CN1105029A - 制备溶解蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种溶解蛋白质的制备方法,将含
二硫键的水不溶性蛋白质物质中的二硫键还无成巯
基,再部分或全部转变成羧甲基二硫基。该方法特别
包括(a)用还原剂的碱性水溶液处理含二硫键的水不
溶性蛋白质物质,和(b)在弱酸性至弱碱性条件下,
在氧化剂存在下,将步骤(a)处理所得的蛋白质与巯
基乙酸反应。本发明还公开了再生蛋白制品的制备
方法,包括在溶解蛋白质中再生二硫键。
Description
本发明涉及增溶水不溶性和含二硫键蛋白质的方法,这些蛋白质来源于羊毛和其它如动物毛发、人毛发及其它包含蛋白质的物质。此外,本发明还涉及通过再生溶解蛋白质以用于再生蛋白制品如再生蛋白膜和再生蛋白纤维的方法。
众所周知,羊毛中所含的角蛋白,因其具有极好的吸湿性和释水性,而这种特性与空气中的湿度有关,而显得珍贵。这些性质是一种复合物的特性,而这种复合物由具有α-螺旋结构的纤维角蛋白(纤维的结晶部分)和无定形基质蛋白(其分子之间二硫键(-SS-)互相交联)组成。
在增溶具有这些优良物理性能的角蛋白纤维使其再循环上已作了各种尝试。例如,一种已知的方法是用氧化剂处理巯基乙酸钠的水溶液以改善巯基乙酸的还原力。然后,将所得到的部分氧化的巯基乙酸钠水溶液(它已部分转变为巯基二乙酸钠)施用于羽毛,以产生具高粘度和高分子量角蛋白的水溶液(JP-A-53-119900;本文所用的术语“JP-A”表示“未经审查的公开日本专利申请”)。另一种已知的方法是用100%的巯基乙酸在加热条件下处理羊毛使其溶解(JP-A-4-91138)。还有一种已知的方法是通过加入脂族多元醇使角蛋白膜韧化和软化(JP-B-55-33826;本文所用术语“JP-B”表示“经审查的日本专利出版物”)。最后,一种已知的方法是用还原剂来处理羊毛,将所得到的含巯基的蛋白质溶于中性缓冲液中,通过紫外线照射可形成二硫键或交联键,在该溶液中形成可用作细胞培养床的蛋白膜(JP-A-60-160883)。
但是,所有这些传统的方法均有不利之处,因为所用的蛋白增溶方法是通过还原反应将二硫键转变为巯基。蛋白质纤维(如羊毛)因其二硫键交联密度高,故增溶率低。巯基依然存在的增溶蛋白不易溶解于中性水溶液。而且,它们易被空气氧化而形成二硫键,从而变得不溶于水。
当用剧烈的处理(如热处理)未提高增溶率时,蛋白质将会分解。
JP-A-4-91138中所描述的方法缺点在于所得的溶液粘度降低,表明形成了低分子量的蛋白质分子。
本发明的目的是发展一些技术,它们不仅在增溶具有高二硫键交联密度的动物纤维蛋白上有效,而明还能有效地:(1)在溶解的蛋白质中保持角蛋白的分子量和α-螺旋一级结构而无实质上的肽键断裂;(2)获得高的蛋白质水溶解度;及(3)产生能形成二硫键交联结构的增溶蛋白质,以用于再生蛋白制品。
本发明者们已进行了广泛的研究,旨在克服传统方法的缺点,结果发现,角质化组织,例如动物和人毛发(如羊毛、羽毛类)、蹄或足,及其它含角蛋白的物质因含有二硫键而不溶于水,用巯基乙酸水溶液进行处理,来还原二硫键,并在巯基乙酸存在下将所得产物氧化,形成混合的二硫化物(羧甲基二硫化物),这样得到的蛋白质可溶于水。
本发明提供溶解蛋白质的制备方法,包括:
(a)用还原剂的碱性水溶液处理含二硫键的水不溶性蛋白的物质;和
(b)在弱酸性至弱碱性条件下,在氧化剂的存在下,将从步骤(a)来的含二硫键的水不溶性蛋白的物质与巯基乙酸反应。
本发明还进一步涉及到再生蛋白制品的制备方法,包括使上述方法所获得的溶解蛋白质形成所需形状,然后再生蛋白质中的二硫键。
图1显示溶解的羊毛角蛋白蛋白质的氨基酸组成。
图2显示用本发明方法制得的溶解蛋白质的园二色散(CD)谱。
按照本发明,将含二硫键的水不溶性蛋白质中的二硫键(-SS-)还原成巯基(-SH),接着将部分或全部巯基转变成羧甲基二硫基(-SSCH2COOH),从而可以得到溶解性蛋白质。
用于本发明的含二硫键的水不溶性蛋白质包括动物毛发、羽毛、蹄足、角、爪的天然角蛋白及其它类似蛋白质。虽非特别限定,动物毛发的说明性例子包括美利奴绵羊,林肯绵羊及其它类似绵羊的羊毛和人发。
将水不溶性蛋白物质切碎,或需要时研成粉,然后浸泡在含还原剂的碱性水溶液中使其还原。
任何还原剂若溶于水,均可用于此还原反应中。较好的还原剂包括巯基乙酸及其盐、硫羟乳酸及其盐、硫甘油、二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、半胱胺、谷胱甘肽、硫脲、三正丁基膦、氢硼化钠等,其中巯基乙酸及其盐特别好。巯基乙酸和硫羟乳酸的盐的具体例子包括铵盐、钠盐和钾盐。
还原剂用量可由水不溶性蛋白质中的二硫键数目来估算,而后者可通过测定巯基计算得到。通常其用量为每克水不溶性蛋白质用0.0005-5摩尔,较佳为0.005-0.05摩尔。水溶液中的还原剂浓度较佳为0.01-10M,更佳为0.1-1M。
当用巯基乙酸作为还原剂时,其用量可考虑为:它不仅还原水不溶性蛋白质中的二硫键为巯基,而且对后续反应中氧化形成羧甲基二硫键也应是足够的。
还原剂碱性水溶液的pH值以7-13为佳,9-12为更佳。当用酸作还原剂时,可用一种或几种碱性试剂调节水溶液的pH值,碱性试剂宜选自氢氧化钾、氢氧化钠、氨、单乙醇胺和二乙醇胺,以及选自碱性氨基酸(如精氨酸和赖氨酸)、碳酸氢钠、碳酸氢铵等。总之,碱性试剂的种类没有特殊限制。
如若需要,可在还原步骤之后使用蛋白变性剂。2-8M尿素或2-5M盐酸胍的水溶液可用作蛋白变性剂。在搅拌条件下将经还原的水不溶性蛋白质浸泡在0-40℃的蛋白变性剂水溶液中1-48小时,这样可进行蛋白变性的处理。
在还原反应完成并任意选择地用蛋白变性剂处理之后,在氧化剂存在的条件下,蛋白质和巯基乙酸将相互反应。当还原反应中用巯基乙酸作还原剂且在反应系统中仍保持足够量时,它可被用于此氧化反应。
当还原处理中使用巯基乙酸之外的还原剂时,用过滤法收集还原处理的蛋白质以除去还原剂溶液,然后将其浸泡于巯基乙酸水溶液中。
巯基乙酸可使用这样的量以使水溶性蛋白质中的巯基被氧化转变为羧甲基二硫化物。通常,它的用量为每克蛋白质0.0005-0.5摩尔,以0.005-0.05摩尔/克蛋白质为佳。反应系统中巯基乙酸的浓度为0.01-10M,以0.1-1M为佳。
蛋白质与巯基乙酸的反应可在用酸将溶液的pH值调至弱酸性到弱碱性的情况下进行,pH值在5-9的范围内较佳,在pH6-8范围内更佳。所用酸没有特别限制,可选用诸如乙酸、乳酸、洒石酸和琥珀酸之类有机酸和磷酸等无机酸。
虽然未作特别限定,氧化剂可选用氧、溴酸钠、溴酸钾、过氧化等及类似物。
氧化反应可在0-40℃下进行,在反应系统中通入氧气气泡或加入一种上述氧化剂的水溶液即可。当巯基产生的臭味变得不可检出时,或将反应液中取出的适量样品加到0.1M二硝基二苯甲酸钠中性水溶液中,于412nm处测定所得混合物的收吸值,而巯基的消失已可确认时,这样氧化反应即已完成。
如果需要,可用适当的提纯方法将这样得到的溶解蛋白质进一步提纯。例如,将溶解的蛋白质水溶液经透析法(如电渗折法),可除去还原剂和蛋白变性剂如尿素的氧化产物,低分子量多肽类,电解质类等。如果需要,可借助过滤或离心法除去不溶性物质。
本发明方法所得到的溶解蛋白质具有如下性质:
(1)氨基酸分析:
在羊毛蛋白质中原来不存在的羧甲基二硫键在增溶的蛋白质中形成了(图1)。
(2)分子量:
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得分子量为40,000-60,000,在此情况下,在凝胶的几万道尔顿低分子量区域来检出发色观象,这是在处理过程中蛋白质的水解引起的。
(3)圆二色散谱(CD)
在209nm和222nm处检出负峰,表明在水中形成了α-螺旋结构。
从上述结果表明,本发明的溶解蛋白质的结构中,相应的水不溶性蛋白质中部分或全部二硫键(-SS-)裂解形成的巯基(SH)被羧甲基二硫基(-SSCH2COOH)所置换。
由于这些羧甲基二硫基在通常条件下不能转化为胱氨酸二硫键,因此溶解的蛋白质可长期稳定地保存于溶液中。
虽然按本发明方法制得的溶解蛋白质溶于水,但在氧化条件下可再形成胱氨酸二硫键,再生成水不溶性-SS-交联结构。
因此,按本发明制备的溶解蛋白质可用作再生蛋白质制品的材料,例如任意形状的再生蛋白膜和再生蛋白纤维,它们与原来的水不溶性蛋白质具有同样的性质。
这样的再生蛋白膜和纤维可由以下方法制备:a)将按本发明方法制得的溶解蛋白质直接或在用还原剂还原后对水进行渗折,然后通过氧化在多肽中或多肽之间再生成二硫键;或b)将溶解蛋白质模塑成膜或纤维,然后按上述方法在其中再生成二硫键。
此外,在再生其他可利用的蛋白质如胶原、弹性蛋白、丝蛋白和其他类似蛋白质时,通过联合使用天然高分子化合物(如多糖类等)及其衍生物或已知的合成高分子化合物溶液,可制备一些复合材料和物质。
本发明的增溶方法可以高效率地从水溶性蛋白质制成溶解蛋白质。而且,由于反应产物既非强碱性也非强酸性,其后续处理可安全、简便地进行。
此外,按本发明方法制备的溶解蛋白质,即具有羧甲基二硫基的蛋白质,作为制备再生蛋白制品(如再生蛋白膜和再生蛋白纤维)的材料显然是极为有价值的,因为通过将溶解蛋白质模塑成任意形状,再将模塑品还原,接着氧化,使二硫键有效地再生,这样可以重新再回复成原来的水不溶性蛋白质。
例如,采用以下方法可获得再生蛋白膜,该方法包括:
(1)将溶解蛋白质的水溶液铺展在平板上;
(2)将步骤(1)中铺展在平板上的水溶液干燥,以形成溶解蛋白质的膜;
(3)将步骤(2)中所得的膜与还原剂反应;
(4)用含增塑剂的有机溶剂和水的混合溶剂洗涤步骤(3)所得的膜;
(5)干燥步骤(4)所得的膜;和
(6)在水存在的条件下,从平板上揭下所得到的再生蛋白质膜。
步骤(1)中所用的溶解蛋白质在水溶液中的浓度以1-5%(重量)为佳。水溶液可进一步含有1-3%(重量)的增塑剂。
至于铺展溶解蛋白质水溶液的板,可使用各种类型的板,其较佳的例子包括聚四氯乙烯板、聚丙烯板和聚碳酸酯板。
将溶解蛋白质水溶液铺展在平板上,然后干燥1-3天(最好在干燥器中的硅胶上干燥),形成膜。
此后,将膜与还原剂反应,这时溶解蛋白质上的羧甲基二硫基被还原转变成巯基。反应最好在弱碱性条件(即pH8-11)下,在有增塑剂存在的含水和有机溶剂的混合溶剂中进行。在这种情况下,最好先混合有机溶剂和还原剂水溶液制成溶液,然后再加入增塑剂,将溶液喷雾在溶解蛋白质膜上或将溶解蛋白质膜连同平板一起浸入溶液,从而进行反应。溶液中所含有的还原剂浓度以0.1-2M为宜。有机溶剂与所混合的还原剂水溶液的体积比以90/10-70/30为宜。加到溶液中的增塑剂的量为5-20%(重量)为宜。通常,反应在室温下一般进行1/6-1/2小时。
在和还原剂的反应完成之后,用含增塑剂的有机溶剂与水的混合溶剂洗涤膜。混合溶剂中所含增塑剂的量为5-20%(重量)。所混合的有机溶剂和水的体积比以90/10-70/30为宜。
然后,将膜在80-100℃空气中干燥1/10-1/4小时,此时膜中的巯基被氧化转变成二硫键。
此后,可在水存在的条件下将膜从板上揭下,得到无色透明的角蛋白膜。此时,可将膜连同平板一起浸在水中,然后在水中从板上揭下来。或者,可通过用水冲洗,将膜从板上揭下。
增塑剂的类型包括甲基溶纤剂、乙基溶纤剂,丙基溶纤剂,卡必醇和甘油,尤其甘油为佳。有机溶剂的例子包括甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇和丙酮,以甲醇为佳。还原剂的例子包括巯基乙酸和硫二甘醇,以巯基乙酸为佳。
由于蛋白制品与人发、指甲和皮肤组织具有类似的性质并且可制成任意的形状,因此按本发明方法生产的溶解蛋白质在美容和医药领域中也是有价值的。
此外,用按本发明方法制备的溶解蛋白质来作为重金属俘获剂等也是可能的,因为它的结构中含有羧甲基二硫基,当在需要时可成为不溶于水的物质。
为了阐述本发明的具体实施方案提供以下实施例,它们不应被认为是对本发明范围的限制。除非特别指明,所有份、百分率和比率均以重量计。
实施例1
用以3M氢氧化钠预先调节成pH9.6的0.2M巯基乙酸水溶液50ml,将1.0g美利奴羊毛在30℃条件下处理3小时。再在这样处理后的混合物中加入24g尿素(终浓度8M),30℃条件下搅拌24小时以加速还原反应。然后,滴加乙酸调节反应液至pH值为7,接着通过在反应系统中缓缓通入气泡进行3天氧化处理。在此期间,巯基特有的气味将消失。
用能分离分子量10,000或更小分子的渗析膜将上面得到的溶液渗析,从而从溶液中除去尿素等。接着,于2,500rpm离心10分离,将渗析步骤所沉淀出的水不溶性物质分离,得到人们感兴趣的水溶的羊毛角蛋白的粘溶液。
将此溶液冷冻干燥后,称量所得溶解蛋白质粉末的重量,计算出其增溶比为51.4%。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测溶解蛋白质的分子量,在凝胶上相当于分子量40,000和80,000的位置可检出两种角蛋白的特异条带。在凝胶上相当于低分子量水解蛋白产物的区域未见显色。
实施例2
用以3M氢氧化钾预先调节成pH值为10的1.0M2-巯基乙醇水溶液50ml将1.0g羊毛在30℃条件下处理3小时。然后过滤收集经还原处理膨胀了的羊毛,与预先以3M氢氧化钾调节成pH值为10的0.2M巯基乙酸水溶液50ml混合,再与24g尿素(终浓度8M)混合,在30℃下搅拌24小时,加速还原反应。接着,滴加乙酸调节所得溶液至pH值为7,再滴加1M溴酸钠水溶液50ml,室温下氧化处理2小时。在此期间,巯基特有的气味将消失。
用能分离分子量10,000或更小分子的渗析膜将上面得到的溶液渗析,从而从溶液中除去尿素等。接着,于2,500rpm离心10分钟,将渗析步骤所沉淀出的水不溶性物质分离,得到人们感兴趣的水溶的羊毛角蛋白的粘溶液。
将此溶液冷冻干燥后,称量所得溶解蛋白质粉末的重量,计算出其增溶比53%。按实施例1同样的方法,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测溶解蛋白质的分子量,在凝胶上相当于分子量40,000和80,000的位置可检出两种角蛋白的特异条带。在凝胶上相当于低分子量水解蛋白产物的区域未见显色。
实施例1
溶解的羊毛角蛋白的氨基酸组成
用1ml6N盐酸将实施例1中得到的溶解羊毛角蛋白1.4mg进行水解,减压干燥成固体,再溶于2ml0.02N盐酸中。然后,用氨基酸分析仪(L-8500,日立株式会社制)分析10ml这样制得的溶液。分析结果见图1。
由图1所示结果表明,原羊毛蛋白质中不存在的胱氨酸-巯基乙酸二硫键在溶解蛋白质中形成了。
实施例2
人发母细胞硬角蛋白抗体的免疫活性
按实施例1的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结将溶解蛋白质分离,并经还原反应得到再生蛋白质。将这样得到的再生蛋白质转移到聚二氟乙烯膜上,按J.Cell Biol.,Vol.103,p.2593(1987)所公开的方法测定其对从人发母细胞硬角蛋白制得的抗体的活性。还原反应处理前的样品是溶解蛋白质,它对抗体不显示活性,然而还原反应处理后所得到的再生二硫键的蛋白质对抗体则显示活性。
实验例3
园二色散(CD)测定:
将实施例1中得到的水溶的羊毛角蛋白的冷冻干燥粉末一份2mg溶于2ml离子交换蒸馏水。用CD/ORD分光计(A-20型,JASCO制)在200-250nm波长范围内,用1mm样品杯,测定如上制得的溶液的园二色散。结果见图2。
由图2结果表明,增溶的蛋白质在水中形成α-螺旋结构,因为其溶液的波谱在209和222nm处有负峰。
实施例3
在1.0g人发中加入3M氢氧化钾水溶液50ml,调节pH至11。将其与50ml0.2M巯基乙酸水溶液混合,并于50℃下处理20分钟,然后加入24g(终深度8M)尿素。接着将溶液于30℃下搅拌24小时,以加速还原反应。
然后,滴加乙酸将所得溶液调节至pH值为7,并在反应系统中通入气泡进行3天氧化处理,得到溶解的角蛋白水溶液。在此期间,巯基特异性气味将消失。
用渗析膜对这样得到的溶液进行渗析,从该渗析膜可除去分子量10,000或更小的分子,从而从溶液中除去尿素等。接着,于2,500rpm离心10分钟,分离出渗析步骤中所沉淀出的水不溶性物质,得到溶解的人发角蛋白溶液。
将此溶液冷冻干燥后,称量所得溶解蛋白质粉末的重量,计算出其增溶比为31.7%。
实施例4
将2%(重量)甘油加到3%(重量)溶解蛋白质水溶液中,将所得混合物铺在特氟隆平板上。当混合物干燥,在平板上形成膜后,将预先混合的90%(体积)乙醇与10%(体积)1M巯基乙酸水溶液(pH=9.0)中加入10%(重量)甘油所制成的溶液喷雾到膜上。静置10分钟后,将所得的膜连同平板一起浸在一溶液中进行洗涤,该溶液的配制:将80%(体积)乙醇和20%(体积)水混合并加入10%(重量)甘油。然后,将所得的膜在100℃下干燥10分钟,再用水洗涤,由此得到无色透明的再生角蛋白膜,它在水中可以膨胀但不能溶解。
用氨基酸自动分析仪测得用于制备再生角蛋白膜的溶解蛋白质中胱氨酸残基的数目为每1,000个氨基酸残基中有29个,而用甲基碘汞借助极谱法分析,测得制成的再生角蛋白膜上的胱氨酸残基和半胱氨酸残基的数目分别为20和12。
所得的再生角蛋白膜厚度为20μm,它在温度20℃、相对湿度65%下的杨氏系数为10.0×107N/m2,抗断强度为3.5×106N/m2,抗断拉伸为15%。
虽然本发明已被详细描述并有具体实施例参考,而对于本领域的技术人员来说,显然可在其中进行各种变化和修改而不背离其本旨和范围。
Claims (5)
1、溶解蛋白质的制备方法,其特征在于包括:
(a)用还原剂的碱性水溶液处理含二硫键的水不溶性蛋白质物质;和
(b)在弱酸性至弱碱性条件下,在氧化剂的存在下,用巯基乙酸处理从步骤(a)来的所述含二硫键的水不溶性蛋白质的物质。
2、按权利要求1所述的方法,其中所述的还原剂包括巯基乙酸。
3、按权利要求1所述的方法,其中所述的氧化剂包括空气或氧气。
4、按权利要求1所述的方法,其中所述含二硫键的水不溶性蛋白质的物质选自动物的毛发、羽毛、蹄足、角和爪等。
5、再生蛋白制品的制备方法,其特征在于包括:
(a)用还原剂的碱性水溶液处理含二硫键的水不溶性蛋白质的物质;
(b)在弱酸性至弱碱性条件下,在氧化剂的存在下,将从步骤(a)来的所述含二硫键的水不溶性蛋白质的物质与巯基乙酸反应;
(c)回收溶解的蛋白质;
(d)将所述溶解的蛋白质成形;及
(e)在所述的溶解蛋白质中再生二硫键。
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