CN101638681B - 一种海洋珍珠贝氨基甙的双水相萃取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用双水相萃取来纯化海洋珍珠贝氨基甙的方法,其特征包括以下步骤:将中国专利ZL200610037275.8所述方法中离心分离氨基甙后余下的残留有海洋珍珠贝氨基甙的上清液中的乙醇除去,得到无乙醇的海洋珍珠贝氨基甙水溶液,然后将聚乙二醇,磷酸二氢钾和无乙醇的海洋珍珠贝氨基甙水溶液按质量比3~4∶4~7∶25混合,静置分层,取上层相,用氯仿萃取,去除氯仿有机相,得到海洋珍珠贝氨基甙和无机盐的混合水溶液,然后超滤脱盐,冷冻干燥后得到高纯度海洋珍珠贝氨基甙粉末。本发明操作简单,条件温和,能耗低,所采用的化学试剂可重复回收利用,得到的海洋珍珠贝氨基甙纯度高,与上述专利得到的海洋珍珠贝氨基甙的特征成分一致。
Description
技术领域
本发明涉及一种海洋珍珠贝氨基甙的提纯方法,具体来说是涉及一种用双水相萃取来纯化海洋珍珠贝氨基甙的方法。
背景技术
氨基甙是由氨基酸分子和糖元部分组成的一类物质,其中的糖基由氨基己糖和己糖醛酸(D-glucuronic和L-iduronic acid)或半乳糖单元交替、无支链排列组成,并在不同位置连有磺酸基。依据磺酸基取代位置和数目不同,氨基甙分为硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸肝素(HS)、硫酸角质素(KS)等种类。氨基甙的分子结构序列的种类非常繁多,不同结构氨基多糖分子与其它高分子发生交互作用时有高度的选择性。氨基甙与生物的普通或病态生理过程中细胞间和细胞组织间的相互作用非常重要,例如在组织形成、胚胎发育、细胞识别、粘连迁移、生长因子调节、脂类代谢、神经系统的发育和再生、炎症的消除等过程中,氨基甙都扮演重要的角色。药理学研究发现氨基甙具有抗肿瘤、抗凝血、增强免疫力、降血脂等生物活性。因此氨基甙的制备、分离和纯化工作已经引起国内外广泛重视。近年来,海洋生物成为氨基甙的重要来源。如Souza等报道了从电鳗中分离纯化硫酸软骨素和硫酸皮肤素衍生物的过程,张偲等(中国专利ZL200610037275.8)和范秀萍等分别报道了珍珠贝氨基甙的制备和纯化;吴红棉等报道了波纹巴非蛤氨基多糖的分离纯化。已有的报道中,氨基甙的制备都包含对生物组织的酶解制备氨基甙粗品和粗品的纯化步骤两个重要步骤,其中氨基甙粗品的纯化方法有珍珠贝氨基甙的定重分离方法、等电点沉淀法、柱层析法等。
中国专利ZL200610037275.8公开了一种由氨基酸序列为-GASRERCAKLSG-的小肽和硫酸软骨素B的重复结构片段组成,其中硫酸软骨素B与氨基酸序列中的谷氨酸联接,相对分子质量范围为1300~33000的海洋珍珠贝氨基甙。所述的硫酸软骨素B由以下式(1)表示:
式(1)
还公开了这种海洋珍珠贝氨基甙的制备方法:以海洋珍珠贝(珍珠贝软体部和贝壳)为原料,通过超声波或液氮破细胞膜,酸解,仿胃液酶解,仿肠液酶解,用不同配比有机溶剂进行定重分离、离心分离等步骤,制得高纯度海洋珍珠白氨基甙。但离心分离氨基甙后余下的上清液中还残留有部分海洋珍珠贝氨基甙,与电泳分析中迁移率较低的未知杂质混合,并且使用ZL200610037275.8中提高乙醇浓度的方法也无法将杂质分离,因为那些杂质和珍珠贝氨基甙形成共沉淀。要分离提纯这部分海洋珍珠贝氨基甙必须寻求新的方法。
双水相系统是指在一定条件下,互不相容的水溶液系统。常见的双水相系统有聚合物-聚合物-水、聚合物-无机盐-水、聚合物-有机盐-水、表面活性剂-水等类型。双水相萃取技术(Aqueous two-phase extraction,ATPE)是利用混合物中不同成分在两相中溶解度的差异对混合物进行分离,这种技术具有分离条件温和、速度快、能耗低、污染低、高通量、易于放大应用于工业生产等优点。自1956年双水相萃取技术出现以来,经过数十年的发展,双水相萃取方法已经成为得到广泛应用的生物制品下游分离、浓缩技术。双水相萃取法在氨基甙分离纯化的应用上尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于通过双水相萃取技术从上述上清液中分离纯化得到高纯度的海洋珍珠贝氨基甙。
我们通过将中国专利ZL200610037275.8所述方法中离心分离氨基甙后余下的上清液中的乙醇除去,在得到的水溶液中加入聚乙二醇和磷酸二氢钾,分层后用氯仿除去聚乙二醇,得到海洋珍珠贝氨基甙和无机盐的混合水溶液,脱盐干燥后得到高纯度的海洋珍珠贝氨基甙,从而实现了本发明的目的。
本发明的海洋珍珠贝氨基甙的双水相萃取方法,其特征包括以下步骤:
(1)将残留有海洋珍珠贝氨基甙的上清液中的乙醇除去,得到无乙醇的含海洋珍珠贝氨基甙水溶液,所述的残留有海洋珍珠贝氨基甙的上清液是通过下述步骤得到:将海洋珍珠贝粉碎后,破细胞膜,加入氟汰酸或乳酸调节pH值至6.0~6.5,混合均匀后得酸解液,将酸解液经过仿胃液酶解,再经仿肠液酶解后,冷冻干燥得到可溶性粉末,将得到的粉末用水溶解,加入乙醇至其质量分数达55%~60%,然后取上清液,向上清液中加入乙醇至其乙醇质量分数达75%,离心分离,取去沉淀部分(海洋珍珠贝氨基甙)后得到残留有海洋珍珠贝氨基甙的上清液;
(2)将聚乙二醇、磷酸二氢钾和步骤(1)得到的无乙醇的含海洋珍珠贝氨基甙水溶液按质量比3~4∶4~7∶25充分混合,静置分层,取上层相(富含聚乙二醇),用氯仿萃取,去除氯仿有机相,得到海洋珍珠贝氨基甙和无机盐的混合水溶液;
(3)将步骤(2)得到的海洋珍珠贝氨基甙和无机盐的混合水溶液超滤脱盐,冷冻干燥后得到纯海洋珍珠贝氨基甙粉末。
步骤(1)中在真空下30~40℃将残留有海洋珍珠贝氨基甙的上清液中的乙醇除去;无乙醇的含海洋珍珠贝氨基甙水溶液中海洋珍珠贝氨基甙和杂质混合物的总含量最好在质量分数5%~15%;步骤(2)所述的聚乙二醇的相对分子质量最好是4000或6000,所述的静置时间可以是10~24小时,所述的氯仿的用量最好为聚乙二醇相体积的0.5~1.5倍,萃取次数为3~5次。
本发明有操作简单,条件温和,能耗低,所采用的化学试剂可重复回收利用,得到的终产物经电泳分析证实其中的杂质已除去,通过理化测试证实本发明得到的产物的特征成分性质与中国专利200610037275.8得到的海洋珍珠贝氨基甙的特征性成分一致。
附图说明
图1:海洋珍珠贝氨基的电泳图,其中
1:硫酸软骨素B标样(0.2mg/mL,10uL);
2:硫酸软骨素B标样(2mg/mL,10uL);
3:进行双水相萃取前的海洋珍珠贝氨基甙(2mg/mL,10uL);
4:实施例1得到的海洋珍珠贝氨基甙(2mg/mL,10uL);
5:实施例2得到的海洋珍珠贝氨基甙。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明,不是对本发明的限制。
以下实施例中所采用的聚乙二醇由成都科龙化工厂生产,其余有机试剂均由天津百世公司生产(分析纯),无机试剂购自广州试剂公司(分析纯)。纯水使用MiniQ纯水制备系统制备。
实施例1:
将1000g海洋珍珠贝(珍珠贝软体部和贝壳)粉碎后,用22KHz超声波破细胞膜,加蒸馏水2000mL混合均匀,使用1mol/L氟汰酸调节pH值至6.0,后得酸解液,取1000mL酸解液加入2.8g木瓜蛋白酶,然后用0.1mol/LNaOH溶液调节的pH值为7.5,酶解温度是50℃,酶解时间是6h,得到酶解液。取30g胰蛋白酶,0.025mol,磷酸二氢钾,0.01mol氯化钾,4mmol牛磺胆酸钠和1mmol磷酯酸胆碱,用少量水溶解后,加入上述得到的酶解液混匀并定容到1000mL,用0.1mol/LNaOH溶液调节溶液的pH值到8.0,酶解温度是45℃,酶解时间是2h,冷冻干燥得到可溶性粉末。
将上述得到的粉末用水溶解,加入纯乙醇使其乙醇终质量分数达60%,取上清液;向上清液中加入乙醇使其乙醇终质量分数达75%,5000r/min离心取去沉淀部分,余下残留有海洋珍珠贝氨基甙的上清液。
将上述残留有海洋珍珠贝氨基甙的上清液在40℃真空蒸馏除去乙醇,得到无乙醇的海洋珍珠贝氨基甙水溶液,从中取少量冻干,计算干物质含量约为质量分数5%。
取上述无乙醇的海洋珍珠贝氨基甙水溶液1000mL,加入160g聚乙二醇4000,加入160gKH2PO4,充分搅拌平衡。倒入2000mL分液漏斗,静置24小时,双水相系统完全分层,此时双水相系统总体积约为1180mL,上相体积约430mL,下相体积约750mL。上下相分离后向分液漏斗内的上相中加入215mL氯仿萃取聚乙二醇,反复萃取3次,除去聚乙二醇,得海洋珍珠贝多糖和无机盐混合水溶液。
将海洋珍珠贝多糖和无机盐混合水溶液用德国Satorius公司产VIVAFLOW50型板框超滤器脱盐(聚砜膜,截留分子质量300~1000u,工作压力0.1MPa,温度25℃),冷冻干燥后得到海洋珍珠贝氨基甙27g。
取得到的海洋珍珠贝氨基甙进行电泳分析,证实其中的低迁移率杂质已被除去,具体见图1中4。分析条件:0.05mol/L 1,3-diaminopropane/acetate缓冲液,pH 9.0;电泳用凝胶板:0.5%琼脂糖缓冲液溶液制备;电泳参数:100V,60min;显色:固定液:0.1%CTAB,200mL纯水,0.2%CTAB(固定2h);显色剂:0.1%toluidine blue in acetic acid/ethanol/water(体积比0.1∶5∶5)。
将得到的海洋珍珠贝氨基甙进行分子质量测定,利用高效液相凝胶渗透色谱法,以标准肽和硫酸软骨素为标准品。测试条件:Waters Ultrahydrogel型凝胶柱,流动相0.1mol/LNaNO3。得出的相对分子质量分布范围为1300~30000。
将得到的海洋珍珠贝氨基甙进行小肽的氨基酸序列测定:将衍生化的小肽溶于0.1%TFA(三氟乙酸)中,以CCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)为基质。结晶后,采用脉冲氮激光(337nm)作为离子解析电离源,以线性-延时引出模式,在Brucker Biflex III型MALDI-TOF质谱仪上进行分析,结果显示本产物的纯度完全满足测序要求。然后在Applied Biosystems Procisemodel 491 N-端氨基酸测序仪上进行序列分析,循环终止于第12个氨基酸残基,并且小肽的氨基酸序列为GASRERCAKLSG。根据测序结果,计算小肽的分子质量为1432.56u。
将得到的海洋珍珠贝氨基甙进行糖基的结构分析:
红外光谱测定:取1mg本发明产物,采用溴化钾压片法进行红外光谱测定。在1738.6cm-1处有一个强吸收峰,是羰基的伸缩振动,表明含有糖醛酸结构。
全水解及GC分析:取6mg本发明产物,放入试管中,加入4mL的TFA(三氟乙酸),用酒精喷灯高温封管。在110℃水解2小时,在40℃以下减压除去TFA,然后加入5mL甲醇蒸干,重复三次,尽量除去残留TFA。加入1mL水溶解得到的产物,用纤维素板层析。将薄层层析分析后得到的样品(溶出后直接进入下一步反应,不需称量)加水至3mL,加入10mg的NaBH4在室温下还原2小时后用冰醋酸调节溶液的pH值至4~5之间,减压蒸干,重复三次,保证还原完全,真空干燥彻底除去水分得到固体粉末,然后加入2mL醋酐密封,在水浴中加热反应2小时,减压出去过量的醋酐,加入1mL的甲苯,蒸干,重复操作三次。将乙酰化后的产物用氯仿5mL溶解,加入5mL水,洗涤三次,将氯仿层干燥后浓缩,进行GC分析。GC分析证明,本发明的的海洋珍珠贝氨基甙中含有氨基半乳糖。
TLC分析证明样品含有糖醛酸,因此进行糖醛酸的还原反应。取薄层层析分析后得到的样品2mg进行糖残基组成的GC分析,证明为艾杜糖醛酸。
上述理化分析结果证明,本发明制得海洋珍珠贝氨基甙特征性成分理化性质与ZL200610037275.8制得的相同,未发生变化。
实施例2:
将1000g海洋珍珠贝(珍珠贝软体部和贝壳)粉碎后,用24KHz超声波破细胞膜,加蒸馏水2000mL混合均匀,使用1mol/L乳酸调节pH值至6.5,后得酸解液,取1000mL酸解液加入3.5g木瓜蛋白酶,然后用0.1mol/LNaOH溶液调节的pH值为7.0,酶解温度是45℃,酶解时间是8小时,得到酶解液。取50g胰蛋白酶,0.032mol磷酸二氢钾,0.03mol氯化钾,6mmol牛磺胆酸钠和2mmol磷酯酸胆碱,用少量水溶解后,加入上述得到的酶解液混匀并定容到1000mL,用0.1mol/LNaOH溶液调节溶液的pH值到8.5,酶解温度50℃,酶解时间4h,冷冻干燥得到可溶性粉末。
将上述得到的粉末首先加入纯乙醇使其乙醇终质量分数达55%,取上清液;向上清液中加入乙醇使其乙醇终质量分数达75%,4500r/min离心取沉淀部分,余下残留有海洋珍珠贝氨基甙的上清液
将上述残留有海洋珍珠贝氨基甙的上清液在30℃真空蒸馏除去乙醇和部分水份,得到无乙醇的海洋珍珠贝氨基甙水溶液,从中取少量冻干,计算干物质含量约为质量分数15%。
在上述1000mL无乙醇的海洋珍珠贝氨基甙水溶液中,加入120g聚乙二醇6000,加入280gKH2PO4,充分搅拌平衡。倒入2000mL分液漏斗,静置10小时,双水相系统完全分层,此时双水相系统总体积约为1200mL,上相体积约360mL,下相体积约840mL。上下相分离后向分液漏斗内的上相中加入540mL氯仿萃取聚乙二醇,反复萃取3次,除去聚乙二醇,得海洋珍珠贝多糖和无机盐混合水溶液。
将海洋珍珠贝多糖和无机盐混合水溶液用德国Satorius公司产VIVAFLOW50型板框超滤器脱盐(聚砜膜,截留分子质量1000u,工作压力0.1MPa,温度25℃),冷冻干燥后得到海洋珍珠贝氨基甙80g。
取得到的海洋珍珠贝氨基甙进行电泳分析,证实其中的低迁移率杂质已被除去,具体见图1中5。通过同实施例1的理化分析证明,制得海洋珍珠贝氨基甙特征性成分理化性质与ZL200610037275.8制得的相同,未发生变化。
Claims (2)
1.一种海洋珍珠贝氨基甙的双水相萃取方法,其特征包括以下的步骤:
(1)将残留有海洋珍珠贝氨基甙的上清液中的乙醇除去,得到无乙醇的含海洋珍珠贝氨基甙水溶液,所述的残留有海洋珍珠贝氨基甙的上清液是通过下述步骤得到:将海洋珍珠贝粉碎后,破细胞膜,加入氟汰酸或乳酸调节pH值至6.0~6.5,混合均匀后得酸解液,将酸解液经过木瓜蛋白酶酶解,再经胰蛋白酶酶解后,冷冻干燥得到可溶性粉末,将得到的粉末用水溶解,加入乙醇至其质量分数达55%~60%,然后取上清液,向上清液中加入乙醇至其乙醇质量分数达75%,离心分离,取去沉淀部分后得到残留有海洋珍珠贝氨基甙的上清液;
(2)将聚乙二醇、磷酸二氢钾和步骤(1)得到的无乙醇的含海洋珍珠贝氨基甙水溶液按质量比3~4∶4~7∶25充分混合,静置分层,取上层相,用氯仿萃取,去除氯仿有机相,得到海洋珍珠贝氨基甙和无机盐的混合水溶液;
(3)将步骤(2)得到的海洋珍珠贝氨基甙和无机盐的混合水溶液超滤脱盐,冷冻干燥后得到纯海洋珍珠贝氨基甙粉末。
2.根据权利要求1所述的一种海洋珍珠贝氨基甙的双水相萃取方法,其特征是步骤(1)中在真空下30~40℃将残留有海洋珍珠贝氨基甙的上清液中的乙醇除去;无乙醇的含海洋珍珠贝氨基甙水溶液中海洋珍珠贝氨基甙和杂质混合物的总含量在质量分数5%~15%;步骤(2)所述的聚乙二醇的相对分子质量是4000或6000,所述的静置时间是10~24小时,所述的氯仿的用量为聚乙二醇相体积的0.5~1.5倍,萃取次数为3~5次。
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