CN113896763B - 一种类蛇毒三肽的合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种类蛇毒三肽的合成方法，属于多肽制备方法技术领域，具体为：以Fmoc‑Dab(Boc)‑OH、苄胺、Boc‑β‑Ala‑OH和H‑Pro‑OMe·HCl为原料合成类蛇毒三肽粗品，然后利用高效液相色谱、阴离子交换色谱相结合的方法对类蛇毒三肽粗品进行纯化得到高纯类蛇毒三肽，合成工艺路线短，分离纯化效果高，所得高纯类蛇毒三肽纯度，收率高。

Description

一种类蛇毒三肽的合成方法

技术领域

本发明属于多肽制备方法技术领域，具体涉及一种类蛇毒三肽的合成方法。

背景技术

类蛇毒三肽(H-β-Ala-Pro-DAB-NH-Bzl)是一种模拟蛇毒毒素活性的小分子多肽，研究发现，类蛇毒三肽可通过松弛面部肌肉、减少肌肉收缩而达到平滑和祛皱的目的。目前欧美、韩国、泰国等国已经研发出含有类蛇毒三肽的化妆品，类蛇毒三肽作为化妆品新型的美容成分也越来越热门。

目前，常规合成类蛇毒三肽的方法大多为液相合成和固相合成，但是液相合成的方法步骤较多，比较繁琐，全部采用液相合成方法得到的类蛇毒三肽粗品的纯度不高，总产率也不高，后续纯化收率低；采用固相合成，纯化难度较大，收率也极低，采用固相合成或液相合成都不可避免各方法的局限性。因此开发工艺简便、成本较低、纯度高的类蛇毒三肽合成方法，对广泛使用于化妆品的类蛇毒三肽有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种方法简单、收率高、产品纯度高的类蛇毒三肽的合成方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种类蛇毒三肽的合成方法，包括下述步骤：

S1、合成H-Dab(Boc)-NHBzl：

在四氢呋喃中，Fmoc-Dab(Boc)-OH(Nα-芴甲氧羰基-Nγ-叔丁氧羰基-L-2,4-二氨基丁酸)、苄胺、NMM(N-甲基吗啡啉)、EDCI(1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺)反应得到Fmoc-Dab(Boc)-NHBzl，然后用包含哌啶的四氢呋喃溶液脱除Fmoc保护基，得到H-Dab(Boc)-NHBzl；

S2、合成Boc-β-Ala-Pro-OH：

在四氢呋喃中，Boc-β-Ala-OH(N-叔丁氧羰基-β-丙氨酸)、H-Pro-OMe·HCl(L-脯氨酸甲酯盐酸盐)、NMM、HOBT(1-羟基苯并三唑)、EDCI反应得到Boc-β-Ala-Pro-OMe，然后用NaOH溶液水解得到Boc-β-Ala-Pro-OH；

S3、合成Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-NH-Bzl：

在四氢呋喃中，Boc-β-Ala-Pro-OH、H-Dab(Boc)-NHBzl、HOBT、EDCI反应得到Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-NH-Bzl；

S4、合成类蛇毒三肽：

将Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-NH-Bzl用三氟乙酸水溶液脱除Boc保护基，得到类蛇毒三肽粗品；

S5、类蛇毒三肽粗品纯化：

类蛇毒三肽粗品经粗品处理、高效液相色谱、阴离子交换色谱，得到高纯类蛇毒三肽；其中，

所述类蛇毒三肽粗品纯化过程中，阴离子交换色谱所用填料为改性聚甲基丙烯酸环氧丙酯-三聚氰酸三烯丙酯(PGMA-TCA)色谱填料。

本发明通过液相合成的方法，以Fmoc-Dab(Boc)-OH、苄胺、Boc-β-Ala-OH和H-Pro-OMe·HCl为原料，经上述步骤合成类蛇毒三肽粗品，利用Fmoc-Dab(Boc)-OH与苄胺连接的方法消除了Dab的消旋问题，克服了CTC树脂的稳定性问题，合成工艺路线短，然后利用高效液相色谱、阴离子交换色谱相结合的方法对粗品进行纯化，得到纯度高于99％的类蛇毒三肽，同时也除去了三氟乙酸水溶液脱Boc保护基过程中带来的三氟乙酸，减少了类蛇毒三肽的损失，得率高，且未破坏类蛇毒三肽的生物活性，纯化效率高。

进一步地，所述步骤S1中，Fmoc-Dab(Boc)-OH、苄胺、NMM、EDCI的摩尔比为1:1.0～1.2:1.2～1.5:10～15。

进一步地，所述步骤S1中，四氢呋喃溶液中哌啶的体积分数为10～20％。

进一步地，所述步骤S2中，Boc-β-Ala-OH、H-Pro-OMe·HCl、NMM、HOBT、EDCI的摩尔比为1:0.9～1.2:0.9～1.2:1.0～1.2:1.0～1.2。

进一步地，所述步骤S2中，NaOH溶液的质量分数为5～20%。

进一步地，所述步骤S3中，HOBT、EDCI的添加摩尔量分别为Boc-β-Ala-Pro-OH摩尔量的0.1～0.14倍、10～12倍。

进一步地，所述步骤S4中，三氟乙酸混合水溶液的质量分数为90～95%。

进一步地，所述步骤S1～S4中，反应温度均为室温。

进一步地，所述步骤S5中，粗品处理过程为：

将类蛇毒三肽粗品加入到含有0.5～3vol%三氟乙酸的双蒸水中，用3.0～0.45μm的滤膜过滤，得到类蛇毒三肽粗品水溶液。

更进一步地，所述类蛇毒三肽粗品、含三氟乙酸的双蒸水的质量体积比为1g:20～50mL。

进一步地，步骤S5中，高效液相色谱纯化过程中：

填料为F型SBC MCI GEL色谱填料，填料的粒径为30～50μm，流动相A为含有0.02～0.05vol%乙醇胺、0.05～1vol%磷酸水溶液，流动相B乙腈，用20%B相累加进样，洗脱梯度为：20%、30min，35～80%、70min，80%恒流；检测波长为200～230nm，流速20～60mL/min，柱温为35～45℃，进行梯度洗脱，收集类蛇毒三肽样品液，并减压浓缩至30～60mg/mL。

进一步地，所述步骤S5中，阴离子交换色谱过程中：

填料为改性PGMA-TCA色谱填料，流动相为包含0.02～0.05vol%醋酸铵、0.5～2vol%醋酸的水溶液，流速为2～10mL/min，柱温为30～45℃，收集乙酸型类蛇毒三肽溶液，减压浓缩、冷冻干燥获得高纯类蛇毒三肽。

进一步地，改性PGMA-TCA色谱填料是以PGMA-TCA微球为基质，利用芦竹碱对其进行接枝改性，在表面形成一层芦竹碱作为阴离子交换功能基团制成；具体步骤如下：

1)单分散聚苯乙烯微球种子与邻苯二甲酸二丁酯混合活化；

2)以GMA为单体，TCA为交联剂，乙醇水溶液为溶剂，加入活化后的单分散聚苯乙烯微球种子，在引发剂、稳定剂、乳化剂的作用下发生聚合反应制得PGMA-TCA微球；

3)将PGMA-TCA微球用甲苯水溶液中充分溶胀后，加入芦竹碱反应，抽滤，用水、丙酮和乙醇洗涤，干燥即得改性PGMA-TCA色谱填料。

更进一步地，所述步骤1)中，聚苯乙烯微球种子、邻苯二甲酸二丁酯的质量体积比为1g:10～20mL。

更进一步地，所述步骤2)中，GMA、TCA的质量比为1:0.15～0.3。

更进一步地，所述步骤2)中，单分散聚苯乙烯微球种子、GMA的质量比为1:8～20。

更进一步地，所述步骤2)中，

引发剂为任意比例的过氧化苯甲酰与偶氮二异丁腈、偶氮偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯中任一种的混合物；引发剂的添加量为GMA质量的0.4～1%；

稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮，稳定剂的添加量为GMA质量的0.1～0.5%；

乳化剂为十二烷基硫酸钠，乳化剂的添加量为GMA质量的1～2%。

更进一步地，所述步骤2)中，反应温度为60～85℃，反应时间为10～24h。

更进一步地，所述步骤3)中，PGMA-TCA微球、芦竹碱的质量比为1:0.6～1。

更进一步地，所述步骤3)中，反应温度为55～70℃，反应时间为8～16h。

本发明通过上述方法，以PGMA-TCA微球为基质，该微球无孔隙、结构致密，机械强度高，稳定性好，表面暴露大量的环氧基团，以芦竹碱为改性剂对其进行改性，芦竹碱中的氨基与微球表面的环氧基团发生反应，在微球表面形成一层致密的芦竹碱层作为阴离子交换功能基团，改性后的PGMA-TCA微球仍为致密性结构，粒径在5～8μm之间，功能基团分布在微球的外表面，避免了离子交换过程中多肽、蛋白质等大分子在孔内的扩散速率较低，从而达到快速传质的目的，消除了停滞流动相传质带来的峰加宽，提高了柱效，分离效果变好，且减少了对类蛇毒三肽活性的破坏；改性PGMA-TCA微球填料由于以PGMA-TCA微球为基质，其中含有大量的刚性基团，且致密程度高，结构紧密，减少因孔隙带来的强度差的缺陷，弥补了传统聚合物填料的缺陷，另外，利用芦竹碱改性后的微球表面引入了新的刚性基团，进一步增加了填料的机械强度，且耐热性能得到大幅度提升。

经上述方法制备得到的类蛇毒三肽。

本发明还提供了类蛇毒三肽在制备抗皱化妆品中的应用，所述类蛇毒三肽添加量为0.01～3％。

所述化妆品的剂型为精华液、乳液、乳膏、粉剂、霜剂、凝胶、敷料中的任一种。

所述化妆品的使用方式为经皮涂抹使用。

类蛇毒三肽的亲脂性较差，透过肌肤角质层的能力较差，能达到的抗皱效果大大降低，为提高类蛇毒三肽的皮肤渗透性，获得高效的抗皱效果，本发明还将四己基癸醇抗坏血酸酯、白花前胡醇与类蛇毒三肽同时添加到抗皱化妆品中，所述四己基癸醇抗坏血酸酯的添加量为类蛇毒三肽质量的0.3～0.5倍，白花前胡醇的添加量为类蛇毒三肽质量的0.02～0.04倍。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以Fmoc-Dab(Boc)-OH、苄胺、Boc-β-Ala-OH和H-Pro-OMe·HCl为原料，经上述步骤合成类蛇毒三肽粗品，利用Fmoc-Dab(Boc)-OH与苄胺连接的方法消除了Dab的消旋问题，克服了CTC树脂的稳定性问题，合成工艺路线短，然后利用高效液相色谱、阴离子交换色谱相结合的方法对粗品进行纯化，阴离子交换色谱过程中，色谱填料为改性PGMA-TCA色谱填料，其为无孔的致密结构，机械强度高，耐热性好，功能基团分布在微球外表面，避免了离子交换过程中多肽、蛋白质等大分子在孔内的扩散速率低的问题，从而达到快速传质的目的，分离效果提高，所得类蛇毒三肽的纯度高于99％，纯化收率高于57%，且生物活性高，可直接添加到化妆品中，起到抗皱等效果。

附图说明

图1是实施例1中类蛇毒三肽的合成路线图；

图2是实施例1所得改性PGMA-TCA色谱填料的SEM图；

图3是改性PGMA-TCA色谱填料的机械强度(破碎率)测试结果示意图；

图4是改性PGMA-TCA色谱填料的耐热性(热分解温度)测试结果示意图；

图5是类蛇毒三肽的纯度和收率测试结果示意图；图中B代表纯度、C代表收率；

图6是类蛇毒三肽对肌细胞收缩率的测试结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明并不限于这些实施例。除非另有说明，实施例中使用的原料和仪器均是商购获得的，是本领域常规使用的仪器和原料，只要其能满足实验需要即可。

实施例1：

本实施例提供了一种类蛇毒三肽的合成方法，合成路线如图1所示，所述方法包括：

S1、H-Dab(Boc)-NHBzl的制备：

在600mL四氢呋喃中，加入44gFmoc-Dab(Boc)-OH、11.8g苄胺、14.2gNMM，室温下搅拌5min后，加入235gEDCI，搅拌反应24h，产物中加水析出固体，水洗，用二氯甲烷溶解，分层，有机层干燥，过滤，旋蒸除去二氯甲烷，所得化合物用加入到400mL、含15vol％哌啶的四氢呋喃溶液中，室温搅拌反应30min，旋转蒸发浓缩，加入乙醚析出沉淀，过滤，用乙醚洗涤2次，干燥，得到27.6gH-Dab(Boc)-NHBzl；

S2、Boc-β-Ala-Pro-OH的制备：

在500mL四氢呋喃中，加入18.9gBoc-β-Ala-OH、16.6gH-Pro-OMe·HCl、1.65gHOBT、10gNMM，搅拌5min后加入21gEDCI，室温下搅拌反应10h，得到Boc-β-Ala-Pro-OMe，然后将Boc-β-Ala-Pro-OMe用甲醇溶解，加入10wt%的氢氧化钠溶液，搅拌4h，用1mol/L的盐酸溶液调节pH至4，旋转蒸发浓缩，浓缩液用乙酸乙酯萃取，有机相干燥，得到30.4gBoc-β-Ala-Pro-OH；

S3、合成Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-NH-Bzl：

在500mL四氢呋喃中，加入30.4gBoc-β-Ala-Pro-OH、27.6gH-Dab(Boc)-NHBzl、1.4gHOBT，室温下搅拌5min后，加入197gEDCI，搅拌反应4h，旋转蒸发浓缩，向浓缩液中加入350mL乙酸乙酯，分层，用1wt％盐酸水溶液洗涤有机相3次，旋转蒸发浓缩，用乙醚析出沉淀，抽滤，干燥，得到58.2gBoc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-NH-Bzl；

S4、合成类蛇毒三肽：

将Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-NH-Bzl加入到质量分数90%的三氟乙酸水溶液中，室温下搅拌2h，旋蒸除去水分，得到类蛇毒三肽粗品；

S5、类蛇毒三肽粗品纯化：

1)将1g类蛇毒三肽粗品加入到40mL含有2wt%三氟乙酸的双蒸水中，用0.4μm的滤膜过滤，得到类蛇毒三肽粗品水溶液；

2)高效液相色谱纯化：

用F型SBC MCI GEL色谱填料进行高效液相色谱纯化，填料的平均粒径为40μm，以含有0.03vol%乙醇胺、0.1vol%磷酸的水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，用20%B相累加进样，洗脱梯度为：30minB相50%；检测波长为210nm，流速40mL/min，柱温为40℃，进行洗脱，收集类蛇毒三肽溶液，并减压浓缩至40mg/mL；

3)阴离子交换色谱转盐：

用改性PGMA-TCA色谱填料进行阴离子交换色谱纯化，以包含0.04vol%醋酸铵、1vol%醋酸的水溶液为流动相，检测波长为210nm，流速为4mL/min，柱温为35℃，收集目标峰，减压浓缩、冷冻干燥获得高纯类蛇毒三肽。

所述改性PGMA-TCA色谱填料经由下述方法制备得到：

将1g单分散聚苯乙烯微球种子与20mL邻苯二甲酸二丁酯混合，搅拌使其充分活化；将10gGMA、2gTCA加入到20wt%乙醇水溶液中，加入活化后的单分散聚苯乙烯微球种子，然后加入0.06g过氧化苯甲酰与偶氮二异丁腈的混合物，混合质量比为1:1，加入0.04g聚乙烯吡咯烷酮K30、0.15g十二烷基硫酸钠，75℃下反应16h，反应完后，过滤，水洗，干燥，得到PGMA-TCA微球；将10gPGMA-TCA微球用20wt%甲苯水溶液充分溶胀后，加入8.8g芦竹碱，65℃下反应12h，抽滤，用水、丙酮和乙醇洗涤，真空干燥即得改性PGMA-TCA色谱填料。

本实施例还提供了一种抗皱化妆品，其制备方法包括：在无菌水中，加入1wt%的本实施例所得类蛇毒三肽、8wt%的丙二醇、1wt%的甘油、1.5wt%的吐温-80，用10wt%的柠檬酸水溶液调节pH至5，即得。

实施例2：

本实施例提供了另一种类蛇毒三肽的合成方法，其与实施例1的不同之处仅在于，改性PGMA-TCA色谱填料制备过程中，芦竹碱的添加量为6g。

本实施例还提供了一种抗皱化妆品，其与实施例1的不同之处仅在于，利用本实施例所得类蛇毒三肽代替实施例1所得类蛇毒三肽。

实施例3：

本实施例提供了另一种类蛇毒三肽的合成方法，其与实施例1的不同之处仅在于，改性PGMA-TCA色谱填料制备过程中，芦竹碱的添加量为10g。

本实施例还提供了一种抗皱化妆品，其与实施例1的不同之处仅在于，利用本实施例所得类蛇毒三肽代替实施例1所得类蛇毒三肽。

实施例4：

本实施例提供了一种抗皱化妆品，其与实施例1的不同之处仅在于，还添加了0.45wt%四己基癸醇抗坏血酸酯和0.03wt%的白花前胡醇。

对比例1：

本实施例提供了另一种类蛇毒三肽的合成方法，其与实施例1的不同之处仅在于，改性PGMA-TCA色谱填料制备过程中，芦竹碱的添加量为5g。

本实施例还提供了一种抗皱化妆品，其与实施例1的不同之处仅在于，利用本实施例所得类蛇毒三肽代替实施例1所得类蛇毒三肽。

对比例2：

本实施例提供了另一种类蛇毒三肽的合成方法，其与实施例1的不同之处仅在于，改性PGMA-TCA色谱填料制备过程中，芦竹碱的添加量为11g。

本实施例还提供了一种抗皱化妆品，其与实施例1的不同之处仅在于，利用本实施例所得类蛇毒三肽代替实施例1所得类蛇毒三肽。

对比例3：

本实施例提供了另一种类蛇毒三肽的合成方法，其与实施例1的不同仅在于，利用市售的WAX色谱填料代替改性PGMA-TCA色谱填料。

本实施例还提供了一种抗皱化妆品，其与实施例1的不同之处仅在于，利用本实施例所得类蛇毒三肽代替实施例1所得类蛇毒三肽。

对比例4：

本实施例提供了另一种抗皱化妆品，其与实施例4的不同之处仅在于，未添加四己基癸醇抗坏血酸酯。

对比例5：

本实施例提供了另一种抗皱化妆品，其与实施例4的不同之处仅在于，未添加白花前胡醇。

试验例1：

改性PGMA-TCA色谱填料的形貌表征：

将实施例1所得改性PGMA-TCA色谱填料充分干燥后制成样品，用S-4700型场发射扫描电子显微镜进行表观形貌表征，表征结果如图2所示。

从图2可以观察到，经本发明所述的方法制备得到的改性PGMA-TCA色谱填料的直径在5～8μm，球形度很好，粒径均匀，分散性好，无团聚现象，未观察到破裂或絮状物，表面干净、光滑，无明显的微孔。

试验例2：

机械强度测试：

以实施例1～3和对比例1、2所得改性PGMA-TCA色谱填料为样品，参考《SY/T5108-2006压裂支撑剂性能指标及测试推荐方法》测试其破碎率，用破碎率来表征其机械强度，压力为60MPa，测试结果如图3所示。

从图3可以观察到，本发明所得改性PGMA-TCA色谱填料可至少抵抗60MPa的压力而基本保持不破碎，破碎率最低可达1%以下，从实施例和对比例的数据对比可以看出，改性PGMA-TCA色谱填料制备过程中，随着芦竹碱添加量的增大，可增加与微球表面环氧基团的反应，增加交联密度，增大紧密程度，从而能够提高填料的压缩强度，破碎率减小，还可以看出，随着芦竹碱添加量增大到一定程度，其破碎率反而增大，这可能是因为芦竹碱的添加量过多，会引起芦竹碱与微球表面环氧基团反应的不均匀，所得微球的致密程度有所下降，压缩强度降低，从而使破碎率升高。综上所述，本发明通过一定量的芦竹碱对PGMA-TCA微球进行改性，能够提升色谱填料的机械强度，弥补了现有聚合物型色谱填料的缺陷。

试验例3：

耐热性能测试：

以实施例1～3和对比例1、2所得改性PGMA-TCA色谱填料为样品，利用STA409PC的热重分析仪测试其热分解温度，测试结果如图4所示。

从图4可以观察到，本发明优选实施例1～3所得改性PGMA-TCA色谱填料的热分解温度不低于335℃，耐热性能优异，对比例1和2所得改性PGMA-TCA色谱填料的热分解温度明显低于实施例1，说明芦竹碱的改性处理对色谱填料的耐热性能影响较大，利用一定量的芦竹碱对PGMA-TCA微球进行改性，有助于提高色谱填料的热分解温度，耐热性能提升，这可能与改性PGMA-TCA色谱填料表面形成的交联结构有关。

试验例4：

类蛇毒三肽的纯度和收率测试：

以实施例1～3、对比例1～3所得高纯类蛇毒三肽为样品，利用高效液相色谱测试其纯度，并利用高纯类蛇毒三肽与纯化前类蛇毒三肽粗品的质量计算其收率，测试结果如图5所示。

从图5可以观察到，利用本发明所述方法对合成的类蛇毒三肽粗品进行分离纯化，既保证了高纯度，又使其具有较高的纯化收率，对比实施例和对比例的收率和纯度测试结果，可以看出，对比例1和2的纯度与实施例1相比略有降低，而收率的下降幅度较大，说明芦竹碱的改性处理对色谱填料的分离纯化效果具有一定的影响，经一定量的芦竹碱对PGMA-TCA微球进行改性后，可提高阴离子交换色谱过程中的传质速度，消除了停滞流动相传质带来的峰加宽，提高了柱效，分离效果高，并减少类蛇毒三肽的损失，从而同时保证了类蛇毒三肽的高纯度和高收率；还可以看出，对比例3的纯度与实施例1的差距较小，而收率差距显著，说明与现有技术相比，本发明提供的改性PGMA-TCA色谱填料能够提高阴离子交换色谱的分离效果，减少类蛇毒三肽的损失，从而提高类蛇毒三肽的纯化收率。

试验例5：

类蛇毒三肽对肌细胞收缩率的测试：

类蛇毒三肽能够降低肌肉收缩频率从而达到抗皱除皱效果，因此本发明利用抗皱化妆品对肌细胞收缩率的影响来评价其生物活性，具体测试方法如下：选择神经肌细胞进行细胞收缩试验，分别用实施例1、4和对比例1～5所得抗皱化妆品处理培养好的肌细胞，分别在30min时对肌细胞收缩率进行检测，以生理盐水处理的肌细胞为空白对照组，测试结果如图6所示。

从图6可以观察到，实施例1所得类蛇毒三肽在30min时就可发挥较为明显的降低肌肉收缩频率的作用，收缩频率降至40.6%，相比实施例1，对比例1～3所得类蛇毒三肽在30min时降低肌肉收缩频率的效果较差，收缩频率明显高于实施例1，说明一定量的芦竹碱对PGMA-TCA微球进行改性后，可提高阴离子交换色谱的分离效率，减少对类蛇毒三肽活性的破坏，达到高效降低肌肉收缩频率的作用；相比实施例1，实施例4所得类蛇毒三肽在30min时降低肌肉收缩频率的作用明显较高，收缩频率降至26.4%，而对比例4和5的收缩频率为35.7%和34.2%，说明添加四己基癸醇抗坏血酸酯、白花前胡醇与类蛇毒三肽之间具有协同作用，能够提高抗皱效果，这可能是因为四己基癸醇抗坏血酸酯、白花前胡醇的添加，能够在一定程度上改变类蛇毒三肽在皮肤和载体间的分配系数，提高类蛇毒三肽的渗透性，增加透皮吸收，从而更好的发挥降低肌肉收缩频率的作用。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (7)

1.一种类蛇毒三肽的合成方法，其特征在于，包括下述步骤：

S1、合成H-Dab(Boc)-NHBzl：

在四氢呋喃中，Fmoc-Dab(Boc)-OH、苄胺、NMM、EDCI反应得到Fmoc-Dab(Boc)-NHBzl，然后用包含哌啶的四氢呋喃溶液脱除Fmoc保护基，得到H-Dab(Boc)-NHBzl；

S2、合成Boc-β-Ala-Pro-OH：

在四氢呋喃中，Boc-β-Ala-OH、H-Pro-OMe·HCl、NMM、HOBT、EDCI反应得到Boc-β-Ala-Pro-OMe，然后用NaOH溶液水解得到Boc-β-Ala-Pro-OH；

S3、合成Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-NH-Bzl：

在四氢呋喃中，Boc-β-Ala-Pro-OH、H-Dab(Boc)-NHBzl、HOBT、EDCI反应得到Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-NH-Bzl；

S4、合成类蛇毒三肽：

将Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-NH-Bzl用三氟乙酸水溶液脱除Boc保护基，得到类蛇毒三肽粗品；

S5、类蛇毒三肽粗品纯化：

类蛇毒三肽粗品经粗品处理、高效液相色谱、阴离子交换色谱，得到高纯类蛇毒三肽；其中，

所述类蛇毒三肽粗品纯化过程中，阴离子交换色谱所用填料为改性聚甲基丙烯酸环氧丙酯-三聚氰酸三烯丙酯色谱填料；

所述改性聚甲基丙烯酸环氧丙酯-三聚氰酸三烯丙酯色谱填料是以聚甲基丙烯酸环氧丙酯-三聚氰酸三烯丙酯微球为基质，利用芦竹碱对其进行接枝改性，在表面形成一层芦竹碱作为阴离子交换功能基团制成，具体包括下述步骤：

1)单分散聚苯乙烯微球种子与邻苯二甲酸二丁酯混合活化；

2)以甲基丙烯酸环氧丙酯为单体，三聚氰酸三烯丙酯为交联剂，乙醇水溶液为溶剂，加入活化后的单分散聚苯乙烯微球种子，在引发剂、稳定剂、乳化剂的作用下发生聚合反应制得聚甲基丙烯酸环氧丙酯-三聚氰酸三烯丙酯微球；

3)将聚甲基丙烯酸环氧丙酯-三聚氰酸三烯丙酯微球用甲苯水溶液中充分溶胀后，加入芦竹碱反应，抽滤，用水、丙酮和乙醇洗涤，干燥即得改性聚甲基丙烯酸环氧丙酯-三聚氰酸三烯丙酯色谱填料。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤S1中，Fmoc-Dab(Boc)-OH、苄胺、NMM、EDCI的摩尔比为1:1.0～1.2:1.2～1.5:10～15；

步骤S2中，Boc-β-Ala-OH、H-Pro-Ome·HCl、NMM、HOBT、EDCI的摩尔比为1:0.9～1.2:0.9～1.2:1.0～1.2:1.0～1.2；

步骤S3中，HOBT、EDCI的添加摩尔量分别为Boc-β-Ala-Pro-OH摩尔量的0.1～0.14倍、10～12倍。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，粗品处理过程为：

将类蛇毒三肽粗品加入到含有少量三氟乙酸的双蒸水中，用3.0～0.45μm的滤膜过滤，得到类蛇毒三肽粗品水溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，阴离子交换色谱过程中：

填料为改性聚甲基丙烯酸环氧丙酯-三聚氰酸三烯丙酯色谱填料，流动相为包含0.02～0.05vol%醋酸铵、0.5～2vol%醋酸的水溶液，流速为2～10mL/min，柱温为30～45℃，收集乙酸型类蛇毒三肽溶液，减压浓缩、冷冻干燥获得高纯类蛇毒三肽。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，聚甲基丙烯酸环氧丙酯、三聚氰酸三烯丙酯的质量比为1:0.15～0.3。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，聚甲基丙烯酸环氧丙酯-三聚氰酸三烯丙酯微球、芦竹碱的质量比为1:0.6～1。

7.权利要求1～6任一项所述所述方法制备得到的类蛇毒三肽在制备抗皱化妆品中的应用，其特征在于，所述类蛇毒三肽的添加量为0.01～3％；

所述抗皱化妆品中还添加有四己基癸醇抗坏血酸酯、白花前胡醇；

所述四己基癸醇抗坏血酸酯的添加量为类蛇毒三肽质量的0.3～0.5倍，白花前胡醇的添加量为类蛇毒三肽质量的0.02～0.04倍。

Images