CN116655939A - 一种具有巯基/二硫键动态共价交联体系的角蛋白再生材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有巯基/二硫键动态共价交联体系的角蛋白再生材料及其制备方法，以角蛋白原料制备含有巯基的角蛋白多肽溶液；选取改性化合物，改性化合物为至少包含两个巯基基团的抗氧化物；向角蛋白多肽溶液中加入改性化合物对角蛋白多肽分子上巯基基团进行接枝改性，得到分子间具有动态共价交联体系的角蛋白再生材料。本发明采用接枝角蛋白分子链上的巯基基团，以此改变分子间二硫键交联的链段结构。接枝改性后，多肽链化学结构改变，降低了分子间二硫键断裂和键合所需活化能，使其在较低环境要求下形成动态共价交联效果，从而改变多肽分子间相互作用力，并优化分子聚集态结构，改善再生材料结构和性能缺陷。
Description
技术领域
本发明公开了一种具有巯基/二硫键动态共价交联体系的角蛋白再生材料及其制备方法，属于生物质材料技术领域。
背景技术
角蛋白是一种重要的动物基生物质材料，其天然储量丰富，可以从人体毛发或者动物的羽毛、角、趾中提取获得。其具有机械硬度高、化学性质稳定、生物相容性和活性优良等优点，有巨大的应用潜力。常规的角蛋白材料呈现出韧性差、脆性强的机械性能缺陷，因此无法得到产业化应用和推广。目前一般采用改变多肽间二硫键交联度促使大分子构象及聚集态发生转变，进而影响再生材料的物理结构和各项性能。而最新研究中显示，以多肽中巯基为反应位点建立分子间动态共价交联体系可以实现角蛋白再生材料高值化应用。
在外界环境刺激下，通过共价键的断裂与重组诱导高分子网络结构动态调整，当刺激消除后又可表现出常规共价高分子般的稳定性。因此利用巯基和二硫键在特定环境中通过氧化还原反应发生可逆转化，构建分子间动态共价交联体系改善角蛋白材料的机械性能缺陷。然而，由于二硫键键能较强，需要比较严苛的环境条件或催化剂作用。目前构建再生角蛋白材料分子间动态共价交联的方案为调节角蛋白所处环境PH值，利用碱性条件触发巯基/二硫键交换反应形成共价交联体系或利用半胱氨酸切断角蛋白分子内二硫键并使其形成分子间交联，控制半胱氨酸用量使二硫键产生动态转变效果。以上方案均需较为严苛的环境条件或催化剂作用下才能形成动态共价键，严重限制了再生角蛋白材料的应用形式和推广价值。
发明内容
本申请的目的在于，提供一种具有巯基/二硫键动态共价交联体系的角蛋白再生材料及其制备方法，以解决现有技术中因为角蛋白内二硫键键能较强，需要较为严苛的环境条件或催化剂条件才能形成动态共价键的技术问题。为实现上述目的，本发明提出了一种具有巯基/二硫键动态共价交联体系的角蛋白再生材料的制备方法，具体方案如下：
一种具有巯基/二硫键动态共价交联体系的角蛋白再生材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、以角蛋白原料制备含有巯基基团的角蛋白多肽溶液；
步骤二、选取改性化合物，所述改性化合物为至少包含两个巯基基团的抗氧化物；
步骤三、向所述角蛋白多肽溶液中加入所述改性化合物对角蛋白多肽分子上的巯基基团进行接枝改性，得到分子间具有动态共价交联体系的角蛋白再生材料。
优选的，所述改性化合物与所述角蛋白多肽溶液中角蛋白的质量比为1～5：10。
优选的，所述改性化合物为α-硫辛酸、2,3-二巯基丙磺酸钠，二巯基噻二唑，2,3-二硫代(2-巯基)-1-丙烷硫醇中的任一种。
优选的，所述改性化合物为α-硫辛酸；
向所述角蛋白多肽溶液中加入所述改性化合物，具体为：
在30～60℃下，将所述α-硫辛酸加入所述角蛋白多肽溶液中进行搅拌，并反应1～4h；所述α-硫辛酸与所述角蛋白多肽溶液中角蛋白的质量比为1～5:10。
优选的，以角蛋白原料制备含有巯基基团的角蛋白多肽溶液，具体为：
步骤1.1、采用还原剂对所述角蛋白原料进行预处理，获得还原态角蛋白材料；
步骤1.2、将所述还原态角蛋白材料浸入甲酸溶液中溶解，获得含有巯基基团的角蛋白多肽溶液。
优选的，所述步骤1.1之后还包括：
测定所述还原态角蛋白材料中的巯基基团含量，直至所述巯基基团含量大于预设值。
优选的，测定所述还原态角蛋白材料中的巯基基团含量，具体包括：
步骤1.1.1、将所述还原态角蛋白材料浸泡于醋酸铅溶液中进行反应后清洗并烘干，获得样品A；
步骤1.1.2、将所述样品A水解后与缓冲液混合，得到A混合物；
步骤1.1.3、测量所述A混合物中的胱氨酸含量，根据胱氨酸含量确定巯基基团含量。
优选的，采用还原剂对所述角蛋白原料进行预处理，具体包括；
将所述角蛋白原料在60～90℃下，以1:10～30的浴比在质量分数为30～50％的TCEP溶液中反应30～120min。
优选的，将所述还原态角蛋白材料浸入甲酸溶液中溶解，具体包括；
将所述还原态角蛋白材料在50～70℃下，以1:10～30的浴比浸入到质量分数为70～90％的所述甲酸溶液中溶解4～7h。
一种所述的制备方法制备的角蛋白再生材料。
有益效果：本发明利用α-硫辛酸(ALA)接枝角蛋白分子链上的巯基基团，以此改变分子间二硫键交联的链段结构。常规情况下，制备再生材料后，巯基(-SH)间极易相互交联再次形成二硫键(-S-S-)，而经过ALA接枝改性后角蛋白分子间将形成更“长程”的二硫键链段结构(-S-ALA-S-)，化学结构上的变化会降低-S-ALA-间化学键断裂和键合所需活化能，使其在较低环境要求下形成动态共价交联效果。
ALA改性后，分子间相互作用力发生改变，并且分子间二硫键链段在一定条件下易于打开，有助于改善多肽分子的聚集态结构，提高材料的结晶程度，改善结构和性能缺陷。同时，分子间作用力减弱，材料受力时分子间更容易产生一定的滑移，使得材料的柔韧性也得到优化。
附图说明
图1为巯基含量可控的角蛋白多肽溶液制备技术路线示意图；
图2为羊毛纤维表面硫元素的XPS谱图分析，其中(a)为未处理羊毛纤维，(b)TCEP处理60min后羊毛纤维；
图3为羊毛角蛋白质凝胶电泳测试结果；
图4为ALA接枝多肽构建巯基/二硫键动态共价交联体系的技术示意图；
图5为α-硫辛酸改性再生角蛋白膜物理结构变化，其中(a)(b)未改性制备的再生膜，(c)(d)改性后制备的再生膜；
图6为未改性和α-硫辛酸改性后制备的角蛋白膜拉曼光谱测试结果；
图7为α-硫辛酸改性角蛋白膜红外测试结果；
图8为α-硫辛酸改性角蛋白膜力学性能测试结果；
图9为α-硫辛酸改性角蛋白膜弯曲形态照片。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。
本发明公开了一种具有巯基/二硫键动态共价交联体系的角蛋白再生材料及其制备方法。本发明以经过脱脂和清洁处理的人发、羊毛、指甲、鱼鳞、牛角和禽类羽毛等中的任一种作为角蛋白再生材料的原料，制备一种具有巯基/二硫键动态公交交联体系的角蛋白再生材料，制备方法为：
步骤一、以角蛋白原料制备含有巯基基团的角蛋白多肽溶液；
步骤1.1、采用还原法对角蛋白原料进行预处理，获得还原态角蛋白材料；具体的，选用能有效还原二硫键的还原剂，对角蛋白原料进行还原预处理，还原剂选用例如硫醇、亚硫酸盐等，其中TCEP在水溶液中的稳定性和溶解性很好，在酸性、碱性溶液中的稳定性也不错，作为一种高效二硫键还原剂，优先选用在蛋白质化学及蛋白质组学研究中。
步骤1.2、测定还原态角蛋白材料中的巯基基团含量，直至巯基基团含量大于预设值。
测定还原态角蛋白材料中的巯基基团含量，具体包括：
步骤1.2.1、将还原态角蛋白材料浸泡于醋酸铅溶液中进行反应后清洗并烘干，获得样品A；
步骤1.2.2、使用盐酸溶液将样品A在水解管中水解获得水解试样B，将水解试样B脱酸至干燥后加入缓冲液，并使用氨基酸分析仪测试胱氨酸含量，根据胱氨酸含量确定巯基基团含量。
步骤1.3、将还原态角蛋白材料浸入甲酸溶液中进行溶解，获得角蛋白多肽溶液。
步骤二、选取针对巯基接枝反应的改性化合物，改性化合物为至少包含两个巯基基团的抗氧化物；改性化合物具有抗氧化性，为α-硫辛酸、2,3-二巯基丙磺酸钠，二巯基噻二唑，2,3-二硫代(2-巯基)-1-丙烷硫醇中的任一种。
步骤三、向角蛋白多肽溶液中加入改性化合物对角蛋白多肽溶液中的巯基基团进行接枝改性，得到分子间具有动态共价交联体系的角蛋白再生材料。改性化合物与角蛋白多肽溶液中角蛋白的质量比为1～5:10。
如图1所示，一个具体实施例中，选用羊毛作为角蛋白原料，采用TCEP对角蛋白纤维进行还原预处理，采用质量分数为30～50％的TCEP溶液，在60～90℃下，以1:10～30的浴比在TCEP溶液中反应30～120分钟。
具体的，本实施例中选用细度为70s的澳毛作为角蛋白原料，澳毛直径为18～20μm，将羊毛纤维在80℃下，以1:10的浴比在质量分数为40％的TCEP溶液中反应60分钟。预处理完成后，将羊毛纤维中多余的TCEP溶液挤压去除后，浸入甲酸溶液中进行溶解，甲酸溶液的质量分数为85％，羊毛纤维与甲酸溶液的浴比为1:20，溶解5小时，溶解温度为50℃，完成后过滤未溶解的残渣获得角蛋白多肽溶液。
在制备角蛋白多肽溶液时，需要判断还原剂对二硫键的作用程度，即测定还原态角蛋白材料中的巯基基团含量，我们设计采用一种金属离子封闭结合氨基酸含量测试的检测方法，具体操作如下：
将TCEP溶液处理后的羊毛纤维按照浴比1:20的比例浸泡于1.5g/L的醋酸铅溶液中，在60℃的条件下反应30分钟，反应完成后充分清洗并烘干羊毛纤维。并称取200mg的羊毛纤维试样置于水解管中，加入6M纯盐酸溶液10ml，用酒精喷灯封管后置于110℃的烘箱中水解24个小时，待羊毛纤维试样完全水解后取出、冷却、开管。将水解样品过滤后定容，吸取定容后的样品2mL，置真空脱酸仪上脱酸，温度60℃，脱酸至干燥。在脱酸后的样品中加入2mL样品缓冲液，置震荡混合器上混合均匀，针管吸取少量，通过过滤孔径为0.22μm的过滤器过滤后，用日立牌L8900型氨基酸分析仪进行测试。测量未通过还原预处理的羊毛纤维中的胱氨酸含量，对比分析未还原纤维和还原处理后纤维中胱氨酸(羊毛中二硫键主要存在于胱氨酸结构内)含量的变化，判定TCEP对羊毛二硫键的还原作用程度。测试结果如表1所示。
表1TCEP还原预处理前后羊毛纤维氨基酸含量测试结果
如表1测试结果可知，还原预处理后羊毛纤维内胱氨酸含量显著减少，证明TCEP对二硫键的有效还原作用。
将还原预处理后的羊毛纤维与未处理羊毛纤维对比测试，如图2所示，证明羊毛纤维预处理后二硫键被还原为巯基基团。
测定还原预处理后的羊毛纤维中的二硫键被还原比例，直至被还原比例大于预设值。即被还原胱氨酸的质量占原材料内胱氨酸总质量的比例大于50％。
当还原预处理后的羊毛纤维中的巯基含量即被还原胱氨酸比例大于50％后，向还原预处理后的羊毛纤维中加入甲酸溶液，将还原预处理后的羊毛纤维在50～70℃下，以1:10～30的浴比浸入到质量分数为70～90％的甲酸溶液中溶解4～7h。利用酸性溶解细胞间质，使羊毛纤维快速溶解，获得角蛋白多肽溶液，甲酸溶液溶解后角蛋白提取率约为65％。
对提取所得角蛋白多肽与标准蛋白质试样进行SDS-PAGE凝胶电泳测试，如图3所示，可知，提取所得角蛋白分子质量主要集中在40～60kDa、26kDa和14.4kDa区域，具有较大分子质量。
常规情况下，角蛋白制备再生材料后，巯基(-SH)间极易相互交联再次形成二硫键(-S-S-)，未改性的再生角蛋白内，由于二硫键以及氢键的杂乱交联，多肽大分子极易相互团聚，导致材料的结晶度较低，结构和性能存在缺陷。因此本申请采用接枝角蛋白分子链上的巯基基团，以此改变分子间形成二硫键交联的链段结构。
如图4所示，对角蛋白多肽溶液中的角蛋白进行改性，利用改性化合物接枝角蛋白分子链上的巯基基团，实现巯基/二硫键动态共价交联体系在多肽间的调控构建。
其中改性化合物为至少包含两个巯基基团的抗氧化物；改性化合物具有抗氧化性，为α-硫辛酸、2,3-二巯基丙磺酸钠，二巯基噻二唑，2,3-二硫代(2-巯基)-1-丙烷硫醇中的任一种。具体的，本实施例选用α-硫辛酸(ALA)为改性化合物，在30～60℃下，将与角蛋白多肽溶液中角蛋白质量百分比为10～50％的α-硫辛酸加入角蛋白多肽溶液中充分搅拌后，反应1～4h。具体的，α-硫辛酸与角蛋白溶液中角蛋白的质量比为3：10，在40℃下，将α-硫辛酸加入至角蛋白多肽溶液中充分搅拌，反应2小时，得到分子间具有动态共价交联体系的角蛋白溶液即角蛋白再生材料。其中，α-硫辛酸的接枝质量百分比可达13％以上，改性后的角蛋白溶液的黏度得到提升，大分子链段也更加舒展。
本发明的角蛋白再生材料内构建的巯基/二硫键动态共价交联体系，可应用于膜、纤维和纳米纤维等多种形式的角蛋白再生材料。
具体的，本实施例中，获得接枝改性的角蛋白溶液后，将其采用铸膜法制备为再生角蛋白膜，将未改性的角蛋白多肽溶液和改性后的角蛋白溶液分别均匀地铺展于一定大小的玻璃平板上，控制其液面厚度，而后置于50℃的恒温烘箱中干燥24h，制备得到再生角蛋白膜。
对未改性的角蛋白多肽溶液和改性后的角蛋白溶液分别制备的再生角蛋白膜的物理结构进行观察对比。如图5所示，可知，通过α-硫辛酸接枝改性构建多肽间动态共价交联体系后，再生膜材料的物理结构变得更加均匀致密。
分别对未改性和改性后的制备的再生角蛋白膜进行拉曼光谱测试和红外测试。如图6和图7所示，测试结果证明α-硫辛酸有效通过巯基与角蛋白大分子发生接枝反应，并使角蛋白多肽间二硫键的键合形式和链段结构产生变化。同时，改性后部分多肽的分子构象由无规卷曲转变为β-折叠结构，多肽间聚集态结构变得更加有序。
分别对未改性和改性后的制备的再生角蛋白膜进行力学性能进行测试，如图8所示，可知，未改性角蛋白膜的拉伸断裂强度为8.03Mpa，断裂伸长率为0.87％。而经过改性后再生膜的断裂强度提高为17.88Mpa，伸长率则达到6.08％，其强度和韧性均得到显著改善。
分别对未改性和改性后的制备的再生角蛋白膜弯曲形态进行观察，如图9所示，可知，改性后再生角蛋白膜材料的拉伸强力、断裂伸长率和柔韧性均有明显改善，证明本发明巯基/二硫键动态共价交联体系可有效优化再生角蛋白材料的结构和机械性能。
未改性的再生角蛋白内，由于二硫键以及氢键的杂乱交联，多肽大分子极易相互团聚，导致材料的结晶度较低，结构和性能存在缺陷。本实施例利用ALA接枝角蛋白分子链上的巯基基团，以此改变分子间二硫键交联的链段结构。常规情况下，制备再生材料后，巯基(-SH)间极易相互交联再次形成二硫键(-S-S-),而经过ALA接枝改性后角蛋白分子间将形成更“长程”的二硫键链段结构(-S-ALA-S-)，化学结构上的变化会降低-S-ALA-间化学键断裂和键合所需活化能，使其在较低环境要求下形成动态共价交联效果。且ALA改性后，分子间相互作用力发生改变，分子间二硫键链段在一定条件下易于打开，有助于改善多肽分子的聚集态结构，提高材料的结晶程度，改善结构和性能缺陷。同时，分子间作用力减弱，材料受力时分子间更容易产生一定的滑移，使得材料的柔韧性也得到优化。
以上实施例仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但不能因此而理解为对本发明专利的范围约束。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应该以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种具有巯基/二硫键动态共价交联体系的角蛋白再生材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、以角蛋白原料制备含有巯基基团的角蛋白多肽溶液；
步骤二、选取改性化合物，所述改性化合物为至少包含两个巯基基团的抗氧化物；
步骤三、向所述角蛋白多肽溶液中加入所述改性化合物对角蛋白多肽分子上巯基基团进行接枝改性，得到分子间具有动态共价交联体系的角蛋白再生材料。
2.根据权利要求1所述的具有巯基/二硫键动态共价交联体系的角蛋白再生材料的制备方法，其特征在于，所述改性化合物与所述角蛋白多肽溶液中角蛋白的质量比为1～5：10。
3.根据权利要求1所述的具有巯基/二硫键动态共价交联体系的角蛋白再生材料的制备方法，其特征在于，所述改性化合物为α-硫辛酸、2,3-二巯基丙磺酸钠，二巯基噻二唑，2,3-二硫代(2-巯基)-1-丙烷硫醇中的任一种。
4.根据权利要求3所述的具有巯基/二硫键动态共价交联体系的角蛋白再生材料的制备方法，其特征在于，所述改性化合物为α-硫辛酸；
向所述角蛋白多肽溶液中加入所述改性化合物，具体为：
在30～60℃下，将所述α-硫辛酸加入所述角蛋白多肽溶液中进行搅拌，并反应1～4h；所述α-硫辛酸与所述角蛋白多肽溶液中角蛋白的质量比为1～5:10。
5.根据权利要求1所述的具有巯基/二硫键动态共价交联体系的角蛋白再生材料的制备方法，其特征在于，以角蛋白原料制备含有巯基基团的角蛋白多肽溶液，具体为：
步骤1.1、采用还原剂对所述角蛋白原料进行预处理，获得还原态角蛋白材料；
步骤1.2、将所述还原态角蛋白材料浸入甲酸溶液中溶解，获得含有巯基基团的角蛋白多肽溶液。
6.根据权利要求5所述的具有巯基/二硫键动态共价交联体系的角蛋白再生材料的制备方法，其特征在于，所述步骤1.1之后还包括：
测定所述还原态角蛋白材料中的巯基基团含量，直至所述巯基基团含量大于预设值。
7.根据权利要求6所述的具有巯基/二硫键动态共价交联体系的角蛋白再生材料的制备方法，其特征在于，测定所述还原态角蛋白材料中的巯基基团含量，具体包括：
步骤1.1.1、将所述还原态角蛋白材料浸泡于醋酸铅溶液中进行反应后清洗并烘干，获得样品A；
步骤1.1.2、将所述样品A水解后与缓冲液混合，得到A混合物；
步骤1.1.3、测量所述A混合物中的胱氨酸含量，根据胱氨酸含量确定巯基基团含量。
8.根据权利要求5所述的具有巯基/二硫键动态共价交联体系的角蛋白再生材料的制备方法，其特征在于，采用还原剂对所述角蛋白原料进行预处理，具体包括；
将所述角蛋白原料在60～90℃下，以1:10～30的浴比在质量分数为30～50％的TCEP溶液中反应30～120min。
9.根据权利要求5所述的具有巯基/二硫键动态共价交联体系的角蛋白再生材料的制备方法，其特征在于，将所述还原态角蛋白材料浸入甲酸溶液中溶解，具体包括；
将所述还原态角蛋白材料在50～70℃下，以1:10～30的浴比浸入到质量分数为70～90％的所述甲酸溶液中溶解4～7h。
10.一种使用权利要求1-9任一项所述的制备方法制备的角蛋白再生材料。
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| CN1105029A (zh) * | 1993-05-24 | 1995-07-12 | 花王株式会社 | 制备溶解蛋白质的方法 |
| CN102120753A (zh) * | 2010-12-23 | 2011-07-13 | 暨南大学 | 一种改性角蛋白材料及其制备方法和应用 |
| CN106867000A (zh) * | 2017-03-16 | 2017-06-20 | 苏州佰锐生物科技有限公司 | 一种促进角蛋白溶解及增强角蛋白材料强度的方法 |
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