CN102603910A

CN102603910A - 一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法

Info

Publication number: CN102603910A
Application number: CN201210050618XA
Authority: CN
Inventors: 陈群
Original assignee: Hefei College
Current assignee: Hefei Chuangxin Medical Technology Co., Ltd.
Priority date: 2012-02-29
Filing date: 2012-02-29
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2032-02-29
Also published as: CN102603910B

Abstract

本发明公开了一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法，在旋转蒸发仪的反应瓶中加入氨基磺酸和有机溶剂，预热至反应温度，氨基磺酸完全溶解后加入干燥的茯苓多糖粉末，反应体系抽真空，反应结束后，冷却至室温，用饱和碱溶液调反应液pH到9-10，继续抽真空除氨，反复进行，直至反应液无氨气味、pH值维持在7以上、不再下降为止，再加乙醇，沉淀多糖硫酸酯，过滤后再复溶于水，过滤，放入超滤器中脱盐并浓缩，用饱和氯化钡溶液检测洗脱液中游离硫酸根的残留量，直至无白色沉淀。本发明大大提高了硫酸化效率，抑制多糖分子降解和糖环双键的产生，产品色泽变浅，产品最终品质明显改善。

Description

一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法

技术领域

本发明属于药物化学领域，尤其涉及一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法。

背景技术

多糖是自然界最丰富的存在物质，由单糖残基以共价键键合而成。多糖硫酸酯是多糖衍生物，由多糖分子链单糖残基的某些羟基被硫酸根取代而形成，其中，分子量和单糖残基硫酸根取代度(DS)是最重要的2项理化参数。多糖硫酸酯药学活性十分广泛，具有抗凝血、抗血栓、抗病毒、降血脂和抗肿瘤等活性。1987年原联邦德国的Beyer与Hoechst公司合作，人工合成硫酸化木聚糖用于艾滋病的治疗。硫酸化右旋糖酐钠盐(Dextran sulfate sodium)已是临床治疗II a及II b型高血脂症和保护血管内皮的药物。

多糖硫酸酯大致可分成两类，一类是天然的硫酸化多糖，如动物糖胺聚糖、褐藻多糖硫酸酯、卡拉胶等。此类药物需通过分离、纯化获得，来源有限，提纯工艺复杂，价格昂贵，产品质量不易控制。另一类是人工半合成产物，通过简单分离获得丰富的天然多糖，经硫酸酯化结构修饰获得多糖硫酸酯，制备工艺简单，产品成本低，易通过控制反应条件合成出符合预期分子结构的产物。人工合成硫酸化多糖的方法很多，多糖构型不同，合成的方法不同，吡喃型多糖一般采用Wolfrom法，呋喃型多糖采用Nagasawa方法。

茯苓系多孔菌科药用真菌茯苓(Poria cocos(Schw.)Wolf)的干燥菌核，我国药典记载茯苓性味甘、淡、平，归心、肺、脾、肾经，具有利水渗湿，健脾宁心之功效，用于水肿尿少，痰饮眩悸，脾虚食少，便溏泄泻，心神不安，惊悸失眠。茯苓主要成分为碱溶性多糖，含量高达90％以上，为近似直链的β-1，3葡聚糖，开发利用茯苓多糖资源具有重大意义。本发明将氨基磺酸作为磺化试剂，对茯苓多糖进行硫酸化反应。本发明方法和目前普遍应用的SO₃-吡啶为磺化试剂的Wolfrom法相比，具有反应工艺简单、工艺成本大大降低、安全系数高、磺化效率高、副反应小等显著优点。由于工艺环节减少制作SO₃-吡啶危险步骤，大大简化制备工艺和增加工业化的安全系数。初步药效学实验结果表明茯苓多糖硫酸酯具有很强的抗凝血活性。

氨基磺酸(ASA，aminosulfonic acid)是重要的精细化工产品，由尿素与发烟硫酸或氯磺酸作用而得，广泛应用于金属和陶瓷制造的多种工业设备和民用设施的清洗剂、石油处理剂，以及染料医药工业用磺化试剂等各个领域中。氨基磺酸可以制成极纯的常温时稳定的结晶体，其水溶液具有与盐酸、硫酸同等的强酸性，别名固体硫酸。

氨基磺酸分子结构式

氨基磺酸作为磺化试剂广泛用于有机合成反应之中，与伯醇一起加热时容易生成硫酸二甲酯及氨。与苯酚、萘分别反应时可生成苯酚磺酸、萘酚磺酸铵。与其他高分子胺类(如脂肪酰胺等)容易反应，制成水溶性化合物。

发明内容

本发明的目的是提出一种成本较低且品质更好的一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法。

为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：

一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：

包括以下步骤：

(1)、茯苓去皮、干燥、粉碎，分3-5次溶于总体积为其10-15倍的0.5mol/LNaOH中，每次均在4-10℃浸提多糖5-10h，合并浸提所得上清液，用10％左右的醋酸将上清液中和至pH6-8，4-10℃下沉淀过夜，低温离心收集沉淀，去离子水洗涤沉淀3-5次，再用无水乙醇、丙酮和乙醚依次洗涤，70-90℃干燥，得白色茯苓多糖，研成粉末待用；

(2)、在旋转蒸发仪的反应瓶中加入氨基磺酸和有机溶剂，预热至反应温度80℃左右，氨基磺酸完全溶解后加入步骤(1)所得的干燥的茯苓多糖粉末，多糖和有机溶剂的料液比g∶mL＝1-20∶100，氨基磺酸和茯苓多糖的单糖残基的摩尔比为2-5∶1，反应温度70-95℃，反应体系抽真空，旋转搅拌反应0.2-5小时，转速60-150rpm；

(3)、反应结束后，冷却至室温，用饱和碱溶液调反应液pH到9-10，继续抽真空除氨，当pH值显著下降至6.5以下后，再加碱溶液调pH到9-10，再抽真空，如此反复2-10次，直至反应液无氨气味、pH值维持在7以上为止；

(4)、再向步骤(3)所得的反应液中加其3-5倍体积的95％左右的乙醇，沉淀多糖硫酸酯，过滤后再复溶于水，过滤，放入超滤器中脱盐并浓缩，用饱和氯化钡溶液检测洗脱液中游离硫酸根的残留量，直至无白色沉淀，超滤膜分子截留量为3000-15000Da，浓缩液用其3-5倍体积的95％左右的乙醇沉淀2-5次，最后收集沉淀，80-105℃烘干粉碎，即得产品。

所述的一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂为非质子极性溶剂，可以是单一溶剂或两种以上溶剂的混合。

所述的一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂为二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲酰胺、吡啶中的一种或几种。

所述的一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的碱溶液包括NaOH、KOH、Ca(OH)₂、Na₂CO₃、K₂CO₃、CaCO₃中的一种或两种。

本发明的原理为：

本发明之所以选用茯苓多糖制备硫酸化多糖，因为茯苓多糖自然界含量丰富，年产量以万吨计，提取纯化成本低，且茯苓多糖为近似直链的β-1，3葡聚糖，硫酸化过程中因为没有支链的位阻效应，相对其它多糖磺化效率更高。张珏(江南大学2005届博士论文)报导用氨基磺酸硫酸化灵芝碱溶性多糖，料液比(g∶mL)为2∶100；陈群在文献“茯苓硫酸酯化多糖的制备及其核磁共振波谱分析”(安徽农业科学，2010，38(1)：45-47)中报导用氨基磺酸硫酸化茯苓多糖，料液比(g∶mL)为2∶100。二者都是先将多糖溶解于有机溶剂中，再加入氨基磺酸进行反应。由于多糖在有机溶剂中溶胀粘度很大，限制了料液比的增大。本发明创新处在于先将氨基磺酸溶解于有机溶剂中，再直接加入多糖干粉进行反应，提高料液比，最高可达20∶100，增加反应中分子碰撞机会，大大提高磺化效率。本发明另一创新处在于反应全程抽真空，及时抽出反应产生的水，即可提高磺化效率，又抑制多糖分子降解和糖环双键的产生，产品色泽变浅。本发明创新处还在于产品后处理中采用反复调pH值、反复真空脱氨，改善产品最终品质。

本发明的有益效果：

1、本发明先将氨基磺酸溶解于有机溶剂中，再直接加入多糖干粉进行反应，提高料液比，最高可达20∶100，增加反应中分子碰撞机会，大大提高磺化效率；

2、本发明在反应全程抽真空，及时抽出反应产生的水，即可提高磺化效率，又抑制多糖分子降解和糖环双键的产生，产品色泽变浅；

3、本发明在产品后处理中采用反复调pH值、反复真空脱氨，改善产品最终品质。

附图说明

图1为茯苓多糖硫酸酯红外光谱；

图2为茯苓多糖硫酸酯¹³C-NMR谱；

图3为茯苓多糖分子结构式；

图4为茯苓多糖硫酸酯分子结构式。

具体实施方式、

实施例1：

一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：

包括以下步骤：

所述的一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的碱溶液包括NaOH、KOH、Ca(0H)₂、Na₂CO₃、K₂C0₃、CaCO₃中的一种或两种。

本发明专利产品单糖硫酸根取代度(DS)变化在0.5-2.7间，分子量变化在5,000-50,000Da间。

实施例2：

1、茯苓多糖的提取纯化

称取100g茯苓粉，分3次溶于总共为10倍体积的0.5mol/L NaOH中，每次4℃浸提多糖8h，合并3次浸提上清液，10％醋酸中和至pH6.5，4℃冰箱中沉淀过夜。低温离心收集沉淀，去离子水洗涤沉淀3次，无水乙醇、丙酮和乙醚依次洗涤，70℃干燥得白色茯苓多糖，研成粉末待用。苯酚-硫酸法检测多糖含量为99.2％，粘度法测定粘均分子量为2.15×10⁵Da。

2、茯苓多糖硫酸酯(Pachyman sulfate，PS)的制备

(1)1000ml梨形瓶中加入二甲基甲酰胺(DMF)200ml，水浴加热至80℃，加入氨基磺酸90g并完全溶解；

(2)加入30g茯苓多糖，氨基磺酸和茯苓多糖单糖残基摩尔比为5∶1，茯苓多糖与DMF的料液比(g∶mL)为15∶100；梨形瓶接旋转蒸发仪70℃旋转反应3小时，转速110rpm，抽真空，真空度达0.095MPa；

(3)饱和Na₂CO₃溶液调反应液pH到9.5；继续抽真空除氨，当pH值显著下降至6.5及其以下后，再加Na₂CO₃溶液调pH到9.5，再抽真空，如此反复5次，反应液无氨气味、pH值不再因脱氨下降。

(4)反应液中加入4倍体积的95％乙醇，沉淀多糖硫酸酯，过滤后再复溶于水，再过滤，放入超滤器中脱盐并浓缩，用饱和氯化钡检测洗脱液中游离硫酸根的残留量，直至无白色沉淀；超滤膜分子截留量为10000Da。

(5)浓缩液用5倍体积95％乙醇沉淀3次，最后收集沉淀，90℃烘干粉碎，得浅黄色粉末，得率115％。

3、茯苓多糖硫酸酯分子量测定

采用琼脂糖凝胶电泳法。电泳缓冲液为巴比妥缓冲液：取巴比妥钠12.4g溶于800ml水中，用2mol/L HCl调pH 8.6，加水至1000mL备用。电泳样品溶解液：0.1％溴酚蓝的40％蔗糖溶液。电泳染色液：0.5％甲苯胺蓝的50％乙醇溶液。分子量标准参照是肝素(HP)、低分子肝素(LMWH)和硫酸软骨素(CS)。

凝胶浓度1.2％，胶板厚3mm，电泳电压10V/cm；分子量标准品和样品均用电泳样品溶解液配成10mg/mL的溶液，上样5μL；电泳结束后染色10min，流水振荡脱色，按下式计算各供试品的电泳迁移率：电泳迁移率＝供试品泳动距离/低分子肝素泳动距离。

迁移率对硫酸化多糖分子量(M)对数作图得回归方程：迁移率＝-0.305lgM+2.190(R²＝0.9985)。代入PS的迁移率得茯苓多糖硫酸酯分子量为10471Da。

表1茯苓多糖硫酸酯(PS)琼脂糖电泳迁移率

4、茯苓多糖硫酸酯单糖残基硫酸根取代度(DS)测定

采用元素分析法。检测仪器为德国元素分析系统公司的元素分析仪Vario ELcube。结果显示硫元素含量质量百分比为14.67％。单葡萄糖残基结合硫酸根数——取代度((DS，Degree of Sulfation))计算公式为：DS＝1.62×S％÷(32-1.02S％)，代入S元素分析结果，DS为1.395。

5、茯苓多糖硫酸酯红外光谱分析

采用KBr压片法，仪器为热电NICOLET 8700傅里叶变换红外光谱仪，仪器校正采用聚苯乙烯薄膜法。结果显示(见图1)1232cm^-1附近的吸收峰，归属于C-H变角振动峰和硫酸根的S＝O伸缩振动峰；812cm^-1附件的吸收峰，为C-O-S键的振动峰，该两处吸收峰为硫酸化糖类的特征峰。

6、茯苓多糖硫酸酯核磁共振光谱分析

仪器为德国BRUKER AV500M超导核磁共振仪，溶剂为氘代Me₂SO-d₆。测试结果见表2和图2

表2PS ¹³C-NMR谱图数据解析列表

碳原子编号及归属	C1	C2	C2-S	C3	C4	C5	C6-S	C6
									化学位移(ppm)	102.7	73.3	79.4	84.8	68.4	74.0	67.7	61.3

61.3ppm处的C6信号十分减弱，在67.7ppm处强信号说明C6几乎全部被硫酸化；73.3ppm C2化学位移和79.4ppm硫酸化的C2化学位移说明C2被部分硫酸化。

PS底物为茯苓多糖，其公认结构为β-1，3葡聚糖(见图3)。综合项目4、5和6的结果，可得出结论：硫酸化产物PS硫酸化位点为葡萄糖残基上的C6，39.5％的C2位点也发生硫酸酯化反应。PS结构见图4。

7、茯苓多糖硫酸酯抗凝血活性测定

检测方法采用新鲜兔血法。用0.9％生理盐水配制8％柠檬酸三钠、0.25％和1％CaCl₂。肝素标准品(上海生工，抗凝血效价150U/mg)配制成8U/mL，PS配制成0.05mg/mL，均用生理盐水配制。

(1)兔血浆的配置兔颈动脉取血收集于预先加入8％柠檬酸三钠溶液的容器中，柠檬酸三钠与血浆的比例为1∶19，边收集边摇动，迅速于离心机上分离血浆。取1mL血浆于试管中，加0.2mL 1％氯化钙溶液混匀，若5分钟内有血块出现，则此血浆可用。将血浆分装多份，每份体积不超过100ml，装入200mL的容量瓶中，-8℃保存。

(2)测定肝素标准品和PS 1/2凝固度所需的大致体积(V_1/2)取冰冻血浆，37℃水浴解冻，并用粗滤纸过滤。分标准品组和样品组，每组取19支试管，按顺序吸入70-250μL肝素标准液或PS样品液，以10μL加1级(即70，80，90，100....250μL)，各管加1mL过滤后的血浆和0.8mL 0.25％氯化钙溶液，每管以同样的方式倒转3次混匀。垂直放试管于37℃水浴内，开始记时。1小时后取出试管观察，记录凝固度。凝固度分5级，分级标准依据中国药典2005年版二部附录XIID。结果是肝素标准品V_1/2是140μL，PS V_1/2是225μL。

(3)肝素和样品精确1/2凝固度体积(V_1/2)测定取28支试管，分4组：标准液2组，测定2组。每组以大致V_1/2作中点，上下每管间隔5μL，各做3管(即V_1/2±15μL，V_1/2±10μL，V_1/2±5μL，V_1/2)。每支试管加入过滤血浆1mL和0.25％氯化钙溶液0.8mL。每管以同样的方式倒转3次混匀，放入37℃水浴中恒温。1小时后取出，观察并记录凝固度，确定每组标准液和样品液的V_1/2体积。结果是肝素精确V_1/2为135μL，PS精确V_1/2是225μL。

(4)PS效价计算PS效价(U/mg)＝(Vstd*Cstd)/(Vsam*Csam)

式中：Vstd---肝素标准品1/2凝固度的肝素加入体积(μL)，这里是135μL

Vsam---PS样品1/2凝固度时加入体积(μL)，这里是225μL

Cstd---肝素标准品溶液的浓度(U/mL)，这里是8U/mL

Csam---PS样品溶液的浓度(mg/mL)，这里是0.05mg/mL

通过计算，PS样品的效价为96U/mg，相当于肝素标准品的64％。

Claims

1.一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：

包括以下步骤：

（1）、茯苓去皮、干燥、粉碎，分3-5次溶于总体积为其10-15倍的0.5 mol/L NaOH中，每次均在4-10 ℃浸提多糖5-10 h，合并浸提所得上清液，用10％左右的醋酸将上清液中和至pH6-8，4-10 ℃下沉淀过夜，低温离心收集沉淀，去离子水洗涤沉淀3-5次，再用无水乙醇、丙酮和乙醚依次洗涤，70-90 ℃干燥，得白色茯苓多糖，研成粉末待用；

（2）、在旋转蒸发仪的反应瓶中加入氨基磺酸和有机溶剂，预热至反应温度80℃左右，氨基磺酸完全溶解后加入步骤（1）所得的干燥的茯苓多糖粉末，多糖和有机溶剂的料液比g:mL =1-20:100，氨基磺酸和茯苓多糖的单糖残基的摩尔比为2-5:1，反应温度70-95 ℃，反应体系抽真空，旋转搅拌反应0.2-5小时，转速60-150 rpm；

（3）、反应结束后，冷却至室温，用饱和碱溶液调反应液pH到9-10，继续抽真空除氨，当pH值显著下降至6.5以下后，再加碱溶液调pH到9-10，再抽真空，如此反复2-10次，直至反应液无氨气味、pH值维持在7以上为止；

（4）、再向步骤（3）所得的反应液中加其3-5倍体积的95%左右的乙醇，沉淀多糖硫酸酯，过滤后再复溶于水，过滤，放入超滤器中脱盐并浓缩，用饱和氯化钡溶液检测洗脱液中游离硫酸根的残留量，直至无白色沉淀，超滤膜分子截留量为3000-15000 Da，浓缩液用其3-5倍体积的95%左右的乙醇沉淀2-5次，最后收集沉淀，80-105 ℃烘干粉碎，即得产品。

2.根据权利要求1所述的一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂为非质子极性溶剂，可以是单一溶剂或两种以上溶剂的混合。

3.根据权利要求2所述的一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂为二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲酰胺、吡啶中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述的碱溶液包括NaOH、KOH、Ca(OH)₂、Na₂CO₃ 、K₂CO₃、 CaCO₃中的一种或两种。