CN110312519A - 毛发防脱或毛发促生用注射用组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种包含角蛋白的毛发防脱或毛发促生用注射用药学组合物，上述组合物的毛囊生成以及毛发促生效果非常优秀，能够有效地作为毛发脱落的预防以及治疗剂或毛发促生剂使用。
Description
技术领域
本申请主张基于2017年01月31日的韩国专利申请第10-2017-0014047号的优先权利益，在相应的韩国专利申请文献中公开的所有内容属于本说明书的一部分内容。
本发明涉及一种包含角蛋白的毛发防脱或毛发促生用注射用组合物。
背景技术
毛发脱落是指在正常情况下应有毛发生长的部分没有生长出毛发的状态，已知其最主要的原因为遗传性因素。最近随着社会压力的增加，因为环境污染、方便食品等西方化的饮食习惯、频繁的烫发以及染色、错误的头皮管理等原因而导致的毛发脱落人群的数量也正在逐渐增加。但是，直至目前为止并没有能够查明导致毛发脱落的明确原因，而且最近受到毛发脱落症状困扰的人群数量正在逐渐增加且其年龄段也呈现出了年轻化的趋势。
而且，直至目前为止并没有能够研发出毛发脱落症状的效果显著的治疗方法，在东医宝鉴中记载有如神应养真丹等与毛发脱落相关的若干种口服处方，此外还有如利用胡麻油(芝麻)等对毛发脱落部位进行按摩的方法、将特定的中药处方浸泡到酒中之后进行涂抹的方法、对特定穴位进行刺激的方法等，但是其疗效具有很大的个人差异。此外，直至目前为止并没有与可普遍适用的新药材料相关的报告。
作为现有的毛发脱落症状的治疗方法，包括与荷尔蒙学说相关的以女性荷尔蒙作为主材料的制剂，但是因为有与出现皮肤炎症、荷尔蒙给药所导致的副作用等相关的报告，因此目前已经停止使用。作为最近使用的最具代表性的毛发生长剂，包括最初作为血液循环促进用途开发使用但因为在所使用的患者当中出现了毛发生长的副作用而在后来作为毛发生长原料由美国食品药品监督管理局(FDA)批准作为毛发生长治疗剂使用的美国专利第3,382,247号中的米诺地尔(6-Amino-1,2-dihydro-1-hydroxy-2-imino-4-phenoxypyrimidine，6-氨基-1,2-二氢-1-羟基-2-亚氨基-4-苯氧基嘧啶)以及在美国专利第5,215,894号中提及的默克公司的非那雄胺(finasteride)。
但是，米诺地尔的使用感较为粘稠且有报告指出其具有诱发皮肤刺激的副作用，而非那雄胺目前以口服用制剂形态使用，但有报告指出其摄入会导致如性功能障碍等副作用，而为了实现毛发防脱，必须长时间持续服用才能够呈现出一定的效果。
因此，需要开发出一种能够替代现有的毛发生长剂且毛发防脱以及毛发促生效果优秀的新型的治疗剂。
先行技术文献
专利文献
(专利文献1)美国专利第3,382,247号
(专利文献2)美国专利第5,215,894号
专利内容
本发明人在为了解决如上所述的现有问题而持续性地对能够替代现有毛发生长剂的新型治疗剂进行研究的过程中，确认了角蛋白能够促进毛发的生长并防止毛发的脱落，进而确认了在将角蛋白向皮肤组织进行注射时与涂布在皮肤上的方式相比，其毛发促生以及毛发防脱效果更加优秀，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于提供一种包含角蛋白的毛发防脱或毛发促生用注射用药学组合物。
为了达成上述目的，适用本发明的一实施例提供一种包含角蛋白的毛发防脱或毛发促生用注射用药学组合物。
在适用本发明的一实施例中，上述角蛋白能够是水解角蛋白或结合到水溶性聚合物的角蛋白。
上述水解角蛋白的分子量能够是500至10,000道尔顿(Dalton)。
上述水溶性聚合物能够是从由透明质酸(hyaluronic acid)、聚乙二醇(PEG)、海藻酸(alginic acid)、果胶(pectin)、角叉菜胶(carrageenan)、硫酸软骨素(chondroitinsulfate)、硫酸葡聚糖(dextran sulfate)、酮酸、聚赖氨酸(polylysine)、胶原蛋白、明胶、羧甲基壳聚糖、纤维蛋白(fibrin)、葡聚糖(dextran)、琼脂糖(agarose)、支链淀粉(pullulan)、聚丙烯酰胺(PAAm)、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共-丙烯酸)(P(NIPAAm-co-AAc))、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共-甲基丙烯酸乙酯)(P(NIPAAm-co-EMA))、聚醋酸乙烯酯/聚乙烯醇(PVAc/PVA)、聚(N-乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸羟乙酯)(P(MMA-co-HEMA))、聚(聚乙二醇-共-缩氨酸)(P(PEG-copeptide))、海藻酸盐-g-(聚氧乙烯-聚环氧丙烷-聚氧乙烯)(alginate-g-(PEOPPO-PEO))、聚((聚乳酸-共-羟基乙酸)-共-丝氨酸)(P(PLGA-co-serine))、胶原蛋白-丙烯酸盐(collagenacrylate)、海藻酸盐-丙烯酸盐(alginate-acrylate)、聚(羟丙基甲基丙烯酰胺-g-缩氨酸)(P(HPMA-g-peptide))、聚(甲基丙烯酸羟乙酯/基质胶)(P(HEMA/Matrigel))、透明质酸-g-N-异丙基丙烯酰胺(HA-g-NIPAAm)、聚氧乙烯(PEO)、聚氧乙烯-聚环氧丙烷共聚物(PEO-PPO，Pluronic series)、聚氧乙烯-聚乳酸共聚物(PEO-PLA)、聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物(PEO-PLGA)、聚氧乙烯-聚已酸内酯共聚物(PEO-PCL)、聚氧乙烯烷基醚(polyoxyethylene alkyl ethers，BrijSeries)、聚氧乙烯蓖麻油衍生物(polyoxyethylene castor oil derivatives，Cremophores)、聚山梨酯(polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters,TweenSeries)以及硬脂酸聚氧乙烯酯(polyoxyethylene stearates)构成的组中选择的1种以上。
上述角蛋白能够促进毛发再生。
上述药学组合物能够增加从由β-连环蛋白(beta catenin)、性别决定Y染色体去高迁移组盒基因9(Sox-9)、性别决定Y染色体去高迁移组盒基因2(Sox-2)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)、白细胞分化抗原133(CD133)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、成纤维细胞生长因子10(FGF10)、重组人骨形态发生蛋白6(BMP6)、P-钙粘蛋白(P-cadherin)、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、肌节同源盒2(MSX2)、叉头框蛋白N1(FOXN1)以及白细胞分化抗原10(CD10)构成的组中选择的1种以上的表达量。
上述药学组合物能够被给药到真皮层或皮下组织。
上述药学组合物还能够包含经皮吸收促进剂(penetration enhancer)。
上述经皮吸收促进剂能够是从由亚砜(sulphoxide)、氮酮(azone)、吡咯烷酮(pyrrolidone)、脂肪酸、碳原子数为1至4的低级醇、碳原子数为6以上的高级脂肪醇(fattyalcohol)、乙二醇(glycol)、尿素(urea)、萜烯(terpene)、萜类化合物(terpenoid)以及磷脂(phospholipid)构成的组中选择的1种以上。
上述水解角蛋白，能够通过包括：S1)使水解酶与角蛋白发生反应的步骤；以及，S2)对上述水解酶进行去除的步骤；的水解角蛋白的制造方法进行制造。
上述水解酶能够是蛋白酶-K。
上述水解酶能够被固定到小珠中。
上述水解角蛋白的制造方法，在上述第S2)步骤之后，还能够包括：S3)对水解酶的活性进行去除的步骤。
适用本发明的包含角蛋白的注射用药学组合物，能够促进毛发的生长以及毛囊的形成。
此外，适用本发明的包含角蛋白的注射用药学组合物，在向皮肤组织进行注射时与涂布在皮肤上的方式相比，其毛发促生以及毛发防脱效果更佳优秀。
因此，适用本发明的药学组合物能够作为毛发防脱或毛发促生用的治疗剂使用。
附图说明
图1是对聚乙二醇化的角蛋白进行核磁共振(NMR)分析的数据。
图2是对在向去除毛发之后的老鼠注射实施例1至实施例6并经过2周之后的毛发生长效果进行图示的示意图。
图3是对在向去除毛发之后的老鼠注射实施例1至实施例6并经过2周之后通过利用苏木精-伊红进行染色而对毛囊的形成程度进行图示的示意图。
图4是对在向去除毛发之后的老鼠注射实施例1至实施例6并经过2周之后的毛发生长的各个阶段中的毛囊形成数量进行图示的图表。
图5是对在向去除毛发之后的老鼠注射实施例1至实施例6并经过2周之后形成的毛囊的大小进行图示的图表。
图6是用于对所制造出的水解角蛋白与天然角蛋白的分子量的不同进行确认的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果照片。
图7是用于对在利用角蛋白对人类毛乳头细胞进行处理时的细胞增殖的抑制进行确认的示意图。
图8是用于对在利用角蛋白对人类毛乳头细胞进行处理时通过对与细胞的相互作用进行分析而对细胞表面上的角蛋白粘附进行确认并借此对角蛋白所诱导的细胞集合体的形成进行确认的照片。
图9是对在利用角蛋白对人类毛乳头细胞进行处理时的与细胞的增殖相关的信使核糖核酸(mRNA)的表达的抑制以及与细胞的迁移、细胞集合体的诱导以及细胞外基质的合成相关的信使核糖核酸(mRNA)的表达的增加进行图示的示意图。
图10是用于对在利用角蛋白对人类毛乳头细胞进行处理时的已知毛发生长诱导因子即成纤维细胞生长因子7(FGF7)、成纤维细胞生长因子10(FGF10)以及重组人骨形态发生蛋白6(BMP6)的分子表达的增加进行确认的示意图。
图11是用于对在利用角蛋白对人类外毛根鞘细胞进行处理时的与细胞的迁移以及分化成基质细胞(Matrix cell)相关的因子即β-连环蛋白(beta catenin)以及P-钙粘蛋白(P-cadherin)的表达的增加和分化时的表达减少的分子即白细胞分化抗原34(CD34)的表达的减少进行确认的照片。
图12是用于对在利用角蛋白对人类外毛根鞘细胞进行处理时的与分化成基质细胞(Matrix cell)相关的因子即肌节同源盒2(MSX2)、叉头框蛋白N1(FOXN1)以及急性成淋巴细胞性白血病共同抗原(CD10)的基因表达的增加和分化时的表达减少的分子即角蛋白5(KRT5)以及整合素α6(ITGA6)的基因表达的减少进行确认的图表。
图13是用于对在利用水解角蛋白对外毛根鞘进行处理时的与细胞的迁移以及克隆的活性相关的因子即β-连环蛋白(beta catenin)分子以及参与干细胞特性(stemness)的性别决定Y染色体去高迁移组盒基因9(Sox-9)分子的表达的增加进行确认的示意图。
图14是对在利用水解角蛋白对外毛根鞘细胞进行处理时的参与干细胞特性的性别决定Y染色体去高迁移组盒基因9(Sox-9)基因以及β-连环蛋白基因的表达的增加进行图示的图表。
图15是用于对在利用水解角蛋白对外毛根鞘细胞进行处理时的β-连环蛋白分子的表达达到4倍以上进行确认的示意图。
图16是用于对在利用水解角蛋白对人类毛乳头细胞进行处理时的与毛发再生以及干细胞特性相关的细胞集合体(cell aggregate)的形成增加5倍以上进行确认的示意图。
图17是用于对在利用水解角蛋白对人类毛乳头细胞进行处理时的由碱性磷酸盐细胞表达的水解酶(alkaline phosphatase，碱性磷酸酶)的活性的增加进行确认的照片。
图18是用于对在利用水解角蛋白对人类毛乳头细胞进行处理时的毛发再生以及干细胞特性因子即β-连环蛋白、性别决定Y染色体去高迁移组盒基因2(Sox-2)、水解酶(alkaline phosphatase，碱性磷酸酶，ALPase)、白细胞分化抗原133(CD133)、成纤维细胞生长因子7(FGF-7)以及成纤维细胞生长因子10(FGF-10)分子的表达的增加进行确认的照片。
具体实施方式
本发明提供一种包含角蛋白(keratin)的毛发防脱或毛发促生用注射用药学组合物。
上述角蛋白能够是构成如头发、羊毛、羽毛、角、指甲、马蹄等的真性角蛋白，也能够是存在于如皮肤、神经组织等中的角蛋白。
此外，上述角蛋白能够包含如谷氨酸、精氨酸、胱氨酸等氨基酸，尤其是能够包含高含量的胱氨酸。
上述角蛋白能够是商业上可用的任意的角蛋白，能够是加工成可溶解于水或水溶性溶剂中的形态，较佳地能够是源自于人类头发的角蛋白，分子量能够是40,000至70,000道尔顿(Dalton)。
上述角蛋白能够是水解角蛋白或结合到水溶性聚合物的角蛋白。
上述水解角蛋白是能够在维持角蛋白的性质的同时通过使不溶性的天然角蛋白发生分解而呈现出水溶性的蛋白质，能够与源自于角蛋白的缩氨酸混合使用。上述水解角蛋白能够通过利用酸、碱、氧或水解酶对角蛋白进行水解的方式进行制造，但是并不限定于此，能够通过从天然角蛋白制造出分子量为500至10,000道尔顿的水解角蛋白的通常方法获取。
上述水解角蛋白，能够通过包括：S1)使水解酶与角蛋白发生反应的步骤；以及，S2)对上述水解酶进行去除的步骤；的水解角蛋白的制造方法进行制造。
上述第S1)步骤，是利用水解酶从角蛋白制造出水解角蛋白的步骤。
其中，水解酶是在对酶进行系统分类时被分类为可以对水解反应进行催化的酶的集合，能够根据作用对象分类为9个组。
在上述水解酶是在角蛋白属于蛋白质的特性基础上，能够对天然角蛋白进行水解的酶，较佳地能够是作用于缩氨酸结合的酶。具体来讲，上述作用于缩氨酸结合的酶，能够是从包含亮氨酸氨基肽酶、羧肽酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶以及糜蛋白酶的蛋白分解酶中选择的某一个。较佳地能够是蛋白酶-K(proteinase-K)，但是并不限定于此。
在上述水解角蛋白的制造方法中，当上述第S1)步骤缺失或执行不完整时，能够呈现出毛发防脱或毛发促生效果的水解角蛋白的获取量可能会变少。
接下来，上述第S2)步骤是从水解酶与水解角蛋白的混合物中获取水解角蛋白的步骤。上述水解酶能够被固定到小珠中。如利用上述小珠的磁性差异、利用重量差异或利用粘附与否差异等，能够通过小珠的物理/化学性质从水解角蛋白中分离出水解酶。
上述小珠能够是从由聚-L-乳酸(PLLA)、聚-乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚氨酯(PU)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯(PE)以及磁铁(Ferromagnetite)构成的组中选择的1种以上，但是并不限定于此。具体来讲，上述小珠能够是琼脂糖小珠。
在上述水解角蛋白的制造方法中，当上述第S2)步骤缺失或执行不完整时，能够呈现出毛发促生或毛发防脱效果的水解角蛋白的纯度可能会变低。
此外，上述水解角蛋白的制造方法，在上述第S2)步骤之后，还能够包括：S3)对水解酶的活性进行去除的步骤。
上述第S3)步骤的目的在于通过对水解酶的活性进行去除而停止角蛋白的水解反应，为了防止水解酶与角蛋白发生反应，能够在较高的温度下放置几个小时。
在上述水解角蛋白的制造方法中，通过包括上述第S3)步骤，能够提升水解角蛋白的纯度并获取分子量均匀的水解角蛋白。
作为一实例，上述水解角蛋白能够通过将人类头发投入到以2:1的比例混合氯仿与甲醇的混合液中而去除脂质，接下来在2％的过氧乙酸溶液中进行12小时的搅拌之后投入到5％的2-巯基乙醇、5M的尿素、2.6M的硫代尿素以及25nM的三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)(pH 8.5)中并在50下进行72小时反应的方式获取，但是并不限定于此。
在本发明中，上述水溶性聚合物能够是从由透明质酸(hyaluronic acid)、聚乙二醇(PEG)、海藻酸(alginic acid)、果胶(pectin)、角叉菜胶(carrageenan)、硫酸软骨素(chondroitin sulfate)、硫酸葡聚糖(dextran sulfate)、酮酸、聚赖氨酸(polylysine)、胶原蛋白、明胶、羧甲基壳聚糖、纤维蛋白(fibrin)、葡聚糖(dextran)、琼脂糖(agarose)、支链淀粉(pullulan)、聚丙烯酰胺(PAAm)、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共-丙烯酸)(P(NIPAAm-co-AAc))、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共-甲基丙烯酸乙酯)(P(NIPAAm-co-EMA))、聚醋酸乙烯酯/聚乙烯醇(PVAc/PVA)、聚(N-乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸羟乙酯)(P(MMA-co-HEMA))、聚(聚乙二醇-共-缩氨酸)(P(PEG-co-peptide))、海藻酸盐-g-(聚氧乙烯-聚环氧丙烷-聚氧乙烯)(alginate-g-(PEOPPO-PEO))、聚((聚乳酸-共-羟基乙酸)-共-丝氨酸)(P(PLGA-co-serine))、胶原蛋白-丙烯酸盐(collagenacrylate)、海藻酸盐-丙烯酸盐(alginate-acrylate)、聚(羟丙基甲基丙烯酰胺-g-缩氨酸)(P(HPMA-g-peptide))、聚(甲基丙烯酸羟乙酯/基质胶)(P(HEMA/Matrigel))、透明质酸-g-N-异丙基丙烯酰胺(HA-g-NIPAAm)、聚氧乙烯(PEO)、聚氧乙烯-聚环氧丙烷共聚物(PEO-PPO，Pluronicseries)、聚氧乙烯-聚乳酸共聚物(PEO-PLA)、聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物(PEO-PLGA)、聚氧乙烯-聚已酸内酯共聚物(PEO-PCL)、聚氧乙烯烷基醚(polyoxyethylene alkylethers，Brij Series)、聚氧乙烯蓖麻油衍生物(polyoxyethylene castor oilderivatives，Cremophores)、聚山梨酯(polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters,Tween Series)以及硬脂酸聚氧乙烯酯(polyoxyethylene stearates)构成的组中选择的1种以上。较佳地能够是聚乙二醇或透明质酸，但是并不限定于此。
在本发明中，上述聚乙二醇能够是如O-甲基-O'-琥珀酰基聚乙二醇、二元酸聚乙二醇、α,ω-双(2-羧乙基-聚乙二醇)、O,O'-双(2-溴乙基)聚乙二醇、O,O'-双(2-氯乙基)聚乙二醇、聚乙二醇二甲酸、聚乙二醇单甲醚乙酸、O-[2-(3-琥珀酰胺基)乙基]-O'-甲基-聚乙二醇、O-(2-溴乙基)-O'-甲基聚乙二醇、O-(2-氯乙基)-O'-甲基聚乙二醇、聚乙二醇单甲基醚甲硫酸(mesylate)、乙醛官能化的聚乙二醇、缩水甘油醚官能化的聚乙二醇、硝基苯基碳酸酯聚官能化的乙二醇、甲磺酰基(Mesyl)官能化的聚乙二醇或甲苯磺酰基(Tosyl)官能化的聚乙二醇，较佳地能够是O-甲基-O'-琥珀酰基聚乙二醇。
上述水溶性聚合物的分子量能够是1000Da至4000kDa，较佳地能够是2000Da至3000kDa。作为较佳的实例，能够是1000kDa至4000kDa的透明质酸或1000Da至20000Da的聚乙二醇。
上述角蛋白能够促进毛发再生。
具体来讲，上述角蛋白能够通过对人类外毛根鞘细胞或毛乳头细胞的生长以及细胞的集合(aggregation)进行诱导而促进毛发再生。
在本发明中说提及的“毛发促生”是指对“毛发的生长”和/或“毛发的再生”进行促进，“毛发再生”是指通过对人类外毛根鞘细胞或毛乳头细胞的生长或细胞的集合进行诱导而最终防止毛发轻易地发生脱落，具体是指通过在毛发生长的初始阶段即生长期(anagenstage)对毛囊的形成进行促进并对新毛囊的形成进行诱导而使得毛发再生。同时，还包括参与人类外毛根鞘细胞的迁移以及克隆的活性或干细胞特性的表达因子的增加。
此外，适用本发明的药学组合物能够增加包含于人类外毛根鞘细胞或毛乳头细胞内的对毛发再生以及毛发生长进行诱导的基因的表达量。
上述基因能够是从由β-连环蛋白(beta catenin)、性别决定Y染色体去高迁移组盒基因9(Sox-9)、性别决定Y染色体去高迁移组盒基因2(Sox-2)、碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase)、白细胞分化抗原133(CD133)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、成纤维细胞生长因子10(FGF10)、重组人骨形态发生蛋白6(BMP6)、P-钙粘蛋白(P-cadherin)、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、肌节同源盒2(MSX2)、叉头框蛋白N1(FOXN1)以及白细胞分化抗原10(CD10)构成的组中选择的1种以上。
上述β-连环蛋白是通过接收细胞外因子(Wnt)蛋白质的信号并迁移到细胞核内部而对与细胞的增殖以及分化相关的靶基因的表达进行调节的信号传递物质，是包含于将生长成毛发的干细胞中的物质，是与细胞的迁移以及克隆活性相关的物质。
上述性别决定Y染色体去高迁移组盒基因9(Sox-9)是参与干细胞特性(stemness)的物质，是在毛发的外毛根鞘(outer root sheath，ROS)以及皮脂腺(sebaceous gland)细胞的核内表达的基因。
上述性别决定Y染色体去高迁移组盒基因2(Sox-2)在胚胎干细胞中大量表达，不仅对维持胚胎干细胞的全能性起到重要的作用，也是构成诱导性多能干细胞的因子中的一个，同时还是对维持干细胞的性质起到重要功能的物质。
上述碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)是酶的一种，是以多种同功酶存在于身体的多个部位的物质，是在毛发的生成过程中参与毛发基质(hair matrix)内的血管新生的物质，是在毛发生长时活性增加的物质。
上述白细胞分化抗原133(CD133)存在于细胞外膜，已知是在细胞生长时诱导表达的蛋白质，是CD(Cluster of Differentiation，分化抗原)系列的蛋白质，是能够呈现出毛囊干细胞的免疫学特性的物质。
上述成纤维细胞生长因子7(FGF7)是角质细胞生长因子，是通过渗透到位于表皮下方的真皮中而强力促进角质细胞的生长以及增殖的物质。
上述成纤维细胞生长因子10(FGF10)是纤维原细胞生长因子，是通过渗透到位于表皮下方的真皮中而强力促进纤维原细胞的生长以及增殖的物质。
上述重组人骨形态发生蛋白6(BMP6)是用于在包含神经细胞在内的多种类型的细胞中对生物学活性进行调节的蛋白质，是通过诱导人类毛乳头细胞的集合体的形成而对毛发生长进行诱导的因子。
上述P-钙粘蛋白(P-cadherin)以及E-钙粘蛋白(E-cadherin)是钙粘蛋白(cadherin)类的蛋白质，用于细胞的粘附，还具有通过与肌动蛋白细胞骨架连接而帮助其装配的功能，是起到使细胞的基因表达发生变化的信号传递分子作用的蛋白质，是与人类外毛根鞘细胞的迁移以及分化成基质细胞(Matrix cell)相关的因子。
上述肌节同源盒2(MSX2)、叉头框蛋白N1(FOXN1)以及白细胞分化抗原10(CD10)是与将人类外毛根鞘细胞分化成基质细胞(Matrix cell)相关的因子。
上述药学组合物能够通过增加人类外毛根鞘细胞内的β-连环蛋白或性别决定Y染色体去高迁移组盒基因9(Sox-9)而对人类外毛根鞘细胞的迁移以及克隆的活性进行诱导。
上述药学组合物能够促进人类毛乳头细胞的细胞集合体(cell aggregate)的形成并通过提升细胞集合体的形成而对毛发生长进行诱导并提升毛发再生效果。
上述药学组合物能够通过增加人类毛乳头细胞内的β-连环蛋白、性别决定Y染色体去高迁移组盒基因2(Sox-2)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)、白细胞分化抗原133(CD133)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)以及成纤维细胞生长因子10(FGF10)的表达而提升人类毛乳头细胞的干细胞特性。
在适用本发明的具体的一实施例中，在剔除身体功能下降的老龄老鼠的背部部分毛发之后注射了角蛋白溶液并对其毛发的生长密度以及毛囊的形成进行了分析。通过其结果可以确认，角蛋白促进了毛囊的形成以及毛发的再生。借此，可以得知角蛋白能够作为毛发防脱或毛发促生用注射用药学组合物使用。
在本发明中，术语“注射”是指利用注射器将药液注入到如皮内、皮下、肌肉内、静脉内或动脉内等。具体来讲，在适用本发明的药学组合物呈现出毛发防脱或毛发促生功效的特性基础上，上述注射能够是皮下注射，但是并不限定于此。上述注射器不仅能够使用可通过针头进行药液给药的一般的注射器，只要是能够将适用本发明的药学组合物给药到皮下的注射器，就能够不受限制地进行使用。
在本发明中，上述注射用药学组合物能够是液态制剂或干燥粉末形态。上述注射用干燥粉末能够在向患者进行给药时与从由注射用水、生理食盐水、葡萄糖液以及氨基酸液构成的组中选择的1种以上进行重组之后给药到对象个体。
适用本发明的组合物中所包含的活性成分的量会根据给药对象个体的状态、目标治疗程度等发生变化。具体来讲，适用本发明的角蛋白相对于注射用药学组合物能够包含0.001至10(w/v)％浓度，具体来讲能够包含0.01(w/v)％至5(w/v)％浓度，更具体来讲能够包含0.05至2(w/v)％浓度。
当上述角蛋白的浓度小于0.001(w/v)％时，可能会导致毛发防脱或毛发促生效果不足的问题，而当大于10(w/v)％时，可能会引起体内副作用。
在本发明中，上述组合物还能够包含经皮吸收促进剂(penetration enhancer)。
上述药学组合物能够局部给药到希望实现毛发防脱或毛发促生的部位，较佳地能够给药到真皮层或皮下组织。此时，真皮层是表皮下方的最后的层，由血管系统、神经系统、淋巴系统复杂地互相缠绕在一起，是毛囊生成以及生长的层并包含毛乳头。
上述皮下组织是位于真皮层下方的肌肉与骨骼之间的部分，因为有包含大量脂肪的脂肪细胞存在，因此能够使人体变得柔软、塑造人体轮廓并作为能量源使用。此外，还有动脉以及淋巴液循环。
上述经皮吸收促进剂能够是从由亚砜(sulphoxide)、氮酮(azone)、吡咯烷酮(pyrrolidone)、脂肪酸、碳原子数为1至4的低级醇、碳原子数为6以上的高级脂肪醇(fattyalcohol)、乙二醇(glycol)、尿素(urea)、萜烯(terpene)、萜类化合物(terpenoid)以及磷脂(phospholipid)构成的组中选择的1种以上。但是并不限定于此，还能够包含用于在注射用药学组合物中促进活性成分的经皮吸收的通常的促进剂。
上述亚砜能够是从由二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、二甲基乙酰胺(dimethyl acetamide，DMAC)、二甲基甲酰胺(dimethyl formamide，DMF)以及癸基甲基亚砜(decylmethyl sulfoxide，DCMS)构成的组中选择的1种以上，但是并不限定于此。
上述吡咯烷酮(pyrrolidione)能够是从由N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)以及2-吡咯烷酮(2P)构成的组中选择的1种以上，但是并不限定于此。
上述氮酮(azone)能够是1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮(1-dodecylazacycloheptan-2-one)或月桂氮酮(laurocapram)。
上述经皮吸收促进剂能够根据所使用的种类包含注射用组合物中通常容许的量。
适用本发明的药学组合物能够为了毛发防脱或毛发促生而单独使用或与使用荷尔蒙治疗、化学治疗以及生物学反应调节剂的方法并行使用。
本发明提供一种毛发防脱或毛发促生方法，包括：制造出包含角蛋白的注射用药学组合物的步骤；以及，将上述注射用药学组合物给药到个体的步骤。
上述“给药”是指利用适当的方法将特定的物质导入到个体中。在本发明中，在通过将上述组合物注射到个体中而实现毛发防脱或毛发促生效果的特性基础上，上述给药能够是真皮层或皮下组织给药。
适用本发明的药学组合物能够根据包含所使用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般的健康状态、性别、饮食状态、给药时间、给药路径、排出率、药物组合以及需要预防或治疗的特定疾病的严重程度等的各种因素进行多种变化，上述药学组合物的给药量能够根据患者的状态、体重、疾病程度、药物形态、给药路径以及期间而发生变化并由相关从业人员做出适当选择，能够以每天0.0001至100mg/kg或0.001至100mg/kg的量进行给药。给药时能够每天进行1次给药或分成多次进行给药。上述给药量在任何方面都不是为了对本发明的范围进行限定。此外，能够根据人体所需要的毛发生长面积变更给药容量以及浓度，较佳的组合物的浓度能够是0.1至100mg/ml，但是并不限定于此。
上述“个体”是指已经发生或可能发生毛发脱落症状的包含人类的如老鼠、大鼠以及家畜等所有动物。具体来讲，能够是包含人类的哺乳动物。
接下来，为了便于理解本发明，将对较佳的制造例以及实施例进行介绍。但是，下述制造例以及实施例只是为了方便理解本发明而提供，本发明的内容并不因此而受到限定。
制造例1：角蛋白的获取在利用弱性洗剂将人类头发清洗干净之后再利用蒸馏水清洗多次。为了去除脂质，在将头发投入到烧杯中之后投入以2:1的比例混合氯仿与甲醇的混合液直至头发被完全浸没。在24小时之后利用蒸馏水进行多次清洗直至没有用于去除脂质的溶液残留，接下来将头发晾干（air-dry）。将20g的头发投入到800mL的2%过氧乙酸溶液（Sigma aldrich）中，然后在37℃下以300rpm的速度进行12小时的搅拌。在12小时之后利用筛子对头发进行过滤并利用蒸馏水进行清洗，从而去除所残留的氧化物。在将头发投入到400mL的Shindai溶液（5%的2-巯基乙醇、5M的尿素、2.6M的硫代尿素（以上均为Sigmaaldrich）以及25nM的三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl）（pH8.5））中之后，在50℃、400rpm的条件下进行72小时的反应。接下来，将头发溶液投入到50mL的管中并以3500rpm的速度进行20分钟的离心分离。早收集上清液之后利用12-14kDa截留Spectra/4透析膜（Spectrum）进行透析。通过对完成透析的角蛋白液体样本进行冻结干燥而制造出角蛋白粉末。制造例2：水解角蛋白的制造首先，将单蒸水（dH2O）投入到配备有螺帽的聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate）材质的褐色药瓶（10ml，22*48）中，接下来在pH9.0、30℃的条件下以2mg/ml的浓度投入20mg的源自于白色念球菌(Tritirachium album)的蛋白酶-K(Proteinase-K，固定于C，Sigma-Aldrich)进行溶解。在上述蛋白酶-K全部溶解之后，利用精密电子天平(0.001g～620g，AJ-620E)称量出400mg的通过上述制造例1制造出的角蛋白粉末并投入到上述药瓶中。在将上述药瓶投入到数码干燥箱(Digital dryingoven)中之后，利用鸡蛋形状的白色5×2mm的磁力搅拌棒([B00C3ME4ZA]，1572500IKAFLON40，IKA)和移动式MS-H-S10型10-通道(Channel)磁力搅拌器在30℃下以300rpm的速度进行1小时的搅拌。将完全水解角蛋白(hydrolyzed keratin)溶液投入到离心分离机中并在250g条件下运行10分钟，从而使固定有蛋白酶-K的C发生沉淀并将其去除。在收集上清液之后将各10μl的上清液分别投入到各个聚合酶链反应(PCR)管中。通过将上述管在CFX96 TouchTM实时聚合酶链反应(Real-Time PCR)检测系统装置中以99℃煮沸1小时而去除蛋白酶-K的活性。通过对水解角蛋白液体样本进行冻结干燥而制造出水解角蛋白粉末。
制造例3：聚乙二醇化角蛋白(PEGylated Keratin)的制造
制造例3-1：聚乙二醇化角蛋白的合成
首先，利用精密电子天平(0.001g～620g，AJ-620E)称量出0.5g的通过上述制造例1制造出的角蛋白粉末并投入到500mL的派莱克斯耐高温烧杯(ISOLAB，YLS，德国)中。在向烧杯投入100mL的三蒸水之后，利用40×8mm的磁力搅拌棒([B00C3ME4ZA]，1572500IKAFLON 40，IKA)和MS-H-S10型10-通道(Channel)磁力搅拌器以300rpm的速度进行24小时的搅拌。
将300mg的聚乙二醇单甲醚改性的O-甲基-O'-琥珀酰基聚乙二醇5000(mPEG，17929-5G-F，Lot#R063737/2V，Sigmaaldrich)投入到20mL的三蒸水中进行1小时的溶解。向聚乙二醇单甲醚改性的O-甲基-O'-琥珀酰基聚乙二醇5000(mPEG)溶液投入16mg的4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)4-甲基氯化吗啉盐(DMTMM)n-水合物(327-53752，wakochemical)并进行1小时的搅拌。在将角蛋白溶液与聚乙二醇单甲醚改性的O-甲基-O'-琥珀酰基聚乙二醇5000(mPEG)以及4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)4-甲基氯化吗啉盐(DMTMM)的结合溶液投入到500mL烧杯中之后，利用40×8mm的磁力搅拌棒(1572500IKAFLON 40，IKA)和MS-H-S10型10-通道(Channel)磁力搅拌器在室温条件下以300rpm的速度进行3天的搅拌，从而使聚乙二醇(PEG)与角蛋白发生反应。
制造例3-2：聚乙二醇化角蛋白的纯化
在制造例3-1的反应结束之后，将各100mL的聚乙二醇化角蛋白溶液分别投入到各个Spectra/Por渗透膜管(直径16mm，平宽25mm，mV10000，Spectrum)中之后利用Spectra/Por RC透析管封口器(最大款55mm，Orange，Spectrum)封闭两侧的管。在向5L的塑料烧杯(直径197mm，高度265mm)倒入4L的三蒸水之后投入装有聚乙二醇化角蛋白溶液的管并利用磁力棒进行搅拌透析。在此过程中，每隔12小时更换新的三蒸水，在室温条件下历时3天共计更换6次三蒸水进行透析。在将各40mL的最终的聚乙二醇化角蛋白溶液分别投入到各个50mL离心管(17×120mm，BD Falcon)中之后，利用超低温冷库(Nihon freezer，Uprighttype，Single cooling type，542l)在-70℃条件下进行24小时的完全冻结处理。在打开离心管盖并投入到冻结干燥器(ALPHA 2-4 LSC PLUS，Laboratory freeze dryers，Christ)中之后在-85℃的真空状态下进行3天的干燥处理，使其完全成为粉末形态。接下来，通过核磁共振(NMR)对聚乙二醇化角蛋白进行分析。其结果如图1所示，可以确认在聚乙二醇化角蛋白中同时有分别在角蛋白以及聚乙二醇(PEG)中特异性出现的峰值存在。
制造例3-3：包含过氧化氢的聚乙二醇化角蛋白溶液的制造
利用精密电子天平(0.001g～620g，AJ-620E)称量出20mg的通过制造例3-2获取的聚乙二醇化角蛋白。接下来在通过将102μl的H2O2(30％过氧化氢，分子量为34.01，JUNSEICHEMICAL，7722-84-1)投入到898μl的三蒸水中而制造出1M的1mL溶液之后，利用蒸馏水连续稀释(serial dilution)至100倍和20倍，最终制造出500uM的H2O2溶液。向1mL的所制造出的500uM的H2O2溶液投入聚乙二醇化角蛋白(PEGylated Keratin)并进行5分钟的涡旋振荡，从而制造出包含500uM的H2O2的聚乙二醇化角蛋白溶液。利用气压式真空包装机即尼龙真空包装机150×200mm(NY/PELLDPE)(80um)对装有所制造出的溶液的玻璃瓶进行密封保管。
试验例1：动物试验中的毛发生长效果
试验例1-1：动物模型的准备
作为用于验证角蛋白的毛发生长效果的动物试验模型，使用了24只12周龄、体重为20-25g的C57BL/6J老龄老鼠(Charles River Corp.Inc.，Barcelona，西班牙)。利用异氟烷(isoflurane)对上述老鼠进行麻醉之后，利用理发剪(clipper)剔除了除休止期(telogen stage)毛乳头之外的毛发以及毛乳头。在利用聚乙烯吡咯酮碘(povidone-iodine)溶液对皮肤进行消毒之后再利用60％的酒精进行擦拭。
试验例1-2：角蛋白的毛发生长效果
按照如下述表1所示的条件向通过上述试验例1-1准备的老鼠的背部进行给药。作为正常对照组，适用在剔除毛发之后没有进行任何处理的老鼠。在饲养所有的老鼠2周之后，在第2周利用实体显微镜(SZX16，Olympus)对剔除毛发的部位进行观察。其结果如图2所示。
【表1】
通过其结果可以发现，上述实施例1至实施例6与正常对照组相比的毛发生长效果均非常优秀，在上述实施例1至实施例6中的毛发均匀生长，且在实施例1、实施例2以及实施例4中的毛发生长密度更加绵密。借此可以确认，在对角蛋白进行皮下内注射时与涂布在皮肤上的方式相比，其毛发生长效果更加优秀，而且适用本发明的包含角蛋白的注射用药学组合物具有毛发防脱以及毛发促生效果，且毛发防脱以及毛发促生效果更佳快速呈现。
此外，适用本发明的包含角蛋白的注射用药学组合物与通常的作为皮肤外用剂剂型涂布在皮肤上的方式相比，其毛发防脱以及毛发促生效果明显优秀，以注射剂剂型注射到皮下时的生物体利用率更高。
此外，通常在将剂型转换成并非皮肤外用剂的注射剂剂型时，在作为注射剂使用时与作为皮肤外用剂使用的方式相比，随着生物体利用率的增加，如毒性等副作用(sideeffect)也会随之增加，因此解决上述副作用也显得尤为重要。适用本发明的包含角蛋白的注射用药学组合物如上述图2所示，可以确认在对包含角蛋白的注射用药学组合物进行皮下注射时没有任何毒性，而且在皮下注射之后没有观察到因为与身体内的血液或水分发生反应而导致的副作用。
试验例1-3：对角蛋白的毛发生长效果的组织学分析
在完成试验例1-2之后，分别宰杀利用实施例1至实施例6的溶液进行给药的老鼠、正常对照组以及阳性对照组获取组织试片。利用苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，H&E)进行染色，其观察分析结果如图3至图5所示。
通过其结果可以确认，利用上述实施例1至实施例6的角蛋白溶液进行给药的老鼠与正常对照组相比，其毛囊(hair follicle)的形成频度非常高(图3)。尤其是利用实施例1至实施例4的角蛋白以及水解角蛋白溶液进行给药的老鼠与利用实施例5至实施例6的聚乙二醇化角蛋白溶液进行给药的老鼠相比，其毛囊的大小有所增加。具体来讲，如图4所示，根据按照毛发生长的各个阶段进行分析的结果可以发现在毛发生长的初始阶段即生长期(anagen stage)中的毛囊形成得到促进，借此可以确认新毛囊的形成得到诱导(图4)。此外，随着像老鼠进行给药的角蛋白溶液浓度的提升，呈现出了毛囊的直径大小变大的倾向(图5)。
试验例2：水解角蛋白的确认
通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对在制造例2中是否制造出水解角蛋白进行确认，其结果如图6所示。
具体来讲，将plus2预染色标准品(Pre-Stained Standard)(novex)大小标准参照物放置在室温状态并进行涡旋振荡直至溶液被完全混合。对将10μl的BoltTM十二烷基硫酸锂上样缓冲液(LDS Sample Buffer)(4×)、4ul的BoltTM十二烷基硫酸锂还原剂(LDS Reducing Agent)(10×)以及26ul的4％水解角蛋白进行混合的共计40μl的样本进行涡旋震荡。通过将加热块(HYSC_Introduction_Heating Block_2014)的温度设定为100℃并进行10分钟的加热处理而制备出水解角蛋白样本。在去除Bolt双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷(Bis-Tris)4-12％梯度迷你凝胶(gradient mini gel)(Invitrogen)的电泳梳(comb)部分之后利用1×MES电泳缓冲液对加样孔进行洗涤，接下来去除试剂盒末端部分的覆盖带。在对样本进行加样之前利用1×MES电泳缓冲液填充上述试剂盒的盒体(chamber)并利用试剂盒夹锁紧以防止缓冲液发生泄漏。在对样本进行加样时向加样孔填充1×MES电泳缓冲液。利用30μl的4％水解角蛋白样本以及10μl的plus2预染色标准品(Pre-Stained Standard)(novex)大小标准参照物分别进行加样。作为对照组使用0.012、0.015、0.020mg/600μl的PAA角蛋白样本。在利用1×MES电泳缓冲液填充至试剂盒的外侧刻度之后利用大小标准参照物以及4％水解角蛋白样本进行加样，接下来在165V条件下利用PowerPacTM基础电泳仪电源(Basic Power Supply)(Bio-rad)进行40分钟的电泳处理。在完成电泳之后松开试剂盒夹并获取经过电泳处理的凝胶，然后利用考马斯亮蓝(Comassiebrilliant blue)G-250(Sigma)进行24小时的染色处理。利用脱色溶液(Destainsolution；10％(v/v)乙酸，40％(v/v)甲醇)进行清洗直至能够观察到谱带，接下来对大小标准参照物和蛋白质进行确认。
其结果如图6所示，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的分析结果中提取出的天然角蛋白在约50k道尔顿(dalton)的分子量水平上呈现出蛋白质谱带，而水解角蛋白在约3-6k道尔顿的分子量水平上呈现出弥散(smear)的谱带。借此可以得知，水解角蛋白是由多种分子量的分解缩氨酸构成。
试验例3：在实验室阶段(in vitro，体外)中角蛋白对人类毛乳头细胞(DemalPapilla Cell，毛乳头细胞)的细胞集合体诱导以及毛发生长参与因子的表达诱导
为了确认角蛋白的毛发再生效果，对与毛发的生长和集合以及毛发生长诱导相关的因子的表达进行确认。
对利用人类毛乳头细胞制造出的角蛋白溶液是否对细胞增殖具有功效进行确认。
具体来讲，分别将2×104个人类毛乳头细胞接种到24孔板中并在24小时之后将培养基替换成高浓度的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)一般培养基或包含1％(w/v)角蛋白的高浓度的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)一般培养基。接下来在培养1天、3天、5天之后执行细胞增殖分析。在利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)对加样孔进行洗涤之后，向各个加样孔添加利用达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)一般培养基进行10倍稀释的细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit)-8溶液(Dojindo laboratory)，并在利用铝箔遮光之后在37℃下进行1小时30分钟的孵化处理。在完成孵化处理之后从各个加样孔采集100μl移动到96孔板，然后利用96孔型酶标分析仪(format plate reader，ELX 800 universal microplateReader，Bio Tek,Inc.)设备对450nm波长(O.D 450nm)下的吸光度进行测定。其结果如图7所示。
通过其结果可以得知，在利用角蛋白进行处理时，人类毛乳头细胞的增殖得到了抑制(图7)。此外，通过在利用荧光物质复合化的角蛋白进行处理之后对与细胞的相互作用进行分析的结果可以确认角蛋白被粘附在细胞的表面，同时确认了随着时间的经过，角蛋白能够对基于细胞迁移的细胞集合体的形成进行诱导(图8)。
为了通过信使核糖核酸(mRNA)的表达分析进一步确认上述结果，首先将2×105个人类毛乳头细胞接种到6孔板中并在24小时之后替换成高浓度的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)一般培养基或包含1％(w/v)角蛋白的高浓度的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)一般培养基。在对角蛋白进行24小时的处理之后为了执行核糖核酸测序(RNAsequencing)分析，去除在6孔板中培养的细胞的培养基并利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行洗涤。在提取核糖核酸(RNA)时使用Hybrid-R试剂盒(Gene All)，并利用NanoDrop(MICROPUV-Vis Spectrophotometer M600)对所提取出的核糖核酸(RNA)进行定量。委托Macrogen对1μg的核糖核酸(RNA)进行核糖核酸测序(RNA sequencing)分析。
通过其结果可以确认，在利用角蛋白进行处理的人类毛乳头细胞中，与细胞集合体的诱导相关的细胞外基质的合成以及与细胞之间的相互作用相关的信使核糖核酸(mRNA)的表达大幅增加，而与细胞的增殖相关的信使核糖核酸(mRNA)的表达被抑制(图9)。
此外，分别将2×105个人类毛乳头细胞接种到6孔板中并在24小时之后替换成高浓度的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)一般培养基或包含1％(w/v)角蛋白的高浓度的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)一般培养基。在培养3天以及5天之后通过免疫化学染色法对诱导毛发生长的因子的表达程度进行测定。
在按照如上所述的方式培养人类毛乳头细胞之后，对培养基进行去除并利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行洗涤。在通过利用4％多聚甲醛进行10分钟的处理而完成固定之后，再次利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行洗涤。在完成固定之后，通过利用0.1％曲拉通(triton)X-100进行30分钟的处理而完成透化(permeabilization)，接下来利用10％(w/v)的正常山羊血清(normal goat serum，NGS)进行1小时的处理。接下来，利用以1:200的比例稀释的兔抗-人β-连环蛋白抗体(rabbit anti-human beta-catenin antibody)、鼠抗-人成纤维细胞生长因子7(FGF7)抗体(mouse anti-human FGF7antibody)、兔抗-人成纤维细胞生长因子10(FGF10)抗体(rabbit anti-human FGF10antibody)以及兔抗-人重组人骨形态发生蛋白6(BMP6)抗体(rabbit anti-human BMP6antibody)在4℃下进行24小时的反应。在进行24小时的反应之后利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行三次洗涤，接下来利用二级阿莱克萨荧光546结合抗体(secondary Alexa Fluor 546 conjugated antibody)以及二级阿莱克萨荧光488结合抗体(secondary Alexa Fluor 488-conjugated antibody)在常温下进行1小时的处理。接下来，利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行三次洗涤，然后利用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)进行处理。接下来，利用荧光显微镜(OlympusI×71)对染色的细胞进行观察。通过其结果可以确认，在利用角蛋白进行处理的人类毛乳头细胞中，细胞集合体的形成被诱导，且已知毛发生长诱导因子即成纤维细胞生长因子7(FGF7)、成纤维细胞生长因子10(FGF10)以及重组人骨形态发生蛋白6(BMP6)的分子表达大幅增加。
试验例4：在实验室阶段(in vitro，体外)中角蛋白对人类外毛根鞘(outer rootsheath，ORS)的毛发生长参与因子的表达诱导
为了确认角蛋白的毛发再生效果，对与毛发的生长以及毛发生长诱导相关的因子的表达进行确认。
对利用人类外毛根鞘细胞制造的角蛋白溶液是否能够对与毛发的生长以及毛发生长诱导相关的因子的表达造成影响进行确认。
具体来讲，分别将5×104个人类外毛根鞘细胞接种到6孔板中并在24小时之后替换成人类外毛根鞘(ORS)培养基或包含1％(w/v)角蛋白的人类外毛根鞘(ORS)培养基。在培养3天之后，通过免疫化学染色法以及反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)分析对β-连环蛋白(beta catenin)、白细胞分化抗原34(CD34)、P-钙粘蛋白(P-cadherin)以及E-钙粘蛋白(E-cadherin)的表达程度以及转录因子的表达程度进行测定。
在按照如上所述的方式培养人类外毛根鞘(outer root sheath，ORS)细胞之后，对培养基进行去除并利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行洗涤。在通过利用4％多聚甲醛进行10分钟的处理而完成固定之后，再次利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行洗涤。在完成固定之后，通过利用0.1％曲拉通(triton)X-100进行30分钟的处理而完成透化(permeabilization)，接下来利用10％(w/v)的正常山羊血清(normal goat serum，NGS)进行1小时的处理。接下来，利用以1:200的比例稀释的兔抗-人β-连环蛋白抗体(rabbitanti-human beta-catenin antibody)、兔抗-人白细胞分化抗原34(CD34)抗体(mouseanti-human CD34 antibody)、兔抗-人P-钙粘蛋白(P-cadherin)抗体(mouse anti-humanP-cadherin antibody)、兔抗-人E-钙粘蛋白(E-cadherin)抗体(mouse anti-human E-cadherin antibody)以及鼠抗-人整合素β1(integrin beta1)抗体(mouse anti-humanintegrin beta1 antibody)在4℃下进行24小时的反应。在进行24小时的反应之后利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行三次洗涤，接下来利用二级阿莱克萨荧光546结合抗体(secondary Alexa Fluor 546 conjugated antibody)、二级阿莱克萨荧光488结合抗体(secondary Alexa Fluor 488-conjugated antibody)以及藻红蛋白结合鬼笔环肽抗体(PE-conjugated Palloidin antibody)在常温下进行1小时的处理。接下来，利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行三次洗涤，然后利用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)进行处理。接下来，利用荧光显微镜(OlympusI×71)对染色的细胞进行观察。为了执行反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)分析，去除在6孔板中培养的细胞的培养基并利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行洗涤。在提取核糖核酸(RNA)时使用Hybrid-R试剂盒(GeneAll)，并利用NanoDrop(MICROP UV-Vis Spectrophotometer M600)对所提取出的核糖核酸(RNA)进行定量。将1μg的核糖核酸(RNA)添加到AccuPower Cycle Script RTPremix(Bioneer，大田，韩国)并利用热循环器(T106，Bio-Rad)制造出互补脱氧核糖核酸(cDNA)。所使用的引物的序列如下述表2所示。
【表2】
向各个反应添加SYBR Green PCR Mix 10μl、0.5pm的引物(正义(sense)以及反义(antisense))以及50nm的模板(template)。使用RG6000 5plex HRM(Corbett Research)设备执行反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)，设定为在95℃下15秒、退火(annealing)温度57℃下45秒、40周期。为了测定出阈值周期(Threshold cycle，Ct)值，使用相对定量(comparative Ct(2-ΔΔCt))法。
通过其结果可以确认，在人类外毛根鞘(outer root sheath，ORS)细胞中，在利用角蛋白进行处理时关于毛发的再生，与外毛根鞘细胞的迁移以及分化成基质细胞(Matrixcell)相关的因子即β-连环蛋白(beta-catenin)以及P-钙粘蛋白(P-cadherin)的表达有所增加，而已知分化时的表达减少的分子即白细胞分化抗原34(CD34)的表达有所减少(图11)。
此外，可以确认在利用角蛋白进行处理时与人类外毛根鞘(outer root sheath，ORS)细胞分化成基质细胞(Matrix cell)相关的肌节同源盒2(MSX2)、叉头框蛋白N1(FOXN1)以及白细胞分化抗原10(CD10)基因的表达有所增加(图12)，而已知分化时的表达减少的角蛋白5(KRT5)以及整合素α6(ITGA6)的基因表达有所减少(图12)。
试验例5：在实验室阶段(in vitro，体外)中水解角蛋白对人类外毛根鞘细胞的毛发生长参与因子的表达诱导
为了确认水解角蛋白的毛发再生效果，对与毛发的生长以及干细胞特性相关的因子的表达进行确认。
分别将5×104个人类外毛根鞘(outer root sheath，ORS)细胞接种到6孔板中并在24小时之后替换成人类外毛根鞘(ORS)培养基或包含1％(w/v)水解角蛋白的人类外毛根鞘(ORS)培养基。在培养1天、3天、5天之后，通过免疫化学染色法以及反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)分析对β-连环蛋白(beta catenin)、性别决定Y染色体去高迁移组盒基因9(Sox-9)以及白细胞分化抗原44(CD44)的表达程度进行测定。
在按照如上所述的方式培养人类外毛根鞘(outer root sheath，ORS)细胞之后，对培养基进行去除并利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行洗涤。在通过利用4％多聚甲醛进行10分钟的处理而完成固定之后，再次利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行洗涤。在完成固定之后，通过利用0.1％曲拉通(triton)X-100进行30分钟的处理而完成透化(permeabilization)，接下来利用10％(w/v)的正常山羊血清(normal goat serum，NGS)进行1小时的处理。接下来，利用以1:200的比例稀释的兔抗-人β-连环蛋白抗体(rabbitanti-human beta-catenin antibody)、兔抗-人性别决定Y染色体去高迁移组盒基因9(Sox-9)抗体(rabbit anti-human Sox-9 antibody)以及兔抗-人白细胞分化抗原44(CD44)抗体(rabbit anti-human integrin beta1 antibody)在4℃下进行24小时的反应。在进行24小时的反应之后利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行三次洗涤，接下来利用二级阿莱克萨荧光546结合抗体(secondary Alexa Fluor 546 conjugated antibody)以及二级阿莱克萨荧光488结合抗体(secondary Alexa Fluor 488-conjugated antibody)在常温下进行1小时的处理。接下来，利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行三次洗涤，然后利用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)进行处理。接下来，利用荧光显微镜(Olympus I×71)对染色的细胞进行观察。为了执行反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)分析，去除在6孔板中培养的细胞的培养基并利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行洗涤。在提取核糖核酸(RNA)时使用Hybrid-R试剂盒(Gene All)，并利用NanoDrop(MICROP UV-VisSpectrophotometer M600)对所提取出的核糖核酸(RNA)进行定量。将1μg的核糖核酸(RNA)添加到AccuPower Cycle Script RT Premix(Bioneer，大田，韩国)并利用热循环器(T106，Bio-Rad)制造出互补脱氧核糖核酸(cDNA)。所使用的引物的序列如下述表3所示。
【表3】
向各个反应添加SYBR Green PCR Mix 10μl、0.5pm的引物(正义(sense)以及反义(antisense))以及50nm的模板(template)。使用RG6000 5plex HRM(Corbett Research)设备执行反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)，设定为在95℃下15秒、退火(annealing)温度57℃下45秒、40周期。为了测定出阈值周期(Threshold cycle，Ct)值，使用相对定量(comparative Ct(2-ΔΔCt))法。
在按照如上所述的方式培养人类外毛根鞘(outer root sheath，ORS)细胞之后，对培养基进行去除并利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行洗涤。在投入0.3-1ml的蛋白质溶解缓冲液(Cell Lysis Buffer(10X)：RiPA buffer(biorad-89901)&Phosphatase InhibitorCocktail(thermofisher(100X)，78440))之后利用刮刀聚拢细胞并移动到e-tube。利用离心分离机(Centrifuge 5427 R，effendorf 10,000xg)在4℃下进行30分钟的分离，从而获得包含蛋白质的上清液。利用Bio Rad蛋白质分析(Protein Assay)试剂执行蛋白质定量。通过向30μg的蛋白质样本投入6×sample dye(DTT，sigma43815，bromophenol bluesigma，BR0222，Glycerl，bioshop，GLY001)而混合至1×，接下来将样本投入到加热块(HYSC_Introduction_Heating Block_2014)中并在95℃下进行10分钟的加热处理。在轻微地减缓转速(spindown)并进行涡旋震荡(Stuart Scientific SA8 vortex mixer ACinput 90/230V，50-60Hz)之后插入到冰中，接下来准备TetraHandcastSystems(Bio-rad)。为了制造出凝胶，在手动铸造用板(Plates for HandCasting)上组装短性玻璃(short glass)以及长性玻璃(long glass)，接下来在利用70％乙醇(merk)以及蒸馏水对玻璃板进行洗涤之后投入到框架中并在用于凝固凝胶的板底部涂抹油脂(grease)以防止凝胶发生泄漏。最终制造出22ml的分离凝胶(separatinggel)(包含6ml的30％丙烯酰胺(30％Acrylamide/Bis Solution，19:1#1610154)，5ml的dH2O，3.75ml的1.5M Tris-HCl(sigma，T1503)，150μl的10％SDS(sigma，sodium dodecylsulfite，L3771)，7.5μl的TEMED(USB，76230)以及75μl的10％过硫酸铵(sigma，215589))并投入到玻璃板中，然后投入70％的乙醇调整水平。在经过约30分钟之后倾斜玻璃板去除乙醇，接下来在分离凝胶的上方最终制造出了10ml的积层凝胶(stacking gel)(包含1.3ml的30％的丙烯酰胺(30％Acrylamide/Bis Solution，19:1#1610154)1.3ml，6.1ml的dH2O，2.5ml的1.0M Tris-HCl(sigma，T1503))，100μl的Tris-HCl(sigma，T1503)，10μl的TEMED(USB，76230)以及60μl的10％过硫酸铵(sigma，215589))。在投入积层凝胶并插入1.0mm的电泳梳(comb)之后将凝胶板安装到电泳槽中。将样本加样到各个加样孔中，同时投入5μl的大小标准参照物(ladder)(蛋白质分子量标准参照物10-245kDa ab116028-Abcam)。将迷你凝胶(Minigel)在50V条件下进行20分钟的反应之后，在经过积层凝胶时提升到100V并进行1小时-1.5小时的电泳处理。在完成电泳处理之后，将凝胶从凝胶板中分离并投入到转移缓冲液(transfer buffer)中。此外，上述转移缓冲液是利用14.4g的甘氨酸(Glycine，sigma)14.4g、3g的Trizma基质(sigma，T1503)、200mL的甲醇(merk)以及800ml的dH2O进行制造。将聚偏二氟乙烯(PVDF)转移膜(transfer membrane)(millipore cat No ISEQ 10100 10cm×10cm PVDF)在甲醇中浸泡5分钟、在三蒸H2O中浸泡3分钟以及在转移缓冲液中浸泡3分钟并进行晃动之后，按照如下所述的顺序制造出多层试剂盒。(-)黑色版-海绵-3M纸-透明板转移装置(Bio-rad)。将上述试剂盒投入到水槽中并在搅拌器(stirrer)上方以200V的条件进行90分钟的转移处理。在完成转移之后对凝胶和膜进行染色并对谱带进行确认。通过将2.5g的丽春红S染色液(ponceau S)以及5ml的乙酸添加到dH2O中至500ml而制造出试剂液之后将上述膜整体金跑到试剂液中并晃动约5分钟，接下来利用H2O清洗2-3次之后对谱带进行确认并对梯度大小进行标记。利用10g的脱脂乳(skim milk)(BD，2322100)以及200ml的TBS(Tris 12g，NaCl 9g in dH2O)制造出封闭溶液(blocking solution)，接下来在将膜投入到塑料容器中之后在10ml的封闭溶液中进行1小时的孵化(incubation)处理。在向上述10ml的封闭溶液投入以1:1000的比例稀释的B-连环蛋白1级抗体(Anti-beta Cateninantibody[E247](ab32572))和B-肌动蛋白1级抗体(β-Actin Antibody(C4))之后，利用Santa Cruz孵化器在4℃下进行24小时的孵化处理。在投入TBST(Tris 12g，NaCl 9g indH2O，1％tween 20)进行3次每次5分钟的洗涤之后向10ml的封闭溶液投入以1:10000的比例稀释的B-连环蛋白2级抗体(goat anti-rabbit IgG-HRP：sc-2004)以及B-肌动蛋白2级抗体(mouse anti-rabbit IgG-HRP)并进行2小时的孵化处理。在投入TBST(Tris 12g，NaCl9g in dH2O，1％tween 20)进行3次每次5分钟的洗涤之后投入电致化学发光基质(ECLSubstrate)(大明科技)并进行5分钟的孵化处理。在暗室中将膜放置在显像用试剂盒(大明科技，高灵敏度滤光器)中并对X线胶片(大明科技8×10英寸)进行约5分钟左右的孵化处理，接下来取出胶片并在自动显像器(SAEKI，P&C，ATL-1500)中进行显像处理。
通过其结果可以确认，在人类外毛根鞘(outer root sheath，ORS)细胞中，在利用水解角蛋白进行处理时关于毛发的再生，与外毛根鞘细胞的迁移以及克隆的活性相关的因子即β-连环蛋白(beta catenin)以及参与干细胞特性(stemness)的性别决定Y染色体去高迁移组盒基因9(Sox-9)分子的表达有所增加(图13)。此外，可以确认参与干细胞特性(stemness)的性别决定Y染色体去高迁移组盒基因9(Sox-9)基因以及β-连环蛋白(betacatenin)基因的表达有所增加(图14)。尤其是，可以确认在利用水解角蛋白进行处理时β-连环蛋白的表达达到4倍以上(图15)。
试验例6：在实验室阶段(in vitro，体外)中水解角蛋白对人类毛乳突细胞的毛发生长参与因子的表达诱导
分别将2×105个人类毛乳突(dermal papilla，DP)细胞接种到没有进行任何处理的6孔板中并在24小时之后替换成人类毛乳突(DP)培养基或包含1％(w/v)水解角蛋白的人类毛乳突(DP)培养基。在培养1天、2天以及3天之后，对细胞集合体(Cell aggregate)的形成程度以及碱性磷酸水解酶(Alkaline Phosphatase)的活性程度进行分析，并通过免疫化学染色法对β-连环蛋白(beta catenin)、性别决定Y染色体去高迁移组盒基因2(Sox-2)、白细胞分化抗原133(CD133)、碱性磷酸水解酶(Alkaline phosphatase)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)以及成纤维细胞生长因子10(FGF10)的表达程度进行测定。
在如上所述的人类毛乳头(dermal papilla，DP)细胞的培养过程中，利用光学显微镜对利用水解角蛋白进行处理时生成的细胞集合体(Cell aggregate)的数量进行测定。
此外，在按照如上所述的方式培养人类毛乳头(dermal papilla，DP)细胞进行培养之后，通过利用4％多聚甲醛进行1分钟至2分钟的处理而完成固定，接下来利用碱性磷酸水解酶检测试剂盒(Alkaline phosphatase detection kit,Merk Millipore SCR004)中的冲洗缓冲液(Rinse buffer)进行洗涤，然后添加1ml的将萘酚AS-BI磷酸盐(NaphtholAS-BI phosphate solution):快速红紫溶液(Fast Red Violet solution):蒸馏水(distilled water)以2:1:1的比例混合的反应溶液并在黑暗的常温条件下进行15分钟的反应。在完成反应之后，利用荧光显微镜(Olympus I×71)对在由碱性磷酸细胞表达的水解酶(Alkaline Phosphatase)的活性作用下染色的细胞进行观察。
此外，在按照如上所述的方式培养人类毛乳头(dermal papilla，DP)细胞之后，对培养基进行去除并利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行洗涤。在通过利用4％多聚甲醛进行10分钟的处理而完成固定之后，再次利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行洗涤。在完成固定之后，通过利用0.1％曲拉通(triton)X-100进行30分钟的处理而完成透化(permeabilization)，接下来利用10％(w/v)的正常山羊血清(normal goat serum)进行1小时的处理。接下来，利用以1:200的比例稀释的兔抗-人β-连环蛋白抗体(rabbit anti-human beta-cateninantibody)、鼠抗-人性别决定Y染色体去高迁移组盒基因2(Sox-2)抗体(mouse anti-humanSox-2 antibody)、鼠抗-人碱性磷酸酶(ALPase)抗体(mouse anti-human ALPaseantibody)、兔抗人白细胞分化抗原133(CD133)抗体(rabbit anti-human CD133antibody)、鼠抗人成纤维细胞生长因子7(FGF-7)抗体(mouseanti-human FGF-7antibody)以及兔抗-人成纤维细胞生长因子10(FGF-10)抗体(rabbit anti-human FGF-10antibody)在4℃下进行24小时的反应。在进行24小时的反应之后利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行三次洗涤，接下来利用二级阿莱克萨荧光546结合抗体(secondary AlexaFluor 546 conjugated antibody)以及二级阿莱克萨荧光488结合抗体(secondary AlexaFluor 488-conjugated antibody)在常温下进行1小时的处理。接下来，利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行三次洗涤，然后利用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)进行处理。利用荧光显微镜(Olympus I×71)对染色的细胞进行观察。
通过其结果可以确认，在人类毛乳头(dermal papilla，DP)细胞中，在利用水解角蛋白进行处理时与毛乳头细胞的毛发再生以及干细胞特性(stemness)相关的细胞集合体(cell aggregate)的形成增加5倍以上(图16)，同时可以确认碱性磷酸细胞表达的水解酶的活性有所增加(图13)。进而，可以确认毛乳头细胞的毛发再生以及干细胞特性(stemness)因子即β-连环蛋白(betacatenin)、性别决定Y染色体去高迁移组盒基因2(Sox-2)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)、白细胞分化抗原133(CD133)、成纤维细胞生长因子7(FGF-7)以及成纤维细胞生长因子10(FGF-10)分子的表达有所增加(图18)。
通过上述试验例1至试验例6可以得知，角蛋白能够提升参与毛发再生的干细胞的干细胞特性并通过诱导细胞的迁移以及分化而形成细胞集合体，从而有效地对毛发的再生进行诱导。
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Claims (13)
1.一种包含角蛋白的毛发防脱或毛发促生用注射用药学组合物。
2.根据权利要求1所述的毛发防脱或毛发促生用注射用药学组合物，其特征在于：
上述角蛋白是水解角蛋白或结合到水溶性聚合物的角蛋白。
3.根据权利要求2所述的毛发防脱或毛发促生用注射用药学组合物，其特征在于：
上述水解角蛋白的分子量为500至10,000道尔顿(Dalton)。
4.根据权利要求2所述的毛发防脱或毛发促生用注射用药学组合物，其特征在于：
上述水溶性聚合物是从由透明质酸(hyaluronic acid)、聚乙二醇(PEG)、海藻酸(alginic acid)、果胶(pectin)、角叉菜胶(carrageenan)、硫酸软骨素(chondroitinsulfate)、硫酸葡聚糖(dextran sulfate)、酮酸、聚赖氨酸(polylysine)、胶原蛋白、明胶、羧甲基壳聚糖、纤维蛋白(fibrin)、葡聚糖(dextran)、琼脂糖(agarose)、支链淀粉(pullulan)、聚丙烯酰胺(PAAm)、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共-丙烯酸)(P(NIPAAm-co-AAc))、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共-甲基丙烯酸乙酯)(P(NIPAAm-co-EMA))、聚醋酸乙烯酯/聚乙烯醇(PVAc/PVA)、聚(N-乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸羟乙酯)(P(MMA-co-HEMA))、聚(聚乙二醇-共-缩氨酸)(P(PEG-co-peptide))、海藻酸盐-g-(聚氧乙烯-聚环氧丙烷-聚氧乙烯)(alginate-g-(PEOPPO-PEO))、聚((聚乳酸-共-羟基乙酸)-共-丝氨酸)(P(PLGA-co-serine))、胶原蛋白-丙烯酸盐(collagenacrylate)、海藻酸盐-丙烯酸盐(alginate-acrylate)、聚(羟丙基甲基丙烯酰胺-g-缩氨酸)(P(HPMA-g-peptide))、聚(甲基丙烯酸羟乙酯/基质胶)(P(HEMA/Matrigel))、透明质酸-g-N-异丙基丙烯酰胺(HA-g-NIPAAm)、聚氧乙烯(PEO)、聚氧乙烯-聚环氧丙烷共聚物(PEO-PPO，Pluronic series)、聚氧乙烯-聚乳酸共聚物(PEO-PLA)、聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物(PEO-PLGA)、聚氧乙烯-聚已酸内酯共聚物(PEO-PCL)、聚氧乙烯烷基醚(polyoxyethylene alkyl ethers，BrijSeries)、聚氧乙烯蓖麻油衍生物(polyoxyethylene castor oilderivatives，Cremophores)、聚山梨酯(polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters,TweenSeries)以及硬脂酸聚氧乙烯酯(polyoxyethylene stearates)构成的组中选择的1种以上。
5.根据权利要求1所述的毛发防脱或毛发促生用注射用药学组合物，其特征在于：
上述角蛋白可以促进毛发再生。
6.根据权利要求1所述的毛发防脱或毛发促生用注射用药学组合物，其特征在于：
上述药学组合物增加从由β-连环蛋白(beta catenin)、性别决定Y染色体去高迁移组盒基因9(Sox-9)、性别决定Y染色体去高迁移组盒基因2(Sox-2)、碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase)、白细胞分化抗原133(CD133)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、成纤维细胞生长因子10(FGF10)、重组人骨形态发生蛋白6(BMP6)、P-钙粘蛋白(P-cadherin)、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、肌节同源盒2(MSX2)、叉头框蛋白N1(FOXN1)以及白细胞分化抗原10(CD10)构成的组中选择的1种以上的表达量。
7.根据权利要求1所述的毛发防脱或毛发促生用注射用药学组合物，其特征在于：
上述药学组合物被给药到真皮层或皮下组织。
8.根据权利要求1所述的毛发防脱或毛发促生用注射用药学组合物，其特征在于：
上述药学组合物还包含经皮吸收促进剂(penetration enhancer)。
9.根据权利要求8所述的毛发防脱或毛发促生用注射用药学组合物，其特征在于：
上述经皮吸收促进剂是从由亚砜(sulphoxide)、氮酮(azone)、吡咯烷酮(pyrrolidone)、脂肪酸、碳原子数为1至4的低级醇、碳原子数为6以上的高级脂肪醇(fattyalcohol)、乙二醇(glycol)、尿素(urea)、萜烯(terpene)、萜类化合物(terpenoid)以及磷脂(phospholipid)构成的组中选择的1种以上。
10.根据权利要求2所述的毛发防脱或毛发促生用注射用药学组合物，其特征在于：
上述水解角蛋白，通过包括：S1)使水解酶与角蛋白发生反应的步骤；以及，S2)对上述水解酶进行去除的步骤；的水解角蛋白的制造方法进行制造。
11.根据权利要求10所述的毛发防脱或毛发促生用注射用药学组合物，其特征在于：
上述水解酶为蛋白酶-K。
12.根据权利要求10所述的毛发防脱或毛发促生用注射用药学组合物，其特征在于：
上述水解酶被固定到小珠中。
13.根据权利要求10所述的毛发防脱或毛发促生用注射用药学组合物，其特征在于：
上述水解角蛋白的制造方法，在上述第S2)步骤之后，还包括：S3)对水解酶的活性进行去除的步骤。
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