包含角蛋白的任何物质。适宜地，角蛋白材料可包括羽毛、毛发、毛皮、兽蹄、指/趾甲和羊毛。

在一个实施例中，角蛋白材料包含β-角蛋白。β-角蛋白可存在于爬行动物的趾甲和爪子中，龟鳖目的壳中，鸟类的羽毛、鸟喙和爪子中，以及豪猪中。适宜地，角蛋白材料可以是羽毛，优选家禽羽毛，优选鸡羽毛。

在一个实施例中，角蛋白材料包含α-角蛋白。α-角蛋白可存在于哺乳动物的毛发(包括羊毛)、兽角、指/趾甲、爪子和兽蹄中。适宜地，角蛋白材料可以是毛发、兽角或兽蹄。

在一个实施例中，角蛋白材料包括羽毛、毛发(诸如猪毛)、兽角、兽蹄或羊毛。适宜地，角蛋白材料可以是羽毛、毛发、兽角、兽蹄或羊毛。

在一个实施例中，将至少5g角蛋白材料用于本发明的工艺和用途。适宜地，将至少50g、优选至少100g、优选至少500g角蛋白材料用于本发明的工艺和用途。

在一个实施例中，使用至少1kg角蛋白材料，优选地使用至少2kg、或至少10kg、或至少20kg、或至少30kg角蛋白材料。

蛋白酶

如本文所用的术语“蛋白酶”与肽酶或朊酶同义。

用于本发明中的蛋白酶可以是枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(bacillolysin)(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x)。适宜地，用于本发明中的蛋白酶可以是蛋白酶肽链内切酶K(EC 3.4.2.1.64)、链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶、肽链内切酶Arg-C、内切蛋白酶Gluc-C(EC 3.4.21.19)、肠激酶(EC 3.4.21.9)、胶原酶(EC3.4.24.3)、嗜热菌蛋白酶(EC 3.4.24.27)、胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)、胰凝乳蛋白酶(EC 3.4.21.1)、胃蛋白酶(EC 3.4.23.1)、曲霉胃蛋白酶(aspergillopepsin)(EC 3.4.23.18)、sedolisin(EC 3.4.21.100)、或二肽基肽酶(EC 3.4.14.1)。

优选地，根据本发明的蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶或角蛋白酶。

合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物起源的那些。化学改性的或蛋白质工程改造的突变体也是合适的。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，例如，碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子为枯草杆菌蛋白酶，尤其是源自芽孢杆菌属(Bacillus)菌种的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309(参见，例如美国专利No.6,287,841)、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(参见，例如WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子为胰蛋白酶(例如猪或牛起源的胰蛋白酶)和镰刀菌(Fusarium)蛋白酶(参见，例如WO 89/06270和WO 94/25583)。可用的蛋白酶的例子还包括但不限于WO92/19729和WO 98/20115中所述的变体。所有这些均以引用方式并入本文。

根据本发明的术语“野生型蛋白酶”或“野生型”描述具有存在于自然界中的氨基酸序列的蛋白酶。

根据本发明的术语“蛋白酶变体”或“变体”描述具有衍生自亲本蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸序列但差别在于一个或多个氨基酸置换、插入和/或缺失(它们一起称为“突变”)的蛋白酶。可以设想，蛋白酶变体也可以是用于另外多轮制备蛋白酶变体的方法诸如分子进化的亲本蛋白酶。

根据本发明的术语“同源多肽”(在本文中也被描述为“同源物”)描述与第一多肽/蛋白酶/酶氨基酸序列相比具有高于75％的序列同一性，优选地具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性的多肽，优选蛋白酶(即，“同源蛋白酶”或“同源酶”)。

术语“其功能等同物”意指该酶必须具有与本文详述的蛋白酶大致相同的功能特性。术语“修饰形式”或“变体”意指所述酶已从其初始形式进行了修饰但保持相同的酶功能特性。具体地讲，术语“变体”或“修饰形式”涵盖这样的蛋白酶，其氨基酸序列衍生自亲本/野生型蛋白酶的氨基酸序列，但具有一个或多个氨基酸置换、插入和/或缺失(它们一起称为突变)。修饰形式或变体与亲本酶相比可显示出改变的酶特性。优选地，修饰形式或变体具有以下增强的表型中的一种或多种：增加的热稳定性，和/或增加的蛋白水解(例如胃蛋白酶)稳定性，和/或增加的比活性，和/或更宽的底物特异性，和/或更宽pH范围内的活性。术语“功能”或“有效”片段意指蛋白酶的保持大致相同的酶功能或效果的片段或部分。

如本文所用，术语“热稳定的”涉及酶在暴露于高温后保持活性的能力。如本文所用，术语“pH稳定的”涉及酶在宽pH范围内保持活性的能力。

在一个优选的实施例中，用于本发明中的蛋白酶可以是如下商业产品中的一者或多者中的一种或多种蛋白酶：

除此之外或作为另一种选择，蛋白酶可包含在以下市售产品中的一者或多者中：Kannase^TM、NovoCarne Tender^TM和Novozym 37020、Novo-ProD^TM(全部得自诺维信公司(Novozymes))；BioSorb-ACDP^TM(印度努尔创新公司(Noor Creations，India))；或Angel^TM酸性蛋白酶(中国安琪酵母股份有限公司(Angel Yeast Co，Ltd.，China))。

适宜地，所述蛋白酶可以是得自芽孢杆菌属(诸如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)、木霉属(Trichoderma)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、沙雷氏菌属(Serratia)或曲霉属(Aspergillus)的蛋白酶。

在一个实施例中，所述蛋白酶得自芽孢杆菌属。适宜地，所述蛋白酶可以得自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌种。在一个实施例中，所述蛋白酶得自枯草芽孢杆菌菌种。

氨基酸序列

在一个实施例中，蛋白酶具有氨基酸序列ID No.1。

在一个实施例中，蛋白酶具有氨基酸序列ID No.2。

本发明的范围还涵盖具有本文所限定的特定性质的酶的氨基酸序列。

如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”是同义的。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。

氨基酸序列可从合适的来源制备/分离，或者其可通过合成制备或者其可通过利用重组DNA技术制备。

本发明中所涵盖的蛋白质可与其他蛋白质，特别是酶结合使用。因此，本发明还涵盖蛋白质的组合，其中该组合包含本发明的蛋白酶和另一种酶，所述另一种酶可以是根据本发明的另一种蛋白酶。

优选地，当与本发明的本身范围有关或当为本发明的本身范围所涵盖时氨基酸序列不是天然的酶。就这一点而言，术语“天然的酶”意指处于其天然环境中并且在其已由其天然核苷酸序列表达时的整个酶。

序列同一性或序列同源性

本发明还涵盖与具有本文所限定的特定性质的多肽的氨基酸序列具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列或编码这种多肽的任何核苷酸序列(下文称为“同源序列”)的用途。在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可等同于“同一性”。

该同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应该提供和/或编码保留该酶的功能活性和/或增强该酶的活性的多肽。

在本说明书的语境中，同源序列意欲包括这样的氨基酸序列，其可与主题序列有至少75、85或90％的同一性，优选至少95或98％的同一性。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本发明的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。

在本说明书的语境中，同源序列意欲包括这样的核苷酸序列，其可与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)有至少75、85或90％的同一性，优选至少95或98％的同一性。通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本发明的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。

同源性比较可通过眼，或更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些市售的计算机程序可计算两条或更多条序列之间的％同源性。

同源性百分数可在连续的序列上计算，即将一条序列与另一条序列进行比对，并将一条序列中的每个氨基酸与另一条序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称为“不产生空位的”比对。通常，这种不产生空位的比对仅在相对短数目的残基范围内进行。

尽管这是十分简单和可靠的方法，但其不能考虑，例如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而在进行全局比对时可能导致同源性百分数有大的降低。因此，将大多数序列比较方法设计产生最佳比对，所述最佳比对考虑可能的插入和缺失而不会过度罚掉整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。

然而，这些更复杂的方法向比对结果中出现的每一个空位赋予“空位罚分”，从而对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对(反映两条比较序列之间相关性较高)将获得比具有许多空位的序列比对结果更高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gap costs)”，其对空位的存在征收相对较高的成本，对空位中每一个后续的残基征收较少的罚分。这是最通常使用的空位评分系统。高的空位罚分将当然会产生具有较少空位的最佳比对结果。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。

最大同源性百分数的计算因而首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。适用于进行这种比对的计算机程序是Vector NTI(英杰公司(Invitrogen Corp.))。可进行序列比较的软件的例子包括但不限于例如：BLAST软件包(参见Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology，4th Ed-Chapter 18(Ausubel等人，1999年，《精编分子生物学方案》，第4版，第18章))、BLAST 2(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)：247-50(《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》，1999年，第174卷第2期，第247-250页)；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8(《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》，1999年，第177卷第1期，第187-188页)和tatianancbi.nlm.nih.gov)、FASTA(Altschul et al 1990 J.Mol.Biol.403-410(Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第403-410页))和AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA可用于离线和在线搜索(参见Ausubel等人，1999，第7-58页至7-60页)。

尽管最终的同源性百分数也可按同一性来度量，但比对过程本身通常不是基于要么全有要么全无(all-or-nothing)的成对比较。相反，通常使用标度化相似性评分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离向每一成对比较赋予分值。通常使用的这种矩阵的例子是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(对于进一步的细节请参见用户手册)。对于一些应用而言，优选的是使用Vector NTI软件包的各默认值。

作为另一种选择，同源性百分数可用Vector NTI(英杰公司)中的多重比对功能，基于类似于CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1988)，Gene73(1)，237-244(Higgins DG和Sharp PM，1988年，《基因》，第73卷第1期，第237-244页))的算法来计算。

一旦该软件产生了最佳比对，则有可能计算同源性百分数，优选序列同一性百分数。作为序列比较的一部分，该软件通常进行这些计算并产生数值结果。

当测定序列同一性时应该使用空位罚分(Gap Penalties)，然后优选地将如下参数用于成对比对：

在一个实施例中，可使用采用上面限定的空位罚分和空位延伸组的CLUSTAL。

适宜地，关于核苷酸序列的同一性程度是在至少20个连续核苷酸上，优选在至少30个连续核苷酸上，优选在至少40个连续核苷酸上，优选在至少50个连续核苷酸上，优选在至少60个连续核苷酸上，优选在至少100个连续核苷酸上测定。

适宜地，关于核苷酸序列的同一性程度可在整个序列上测定。

变体/同源物/衍生物

本发明还涵盖蛋白质的任何氨基酸序列或编码这种蛋白质的任何核苷酸序列的变体、同源物和衍生物的用途。

在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可等同于“同一性”。

在本说明书的语境中，同源序列意欲包括这样的氨基酸序列，其可与主题序列具有至少75、80、85或90％的同一性，优选至少95、96、97、98或99％的同一性。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本发明的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。

在本说明书的语境中，同源序列意欲包括这样的核苷酸序列，其可与编码本发明的酶的核苷酸序列(主题序列)具有至少75、80、85或90％的同一性，优选至少95、96、97、98或99％的同一性。通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本发明的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。

同源性比较可通过眼，或更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些市售的计算机程序可计算两条或更多条序列之间的同源性百分数。

然而，这些更复杂的方法向比对结果中出现的每一个空位赋予“空位罚分”，从而对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对(反映两条比较序列之间相关性较高)将获得比具有许多空位的序列比对结果更高的分数。通常使用“仿射空位成本”，其对空位的存在征收相对较高的成本，对空位中每一个后续的残基征收较少的罚分。这是最通常使用的空位评分系统。高的空位罚分将当然会产生具有较少空位的最佳比对结果。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit程序包时，对于氨基酸序列的默认空位罚分为：空位-12，每个空位延伸-4。

最大同源性百分数的计算因而首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。适用于进行这种比对的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(Devereux et al 1984 Nuc.Acids Research 12 p387(Devereux等人，1984年，《核酸研究》，第12卷，第387页))。其他可进行序列比较的软件的例子包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel et al.，1999 ShortProtocols in Molecular Biology，4^th Ed-Chapter 18(Ausubel等人，1999年，《精编分子生物学方案》，第4版，第18章))、FASTA(Altschul et al.，1990 J.Mol.Biol.403-410(Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第403-410页))以及比较工具的GENEWORKS程序包。BLAST和FASTA二者均可用于离线和在线搜索(参见Ausubel et al.，1999，ShortProtocols in Molecular Biology，pages 7-58 to 7-60(Ausubel等人，1999年，《精编分子生物学方案》，第7-58至7-60页))。然而，对于某些应用，优选使用GCG Bestfit程序。称为BLAST 2 Sequences的新型工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)：247-50(《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》，1999年，第174卷第2期，第247-250页)；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8(《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》，1999年，第177卷第1期，第187-188页)以及tatianancbi.nlm.nih.gov)。

尽管最终的同源性百分数也可按同一性来度量，但比对过程本身通常不是基于要么全有要么全无的成对比较。相反，通常使用标度化相似性评分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离向每一成对比较赋予分值。通常使用的这种矩阵的例子是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(对于进一步的细节请参见用户手册)。对于某些应用，优选使用GCG软件包的公用默认值，或者在其他软件的情形中，使用默认矩阵，如BLOSUM62。

作为另一种选择，同源性百分数可使用DNASIS^TM(日立软件公司(Hitachi Software))中的多重比对功能，基于类似于CLUSTAL(HigginsDG&Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244(Higgins DG和Sharp PM，1988年，《基因》，第73卷第1期，第237-244页))的算法来计算。

序列还可以具有氨基酸残基的缺失、插入或置换，所述缺失、插入或置换产生沉默改变和导致功能等同的物质。可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行有意的氨基酸置换，只要该物质的二级结合活性得以保留。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；以及具有类似亲水性值的含不带电的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。

可以例如根据下表进行保守置换。第二列中同一区组内的氨基酸，优选第三列中同一行内的氨基酸可以彼此置换：

本发明还涵盖可能出现的同源置换(在本文中，置换和取代都用来指现有的氨基酸残基与另选的残基的交换)，即对等置换，如碱性对碱性，酸性对酸性，极性对极性等。非同源置换也可能出现，即从一类残基置换成另一类残基，或作为另一种选择涉及到加入非天然氨基酸，如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。

还可以用非天然氨基酸进行置换，包括：α*和α-二取代的*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化衍生物(如三氟酪氨酸*、对氯苯丙氨酸*、对溴苯丙氨酸*、对碘苯丙氨酸*)、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸^#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜^#*、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、对硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟脯氨酸^#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物(如4-甲基-苯丙氨酸*、五甲基-苯丙氨酸*)、L-苯丙氨酸(4-氨基)^#、L-酪氨酸(甲基)*、L-苯丙氨酸(4-异丙基)*、L-Tic(1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸^#和L-苯丙氨酸(4-苄基)*。为了上文的讨论(与同源或非同源置换有关)的目的已利用记号*指示衍生物的疏水性，而已利用#指示衍生物的亲水性，#*指示两亲特性。

变体氨基酸序列可包括可在序列的任何两个氨基酸残基之间插入的合适的间隔基团，这些间隔基团除了氨基酸间隔物如甘氨酸或β-丙氨酸残基外还包括烷基基团如甲基、乙基或丙基基团。变异的另一种形式(涉及存在类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基)将是本领域技术人员十分了解的。为了避免疑惑，“类肽形式”用于指其中α-碳取代基处于残基的氮原子而不是α-碳上的变体氨基酸残基。用于制备类肽形式的肽的工艺是本领域已知的，例如Simon RJ et al.，PNAS(1992)89(20)，9367-9371(SimonRJ等人，《美国国家科学院院刊》，1992年，第89卷第20期，第9367-9371页)和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134(HorwellDC，《生物技术趋势》，1995年，第13卷第4期，第132-134页)。

在一个方面，优选地根据本发明的蛋白酶序列的任一种为分离的形式。术语“分离的”意指该蛋白酶序列至少基本上不含与该蛋白酶序列在自然界中天然结合以及在自然界中存在的至少一种其他组分。本发明的蛋白酶序列可以基本上不含所述物质可能原本与之相关联的一种或多种污染物的形式提供。因此，例如，其可基本上不含一种或多种潜在污染性的多肽和/或核酸分子。

在一个方面，优选地根据本发明的蛋白酶序列是纯化的形式。术语“纯化的”意指给定的组分以高水平存在。理想的是该组分为组合物中存在的主要组分。优选地，其以至少约90％、或至少约95％或至少约98％的水平存在，所述水平是相对于所考虑总组合物以干重/干重计来测定的。

除非另外指明，否则本发明采用常规的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫技术，这些技术均在本领域普通技术人员的能力之内。这些技术在文献中进行了解释。参见例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，andT.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Books 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press(J.Sambrook、E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，第1-3册，冷泉港实验室出版社)；Ausubel，F.M.et al.(1995 and periodic supplements；Current Protocols in Molecular Biology，ch.9，13，and 16，John Wiley&Sons，New York，N.Y.)(Ausubel，F.M.等人，1995年及定期补遗，《最新分子生物学实验方法汇编》，第9、13和16章，约翰威利父子出版公司，纽约州纽约)；B.Roe，J.Crabtree，and A.Kahn，1996，DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques，John Wiley&Sons(B.Roe、J.Crabtree和A.Kahn，1996年，《DNA分离和测序：基本技术》，约翰威利父子出版公司)；M.J.Gait(Editor)，1984，Oligonucleotide Synthesis.A Practical Approach，Irl Press(M.J.Gait编辑，1984年，《寡核苷酸合成：实践方法》，Irl出版社)；以及D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNAStructure Part A：Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods inEnzymology，Academic Press(D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992年，《酶学方法：DNA结构A部分：DNA的合成和物理分析》，酶学方法，学术出版社)。这些一般性文本中的每一个以引用方式并入本文。

在一个实施例中，蛋白酶由核酸序列ID No.3编码。

在一个实施例中，蛋白酶由核酸序列ID No.4编码。

本发明的范围涵盖编码具有本文所限定的特定性质的蛋白质的核苷酸序列。本文所用的术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物(诸如其部分)。核苷酸序列可为基因组起源的或合成或重组起源的，其可以是双链的或单链的而无论是代表有义链还是反义链。与本发明有关的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。优选地，其意指DNA，更优选地，意指编码本发明的cDNA序列。

在一个优选的实施例中，当与本发明的范围本身有关以及当为本发明的范围本身所涵盖时，核苷酸序列不包括处于其天然环境中时或其连接至其也存在于其/它们的天然环境中的天然结合的序列时的根据本发明的天然核苷酸序列。为便于说明，我们应将这个优选的实施例称为“非天然核苷酸序列”。为此，术语“天然核苷酸序列”意指处于它的天然环境中且当与和它天然结合的整个启动子有效连接时的整个核苷酸序列，所述启动子也处于它的天然环境中。然而，本发明的范围所涵盖的氨基酸序列可在核苷酸序列在其天然生物体中表达后分离和/或纯化。优选地，然而，本发明的范围所涵盖的氨基酸序列可由核苷酸序列在其天然生物体中表达，但其中该核苷酸序列不处于在该生物体中其与之天然结合的启动子的控制之下。

通常，由本发明的范围所涵盖的核苷酸序列使用重组DNA技术制备(即重组DNA)。然而，在本发明的另选实施例中，核苷酸序列可用本领域所熟知的化学方法整体或分部分地合成(参见Caruthers MH et al.，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23(Caruthers MH等人，1980年，《核酸研究研讨会丛刊》，第215-223页)以及Horn T et al.，(1980)Nuc Acids Res SympSer 225-232(Horn T等人，1980年，《核酸研究研讨会丛刊》，第225-232页))。

核苷酸序列的制备

编码具有如本文所限定的特定性质的蛋白质或适于修饰的蛋白质的核苷酸序列可从产生所述蛋白质的任何细胞或生物体鉴别和/或分离和/或纯化。多种方法是核苷酸序列鉴别和/或分离和/或纯化领域所熟知的。举个例子，一旦已鉴别和/或分离和/或纯化合适的序列后即可使用PCR扩增技术来制备更多条序列。

举另一个例子，可用来自产生酶的生物体的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果该酶的氨基酸序列是已知的话，可合成标记寡核苷酸探针并用于从该由生物体制备的基因组文库鉴别酶编码克隆。作为另一种选择，可将含有与另一已知酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针用于鉴别酶编码克隆。在后一种情况下，使用较低严格性的杂交和洗涤条件。

作为另一种选择，酶编码克隆可通过这样来鉴别：将基因组DNA的片段插入表达载体(如质粒)中，用所得的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，然后将转化细菌接种于含有酶底物(即麦芽糖)的琼脂板上，从而使得表达该酶的克隆能被鉴别。

在又一个另选方案中，编码该酶的核苷酸序列可以通过已确立的标准方法合成制备，例如由Beucage S.L.et al.，(1981)Tetrahedron Letters 22，p1859-1869(Beucage S.L等人，1981年，《四面体通讯》，第22卷，第1859-1869页)所述的亚磷酰胺方法，或Matthes et al.，(1984)EMBO J.3，p801-805(Matthes等人，1984年，《欧洲分子生物学学会杂志》，第3卷，第801-805页)所述的方法。在亚磷酰胺方法中，合成寡核苷酸，例如在自动DNA合成仪中，将其纯化、复性、连接并克隆入适当的载体中。

核苷酸序列可以为混合的基因组和合成起源、混合的合成和cDNA起源或混合的基因组和cDNA起源，根据标准技术通过连接合成、基因组或cDNA起源的片段制备(视情况而定)。每一连接的片段对应于整个核苷酸序列的各个部分。DNA序列还可使用特定引物通过聚合酶链反应(PCR)制备，例如如US 4,683,202或Saiki R K et al.，(Science(1988)239，pp 487-491)(Saiki R K等人，《科学》，1988年，第239卷，第487-491页)中所述。

用于本发明的核苷酸序列可在它们中包括合成的或修饰的核苷酸。对寡核苷酸的多种不同类型的修饰是本领域已知的。这包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3′和/或5′端添加吖啶或多聚赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解本文所描述的核苷酸序列可以通过本领域可用的任何方法修饰。可进行这种修饰以便增强本发明的核苷酸序列的体内活性或寿命。

本发明还涵盖与本文给出的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列的用途。如果序列与其片段互补，则该序列可用作探针来鉴别其他生物体中的相似编码序列等等。

不与本发明的序列100％同源但属于本发明的范围之内的多核苷酸可以多种方式获得。本文描述的序列的其他变体可例如通过用探针探测(probing)从一系列个体，例如来自不同种群的个体制备的DNA文库来获得。此外，可获得其他同源物并且这种同源物及其片段一般将能够选择性杂交至本文所列序列中所示的序列。这种序列可通过这样获得：从其他动物物种制备的cDNA文库或基因组DNA文库，在中等至高严格性条件下用包含随附的序列表中的序列中的任一条的全部或部分的探针，探测这些文库。类似的考虑用来获得本发明的多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。

变体和株系/物种同源物还可用简并PCR获得，简并PCR将使用下述引物，所述引物设计成靶向变体和同源物内部编码本发明序列中保守氨基酸序列的序列。保守序列可例如通过比对来自数种变体/同源物的氨基酸序列来预测。序列比对可以用本领域已知的计算机软件来进行。例如，广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。

简并PCR中使用的引物将含有一个或多个简并位置并将在比从已知序列用单序列引物克隆序列所用的严格性条件低的严格性条件下使用。

作为另一种选择，这种多核苷酸可通过对已表征的序列进行定点诱变来获得。在例如需要沉默密码子序列改变来优化多核苷酸序列在其中表达的特定宿主细胞的密码子偏好的情形中这可能是有用的。其他序列改变可能是期望的以便引入限制性酶识别位点，或以改变多核苷酸编码的多肽的性质或功能。

本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可以用来产生引物(例如PCR引物)、用于可变扩增反应的引物、探针(例如用放射性或非放射性标记通过常规手段标记有显示标记的探针)，或者可以将该多核苷酸克隆入载体中。这类引物、探针和其他片段将具有至少15个，优选至少20个，例如至少25、30或40个核苷酸长度，并且也被本文所用的术语“本发明的多核苷酸”涵盖。

根据本发明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探针可重组产生、合成产生或通过本领域技术人员可用的任何手段产生。它们还可以通过标准技术克隆。

通常，引物将通过合成手段产生，涉及所需核酸序列的逐步制备，一次一个核苷酸。利用自动化技术完成该过程的技术是本领域轻易获得的。

较长的多核苷酸通常将用重组手段产生，例如用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。引物可被设计为含有合适的限制性酶识别位点使得可将扩增的DNA克隆进合适的克隆载体中。

杂交

本发明还涵盖与本发明的核酸序列互补的序列或能够杂交至本发明的序列或杂交至与之互补的序列的序列。

本文所用的术语“杂交”应包括“一条核酸链与互补链通过碱基配对接合的过程”以及在聚合酶链反应(PCR)技术中所进行的扩增过程。

本发明还涵盖能杂交至与本文给出的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的序列的核苷酸序列的用途。

术语“变体”还涵盖与能够杂交至本文给出的核苷酸序列的序列互补的序列。

优选地，术语“变体”涵盖与能够在严格条件(例如50℃和0.2xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠pH 7.0})下杂交至本文给出的核苷酸序列的序列互补的序列。

更优选地，术语“变体”涵盖与能够在高严格条件(例如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠pH 7.0})下杂交至本文给出的核苷酸序列的序列互补的序列。

本发明还涉及可杂交至本发明的核苷酸序列(包括本文给出的那些序列的互补序列)的核苷酸序列。

本发明还涉及这样的核苷酸序列，该核苷酸序列与可杂交至本发明的核苷酸序列(包括本文给出的那些序列的互补序列)的序列互补。

还包括在本发明范围内的是这样的多核苷酸序列，该多核苷酸序列在中等至最高严格性条件下能够杂交至本文给出的核苷酸序列。

在一个优选的方面，本发明涵盖可在严格条件(例如50℃和0.2xSSC)下杂交至本发明的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列。

在一个更优选的方面，本发明涵盖可在高严格条件(例如65℃和0.1xSSC)下杂交至本发明的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列。

分子进化

作为一个非限制性例子，有可能在体内或体外在核苷酸序列中产生多个定点突变或随机突变，并随后通过多种手段针对所编码的多肽的改善功能性进行筛选。

另外，多核苷酸序列的突变或天然变体可与野生型或其他突变或天然变体重组而产生新的变体。也可以针对所编码的多肽的改善功能性筛选这种新变体。新的优选变体的产生可通过多种本领域十分确立的方法来实现，例如错误阈值诱变(Error Threshold Mutagenesis)(WO 92/18645)、寡核苷酸介导的随机诱变(US 5,723，323)、DNA改组(shuffling)(US 5,605,793)、外切核酸酶介导的基因拼装(exo-mediated gene assembly)(WO00/58517)。这些和类似随机定向分子进化方法的应用使得能在先前对蛋白质结构或功能没有任何了解的情况下鉴别和选择本发明的酶的具有优选的特性的变体，以及使得能产生不可预测的但有利的突变或变体。在本领域中有许多应用分子进化来优化或改变酶活性的例子，这些例子包括但不限于如下中的一种或多种：

在优选的环境条件例如温度、pH、底物下优化宿主细胞中或体外的表达和/或活性，

增加酶活性，改变底物和/或产物特异性，

增加或降低酶或结构稳定性，改变酶

活性/特异性。

定点诱变

一旦已分离了蛋白质编码核苷酸序列，或者已鉴别了推定的蛋白质编码核苷酸序列，可能有利的是使该序列突变以便制备本发明的蛋白质。

可以使用合成性寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有位于所需突变位点旁侧的核苷酸序列。

一种合适的方法在Morinaga et al.，(Biotechnology(1984)2，p646-649)(Morinaga等人，《生物技术》，1984年，第2卷，第646-649页)中公开。向酶编码核苷酸序列引入突变的另一种方法在Nelson and Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，p 147-151)(Nelson和Long，《分析生物化学杂志》，1989年，第180卷，第147-151页)中有描述。

重组体

在一个方面，用于本发明的序列是重组序列，即用重组DNA技术制备的序列。

这些重组DNA技术是在本领域普通技术人员的能力之内。此类技术在例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Second Edition，Books 1-3，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(J.Sambrook、E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，第1-3册，冷泉港实验室出版社)的文献中进行了解释。

在一个方面，用于本发明的序列是合成序列，即通过体外化学或酶合成制备的序列。其包括但不限于经制备而具有宿主生物体(诸如甲醇营养型酵母毕赤酵母属(Pichia)和汉逊酵母属(Hansenula))的最佳密码子使用的序列。

酶的使用

优选地，蛋白酶以约1g/kg角蛋白材料至约50g/kg角蛋白材料的范围使用。

在一个实施例中，角蛋白材料包括羽毛(或由羽毛组成)，并且蛋白酶以约1g/kg角蛋白材料至约10g/kg角蛋白材料的范围使用。

在一个实施例中，角蛋白材料包括羊毛、兽角、兽蹄或它们的混合物(或由羊毛、兽角、兽蹄或它们的混合物组成)，并且蛋白酶以约1g/kg角蛋白材料至约50g/kg角蛋白材料的范围使用。

应当理解，一个蛋白酶单位(PU)为在pH 7.5(40mM Na₂PO₄/乳酸缓冲液)和40℃下在一分钟内从底物(0.6％酪蛋白溶液)释放1微克酚类化合物(以酪氨酸当量表示)的酶量。这可称为用于测定1PU的测定法。

在一个实施例中，适宜地，所述酶为枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x)，并且E.C.分类指定在本文所教导的用于测定1PU的测定法中测试时具有该活性的酶。

在一个实施例中，蛋白酶是嗜碱的并且最佳地在介于约pH 7至约pH12之间的pH下水解。适宜地，蛋白酶可最佳地在介于约pH 8至约pH 11之间的pH下水解。适宜地，蛋白酶可最佳地在介于约pH 8至约pH 10之间的pH下水解。适宜地，蛋白酶可最佳地在约9的pH下水解。

在一个实施例中，蛋白酶是嗜酸的并且最佳地在介于约pH 1至约pH 7之间的pH下水解。适宜地，蛋白酶可最佳地在介于约pH 3至约pH 6之间的pH下水解。适宜地，蛋白酶可最佳地在介于约pH 4至约pH 5之间的pH下水解。

在一个实施例中，蛋白酶是嗜中性的并且最佳地在介于约pH 6至约pH 8之间的pH下水解。适宜地，蛋白酶可最佳地在约7的pH下水解。

在一个实施例中，蛋白酶可最佳地在介于约30℃至约90℃之间的温度下水解。适宜地，蛋白酶可最佳地在介于约40℃至约80℃之间的温度下水解。适宜地，蛋白酶可最佳地在介于约50℃至约80℃之间的温度下水解。优选地，蛋白酶可最佳地在介于约60℃至约80℃之间的温度下水解。

另外的组分

适宜地，可将角蛋白材料和蛋白酶和/或化学试剂任选地与一种或多种另外的组分混合(同时地或依次地)。

另外的组分的例子包括还原剂、表面活性剂、额外的酶、抗微生物剂、盐形式的金属离子、载体、赋形剂、稀释剂、脂肪、肽和矿物质。

在一个实施例中，一种或多种另外的组分可选自：还原剂、额外的酶、盐形式的金属离子、载体、赋形剂、稀释剂、脂肪、肽、矿物质以及它们的组合。

在一个实施例中，一种或多种另外的组分可以是甘油和/或乙酸钠。

在一个实施例中，添加一种或多种额外的酶。所述一种或多种额外的酶可选自：酯酶、脂肪酶、角质酶、蛋白质-二硫化物还原酶(EC 1.8.x.x)、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、外肽酶、内切蛋白酶、酰基转移酶、过水解酶、氧化酶(例如己糖氧化酶和麦芽糖氧化还原酶)、以及蛋白酶。

在一个实施例中，可使用盐形式的一种或多种金属离子。适宜地，金属离子可以是Cu、Mg、Mn、Co、Zn、Fe和Ca中的一种。适宜地，盐可以是氯化物。

在一个实施例中，添加抗微生物剂作为另外的组分。适宜地，添加亚硫酸或其盐作为抗微生物剂。

还原剂

本发明的方法和/或用途还可以使用还原剂。

如本文所用的术语“还原剂”(也称为还原性试剂或还原试剂)是指在还原-氧化(氧化还原)反应中向另一物质提供电子的元素或化合物。因此，还原剂将在氧化还原反应中被氧化。

存在还原剂可刺激蛋白酶对角蛋白的降解。不希望受理论的束缚，据认为，还原剂可分解存在于角蛋白中的二硫键，从而打开结构以有助于蛋白酶进行的水解。

如果一种物质增加达到期望的角蛋白降解水平的速度和/或该物质在指定时间(例如8小时)之后增加了可消化蛋白质的量和/或可用氨基酸的量，则该物质“刺激”角蛋白降解。

适宜地，可在将角蛋白材料与蛋白酶和还原剂混合的步骤之前和/或期间添加还原剂。

在一个实施例中，在本发明的方法和用途中仅将一种还原剂与蛋白酶结合使用。在另一个实施例中，使用两种或更多种还原剂的任意组合。例如，可以使用2种或3种或4种或5种或6种或7种或8种或9种或10种表面活性剂的任意组合。

在一个实施例中，一种或多种还原剂可选自：亚硫酸盐(例如Na₂SO₃和NaHSO₃)、亚硫酸氢盐、连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、二氧化硫、DTT、β-巯基乙醇和硫化物。

适宜地，还原剂可以是亚硫酸钠或亚硫酸氢钠。

虽然可在本发明的方法和用途中添加一种或多种还原剂，但是本发明人已惊讶地发现，通过控制氧气水平，用于实现期望的角蛋白降解程度的还原剂的量可以减少。

在一个实施例中，还原剂可在角蛋白材料与蛋白酶的反应期间连续添加。有利的是，在反应期间连续添加还原剂或在反应期间一系列添加还原剂(例如，多次定量给料)可导致酶水解改善。不希望受理论的束缚，据认为，还原剂可在反应期间被氧化，导致用于分解角蛋白材料中的二硫键的还原剂耗尽。因此，多次定量给料或连续添加还原剂可允许在酶反应期间角蛋白水解的更线性反应。此外，多次定量给料和/或连续添加还原剂可允许更好地控制反应结束时存在的还原剂的水平。这可提供安全方面的优点，因为可对工艺进行控制以确保最终产品中的还原剂的量较低。因此，适宜地，所添加的还原剂可被连续添加或可以按多个剂量添加(诸如2次或更多次、或者3次或更多次、或者4次或更多次、或者5次或更多次、或者10次或更多次)。

表面活性剂

本发明的方法和用途还可以利用表面活性剂(例如，不含硫的表面活性剂)。

在一个实施例中，如本文所用的术语“表面活性剂”是指降低其溶解于其中的液体的表面张力的物质。例如，表面活性剂可降低水的表面张力。表面活性剂可优选地充当洗涤剂、润湿剂、乳化剂或分散剂。适宜地，表面活性剂可以是两亲的(即，可同时包含疏水基团和亲水基团)。

在另一个实施例中，“表面活性剂”可以是“乳化剂”。如本文所用的术语“乳化剂”是指通过增加乳液的动力学稳定性而使乳液稳定的物质。

优选地，所用的表面活性剂(例如，乳化剂)对动物和/或人类无毒。

优选地，表面活性剂选自：癸酸钠；Triton X-100；吐温20；吐温80；卵磷脂；聚氧乙烯硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐三硬脂酸酯；磷脂酸铵；脂肪酸的钠盐、钾盐或钙盐；脂肪酸的镁盐；脂肪酸的单和二甘油酯的乙酸酯；脂肪酸的单和二甘油酯的乳酸酯；脂肪酸的单和二甘油酯的柠檬酸酯；脂肪酸的单和二甘油酯的单和二乙酰基酒石酸酯；脂肪酸的蔗糖酯；蔗糖甘油酯；脂肪酸的聚甘油酯；聚甘油聚蓖麻酸酯；脂肪酸的丙烷-1，2-二醇酯；与脂肪酸的单和二甘油酯相互作用的热氧化大豆油；硬脂酰-2-乳酸钠；硬脂酰-2-乳酸钙；山梨醇酐单硬脂酸酯；山梨醇酐三硬脂酸酯；山梨醇酐单月桂酸酯；山梨醇酐单油酸酯和山梨醇酐单棕榈酸酯。

在一个实施例中，表面活性剂选自：癸酸钠；Triton X-100；吐温20和吐温80。优选地，表面活性剂为癸酸钠。

在一个实施例中，表面活性剂是选自以下的乳化剂：癸酸钠；TritonX-100；吐温20；吐温80；卵磷脂；聚氧乙烯硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐三硬脂酸酯；磷脂酸铵；脂肪酸的钠盐、钾盐或钙盐；脂肪酸的镁盐；脂肪酸的单和二甘油酯的乙酸酯；脂肪酸的单和二甘油酯的乳酸酯；脂肪酸的单和二甘油酯的柠檬酸酯；脂肪酸的单和二甘油酯的单和二乙酰基酒石酸酯；脂肪酸的蔗糖酯；蔗糖甘油酯；脂肪酸的聚甘油酯；聚甘油聚蓖麻酸酯；脂肪酸的丙烷-1，2-二醇酯；与脂肪酸的单和二甘油酯相互作用的热氧化大豆油；硬脂酰-2-乳酸钠；硬脂酰-2-乳酸钙；山梨醇酐单硬脂酸酯；山梨醇酐三硬脂酸酯；山梨醇酐单月桂酸酯；山梨醇酐单油酸酯和山梨醇酐单棕榈酸酯。有利的是，此类表面活性剂是目前用于食品行业并通常被认为能安全用于食品的乳化剂。

在一个实施例中，在本发明的方法和用途中仅将一种表面活性剂与蛋白酶结合使用。在另一个实施例中，使用两种或更多种表面活性剂的任意组合。例如，可以使用2种或3种或4种或5种或6种或7种或8种或9种或10种表面活性剂的任意组合。

待使用的表面活性剂的最佳量可容易地由本领域的普通技术人员确定。

在一个实施例中，所用的表面活性剂的量可在约0.01％w/v至约1％w/v的范围内。优选地，表面活性剂的量可在约0.05-0.9％w/v的范围内。

适宜地，所用的表面活性剂的量可以大于或等于0.01％w/v角蛋白材料。优选地，所用的表面活性剂的量可以大于或等于0.02％w/v、或0.05％w/v或0.1％w/v角蛋白材料。

适宜地，所用的表面活性剂的量可以小于或等于1％w/v角蛋白材料。优选地，所用的表面活性剂的量可以小于或等于0.9％w/v、或0.8％w/v或0.5％w/v角蛋白材料。

在一个实施例中，所用的表面活性剂的量可以在约0.1g/Kg角蛋白材料至约10g/Kg角蛋白材料(例如羽毛)的范围内。适宜地，所用的表面活性剂的量可以在约0.5g/Kg角蛋白材料至约5g/Kg角蛋白材料(例如羽毛)的范围内。

适宜地，所用的表面活性剂的量可以大于或等于0.1g/Kg角蛋白材料。优选地，所用的表面活性剂的量可以大于或等于0.5g/Kg、或1g/Kg、或2g/Kg角蛋白材料。

适宜地，所用的表面活性剂的量可以小于或等于10g/Kg角蛋白材料。优选地，所用的表面活性剂的量可以小于或等于8g/Kg、或5g/Kg或3g/Kg角蛋白材料。

在一个实施例中，表面活性剂与角蛋白材料的比率可以在约1∶100至约1∶10,000的范围内。优选地，表面活性剂与角蛋白材料的比率可以在约1∶500至约1∶5,000的范围内。

适宜地，表面活性剂与角蛋白材料的比率可以大于1∶10,000。

适宜地，表面活性剂与角蛋白材料的比率可小于1∶100。

在一个实施例中，表面活性剂是不含硫的表面活性剂。不希望受理论的束缚，据信，表面活性剂可通过打开溶液中的疏水性角蛋白材料而起作用，从而允许酶更好地进入结构中以进行水解。作为另一种选择，表面活性剂可有助于将经水解的蛋白质从羽毛的表面移除到溶液中，使得羽毛的下层表面暴露于蛋白水解。

在一个实施例中，如果在降解角蛋白材料(例如羽毛)的过程中，在过程结束时存在于溶液中的可溶性蛋白的量与存在于不使用不含硫的表面活性剂的对照方法的溶液中的可溶性蛋白的量相比有所增大，则该不含硫的表面活性剂可以是用于本发明的方法和用途的表面活性剂。适宜地，可溶性蛋白的增加可通过在215-280nm处的吸光度的增加来衡量。

制备饲料的工艺

在另一个方面，提供了用于制备动物饲料的方法，该方法包括将通过本发明的方法制备的角蛋白水解产物与一种或多种动物饲料组成组分混合。

有利的是，根据本发明的方法制备的角蛋白水解产物可在动物饲料中提供有价值的蛋白质来源和/或氨基酸来源。例如，角蛋白水解产物可提供以下氨基酸中的一种或多种的来源：甲硫氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸、精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。

术语“动物饲料”和“饲料”在本文可互换使用。术语“动物饲料组成组分”和“饲料成分”也可互换使用。

动物饲料通常在饲料磨机中制备，在磨机中首先将原料研磨成合适的粒度，然后与适当的添加剂混合。然后可将动物饲料制备为糊状物或粒料；后者通常涉及这样的方法：将温度升高至靶水平，然后使饲料通过模具以制备出特定大小的粒料。让粒料冷却。随后，可添加液体添加剂如脂肪和酶。动物饲料的制备还可涉及额外的步骤，其包括在造粒之前的挤出或膨胀一特别是通过可包括至少使用蒸汽的合适技术来进行。

仅举例而言，用于鸡(例如肉鸡)的动物饲料可由下表中所列举成分中的一种或多种组成，例如以下表中给出的百分比表示：

成分	开食料(％)	育肥料(％)
			玉蜀黍	46.2	46.7
小麦粗粉	6.7	10.0
			玉蜀黍DDGS	7.0	7.0
大豆粉48％CP	32.8	26.2
			动物/植物脂肪共混物	3.0	5.8
L-赖氨酸HCl	0.3	0.3
			DL-甲硫氨酸	0.3	0.3
L-苏氨酸	0.1	0.1
			盐	0.3	0.4
石灰石	1.1	1.1
			磷酸二钙	1.2	1.2
家禽维生素和微量矿物质	0.3	0.3

仅举例而言，鸡(诸如肉鸡)的饲粮规格可如下表中所述：

仅举例而言，适于蛋鸡食用的饲料可由下表中所列举成分中的一种或多种组成，例如以下表中给出的百分比表示：

成分	产蛋期(％)
		玉蜀黍	10.0
小麦	53.6
		玉蜀黍DDGS	5.0
大豆粉48％CP	14.9
		小麦粗粉	3.0
大豆油	1.8
		L-赖氨酸HCl	0.2
DL-甲硫氨酸	0.2
		L-苏氨酸	0.1
盐	0.3
		磷酸二钙	1.6
石灰石	8.9
		家禽维生素和微量矿物质	0.6

仅举例而言，蛋鸡的饲粮规格可如下表中所述：

仅举例而言，用于火鸡的饲料可包含下表中所列举成分中的一种或多种，例如以下表中给出的百分比表示：

成分	阶段1(％)	阶段2(％)	阶段3(％)	阶段4(％)
					小麦	33.6	42.3	52.4	61.6
玉蜀黍DDGS	7.0	7.0	7.0	7.0
					大豆粉48％CP	44.6	36.6	27.2	19.2
油菜籽粉	4.0	4.0	4.0	4.0
					大豆油	4.4	4.2	3.9	3.6
L-赖氨酸HCl	0.5	0.5	0.4	0.4
					DL-甲硫氨酸	0.4	0.4	0.3	0.2
L-苏氨酸	0.2	0.2	0.1	0.1
					盐	0.3	0.3	0.3	0.3
石灰石	1.0	1.1	1.1	1.0
					磷酸二钙	3.5	3.0	2.7	2.0
家禽维生素和微量矿物质	0.4	0.4	0.4	0.4

仅举例而言，火鸡的饲粮规格可如下表中所述：

饲粮规格
					粗蛋白(％)	29.35	26.37	22.93	20.00
家禽代谢能(kcal/kg)	2.850	2.900	2.950	3.001
					钙(％)	1.43	1.33	1.22	1.02
可利用磷(％)	0.80	0.71	0.65	0.53
					钠(％)	0.16	0.17	0.17	0.17
可消化的赖氨酸(％)	1.77	1.53	1.27	1.04
					可消化的甲硫氨酸(％)	0.79	0.71	0.62	0.48
可消化的甲硫氨酸+半胱氨酸(％)	1.12	1.02	0.90	0.74
					可消化的苏氨酸(％)	1.03	0.89	0.73	0.59

仅举例而言，用于仔猪的饲料可包含下表中所列举成分中的一种或多种，例如以下表中给出的百分比表示：

成分	阶段1(％)	阶段2(％)
			玉蜀黍	20.0	7.0
小麦	25.9	46.6
			黑麦	4.0	10.0
小麦粗粉	4.0	4.0
			玉蜀黍DDGS	6.0	8.0
大豆粉48％CP	25.7	19.9
			干乳清	10.0	0.0

大豆油	1.0	0.7
			L-赖氨酸HCl	0.4	0.5
DL-甲硫氨酸	0.2	0.2
			L-苏氨酸	0.1	0.2
L-色氨酸	0.03	0.04
			石灰石	0.6	0.7
磷酸二钙	1.6	1.6
			猪维生素和微量矿物质	0.2	0.2
盐	0.2	0.4

仅举例而言，仔猪的饲粮规格可如下表中所述：

饲粮规格
			粗蛋白(％)	21.50	20.00
猪可消化能(kcal/kg)	3380	3320
			猪净能(kcal/kg)	2270	2230
钙(％)	0.80	0.75
			可消化的磷(％)	0.40	0.35
钠(％)	0.20	0.20
			可消化的赖氨酸(％)	1.23	1.14
可消化的甲硫氨酸(％)	0.49	0.44
			可消化的甲硫氨酸+半胱氨酸(％)	0.74	0.68
可消化的苏氨酸(％)	0.80	0.74

仅举例而言，用于生长猪/肥育猪的饲料可由下表中所列举成分中的一种或多种组成，例如以下表中给出的百分比表示：

成分	生长料/育肥料(％)
		玉蜀黍	27.5
大豆粉48％CP	15.4
		玉蜀黍DDGS	20.0
小麦麸皮	11.1
		米糠	12.0
卡诺拉籽粉	10.0
		石灰石	1.6
磷酸二钙	0.01

盐	0.4
		猪维生素和微量矿物质	0.3
赖氨酸-HCl	0.2
		植物油	0.5

仅举例而言，生长猪/肥育猪的饲粮规格可如下表中所述：

饲粮规格
		粗蛋白(％)	22.60
猪代谢能(kcal/kg)	3030
		钙(％)	0.75
可利用磷(％)	0.29
		可消化的赖氨酸(％)	1.01
可消化的甲硫氨酸+半胱氨酸(％)	0.73
		可消化的苏氨酸(％)	0.66

因此，可以看出，角蛋白水解产物可以用作在这些饲粮中所需的蛋白质和/或氨基酸的良好且可能廉价的来源。

饲料

当用于制备饲料时，根据本发明制备的角蛋白水解产物可结合以下一者或多者使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅助剂或营养活性成分。

如本文所用的术语“动物饲料”意指适合于动物食用的食物，诸如适合于奶牛、猪、羊羔、绵羊、山羊、小鸡、火鸡、鸵鸟、野鸡、鹿、麋鹿、驯鹿、水牛、野牛、羚羊、骆驼、袋鼠；马、鱼；猫、狗、豚鼠、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、沙鼠和毛丝鼠)食用的食物。

根据本发明制备的角蛋白水解产物可按本身已知的方式添加到动物饲料或组分中。

优选地，饲料可以是草料或其预混物、复合饲料或其预混物。在一个实施例中，可将根据本发明制备的角蛋白水解产物与复合饲料、复合饲料组分混合，和/或将其施加到复合饲料、复合饲料组分，或将其施加至复合饲料的预混物或施加至草料、草料组分或草料的预混物中。

如本文所用的术语“草料”意指提供给动物(而非动物必须自己觅食)的任何食物。草料涵盖经切割的植物。

术语草料包括干草、稻草、青贮饲料、压制和制丸的饲料、油和混合日粮以及发芽谷物及豆类。

草料可从选自如下的植物中的一者或多者获得：苜蓿(紫苜蓿(lucerne))、大麦、百脉根、芸苔属植物、Chau moellier、羽衣甘蓝、油菜籽(卡诺拉)、芜菁甘蓝(瑞典甘蓝)、芜菁、三叶草、杂三叶草、红色三叶草、地三叶草、白色三叶草、草、燕麦草、羊茅草、百慕大草、雀麦草、石南荒原草(heath grass)、草地早熟禾(来自天然混合草原草地)、果树草、黑麦草、猫尾草、玉米(玉蜀黍)、粟、燕麦、高粱、大豆、树(用于树-干草的截去树梢的树的嫩枝)、小麦和豆类。

术语“复合饲料”意指以粗粉、丸粒、球丸(nut)、饼或碎屑形式的商业饲料。复合饲料可由各种原料和添加剂共混而来。根据目标动物的具体需求配制这些共混物。

复合饲料可以是提供所有每日所需营养物质的完全饲料、提供日粮(蛋白质、能量)的一部分的浓缩物或仅提供额外的微量营养物质(例如矿物质和维生素)的补充剂。

用于复合饲料中的主要成分是饲料谷物，其包括玉米、大豆、高粱、燕麦和大麦。

适宜地，本文所提及的预混物可以是由微量成分构成的组合物，所述微量成分为例如维生素、矿物质、化学防腐剂、抑制性物质、发酵产物和其他必需成分。预混物通常是适合于掺和进商业口粮内的组合物。

在根据本发明制备动物饲料的方法中，可添加一种或多种动物饲料组成组分，其选自：a)谷类，诸如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物诸如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)得自如下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白质、乳清、干椰肉、芝麻；d)得自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。

通过本发明的方法制备的动物饲料可含有至少30重量％、至少40重量％、至少50重量％或至少60重量％的玉米和大豆粉或玉米和全脂大豆、或者小麦粉或向日葵粉。

除此之外或作为另一种选择，通过本发明的方法制备的动物饲料可包含至少一种高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产品以提供高纤维饲料。高纤维饲料材料的例子包括：小麦、大麦、黑麦、燕麦、谷类的副产品(例如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(DDGS)、麦糠、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳)、棕榈仁及柑橘渣。一些蛋白质来源也可以视为高纤维的：从诸如向日葵、羽扇豆、蚕豆和棉花之类的来源获得的蛋白质。

在本发明中，饲料可以是如下中的一者或多者：复合饲料和预混物，包括丸粒、球丸、或(家畜用)饼；作物或作物残茬：玉米、大豆、高梁、燕麦、大麦、玉米秸秆、椰子干、稻草、糠、糖用甜菜废料；鱼粉；新鲜切草和其他饲用植物；肉粉和骨粉；糖蜜；油饼和滤饼；低聚糖；糖渍饲用植物：干草和青贮饲料；海草；种子和谷物，整体地或通过压碎、碾磨等制备；发芽谷物及豆类；酵母提取物。

如本文所用，术语“施加”是指将根据本发明制备的角蛋白水解产物间接或直接地施加到产品(例如饲料)中。可使用的施加方法的例子包括但不限于：在包含角蛋白水解产物的材料中处理产品、通过将角蛋白水解产物与产品混合而直接施加、将角蛋白水解产物喷涂到产品表面上或将产品浸入角蛋白水解产物的制备物中。

在一个实施例中，优选地将通过本发明的方法制备的角蛋白水解产物与产品(例如饲料)混合或施加到产品上。作为另一种选择，角蛋白水解产物可包含在饲料的乳液或原始成分中。

如本文所用，术语“猪”涉及诸如家猪、食用猪或野猪的非反刍类杂食动物。通常，猪饲料包含约50％的碳水化合物、约20％的蛋白质和约5％的脂肪。高能猪饲料的例子是在玉米的基础上常常混合以饲料补充物，例如蛋白质、矿物质、维生素和氨基酸(诸如赖氨酸和色氨酸)。猪饲料的例子包括动物蛋白产品、海产品、奶产品、谷类产品和植物蛋白产品，所有这些产品还可以包含天然调味料、人工调味料、微量和常量矿物质、动物脂肪、植物脂肪、维生素、防腐剂或药物(诸如抗生素)。应当理解，当在本说明书(包括随附的权利要求书)中提及“猪饲料”时，此提法旨在包括“过渡”或“开食料”饲料(用于使幼猪断乳)和“育肥”或“生长料”饲料(在过渡期后用于使猪生长到适合上市的年龄和/或大小)。

如本文所用，术语“家禽”涉及诸如鸡、肉鸡、母鸡、公鸡、阉鸡、火鸡、鸭、斗鸡、小母鸡或小鸡的禽类。家禽饲料可称为“完全”饲料，因为它们包含全部的蛋白质、能量、维生素、矿物质，以及其他对于禽类的适当生长、产蛋和健康所必需的营养物质。然而，家禽饲料还可包含维生素、矿物质或药物，诸如抗球虫药(例如莫能菌素钠、拉沙里菌素、氨丙嘧吡啶、沙利霉素和磺胺喹啉)和/或抗生素(例如青霉素、杆菌肽、金霉素和土霉素)。

留作产肉的幼鸡或肉鸡、火鸡和鸭的饲养方式不同于留作产蛋的小母鸡。肉鸡、鸭和火鸡具有较大的体型并且比产蛋型鸡更快地增重。因此，对这些禽类饲以较高蛋白质和能量水平的饲粮。

应当理解，当在本说明书(包括随附的权利要求书)中提及“家禽饲料”时，此提法旨在包括“开食料”饲料(孵化后)、“育肥料”、“生长料”或“发育料”饲料(从6-8周龄直到达到可屠宰的大小)和“蛋鸡”饲料(在产蛋期间饲喂)。

宠物食物

在一个方面，“动物饲料”可以是宠物食物。如本文所用的术语“宠物食物”意指适合供家养动物食用的食物，家养动物诸如狗、猫、马、猪、鱼、鸟、仓鼠、沙鼠、豚鼠、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、兔子和南美栗鼠)。

角蛋白水解产物可施加到宠物食物自身和/或宠物食物的一种或多种组成组分(例如成分)上或其中。例如，可将角蛋白水解产物施加到美味增强剂(palatant)上或其中。

存在于狗和猫食物中的典型组成组分的例子包括美味增强剂、全玉米粒、粗大豆、鸡肉副产品粉、粉状纤维素、玉米蛋白粉、大豆粉、鸡肝香料、大豆油、亚麻仁、焦糖色素、加碘盐、L-赖氨酸、氯化胆碱、氯化钾、维生素(L-抗坏血酸基-2-多磷酸盐(维生素C的来源)、维生素E补充剂、烟酸、硝酸硫胺、维生素A补充剂、泛酸钙、生物素、维生素B12补充剂、盐酸吡哆醇、核黄素、叶酸、维生素D3补充剂)、维生素E补充剂、矿物质(如，硫酸亚铁、氧化锌、硫酸铜、一氧化锰、碘酸钙、亚硒酸钠)、牛磺酸、L-肉毒碱、葡萄糖胺、混合生育酚、β-胡萝卜素、迷迭香提取物。

适于添加本发明的角蛋白水解产物的宠物食物配方可基于以下主要成分：玉蜀黍粉(全粉、粗粉或研磨粉)、家禽可食用的内脏粉、麦麸、苜蓿粉、玉蜀黍面筋、稻、亚麻籽粉、菜籽粉、大豆粉或菜豆粉。优选地，该配方还含有稳定剂，并补充有各种维生素和抗氧化剂诸如维生素A、胆钙化醇、维生素E、甲萘醌、柠檬酸、泛酸、叶酸、维生素B12、维生素B6、核黄素(维生素B2)、维生素B1、烟酸(维生素B3)，以及优选地风味增强剂诸如谷氨酰胺、牛磺酸、酵母提取物和盐。作为另一种选择或除此之外，所述配方可补充有复原食物成分，诸如牛肉粉、牛骨粉、鸡脂肪、鸡肝(经水解)、鱼粗粉或鱼粉(诸如金枪鱼粉)。

在一个方面，宠物食物可以是湿或干的宠物食物，其可以是湿润的宠物食物(例如包含18-35％的水分，或甚至18-70％的水分)、半湿润的宠物食物(例如14至18％的水分)、干的宠物食物、宠物食物补充剂或宠物零食的形式。一些宠物食物形式(例如湿润的和半湿润的宠物食物)由于制备宠物食物的加工条件不足以杀死宠物食物上或其中的所有微生物这一事实而特别容易受污染影响。

适宜地，宠物食物可以是粗粒形式。

在一个方面，宠物食物可适用于狗或猫。

在一个方面，用本发明的所述角蛋白水解产物制备的宠物食物在以下情况中可被描述为非变应性的(anallergeinc)：其对通常经受食物不良反应以至于可将该动物称为对食物过敏或食物不耐受，并且在最严重的情况下患有炎症性肠病的宠物有帮助。典型的非变应性宠物食物组合物通常维持标准的20％蛋白质组成，在胃蛋白酶可消化性足够高(理想地，高于75％)的情况下该组合物可以是角蛋白水解产物的形式，并且还含有无毒的成分，诸如玉米淀粉、椰子油、大豆油或水解大豆、天然调味剂、磷酸钾、粉状纤维素、碳酸钙、硅铝酸钠、菊苣、L-酪氨酸、果寡糖、鱼油、L-赖氨酸、氯化胆碱、牛磺酸、L-色氨酸、维生素[DL-α生育酚(维生素E的来源)、肌醇、烟酸、L-抗坏血酸-2-多磷酸盐(维生素C的来源)、D-泛酸钙、生物素、盐酸吡哆醇(维生素B6)、核黄素(维生素B2)、硝酸硫胺(维生素B1)、维生素A乙酸酯、叶酸、维生素B12补充剂、维生素D3补充剂]、DL-甲硫氨酸、万寿菊提取物(万寿菊(Tagetes erecta L.))、组氨酸、微量矿物质[蛋白锌、氧化锌、硫酸亚铁、蛋白锰、蛋白铜、硫酸铜、一氧化锰、碘酸钙、亚硒酸钠]、迷迭香提取物，并且用天然混合的生育酚和柠檬酸防腐。

在一个方面，宠物食物可以是鱼食物。鱼食物通常含有使养殖鱼保持健康所需的主要营养物质、痕量元素和维生素。鱼食品可以是小片、丸粒或片的形式。压成丸粒的形式(其中的一些快速沉降)经常用于较大鱼或底饲物种。一些鱼食物还含有诸如β胡萝卜素或性激素之类的添加剂，以人工增强观赏性鱼的颜色。

在一个方面，宠物食物可以是鸟食物。鸟食物包括用于喂鸟器中以及用于饲喂宠物鸟的食物。通常，鸟食物由多种种子组成，但也可涵盖板油(牛或羊脂肪)。

在一个方面，角蛋白水解产物可诸如通过在宠物食物上喷涂或沉淀而掺入到宠物食物内或宠物食物的表面上。

在一个方面，配制角蛋白水解产物以用于宠物食物。在这个方面，角蛋白水解产物可包含额外的抗污染剂，诸如磷酸、丙酸和丙酸盐、亚硫酸盐、苯甲酸和苯甲酸盐、亚硝酸盐、硝酸盐和对羟苯甲酸酯。

适宜地，可将角蛋白水解产物添加到宠物食物或其组成组分中，使得角蛋白水解产物按宠物食物的重量计以约0.1％至约10％、约0.1％至约5％、或约0.1％至约3％存在。在一个方面，抗污染组合物按宠物食物的重量计以约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0％存在，其中所述值的任一者可在适当的时候形成上或下端值。

在一个方面，宠物食物可以是粗粒。制备粗粒的示例性方法包括以下步骤：

a.通过在高温下混合湿的和干的成分进行预处理以形成粗粒面团(kibble dough)；

b.在高温和高压下挤出粗粒面团；

c.干燥挤出的粗粒；和

d.用局部用液体和/或干燥成分包衣(enrobing)或涂覆干燥的粗粒。

适宜地，可将角蛋白水解产物在工艺的任何阶段(诸如在步骤a和/或d)施加到粗粒。

形式

通过本发明的方法制备的角蛋白水解产物可以任何合适的形式使用，无论是当其单独存在、还是当其存在于组合物中时。所述组合物可以包含来自屠宰场的其他富含营养的废弃物流，诸如血或肉和骨粉，或其可以与其他动物饲料一起制备在组合物中，所述其他动物饲料包括但不限于大豆粉、鱼粉、鱼油、乳清粉、乳清滤液、酒糟、棉籽粉、玉米蛋白粉、卡诺拉粗粉等等。

干粉或颗粒可通过本领域技术人员已知的手段，诸如，在顶喷式流化床涂布器中、在Wurster型底喷式流化床(buttom spray Wurster)中或通过转鼓制粒(例如高剪切制粒)、挤出、锅包衣法或在微成分混合器中制备。

适宜地，角蛋白水解产物可作为喷雾干燥的或冷冻干燥的粉末提供。这种喷雾干燥的角蛋白水解产物的例子在实例5中示出。此类喷雾干燥的粉末与水含量更高的形式相比具有增加的稳定性和操作性的优点，但是所述粉末仍然能够以溶液或悬浮形式提供给最需要营养补充剂的幼小动物。在本发明的一个实施例中，喷雾干燥的角蛋白水解产物是尤其适于饲喂幼小宠物和商业牲畜(包括但不限于牛、猪、貂、狗、猫、肉鸡和火鸡)的粉末形式。喷雾干燥的角蛋白水解产物的小粒度还使得其特别适于较小的生物，诸如幼鱼(鱼苗)，以及甲壳类动物诸如虾和蟹苗。

在一个方面，角蛋白水解产物为液体制剂的形式。此类液体消费品可包含如下中的一者或多者：缓冲液、盐、山梨醇和/或甘油。

在一个实施例中，本发明的角蛋白水解产物可以与至少一种选自如下物质中的至少一者的生理学上可接受的载体一起配制：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na₂SO₄、滑石粉、PVA、山梨醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1，3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐以及它们的混合物。

分离的

在一个方面，适宜地，本发明中使用的一种或多种酶可以是分离的形式。术语“分离的”意指该酶至少基本上不含与该酶在自然界中天然结合且在自然界中存在的至少一种其他组分。本发明的酶可以基本上不含所述物质原本可能与之相关联的一种或多种污染物的形式提供。因此，例如，其可基本上不含一种或多种潜在污染性的多肽和/或核酸分子。

纯化的

在一个方面，优选地，根据本发明的酶是纯化的形式。术语“纯化的”意指酶以高水平存在。理想的是该酶为组合物中存在的主要组分。优选地，其以至少约90％、或至少约95％或至少约98％的水平存在，所述水平是相对于所考虑总组合物以干重/干重计来测定的。

现在将仅以举例的方式，参照如下附图和实例来描述本发明。

实例

实例1

向6根13ml塑料管的每一根中添加100mg经研磨的鸡羽毛(通过研磨使羽轴和空心轴短于0.5cm)、5mg亚硫酸氢钠和65微升Protex P。向管1-3中添加12ml pH为7.90的自来水，而向管4-6中添加12ml的自来水和氢氧化钠以达到0.7mM的最终浓度并脱气(用氮气鼓泡)。将管紧密闭合，然后在50℃下并伴以130rpm振荡温育16h。然后将6根管以4000rpm离心，并将得自每个样品的0.2ml上清液通过0.45微米过滤器过滤，将50微升的每种滤液在280nm下测量作为所释放肽的指标(参见下表1)。从下表中可以看出，通过对反应介质氮气鼓泡进行脱气和向反应介质添加氢氧化钠以达到0.7mM的最终浓度而将肽释放提高了21％。

表1

实例2

对于碱性蛋白酶处理而言，反应混合物包含9ml水、1ml tris-HCl(0.48M，pH8.5)、一根鸡羽毛、150微升Protex 30L(可得自杜邦工业生物科学公司(DuPont Industrial Biosciences ApS))和20mg还原剂亚硫酸氢钠。将反应混合物在自由落体混合器中于50℃下伴以100rpm振荡温育过夜(16小时)。对于过乙酸处理而言，在蛋白酶反应之后，将经Protex 30L处理羽毛的反应混合物离心，然后使沉淀物以各种最终浓度(下表)重悬于过乙酸(目录号77240，西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，纯(purum)，约39％的乙酸溶液)中。

表2

结果：可以看出，随着过乙酸浓度增大，浊度从0.738下降到0.04，表明反应混合物变得更澄清(600nm下的吸光度更低)。这是过乙酸对羽毛蛋白具有氧化和增溶效应所导致的。根据该观察结果，对上清液中总氮的凯式分析表明，随着过乙酸浓度增大，总的可溶性氮从0.78％增加至1.18％。

实例3

向6根试管中的每一根添加100mg鸡羽毛。添加密理博(MilliQ)水，随后混合39％过乙酸(77240，西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))，得到2-20％(v/v)的最终过乙酸浓度，参见下表4。将6根试管紧密闭合，然后在振荡器上于50℃下以80rpm温育24小时。

表3

结果：从图1可以看出，羽毛在2至20％(v/v)的过乙酸中于5小时的反应之后被降解。在24小时的处理之后，将试管以4000rpm离心10分钟，随后将135μl上清液与135μl 10％三氯乙酸(TCA，v/v)混合并再次离心。使用25μl上清液测量280nm下的吸光度。如上表所指出的那样，上清液的吸光度随着过乙酸浓度的增大而增加，表明可溶性级分中释出的肽物质增多。

可使用酸性肽酶(包括最适pH为2-4的胃蛋白酶(EC 3.4.23.1)和/或最适pH为pH 2.8的曲霉胃蛋白酶(EC 3.4.23.18))结合三肽基肽酶(包括最适pH范围为2.5-4.5的sedolisin(EC 3.4.21.100))以及二肽基肽酶(EC3.4.14.1)，对经过乙酸预处理的角蛋白材料进行进一步处理。

实例4

原理：二氧化氯与角蛋白反应，并且最佳地在pH 3.0-3.5、＜40℃的温度下使二硫键分裂。使用乙醇酸来维持pH。

可使用得自杜邦公司(Dupont)的二氧化氯(ClO₂)，通过特异性地氧化二硫键，来处理羽毛。ClO₂可以方便地使用酸化剂(包括HCl、羟基乙酸(乙醇酸)或乙酸)在酸性条件下由亚氯酸钠产生。该工艺与酸性蛋白酶的组合减少了实现期望降解程度所需的ClO2的剂量，并且由于这两种工艺相容，所以不需要进行pH调节。

执行了三种方法。

方法1-先用ClO ₂ 处理，随后进行蛋白酶处理

在该方法中，首先使用i)ClO₂或ii)通过添加5NaClO2+4 HCl(这导致生成4 ClO2+5NaCl+2 H2O)原位生成的ClO₂，或ii)HOCl对羽毛角蛋白进行处理。

然后根据需要将pH调节至所使用酶的最适pH(所述酶可包括：最适pH为2-4的胃蛋白酶(EC 3.4.23.1)和/或最适pH为pH 2.8的曲霉胃蛋白酶(EC 3.4.23.18)，结合三肽基肽酶(包括最适pH范围为2.5-4.5的sedolisin(EC 3.4.21.100))以及二肽基肽酶(EC 3.4.14.1)，或得自杜邦工业生物科学公司(Dupont Industrial Biosciences ApS)的酶：Fermgen或Protex 6L、14L、30L或Protex P)。然后添加蛋白酶，并在30至80℃下温育30至48小时。

方法2-先用蛋白酶处理，随后进行ClO ₂ 处理

首先使用蛋白酶(Fermgen或Protex 6L、14L、30L或Protex P)在30至80℃下处理30至48小时。

然后添加ClO₂，并在30至80℃下反应30分钟至24小时。蛋白酶水解应当在30至80℃下执行30至48小时。

方法3-单步骤工艺

将羽毛与蛋白酶(所述蛋白酶可包括：最适pH为2-4的胃蛋白酶(EC3.4.23.1)和/或最适pH为pH 2.8的曲霉胃蛋白酶(EC 3.4.23.18)，结合三肽基肽酶(包括最适pH范围为2.5-4.5的sedolisin(EC 3.4.21.100))以及二肽基肽酶(EC 3.4.14.1)，或得自杜邦工业生物科学公司(Dupont IndustrialBiosciences ApS)的蛋白酶：Fermgen或Protex 6L、14L、30L或Protex P)和ClO₂混合，然后在30至80℃下温育30分钟至48小时。针对此类工艺选择的蛋白酶具有对氧化剂的抗性，即，蛋白酶的氧化形式与还原形式或天然形式具有至少等同的活性。

对于所有方法：首先使用蒸汽使反应器升温，所述蒸汽还起到对羽毛进行灭菌和软化的作用。在水解之后，可对水解产物进一步蒸汽灭菌，之后将其干燥成羽毛粉。也可将水解产物分离成两个级分，即，可用作氨基酸和肽营养液的液体级分，以及可被干燥成羽毛粉作为供宠物和水产养殖物种食用的动物饲料的沉淀物。

实例5

将原始羽毛与自来水混合。添加NaOH以达到0.7mM的最终浓度，混合，随后添加蛋白酶和亚硫酸盐。持续地混合反应混合物，并将其保持在50至80℃的温度下。所使用的NaOH浓度在0.1mM至50mM的范围内，具体取决于当地自来水的pH和盐分。首先使用蒸汽使反应器升温，所述蒸汽还起到驱出反应器中的空气、对羽毛进行灭菌和软化的作用。在水解之后，对水解产物进一步蒸汽灭菌，之后将其干燥成羽毛粉。然后将水解产物分离成两个级分，即，用作氨基酸和肽营养物的液体级分，以及可被干燥成羽毛粉的沉淀物。

在平行实验中，将水解产物样品离心(10min，10.000×g)，分离出两个级分。可溶性级分(上清液)含有可溶性肽，而粒状级分(沉淀物)含有不溶性肽。将粒状级分在冷冻干燥机中干燥直到恒重，并称重。按照公式1计算，对于包含Protex P的样品而言，水解羽毛的百分比为大约60％；而对于不包含Protex P的样品而言，水解羽毛的百分比为大约4％。

公式1：

水解的羽毛(％)＝100％-(X1-X2)/X1*100％

X1＝水解之前鸡羽毛的干物质质量(g)

X2＝粒状级分的干物质质量(g)

将得自经Protex P水解羽毛的上清液通过355μm筛网过滤。首先将Büchi B-191微型喷雾干燥机启动，然后使用离子交换水，采用如表4所示的参数，使该干燥机在稳定的条件下运行。一旦参数稳定，便以30％的加料速度装入鸡羽毛水解产物，并收集所得的白色粉末产物。该粉末具有极浅白色的外观，在A&D ML-50水分测定仪(105℃干燥温度)上测得其水分含量为大约3％。

表4

喷雾前的液体(℃)	20
		入口预设值(℃)	150
入口实际值(℃)	150
		出口(℃)	98
抽气器(％)	100
		泵(％)	30
雾化气流量(l/h)	600
		雾化进气口(巴)	5
真空(毫巴)	-42

上面说明书中提及的所有出版物以引用的方式并入本文。对本领域的技术人员将显而易见的是，可在不背离本发明的范围和实质的条件下对所描述的本发明方法和系统作出各种修改和变型。尽管本发明已结合特定的优选实施例进行了说明，但应该理解受权利要求书保护的本发明不应该不当地受限于这些特定的实施例。实际上，对生物化学和生物技术或相关领域的技术人员明显的用于执行本发明的所述模式的多种修改旨在处于如下权利要求书的范围内。

Claims

1.一种制备角蛋白水解产物的方法，包括以下步骤：

i)将角蛋白材料与蛋白酶混合；以及

ii)将角蛋白材料与化学试剂混合；

其中步骤ii发生于：

a)步骤i)之后；

b)步骤i)期间，此时所述所选择的蛋白酶在用于所述化学反应的pH条件下水解，和/或

c)步骤i)之前，此时所述所选择的蛋白酶在用于所述化学反应的反应条件下水解。

2.一种商业降解角蛋白的方法，包括以下步骤：

i)使角蛋白材料与蛋白酶反应；以及

ii)使角蛋白材料与化学试剂反应；

其中步骤ii发生于：

a)步骤i)之后；

c)步骤i)之前，此时所述所选择的蛋白酶在用于所述化学反应的pH条件下水解。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述所选择的蛋白酶在用于所述化学反应的pH条件下水解。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶得自芽孢杆菌属(Bacillus)。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶包含如SEQ ID NO：1或2中任一者所定义的多肽序列，或其功能性片段或变体，所述功能性片段或变体在至少50个氨基酸残基上与SEQ IDNO：1或2中的任一者具有至少75％的序列同一性。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶可由与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少75％同一性的编码蛋白酶的核酸序列、或在严格条件下能够杂交至SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的核酸序列或其互补序列的核酸序列转录。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述化学试剂为氧化剂。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述化学试剂为选自以下的化学试剂中的一者或多者：亚氯酸钠、HCl、乙酸、羟基乙酸、NaOH、过酸、HOCl、HOBr、NaClO₂、ClO₂、H₂O₂、氢氧化铵、氢氧化钠和氢氧化钙。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述化学试剂在步骤i)之前和/或期间添加，并且所述化学氧化剂将pH调节至所述蛋白酶在其下最大程度水解的pH。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述所使用的蛋白酶是嗜碱的并且所述化学氧化剂为碱。

11.根据前述权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述所使用的蛋白酶是嗜酸的并且所述化学氧化剂为酸。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤ii)在步骤i)之后发生。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中添加了还原剂。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述还原剂选自：亚硫酸盐(例如Na₂SO₃和NaHSO₃)、亚硫酸氢盐、连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、二氧化硫、硫化物、二氧化硫、DTT和β-巯基乙醇。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中反应步骤i)在受控的氧气水平下进行。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中还将表面活性剂用于工艺步骤i)。

17.根据权利要求13所述的方法，其中所述表面活性剂选自以下中的一者或多者：癸酸钠；Triton-X-100；吐温20；吐温80；卵磷脂；聚氧乙烯硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐三硬脂酸酯；磷脂酸铵；脂肪酸的钠盐、钾盐或钙盐；脂肪酸的镁盐；脂肪酸的单和二甘油酯的乙酸酯；脂肪酸的单和二甘油酯的乳酸酯；脂肪酸的单和二甘油酯的柠檬酸酯；脂肪酸的单和二甘油酯的单和二乙酰基酒石酸酯；脂肪酸的蔗糖酯；蔗糖甘油酯；脂肪酸的聚甘油酯；聚甘油聚蓖麻酸酯；脂肪酸的丙烷-1，2-二醇酯；与脂肪酸的单和二甘油酯相互作用的热氧化大豆油；硬脂酰-2-乳酸钠；硬脂酰-2-乳酸钙；山梨醇酐单硬脂酸酯；山梨醇酐三硬脂酸酯；山梨醇酐单月桂酸酯；山梨醇酐单油酸酯和山梨醇酐单棕榈酸酯。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述角蛋白材料包括以下中的一者或多者：家禽羽毛、毛发、毛皮、兽蹄、指/趾甲和羊毛。

19.根据权利要求15所述的方法，其中所述角蛋白材料包括羽毛或机械切碎的羽毛。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶为选自以下的属中的一者或多者：芽孢杆菌属(Bacillus)、曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、沙雷氏菌属(Serratia)和拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶得自芽孢杆菌属(Bacillus)。

22.一种制备动物饲料的方法，包括将通过根据前述权利要求中任一项所述的方法制备的角蛋白水解产物与一种或多种动物饲料组成组分混合。

23.酶水解和化学水解的组合用于降解角蛋白的用途，其中所述酶水解发生于所述化学水解之前和/或期间。

24.酶水解和化学水解的组合用于降解角蛋白的用途，其中所述化学水解将所述pH调节至用于所述酶水解的所述蛋白酶在其下发生水解的pH。

25.通过根据权利要求1至21中任一项所述的方法制备的角蛋白水解产物在动物饲料中的用途。

26.通过根据权利要求1至21中任一项所述的方法制备的角蛋白水解产物。

27.一种饲料添加剂组合物，其包含根据权利要求26所述的角蛋白水解产物。

28.一种饲料，其包含根据权利要求26所述的角蛋白水解产物。

29.一种方法，其是如本文结合实施例和附图充分描述的。

30.一种用途，其是如本文结合实施例和附图充分描述的。

31.一种产品，其是如本文结合实施例和附图充分描述的。