CN102120753A - 一种改性角蛋白材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改性角蛋白材料及其制备方法和应用。本发明改性角蛋白材料的结构式如式（I）所示。本发明还提供了上述改性角蛋白材料的制备方法。本发明所涉及的改性角蛋白材料可实现植入人体内不可降解或缓慢降解，其降解程度可以通过控制制备工艺参数进行调节。所制备的改性角蛋白材料能应用于止血材料、水凝胶、创伤敷料、软组织填充等，还可作为组织工程化组织构建的支架材料；

Description

一种改性角蛋白材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学材料技术领域，具体涉及一种改性角蛋白材料及其制备方法和应用。

背景技术

目前国内外对角蛋白的研究主要集中于提取技术及性能研究方面，很少涉及到角蛋白材料的改性研究。

一般情况下，角蛋白分子内的二硫键使肽链内部和肽链之间发生交联，形成立体网状结构，使天然角蛋白难以溶解，给毛发中角蛋白的提取、加工及应用带来困难。要制得分子量较高、溶解性较好的角蛋白，只能通过选择性的打开二硫键、破坏氢键等方法来实现。目前提取角蛋白的方法大致有机械法、化学法和生物法等，其中化学法又可分为酸碱水解法、还原法和氧化法等。其它方法和化学法往往可相互结合应用。还原法的反应条件比较温和，对肽链的破坏程度较小，获得的角蛋白产品分子量较高，产率也较高，通常是首选的化学提取方法。

目前国内外应用的还原法的一般做法是用高浓度的尿素溶液处理羽毛或毛发粉状原料，以使角蛋白溶胀，然后加入巯基乙醇溶液在一定的温度下反应提取一段时间, 滤去未溶解的原料，经超滤或透析处理后，再离心分离得到角蛋白溶液；或者是先离心分离，再用盐析法从离心分离所得的上层清液中析出角蛋白，然后将此角蛋白溶于氨水、水或水和低级醇的混合液中， 重新形成角蛋白溶液。

在国内外文献中，所用还原剂一般为巯基化合物，如巯基乙酸钠、巯基乙醇、巯基乙酸和二硫代苏糖醇。为了获得化学性质稳定、力学性能较好的角蛋白材料，现有的研究报道主要是通过化学交联剂的作用，以实现角蛋白分子间的交联，增强角蛋白材料的强度和抗体内降解能力。常用的交联剂为戊二醛、六次甲基二异氰酸酯、碳化二亚胺、（聚）乙二醇脱水甘油醚类、环氧氯丙烷等化学物质。这些方法在角蛋白交联过程中存在引入有毒化学成分、酸或碱对角蛋白的降解、缺乏选择性、交联反应不可逆、对角蛋白分子结构破坏较大等等缺陷，严重影响角蛋白作为生物医学材料的应用。

发展新的角蛋白分子改性技术和方法，以达到在温和的反应条件下，应用安全性更高的试剂，在有效保持角蛋白分子结构特征和生物活性的基础之上，实现角蛋白分子的有效、可逆的交联改性，如形成更多二硫键，以形成稳定性更好，更难降解或降解速率可以调节的新型角蛋白材料，具有巨大的发展前景和应用空间。

发明内容

本发明的目的在于根据现有的角蛋白分子改性效果中存在的结构破坏大、交联反应不可逆、缺乏选择性、易于降解等问题，提供一种难以降解及降解程度在一定范围内可以调节的改性角蛋白材料。

本发明的另一目的在于提供上述改性角蛋白材料的制备方法。

本发明还有一个目的在于提供上述改性角蛋白材料的应用。

一种改性角蛋白材料，其结构式如式（ I）所示：其中，R1, R2分别代表角蛋白分子中与丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基相连的其它氨基酸残基；R5, R6分别代表角蛋白分子中与赖氨酸、精氨酸相连的其它氨基酸残基；R3代表角蛋白分子中丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的侧基；R4代表角蛋白分子中赖氨酸、精氨酸残基的侧基；R7, R8分别代表连接到羟基和氨基上的引入的巯基化修饰基团；左上框代表丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基，右上框代表赖氨酸、精氨酸残基，下框代表巯基化修饰后新形成的二硫键。

式（I）。

本发明制备改性角蛋白材料的基本思路是采用盐酸胍和巯基乙酸作为角蛋白萃取试剂，提取制备还原角蛋白溶液，同时利用巯基化试剂的双（多）官能团特性，与角蛋白分子链中丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸侧基中的羟基或者赖氨酸、精氨酸侧基中的活泼氨基发生反应，引入高密度巯基，使最终形成的富巯基化改性角蛋白分子中除了由角蛋白自身的二硫键还原生成的巯基外，还增加了原角蛋白分子链上氨基酸残基中的氨基和羟基与巯基化试剂反应后生成的新的巯基。如此，通过双（多）官能团巯基化试剂的偶联反应大大提高了角蛋白分子中的巯基密度，最后通过氧化，可生成大量新的二硫键，达到角蛋白的富巯基化改性。

本发明改性角蛋白材料的制备方法包括如下步骤：

（1）角蛋白提取和二硫键的还原；

（2）角蛋白分子的巯基化修饰；

（3）巯基化角蛋白的氧化交联，得到改性角蛋白材料。

作为一种优选方案，步骤（2）中所述巯基化修饰包括氨基巯基化修饰和羟基巯基化修饰；所述巯基化修饰时所用的试剂为巯基乙酸，2-巯基丙酸，3-巯基丙酸，D-半胱氨酸，L-半胱氨酸，巯基丁酸，巯基异丁酸，2,3-二巯基丁二酸及其钠盐、钾盐、铵盐，6-巯基烟酸，2-氨基-4-巯基丁酸，环硫乙烷（硫杂环乙烷），环硫丙烷（硫杂环丙烷），环硫氯丙烷，硫杂环丁烷及其取代产物或巯基钠。

本发明的技术特点在于独辟蹊径，在提取到的还原角蛋白溶液中，通过双（多）官能团巯基化试剂与角蛋白分子链中丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸侧基中的羟基或者赖氨酸、精氨酸侧基中的活泼氨基进一步发生酯化或酰胺化或取代反应，从而在角蛋白分子中引入新的巯基，即形成富巯基化角蛋白。最后通过巯基的自然氧化在改性角蛋白分子间形成二硫键，实现角蛋白分子的交联。通过二硫键交联制备改性角蛋白材料的最大优势在于可以通过加入含巯基试剂如巯基乙醇、巯基乙酸、二硫代苏糖醇等重新将改性角蛋白分子中的二硫键还原成游离巯基，即角蛋白的交联可以实现可逆交联。一方面使角蛋白在水性溶剂中的溶解能力增强，另一方面，可以利用巯基极易氧化形成二硫键的特点实现原位交联，即先植入体内后实现交联。同时该技术方案中不需要添加化学交联剂，不引入新的杂质成分，大幅度减少纯化步骤，可在很大程度上拓展角蛋白材料在生物医学材料领域的应用。

本发明改性角蛋白的制备过程中，步骤（1）的角蛋白提取和二硫键的还原为：

，

此处R1, R2分别表示角蛋白分子中与半胱氨酸相连的其它氨基酸残基。

步骤（2）中的氨基巯基化为：

，

此处R1表示角蛋白分子中的赖氨酸或精氨酸的侧基，R2代表组成角蛋白分子的其它氨基酸残基；

羟基巯基化为：

，

此处R1表示角蛋白分子中的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的侧基，R2代表组成角蛋白分子的其它氨基酸残基。

步骤（3）中的巯基化角蛋白的氧化交联为：

此式中R1表示角蛋白分子中的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的侧基， R3代表角蛋白分子中赖氨酸、精氨酸侧基。R2，R4分别代表组成角蛋白分子的其它氨基酸残基。

上述步骤中，所述巯基化修饰时所用的催化剂为4-二甲氨基吡啶、碳化二亚胺或N,N’-羰基二咪唑。

作为一种最优选方案，上述制备过程中，巯基化修饰时，角蛋白与巯基化试剂的质量比为1:0.01~1:100；反应温度为室温至120℃；反应时间为1~48小时；催化剂用量占反应物总质量的0.01~10%。

综上所述，本发明是通过巯基乙酸和盐酸胍能将毛发中的角蛋白溶解，由于巯基乙酸及其它前面提到的双（多）官能团巯基化试剂还可以与毛发中角蛋白分子链中丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸侧基中的羟基或者赖氨酸、精氨酸侧基中的活泼氨基发生反应，引入新的巯基。由于与相应氨基酸残基中的羟基和氨基反应后生成的巯基是额外增加的，所以在与巯基化试剂反应后，毛发角蛋白分子中的巯基含量大幅度增加，经氧化后，巯基形成二硫键，使得改性后的角蛋白分子交联程度显著增加，其化学稳定性极大增强，从而可改变角蛋白容易发生生物降解的特征，使其适合于作为体内长期植入性材料，可用于止血材料、水凝胶、创伤敷料、软组织填充或作为组织工程化组织构建的支架材料。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明改性角蛋白材料是一种新型的不溶或较难降解的或降解速率可以调节的角蛋白材料；

（2）本发明改性角蛋白材料的制备方法简单，不需要进行复杂的化学反应，可实现规模化生产；

（3）本发明改性角蛋白材料的制备方法采用含巯基的双（多）官能团分子作为改性试剂，改性过程中不采用有毒、有刺激性或可能对人体产生不良影响的溶剂或其它化学试剂；

（4）本发明是通过引入高密度的巯基对还原角蛋白进行改性，制备富巯基化角蛋白材料

（5）本发明通过氧气/空气氧化富巯基化的还原角蛋白，产生高密度二硫键，实现角蛋白分子的交联，同时交联后的角蛋白可以重新用还原剂成可溶性角蛋白，即该交联过程可逆；

（6）本发明不改变角蛋白的基本化学特性和体内应用特征，同时可提高角蛋白的稳定性，达到在体内生理环境难溶或不溶，显著提高其耐降解能力，实现长期植入性的功能。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1

（1）取人头发，用表面活性剂清洗，去离子水反复冲洗干净，80℃烘箱中烘干。

（2）装入索氏提取器，1：1乙醇乙醚混合溶剂脱脂6h，去离子水反复漂洗干燥备用。

（3）洗净脱脂后的人发浸泡于30%双氧水与浓氨水混合溶液（体积比3:1）中，室温下保持1h，使人发完全脱除色素。再经洗涤烘干。

（4）配制巯基乙酸0.2mol/L和盐酸胍6mol/l的溶液。经脱脂处理后人发样品，按照质量比1:100浸泡于提取溶液中，室温浸泡2h，50℃下反应12h。

（5）提取液过滤后离心分离，滤液经截留相对分子质量为12~14KD透析膜对水透析36h左右，得到无色透明还原角蛋白溶液。

（6）角蛋白溶液经浓缩后冷冻干燥，得角蛋白粉末。

（7）角蛋白粉末重新溶解于0.5mol/l的巯基乙酸溶液中，加入适量4-二甲氨基吡啶作为催化剂，55℃下反应2h，得巯基化角蛋白溶液。

（8）巯基化角蛋白溶液再次按照步骤（5）透析处理，得到纯净的巯基化角蛋白溶液。

（9）经纯化后的巯基化角蛋白溶液于室温下通入氧气，直至角蛋白形成白色絮状沉淀物从溶液中分离。得到角蛋白凝胶。

（10）角蛋白凝胶经冷冻干燥得到白色的富含二硫键的交联角蛋白粉末。

实施例2

（1）取人发，洗衣粉浸泡清洗，去离子水反复冲洗干净，80℃烘箱中烘干。

（2）装入蒸馏烧瓶，加入占人发10倍质量的氯仿，回流萃取，脱脂4h，分离出氯仿，加入10倍质量的丙酮，室温搅拌1h后，滤除丙酮，发样用去离子水反复漂洗干燥备用。

（3）脱脂洗净后的人发浸泡于30%双氧水中，室温下保持3h，使人发完全脱除色素。再经洗涤烘干。

（4）配制巯基乙醇0.5mol/L和盐酸胍8mol/l的溶液。

（5）经脱脂处理后人发样品，按照质量比1:100浸泡于提取溶液中，室温浸泡2h后，60℃下反应12h。

（6）提取液过滤后离心分离，滤液经截留相对分子质量为12~14KD超滤膜超滤浓缩至原样品体积的1/3，得到无色透明还原角蛋白溶液。

（7）再加入10倍体积的去离子水，继续超滤浓缩到1/10体积，浓缩液冷冻干燥，得角蛋白粉末。

（8）角蛋白粉末重新溶解于2.0mol/l的巯基丙酸溶液中，加入适量4-二甲氨基吡啶作为催化剂，70℃下反应1h，得巯基化角蛋白溶液。

（9）巯基化角蛋白溶液再次按照步骤（6，7）超滤处理，得到纯净的巯基化角蛋白溶液。

（10）经纯化后的巯基化角蛋白溶液于室温下通入氧气，直至角蛋白形成白色絮状沉淀物从溶液中分离。得到角蛋白凝胶。

（11）角蛋白凝胶经冷冻干燥得到白色的富含二硫键的交联角蛋白粉末。

Claims (8)

1.一种改性角蛋白材料，其特征在于其结构式如式（ I）所示：其中，R1, R2分别代表角蛋白分子中与丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基相连的其它氨基酸残基；R5, R6分别代表角蛋白分子中与赖氨酸、精氨酸相连的其它氨基酸残基；R3代表角蛋白分子中丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的侧基；R4代表角蛋白分子中赖氨酸、精氨酸残基的侧基；R7, R8分别代表连接到羟基和氨基上的引入的巯基化修饰基团；左上框代表丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基，右上框代表赖氨酸、精氨酸残基，下框代表巯基化修饰后新形成的二硫键；

式（I）。

2.权利要求1所述改性角蛋白材料的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）角蛋白提取和二硫键的还原；

（2）角蛋白分子的巯基化修饰；

（3）巯基化角蛋白的氧化交联，得到改性角蛋白材料。

3.根据权利要求2所述改性角蛋白材料的制备方法，其特征在于所述巯基化修饰包括氨基巯基化修饰和羟基巯基化修饰。

4.根据权利要求3所述改性角蛋白材料的制备方法，其特征在于所述巯基化是对角蛋白分子链中丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸侧基中的羟基或者赖氨酸、精氨酸侧基中的活泼氨基发生反应，引入高密度的新的巯基，最终形成富巯基化改性角蛋白。

5.根据权利要求2所述的改性角蛋白材料的制备方法，其特征在于所述巯基化修饰时所用的试剂为巯基乙酸，2-巯基丙酸，3-巯基丙酸，D-半胱氨酸，L-半胱氨酸，巯基丁酸，巯基异丁酸，2,3-二巯基丁二酸及其钠盐、钾盐、铵盐，6-巯基烟酸，2-氨基-4-巯基丁酸，环硫乙烷（硫杂环乙烷），环硫丙烷（硫杂环丙烷），环硫氯丙烷，硫杂环丁烷及其取代产物或巯基钠。

6.根据权利要求4所述的改性角蛋白材料的制备方法，其特征在于所述巯基化修饰时所用的催化剂为4-二甲氨基吡啶、碳化二亚胺或N,N’-羰基二咪唑。

7.根据权利要求6所述的改性角蛋白材料的制备方法，其特征在于巯基化修饰时，角蛋白与巯基化试剂的质量比为1:0.01~1:100；反应温度为室温至120℃；反应时间为1~48小时；催化剂用量占反应物总质量的0.01~10%。

8.权利要求1所述改性角蛋白材料在止血材料、水凝胶、创伤敷料、软组织填充材料或作为组织工程化组织构建的支架材料中的应用。