CN106867000A - 一种促进角蛋白溶解及增强角蛋白材料强度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种促进角蛋白溶解及增强角蛋白材料强度的方法。所述角蛋白是指水不溶的或水中溶解度低的角蛋白,其特征是角蛋白中二硫键含量较高。促进上述水不溶性角蛋白溶解的方法在于将角蛋白加入水溶液中,同时加入一定量的还原剂使二硫键断裂形成自由巯基,促进角蛋白溶解。所述的还原剂包括半胱氨酸、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫醇、焦亚硫酸钠,或者具有还原性的角蛋白或肽,或者其它具有还原性的蛋白质或肽等能够引发二硫键断裂并形成自由巯基的物质。该方法的另一个特征在于,溶解后的角蛋白由于含有自由巯基,可在氧化条件下再次发生二硫键交联,进而显著提高角蛋白材料的力学强度。所述的角蛋白材料可以包括角蛋白水凝胶、膜、海绵、纤维等多种形式。
Description
技术领域
本发明涉及一种促进角蛋白水中溶解的方法,以及用该角蛋白溶液制备高强度的角蛋白水凝胶、膜、海绵和纤维等材料的方法。
背景技术
角蛋白是一种不溶性的纤维状蛋白质,是外胚层细胞的结构蛋白,广泛存在于动物皮肤及皮肤附属物中,如毛发、蹄、壳、爪、角、鳞片等。近几年的大量研究表明,角蛋白是一种生物相容性好且不被机体免疫排斥的优质生物医用材料,具有广阔的应用前景。最为突出的是,经过对羊毛等来源的角蛋白进行氨基酸序列测定发现,其含有Arg-Gly-Asp(RGD)三肽序列。此三肽序列被公认为是细胞外基质中实现细胞结合的有效结合位点,有促进细胞吸附的功能。因此,国内外已开展大量关于角蛋白基生物材料的基础研究及动物实验研究,并在创伤敷料、人造骨以及神经修复等方面都取得了良好效果,已有部分产品应用于临床。
从一级结构上看,角蛋白分子链由19种α-氨基酸构成,并形成了大量的五肽环模式的重复单元,即(C-C-X-P-X)和(C-C-X-SPT-SPT),这里C代表半胱氨酸(Cys),P代表脯氨酸(Pro),S代表丝氨酸(Ser),T代表苏氨酸(Thr),X代表除这几种之外的构成蛋白质的任何一种氨基酸。文献报道,角蛋白富含半胱氨酸残基和大量二硫键。以羊毛角蛋白为例,其半胱氨酸含量约占所有氨基酸总量的10-30%,并通过二硫键的形式构成稳定的空间立体网状结构,进而使羊毛表现出宏观上良好的拉伸和力学强度。然而,高比例二硫键的存在也使得角蛋白极难溶解于水和一般溶剂,并很难从羊毛组织中有效抽提出来。为此,当前角蛋白提取方法都是以破坏二硫键的交联为前提。例如,采用巯基乙醇、焦亚硫酸钠等还原剂将二硫键还原为自由巯基。然而,上述再生角蛋白在后续的纯化(如沉淀、过滤、透析)及干燥过程中,极易被空气中的氧气氧化,使得自由巯基再次被氧化生成二硫键交联,导致其分子量增大,水溶性变差。这给后续材料的成型加工带来困难。目前常用的方法是在一定还原环境中进行角蛋白的提取、纯化和干燥,或者在无氧气的环境中进行。但这样操作对设备和条件控制要求较高。此外,根据文献报道,这种发生完全或部分二硫键交联的再生角蛋白在材料成型后,如制备成凝胶、膜、海绵、纤维等,其蛋白之间多以氢键或非共价键的形式发生作用,因此材料的力学强度较低。对此,有研究者采用材料后处理的方法来提高角蛋白材料的湿强度。具体做法是,先将再生角蛋白制备成薄膜、纤维、泡沫以及粘合剂材料。材料形成后,用还原剂、酸或者蛋白交联剂或者用具有还原形式的角蛋白处理上述材料,使蛋白之间发生新的二硫键交联并形成蛋白交联网络【由可溶性S-磺化的角蛋白衍生物制备生物高分子薄膜纤维泡沫剂粘合剂材料。专利申请号:02819589.2】。但这种方法的不足之处在于,材料形成后,后处理试剂往往不能充分渗透入材料中发挥作用,因此蛋白交联不充分,且所需时间较长。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种促进角蛋白溶解及增强角蛋白材料强度的方法。针对再生角蛋白水中溶解性差,且角蛋白材料强度较低的问题,本发明提出一种简单易行的方法。该方法巧妙地解决了促进角蛋白溶解和提高角蛋白材料强度的双重问题,方法简单,效果明显,并可广泛应用于所有来源角蛋白的溶解和材料成型的处理。
本发明的一种促进角蛋白溶解及增强角蛋白材料强度的方法,所述的角蛋白是指水不溶的或水中溶解度低的角蛋白,其特征是角蛋白中的半胱氨酸残基以二硫键形式发生化学交联。
本发明的一种促进角蛋白溶解及增强角蛋白材料强度的方法,所述的角蛋白原料可以是人或动物毛发,如羊毛、家禽羽毛;动物角或蹄,如牛角、牛蹄;指甲等含有角蛋白的材料,并可以是从角蛋白原料中能够提取得到的任何分子量形式的角蛋白。
本发明所述的促进角蛋白溶解的方法在于将角蛋白加入水溶液中,同时加入一定量的还原剂使二硫键断裂形成自由巯基,促进角蛋白溶解。
本发明所述的促进角蛋白溶解的方法,所述的还原剂包括半胱氨酸、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫醇、焦亚硫酸钠或者具有还原性的角蛋白或肽,或者其它具有还原性的蛋白质或肽等能够引发角蛋白中的二硫键断裂并形成自由巯基的物质。
本发明所述的角蛋白材料包括角蛋白水凝胶、膜、海绵、纤维等。
本发明所述的角蛋白水凝胶的制备方法为将5-30%的角蛋白粉、相比于蛋白粉质量0.1%以上的还原剂加入到水中,搅拌使蛋白溶解,然后静置形成凝胶。
本发明所述的角蛋白膜的制备方法为将5-30%的角蛋白粉、相比于蛋白粉质量0.1%以上的还原剂加入到水中,搅拌使蛋白溶解,然后经溶液浇注、溶剂挥发形成角蛋白膜。
本发明所述的角蛋白海绵的制备方法为将5-30%的角蛋白粉、相比于蛋白粉质量0.1%以上的还原剂加入到水中,搅拌使蛋白溶解,静置形成角蛋白凝胶。然后,冷冻干燥角蛋白凝胶形成角蛋白海绵。
本发明所述的角蛋白纤维的制备方法为将5-30%的角蛋白粉、相比于蛋白粉质量0.1%以上的还原剂加入到水中,搅拌使蛋白溶解。将上述溶液挤出到凝固浴中,经过机械牵拉得到角蛋白纤维。
本发明所述的一种促进角蛋白溶解及增强角蛋白材料强度的方法,特征在于,在角蛋白溶解过程中加入所述还原剂,还原剂使角蛋白分子中的二硫键断裂生成新的自由巯基,促进蛋白溶解。然后,在材料成型加工过程中,新的自由巯基在空气、双氧水等氧化条件下再次发生二硫键交联,形成角蛋白交联网络,因此显著提高角蛋白材料的力学强度。
本发明的有益说明
本发明提供了一种促进角蛋白溶解及增强角蛋白材料的方法,其优势在于:(1)一步法实现蛋白溶解和材料增强的双重目的;(2)充分利用角蛋白一级结构中半胱氨酸残基含量高的特点,通过加入二硫键还原剂,如半胱氨酸,谷胱甘肽等,实现角蛋白材料的力学强度的增强。与现有提高蛋白材料力学强度的方法相比,本发明方法避免使用戊二醛等有毒化学交联剂,可显著降低材料的细胞毒性,有望应用于组织工程材料、药物缓释载体等生物医用材料领域。
附图说明
图1为实施例1所得角蛋白凝胶的微观形貌图。
图2为按照实施例1方法所得对照样凝胶的微观形貌图。
图3为实施例1所得角蛋白凝胶的流变测试图。
图4为按照实施例1方法所得对照样凝胶的流变测试图。
图5为实施例1所得角蛋白凝胶的压缩强度测试图。
图6为按照实施例1方法所得对照样凝胶的压缩强度测试图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
称取质量为0.3g的角蛋白粉末加入到2ml的水或磷酸缓冲液(pH=7.4)中,然后加入占蛋白质量1.5%的半胱氨酸,搅拌溶解后,室温下静置,形成角蛋白凝胶。
实施例2
称取质量为0.15g的角蛋白粉末加入到2ml的水或缓冲液(pH=7.0-12.0)中,然后加入占蛋白质量5%的二硫苏糖醇,搅拌溶解后,室温下静置,形成角蛋白凝胶。
实施例3
称取质量为0.6g的角蛋白粉末加入到2ml的水或缓冲液(pH=7.0-12.0)中,然后加入占蛋白质量1.5%的谷胱甘肽,搅拌溶解后,倒入到模型中,待溶剂挥发后即形成角蛋白膜。
实施例4
称取质量为0.1g的角蛋白粉末加入到2ml的水或缓冲液(pH=7.0-12.0)中,然后加入占蛋白质量0.1%的焦亚硫酸钠,搅拌溶解后,室温下静置,形成角蛋白凝胶。然后,冷冻干燥角蛋白凝胶形成角蛋白海绵。
实施例5
称取质量为0.2g的角蛋白粉末加入到2ml的水或缓冲液(pH=7.0-12.0)中,然后加入占蛋白质1.5%的半胱氨酸,搅拌溶解后,将上述溶液挤出到凝固浴中,经过机械牵拉得到角蛋白纤维。
实施例6
称取质量为0.3g的角蛋白粉末加入到2ml的水或缓冲液(pH=7.0-12.0)中,然后加入占蛋白质3%的半胱氨酸。搅拌溶解后,采用静电纺丝的方法制备纳米角蛋白纤维。
实施例7
按照实施例1中所述的制备方法制备角蛋白凝胶,并对其微观结构和材料强度进行测试。为了突出溶解过程中添加还原剂对提高材料力学强度的显著作用,同时采用溶解过程中不添加还原剂的角蛋白凝胶作为对照。该凝胶称为对照样凝胶。
采用扫描电镜观察角蛋白凝胶和对照样凝胶的微观形貌,结果如图1和图2所示。很明显,采用本发明提出的制备方法,所得凝胶的孔隙结构明显致密。这表明,在角蛋白溶解过程中加入还原剂后,溶解后的角蛋白生成新的自由巯基,可在空气、双氧水等氧化条件下再次发生二硫键交联,因此形成了更加致密的角蛋白交联网络。
分别对角蛋白凝胶和对照样凝胶进行流变学测试,结果如图3和图4所示。很明显,采用本发明提出的制备方法,所得凝胶的G’值显著高于对照样品,说明本发明提出的方法能够显著提高角蛋白材料的力学强度。分别测试角蛋白凝胶和对照样凝胶的压缩强度,结果如图5和图6所示。角蛋白凝胶的压缩强度达到50kPa以上,而对照样凝胶仅为35kPa。以上结果均表明,本发明方法能够有效提高角蛋白材料的力学强度。
Claims (10)
1.一种促进角蛋白溶解及增强角蛋白材料强度的方法,所述的角蛋白是指水不溶的或水中溶解度低的角蛋白,其特征是角蛋白中的半胱氨酸残基以二硫键形式发生化学交联。
2.一种促进角蛋白溶解及增强角蛋白材料强度的方法,所述的角蛋白可以是采用物理或化学方法处理角蛋白原料产生的角蛋白粉,该角蛋白粉的特征在于蛋白分子内存在较多的二硫键交联,水中溶解度低。
3.权利要求2中所述的角蛋白原料可以是人发、羊毛、家禽羽毛、牛角、指甲等含有角蛋白的材料。
4.一种促进角蛋白溶解及增强角蛋白材料强度的方法,所述的促进角蛋白溶解的方法在于将角蛋白加入水溶液中,同时加入一定量的还原剂使二硫键断裂形成自由巯基,促进角蛋白溶解。
5.权利要求4所述的还原剂包括半胱氨酸、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫醇、焦亚硫酸钠,或者具有还原性的角蛋白或肽,或者其它具有还原性的蛋白质或肽等能够引发二硫键断裂并形成自由巯基的物质。
6.一种促进角蛋白溶解及增强角蛋白材料强度的方法,所述的角蛋白材料包括角蛋白水凝胶、膜、海绵、纤维等,也可以是角蛋白与其它无机、有机材料组成的复合材料。
7.权利要求6所述的角蛋白水凝胶的制备方法为将角蛋白粉、还原剂加入到水中,搅拌使蛋白溶解,然后静置形成凝胶。
8.权利要求6所述的角蛋白膜的制备方法为将角蛋白粉、还原剂加入到水中,搅拌使蛋白溶解,然后经溶液浇注、溶剂挥发形成角蛋白膜。
9.权利要求6所述的角蛋白海绵的制备方法为将角蛋白粉、还原剂加入到水中,搅拌使蛋白溶解,静置形成角蛋白凝胶,然后,冷冻干燥角蛋白凝胶形成角蛋白海绵。
10.一种促进角蛋白溶解及增强角蛋白材料强度的方法,特征在于,将角蛋白加入水溶液中,同时加入一定量的还原剂使二硫键断裂形成自由巯基,促进角蛋白溶解,溶解后的角蛋白由于含有自由巯基,可在空气等氧化条件下再次发生二硫键交联,因此能够显著提高角蛋白材料的力学强度。
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