CN105985451A - 一种当归酸性多糖组分及其提取方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种当归酸性多糖组分及其提取方法，以及其在制备抗癌、增强免疫、抗辐射损伤药物及保健品中的应用，属于中药现代化领域。本发明将当归根脱脂后，用碱水回流提取，多糖醇沉析出后除蛋白，透析后阴离子交换柱DEAE系列柱分级，0.5mol/L NaCl洗脱部分尺寸排阻色谱进一步纯化，得到的50kD以上组分减压浓缩，冷冻干燥。本发明提供的当归酸性多糖组分具有显著的抗癌、增强免疫、抗辐射损伤作用。

Description

一种当归酸性多糖组分及其提取方法与应用

技术领域

本发明涉及一种当归酸性多糖组分、提取方法，及其在制备抗癌、增强免疫、抗辐射损伤药物中的应用，属于中药现代化领域。

背景技术

当归为伞形科植物Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，为著名常用中药，有补血活血、润肠调经之功效。国内外学者应用现代提取分离、含量测定方法对当归的化学成分进行了分析研究，发现当归的主要有效成分为多糖和挥发油等。近二十年来，由于分子和细胞生物学的发展，人们逐渐认识到多糖及其复合物具有极为重要的生物功能。研究发现，当归多糖具有抗血栓及改善血液流变、保护心血管系统、抑菌、抗肿瘤、增强免疫、抗消化道溃疡、抗辐射损伤、保护肺部组织细胞、利胆保肝、补血等生物活性[Jin等，Isolation,structure andbioactivities of the polysaccharides from Angelica sinensis(Oliv.)Diels:areview.Carbohydrate Polymers,2012；89(3):713-722]，具有开发成为新药和功能性食品的潜力。

多糖是由10个或10个以上单糖基通过糖苷键连接而成的直链或支链的聚糖。根据单糖组成的不同，多糖可以分为均多糖和杂多糖。自然界中单糖种类有200多种，而且每种单糖同时又分为D-系列和L-系列两类构型，在聚合成多糖时，它们可以通过多种不同的结合位点连接。目前已知的多糖结构中，除单糖基之外，还含有糖醛酸、氨基糖、糖醇等，并且有其他取代基，如：O-乙酰基、N-乙酰基、磺酸基等。这些基团的取代，增加了多糖结构的复杂性，而多糖的活性与其结构性质关系密切。

目前当归多糖的提取分离方法主要报道如下：

丁虹报道了[当归多糖组合物及其制备方法，专利号ZL03118481.2]将当归用水提取，乙醇两次沉淀、离心得多糖的方法。刘娟等[当归多糖的分离纯化及其部分理化性质的研究.华西药学杂志.2004,19(6):412-414]报道了将新鲜当归粉碎后脱去表面油脂，用水煎煮1小时，浓缩、65％乙醇沉淀，等电点沉淀法除蛋白，即加碱溶液调pH10～11，放置过夜，抽滤，滤液用酸溶液调pH5～6，再抽滤，滤液用85％乙醇沉淀，醇沉物进一步用Sevag法去蛋白，冷冻干燥即得当归多糖。张新国等[当归多糖的酶法提取新工艺研究.中医药学报.2012,40(3):96-100]报道了将当归粉用含0.4mg/mL纤维素酶的水(pH＝5.0)60℃提取4小时，100℃灭活酶后，浓缩，Sevag法去蛋白，冷冻干燥即得当归多糖。彭仁琇等[一种从制备当归注射液的废弃物中提取当归多糖的方法，专利号ZL03118537.1]报道了将制备当归注射液所得的醇沉物，加水溶解，0～10℃静置后过滤，去沉淀，浓缩后加入无水乙醇，多次静置、沉淀后得当归多糖的方法。金汝城等[当归多糖制备工艺的研究.中成药.2007,29(8):1146-1150]将脱脂后的当归采用10倍水溶液微波辐射萃取法3次，每次4min提取当归多糖，进一步纯化时采用传统醇沉法。尚京川等[当归多糖的分离提取工艺及其应用，专利申请号201410097326.0]将当归粗粉直接用水提取，提取液浓缩后用95％乙醇沉淀得粗多糖，加饱和氢氧化钙除蛋白，分别经过强酸性阳离子交换树脂和强碱性阴离子交换树脂处理除去酸、碱性物质，透析后浓缩得当归多糖(主要为中性多糖)。可见：目前的当归多糖提取均采用沸水回流提取(100℃)和恒温(70～80℃)水浴提取的方法；辅助提取手段包括采用超声波、微波等技术，采用Sevag法和等电点沉淀法除蛋白，离子交换树脂除酸、碱性杂质。多糖的提取方法对于后续多糖分离及得到的多糖结构和理化特性有重要的影响。

目前报道的多糖分离方法及得到的多糖结构和理化特性如下：

张林维等[张林维，等.当归多糖的分离纯化及其部分性质的研究.生物学杂志,1998,15(3):12-14；张林维，黄汝多.当归水溶性多糖级份AS-Ⅲa和AS-Ⅲb的纯化鉴定和结构研究.激光生物学报,1999,8(2):123-126]将当归进行热水提取、乙醇分级沉淀、DEAE纤维素和SephadexG-150柱层析处理后得到了两个组分：多糖AS-Ⅲa和AS-Ⅲb，AS-Ⅲa是由α(1→3)葡萄糖连接而成的分子量为85kD的葡聚糖，AS-Ⅲb是由葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖以10:10:4的比例组成的分子量为49kD的聚糖。

陈汝贤等[陈汝贤，等.当归多糖XC-1的分离与结构研究.化学通报,2001(6):372-374；陈汝贤，等.当归多糖X-C-3-Ⅱ的分离纯化与组成研究.中国新药杂志,2001,10(6):431-432]先后用热水提取、乙醇沉淀、DEAE-Sephadex A-25柱层析得到两种当归多糖组分XC-1和X-C-3-Ⅱ。XC-1是由α(1→6)葡萄糖连接而成的100kD葡聚糖；X-C-3-Ⅱ是由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖醛酸组成的100kD杂多糖。

孙元琳等[孙元琳，等.当归多糖的分级制备及组成分析.河南工业大学学报(自然科学版),2005,26(2):40-43]将水提得到的当归总多糖经离子交换柱层析分离得到三个多糖组分：W-ASP1、W-ASP2和W-ASP3。W-ASP1由葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖组成，为中性多糖；W-ASP2主要由半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和糖醛酸组成，为弱酸性多糖；W-ASP3主要由半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖组成。之后孙元琳等[孙元琳，等.当归水溶性多糖的分离、纯化及结构初步分析.食品与生物技术学报,2006,25(1):1-4]又用Sepharose CL-6B柱对W-ASP1进行层析分级，得到中性多糖W-ASP11和W-ASP12两种组分，前者为葡聚糖，后者为阿拉伯半乳聚糖。

Lu Zhao等[Lu Zhao,et al.Structural characterization andradioprotection of bone marrow hematopoiesis of two novelpolysaccharides from the root of Angelica sinensis(Oliv.)Diels.Fitoterapia,2012(83):1712-1720]也从当归中得到了两种均一性多糖APS-1a和APS-3a，它们均由半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖以不同比例连接而成。

根据以上可见，目前分离得到的当归多糖组分较多，但不同的组分由于组成的多糖结构及性质不同，因此活性存在很大的差异。发明人对当归多糖进行了多年的研究，首次发现一种酸性多糖组分具有多种活性，抗肿瘤等作用强于总当归多糖。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种当归酸性多糖组分的提取方法，以批量得到具有重大应用价值的当归酸性多糖。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种当归酸性多糖组分的提取方法，包括以下步骤：

(1)脱脂：将当归根粉碎成粉，用有机溶剂回流、浸渍或渗漉提取进行脱脂处理，弃提取液，脱脂后的当归根渣备用；

(2)碱水提取：将所述脱脂后的当归根渣干燥后，用相当于其重量4～10倍的碱水70～100℃下回流1～5h提取2～3次，合并水提液，将其减压浓缩至相当于原体积1/4～1/30的提取浓缩液，4℃预冷2～24小时；

(3)沉淀析出：搅拌下向所述提取浓缩液加入1～5倍体积的甲醇、乙醇或丙酮，4～10℃静置4～24小时后，析出沉淀，1000～6000g离心3～20分钟，沉淀备用；

(4)除蛋白：将离心后的沉淀采用Sevag法、反复冻融法或等电点沉淀法一种或多种方法合用除蛋白直至紫外检测无280nm的蛋白吸收峰，离心除去沉淀，保留水相；

(5)小分子杂质的去除：用截流分子量2000-8000Da的透析膜对所述水相进行水透析除去小分子杂质，收集透析袋内溶液，将其减压浓缩至相当于原体积1/2～1/50的浓缩液，备用；

(6)分级：将步骤(5)所述浓缩液8000～10000g离心后，上DEAE-sephadex A-25或DEAE-纤维素柱，用水洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；再用0.5mol/L的氯化钠水溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集氯化钠水溶液洗脱液，将其减压浓缩至相当于原体积1/2～1/50的洗脱浓缩液；

(7)纯化：将所述洗脱浓缩液8000～10000g离心后，上SephadexG-200、Sephadex G-100、Sephadex G-75、Sephacryl S-400或SephroseCL-6B凝胶柱，用水洗脱，收集分子量50kD以上组分的洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，即得当归酸性多糖组分。

本发明所述的方法，步骤(1)中所述有机溶剂为甲醇、50～100％乙醇、乙醚或石油醚，优选80-100％乙醇。

优选地，步骤(1)中用相当于当归根重量2～8倍的80-100％乙醇在80～100℃加热回流提取1～2小时，共提取2次进行脱脂处理。

本发明所述的方法，步骤(2)中所述碱水为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、氨水中的一种或两种的混合水溶液，优选为0.8～1.2mol/L的氢氧化钠或氢氧化钾。上述碱水能够在不破坏多糖结构的同时获得当归酸性多糖最佳的提取率。

此外本发明所述的方法，各步骤的核心操作参数优选如下：

步骤(1)中用相当于当归根重量2～8倍的80-100％乙醇在80～100℃加热回流提取1～2小时，共提取2次进行脱脂处理。

步骤(2)中所述碱水中的碱为0.8～1.2mol/L的氢氧化钠水溶液。

步骤(3)中加入乙醇体积为2～3倍，4℃静置4～24小时后，析出沉淀，3000～6000g离心10～20分钟。

步骤(4)除蛋白的方法优选为反复冻融法和Sevag法合用除蛋白直至紫外检测无280nm的蛋白吸收峰，离心除去沉淀，保留水相。

步骤(5)小分子杂质的去除方法优选为用截流分子量6000-8000Da的透析膜对上述水相进行水透析除去小分子杂质，透析袋内溶液减压浓缩至相当于原体积1/2～1/20的浓缩液。

步骤(6)分级的方法优选为上述浓缩液离心后，上DEAE-sephadexA-25柱，用水洗脱除杂；再用0.5mol/L的氯化钠水溶液洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集洗脱液，将其减压浓缩至相当于原体积1/5～1/20。

步骤(7)纯化的方法优选为上述洗脱浓缩液离心后，上SephadexG-100凝胶柱，用水洗脱，收集分子量50kD以上组分的洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，即得当归酸性多糖组分。

更具体地，本发明所述提取方法优选包括如下步骤：

(1)脱脂：将当归根粉碎成粉，用相当于当归根重量2～8倍的80-100％乙醇在80～100℃加热回流提取1～2小时，共提取2次进行脱脂处理，弃提取液，脱脂后的当归根渣备用；

(2)碱水提取：将所述脱脂后的当归根渣干燥后，用相当于其重量4～8倍的0.8～1.2mol/L的氢氧化钠水溶液80～100℃下回流1～3小时提取2～3次，合并水提液，将其减压浓缩至相当于原体积1/4～1/20的提取浓缩液，4℃预冷2～24小时；

(3)沉淀析出：搅拌下向所述提取浓缩液加入2～3倍体积的乙醇，4℃静置4～24小时后，析出沉淀，3000～6000g离心10～20分钟，沉淀备用；

(4)除蛋白：将离心后的沉淀采用反复冻融法和Sevag法除蛋白直至紫外检测无280nm的蛋白吸收峰，离心除去沉淀，保留水相；

(5)小分子杂质的去除：用截流分子量6000-8000Da的透析膜对所述水相进行水透析除去小分子杂质，收集透析袋内溶液，将其减压浓缩至相当于原体积1/2～1/20的浓缩液，备用；

(6)分级：将步骤(5)所述浓缩液8000～10000g离心后，上DEAE-sephadex A-25柱，用水洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；再用0.5mol/L的氯化钠水溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集氯化钠水溶液洗脱液，将其减压浓缩至相当于原体积1/5～1/20的洗脱浓缩液；

(7)纯化：将所述洗脱浓缩液8000～10000g离心后，上SephadexG-100凝胶柱，用水洗脱，收集分子量50kD以上组分的洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，即得当归酸性多糖组分。

本发明的第二目的在于保护上述方法提取得到的当归酸性多糖组分。

按本发明提供的上述方法制备的当归酸性多糖组分为淡黄色，无定型粉末，溶于水，与苯酚-硫酸试剂反应显黄色，多糖含量大于90％，蛋白质含量小于5％；单糖组成为甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、氨基半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖。

本发明所述的当归酸性多糖组分具有分子量分布范围和单糖组成明确的特点，其具备明显的抗癌、增强免疫、抗辐射损伤的效果。

本发明的第三目的在于提供一种当归酸性多糖衍生物，将所述当归酸性多糖通过乙酰化、硫酸化和/或羧甲基化制备所得。具体的乙酰化、硫酸化和羧甲基化的方法均为已知的常规方法，为本领域技术人员所掌握，本发明对此不作特别限定，本领域技术人员可以理解的是基于本发明所述当归酸性多糖的药用/保健用价值，其衍生物同样具备相同/相近的活性。

本发明的另一目的在于提供上述当归酸性多糖及其衍生物在制备抗癌症药物、免疫增强药物、抗辐射药物或功能保健品中的应用。

本发明得到的当归酸性多糖组分及衍生物有显著的增强免疫的作用、显著的抗辐射作用，可提高人体对辐射的耐受力，并有助于辐射损伤的修复。

其中，所述的癌症包括食管癌，肺癌，胃癌，肝癌，结、直肠癌，鼻咽癌，脑肿瘤，甲状腺癌，乳腺癌，骨癌，宫颈癌，白血病及黑色素瘤。

本发明所述药物或功能保健品为口服剂型、舌下或口含给药剂型、静脉、皮下、透皮或肌内给药剂型，例如注射液、粉针等。本发明所述药物或功能保健品以当归酸性多糖或衍生物为单一活性成分或作为活性成分之一，本领域技术人员可依据实际需求向其中加入合适的添加剂，采用常规技术手段制备成相应剂型，本发明对此不作特别限定。

具体实施方式

下面列举典型实施例，对本发明进一步说明，但不以任何形式构成对本发明的限制。

实施例1

称取1kg当归根，粉碎为粗粉；用4000mL无水乙醇回流提取2小时(脱脂)，滤出乙醇提取液，把当归根渣(以下也可称为药渣)按上述方法再处理1次，滤出乙醇提取液，残渣挥干乙醇，40℃干燥后，用6000mL 1.0mol/L的NaOH回流提取3次，每次2h。合并水提液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至1000mL，4℃预冷4小时后加入2倍体积无水乙醇，4℃静置12小时后，4000g离心15分钟，收集沉淀。沉淀用400mL水溶解，反复冻融5次，离心，弃去沉淀；采用Sevag法(即V_多糖溶液︰V_氯仿︰V_正丁醇＝20︰4︰1混合振荡半小时，离心，静置分层，取水层)除蛋白，反复4次至氯仿与水的界面无沉淀，离心弃去沉淀。水溶液用截流分子量8000Da的透析膜，对蒸馏水透析48小时除去小分子杂质，收集透析袋内溶液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至150mL。将浓缩液10000g离心10分钟后，上DEAE-sephadex A-25(80cm×3.5cm,i.d.)柱，用水以流速1.5mL/min洗脱2000mL至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；再用0.5mol/L NaCl洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集2000mL 0.5mol/L NaCl洗脱液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至100mL。浓缩液10000g离心10分钟后，上Sephadex G-100(100cm×5cm,i.d.)凝胶柱，用水以流速1.0mL/min洗脱，收集前400mL洗脱液(分子量大于50kD)以上组分的洗脱液，减压浓缩至20mL，冷冻干燥，得到当归酸性多糖5.3g。

实施例2

称取1kg当归根，粉碎为粗粉；用8000mL 95％乙醇回流提取2小时，滤出乙醇提取液，药渣挥干乙醇，50℃干燥后，用8000mL 1.2mol/L的NaOH回流提取2次，每次3h。合并水提液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至800mL，4℃预冷6小时后加入2倍体积无水乙醇，4℃静置12小时后，3000g离心15分钟，收集沉淀。沉淀用300mL水溶解，反复冻融10次，离心，弃去沉淀。水溶液用截流分子量8000Da的透析膜，对蒸馏水透析48小时除去小分子杂质，收集透析袋内溶液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至120mL。将浓缩液10000g离心10分钟后，上DEAE-sephadex A-25(80cm×3.5cm,i.d.)柱，用水以流速1.5mL/min洗脱1500mL至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；再用0.5mol/L NaCl洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集1000mL 0.5mol/L NaCl洗脱液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至80mL。浓缩液10000g离心10分钟后，上Sephadex G-100(80cm×5cm,i.d.)凝胶柱，用水以流速1.0mL/min洗脱，收集前300mL洗脱液(分子量大于50kD)以上组分的洗脱液，减压浓缩至15mL，冷冻干燥，得到当归酸性多糖3.1g。

实施例3

称取1kg当归根，粉碎为粗粉；用2000mL 95％乙醇润湿；用8000ml95％乙醇进行渗漉，药渣挥干乙醇，50℃干燥后，用8000mL 1.0mol/L的KOH回流提取2次，每次3h。合并水提液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至800mL，4℃预冷6小时后加入3倍体积无水乙醇，4℃静置12小时后，3000g离心10分钟，收集沉淀。沉淀用300mL水溶解，反复冻融5次，离心，弃去沉淀。加氢氧化钙碱溶液调pH 11，4℃放置过夜，抽滤，滤液用硫酸溶液调pH 5，4℃放置过夜，再抽滤，滤液加KOH碱溶液调pH 7，水溶液用截流分子量8000Da的透析膜，对蒸馏水透析48小时除去小分子杂质，收集透析袋内溶液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至200mL。将浓缩液10000g离心10分钟后，上DEAE-sephadex A-25(80cm×3.5cm,i.d.)柱，用水以流速1.5mL/min洗脱1200mL至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；再用0.5mol/L NaCl洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集1000mL 0.5mol/L NaCl洗脱液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至80mL。浓缩液10000g离心10分钟后，上Sephadex G-75(80cm×5cm,i.d.)凝胶柱，用水以流速1.0mL/min洗脱，收集前350mL洗脱液(分子量大于50kD)以上组分的洗脱液，减压浓缩至15mL，冷冻干燥，得到当归酸性多糖3.7g。

实施例4

称取1kg当归根，粉碎为粗粉；置于索氏提取器中用3000mL石油醚回流提取4小时，残渣挥干石油醚，40℃干燥后，用8000mL 1.0mol/L的NaOH回流提取3次，每次3h。合并水提液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至2000mL，4℃预冷4小时后加入2倍体积丙酮，4℃静置12小时后，3000g离心10分钟，收集沉淀。沉淀用300mL水溶解，反复冻融5次，离心，弃去沉淀；采用Sevag法(即V_多糖溶液︰V_{氯 仿}︰V_正丁醇＝20︰4︰1混合振荡半小时，离心，静置分层，取水层)除蛋白，反复3次至氯仿与水的界面无沉淀，离心弃去沉淀。水溶液用截流分子量8000Da的透析膜，对蒸馏水透析48小时除去小分子杂质，收集透析袋内溶液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至150mL。将浓缩液10000g离心10分钟后，上DEAE-纤维素(80cm×3.5cm,i.d.)柱，用水以流速1.5mL/min洗脱1000mL至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；再用0.5mol/L NaCl洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集800mL 0.5mol/L NaCl洗脱液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至80mL。浓缩液10000g离心10分钟后，上Sephacryl S-400(80cm×3.5cm,i.d.)凝胶柱，用水以流速1.0mL/min洗脱，收集前300mL洗脱液(分子量大于50kD)以上组分的洗脱液，减压浓缩至15mL，冷冻干燥，得到当归酸性多糖2.7g。

实施例5

称取1kg当归根，粉碎为粗粉；用4000mL无水乙醇回流提取2小时，滤出乙醇提取液，把药渣按上述方法再处理1次，滤出乙醇提取液，残渣挥干乙醇，40℃干燥后，用6000mL 0.8mol/L的NaOH回流提取3次，每次2h。合并水提液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至1000mL，4℃预冷4小时后加入3倍体积无水乙醇，4℃静置12小时后，3000g离心10分钟，收集沉淀。沉淀用400mL水溶解，反复冻融20次，离心，弃去沉淀；水溶液用截流分子量8000Da的透析膜，对蒸馏水透析48小时除去小分子杂质，收集透析袋内溶液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至150mL。将浓缩液10000g离心10分钟后，上DEAE-sephadex A-25(80cm×3.5cm,i.d.)柱，用水以流速1.5mL/min洗脱2000mL至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；再用0.5mol/L NaCl洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集2000mL 0.5mol/L NaCl洗脱液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至100mL。浓缩液10000g离心10分钟后，上Sephadex G-100(100cm×5cm,i.d.)凝胶柱，用水以流速1.0mL/min洗脱，收集前400mL洗脱液(分子量大于50kD)以上组分的洗脱液，减压浓缩至20mL，冷冻干燥，得到当归酸性多糖4.6g。

实施例6

称取1kg当归根，粉碎为粗粉；用6000mL无水乙醇回流提取2小时，滤出乙醇提取液，把药渣按上述方法再处理1次，滤出乙醇提取液，残渣挥干乙醇，40℃干燥后，用6000mL 1.0mol/L的NaOH回流提取3次，每次2h。合并水提液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至1000mL，4℃预冷4小时后加入3倍体积无水乙醇，4℃静置12小时后，3000g离心10分钟，收集沉淀。沉淀用500mL水溶解，采用Sevag法除蛋白，反复8次至氯仿与水的界面无沉淀，离心弃去沉淀。水溶液用截流分子量8000Da的透析膜，对蒸馏水透析48小时除去小分子杂质，收集透析袋内溶液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至150mL。将浓缩液10000g离心10分钟后，上DEAE-sephadex A-25(80cm×3.5cm,i.d.)柱，用水以流速1.5mL/min洗脱2000mL至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；再用0.5mol/L NaCl洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集2000mL 0.5mol/L NaCl洗脱液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至100mL。浓缩液10000g离心10分钟后，上Sephadex G-100(100cm×5cm,i.d.)凝胶柱，用水以流速1.0mL/min洗脱，收集前400mL洗脱液(分子量大于50kD)以上组分的洗脱液，减压浓缩至20mL，冷冻干燥，得到当归酸性多糖4.2g。

实施例7

多糖的乙酰化：称取实施例1得到的多糖100mg于三颈瓶中，加入10mL醋酐和2mL浓硫酸，室温浸泡60小时后反应24小时(55℃)。将反应液倒入20mL 200g/L的醋酸钠溶液中，冰浴搅拌24小时，三氯甲烷萃取3次。萃取液用去离子水和饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤至pH为7，减压蒸干，样品加水溶解，过硅胶柱分离。得到当归酸性多糖的乙酰化修饰物。

实施例8

多糖的硫酸化：称取实施例1得到的多糖100mg，边搅拌边加入到装有5mL二甲基甲酰胺的三颈瓶中，超声处理20min后，将酯化试剂(1.25mL氯磺酸滴加到5mL预冷的无水吡啶中，盐冰浴混合)加入到反应体系中。60℃反应3h。反应完毕后，冷却至0℃左右，再加入2.5mol/L氢氧化钠溶液调pH值至7.0-8.0，透析48小时，用去离子水透析48小时。浓缩后，乙醇沉淀，丙酮、无水乙醚分别洗涤，冷冻干燥。得到当归酸性多糖硫酸化修饰物。

实施例9

多糖的羧甲基化：称取实施例1得到的多糖100mg于三颈瓶中，分散于10mL异丙醇中，室温下搅拌6小时，加入2mL 5mol/L的氢氧化钠溶液，于85℃水浴回流1.5小时，在15分钟内加入15mL 2.5mol/L的氯乙酸，混合物于55℃恒温反应4小时，并不断搅拌，反应结束后，冷却至室温，反应液用5mol/L盐酸调至7.0，过滤，滤液用去离子水透析48小时，浓缩，用乙醇沉淀，甲醇︰水(1︰1)洗涤数次，冷冻干燥,得到当归酸性多糖羧甲基化修饰物。

以下通过试验例来进一步阐明本发明所述当归酸性多糖的物理化学性质和对疾病的治疗效果。

试验例1：当归酸性多糖组分的纯度及重均分子量的测定

色谱柱：Shodex sb-803HQ和sb-805HQ串联柱；流动相：0.05mol/L硫酸钠水溶液；流速：0.8mL/min；柱温：室温；仪器：Waters 2690高效液相色谱仪及工作站，Waters 2414示差折光检测器。标准葡聚糖Dextran T-130、T-80、T-40、T-20和T-10(Amersham公司)分别用流动相临用前配制成2％的溶液，高速离心，上清液进样量10μL，分别求得洗脱体积Ve；蓝色葡聚糖2000000及葡萄糖同法上样，分别求得柱的空体积V₀和总体积Vt。根据公式Kav＝(Ve-Vo)/(Vt-Vo)计算各标准葡聚糖的分配系数(Kav)值，以Kav为横坐标，lg M为纵坐标，得到分子量测定标准曲线：Y＝-3.1671X+5.8824(r＝0.9975)。

分别称取实施例1、2和3得到的多糖同上法制备，进样，保留时间分别为13.347、13.389和13.435min，均为单一对称峰，可见上述实施例得到的当归酸性多糖相同，为均一性多糖，计算可得重均分子量平均为7.2×10⁵Da。

试验例2：当归酸性多糖组分的总糖、糖醛酸、蛋白含量的测定

总糖含量测定：以浓度为0，20，40，60，100，120mg/L的葡萄糖(Sigma公司)为标准制作标准曲线。分别准确称取实施例1、2和3得到的多糖，配制100mg/L的样品水溶液。精密吸取样品液2.0mL于试管中，加入6％苯酚溶液1.0mL及浓硫酸5.0mL，混匀，室温放置20分钟后于490nm波长处测吸光度值，以标准曲线计算多糖含量分别为93.37、90.05、91.77％。

半乳糖醛酸(galacturonic acid，Gal A)含量测定：采用硫酸-咔唑法测定Gal A含量，以浓度为0，20，40，60，80，100mg/L的Gal A(Sigma公司)为标准制作标准曲线。分别准确称取实施例1、2和3得到的当归酸性多糖，配制500mg/L的样品水溶液。精密吸取样品液1.0mL于试管中，在冰水浴中向各管加入6mL浓硫酸，摇匀后，在沸水浴中准确加热10分钟，取出后冷至室温。各管加0.15％咔唑试剂0.5mL，充分混合，在室温下放置30分钟，以0mg/L Gal A标准溶液管为空白，在530nm波长下测定吸光度，以标准曲线计算Gal A含量分别为36.87、35.25和33.12％。

蛋白质含量测定：采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，以浓度为0，10，20，30，40，50mg/L的牛血清白蛋白(Sigma公司)为标准制作标准曲线。分别准确称取实施例1、2和3得到的当归酸性多糖，配制500mg/L的样品水溶液。精密吸取样品液0.5mL于试管中，然后加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0mL，混匀，于595nm波长处测吸光度值，以标准曲线计算蛋白质含量分别为1.08、4.88和3.95％。

试验例3：当归酸性多糖组分的单糖组成分析

多糖水解：精密称取实施例1得到的当归酸性多糖样品5.0mg于安瓿中，加入2mol/L的三氟乙酸2.5mL，充氮气封管，110℃水解6小时。冷却至室温，反应混合物离心后取上清液，加入2mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0。

单糖衍生物的制备：分别加入0.3mol/LNaOH溶液200μL和0.5mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液400μL，混匀后置于70℃水浴30分钟，取出。冷却到室温后，加入0.3mol/L的HCl溶液中和。加入水2mL，4mL氯仿涡旋萃取，离心分层。小心用注射器吸去下层有机层，上层水相再重复萃取2次，得PMP衍生化样品。标准单糖(L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸、D-(+)-半乳糖醛酸、L-岩藻糖、D-(+)-氨基葡萄糖、D-(+)-氨基半乳糖)等同法处理。

HPLC分析方法：采用岛津LC-2010A HT色谱系统；Hypersil BDSC₁₈(4.6mm i.d.×250mm,5μm)分析柱(大连依利特)；检测波长为250nm；柱温为室温。流动相由乙酸铵水溶液(100mmol/L，pH 5.0)、乙腈和四氢呋喃以81∶17∶2的体积比组成，流速为1.0mL/min。进样体积为20μL。

根据单糖的保留时间及峰面积确定实施例1得到的当归多糖单糖组成及摩尔比为甘露糖∶氨基葡萄糖∶鼠李糖∶氨基半乳糖∶葡萄糖醛酸∶半乳糖醛酸∶葡萄糖＝1.7∶13.9∶1.3∶1.3∶2.3∶2.1∶1。

试验例4：当归酸性多糖组分对体外培养的肺癌，肝癌，胃癌，结肠癌，神经胶质瘤，宫颈癌，白血病的生长抑制作用

实验试剂：噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)为Sigma产品；RPMI 1640、DMEM、胰蛋白酶及小牛血清为Gibco产品。其余试剂均为国产分析纯。细胞培养使用RPMI 1640或DMEM培养液(含10％灭活的小牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素)，置于37℃、5％CO₂孵箱中培养。

对体外培养的肿瘤细胞的抑制作用：取对数生长期的细胞，以3～5×10⁷/L的密度接种于96孔板，每孔100μL，在37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养12h。试验设阴性对照组、DMSO溶剂对照组、不同浓度给药组。每个培养孔加入0.02～6mg/L的实施例1得到的当归酸性多糖100μL，使终浓度为0.01～3mg/L，每个浓度设6个复孔，37℃、5％CO₂饱和湿度孵箱内培养48h，每孔加入MTT液(5g/L)20μL，培养4h后，离心，吸弃培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，轻度振荡溶解结晶，置自动酶标仪570nm波长处测OD值，按下列公式计算细胞生长的抑制率：细胞生长抑制率/％＝(1-给药组OD值/对照组OD值)×100％，实验重复3次。

结果：本发明当归酸性多糖对人肺癌A549、肝癌HepG2、胃癌SGC7901、结肠癌SW1116、神经胶质瘤U251、宫颈癌HeLa、白血病K562细胞的生长均有不同程度的抑制作用，结果见表1。

表1 当归酸性多糖对肿瘤细胞增殖的抑制作用(n＝6)

试验例5：当归酸性多糖组分及其衍生物对小鼠肉瘤S180的体内抗肿瘤作用及对免疫脏器的影响

实验动物：BALB/C小鼠，体重18～22g，雌雄不拘，由第四军医大学实验动物中心提供。

瘤株：小鼠肉瘤S180购自陕西省中医药研究院实验动物中心。

实验分组：小鼠随机分为9组，即正常组、模型组、实施例1得到的当归酸性多糖(20mg/kg、50mg/kg)组、实施例7得到的当归酸性多糖乙酰化产物(50mg/kg)组、实施例8得到的当归酸性多糖硫酸化产物(50mg/kg)组、实施例9得到的当归酸性多糖羧甲基化产物(50mg/kg)组、阳性对照组(环磷酰胺)、当归总多糖对照组(按专利号ZL03118481.2方法提取的总多糖)。

对S180肉瘤的抑制作用：取接种7天的腹水S180瘤株制成1×10⁷/mL的瘤细胞悬液，每鼠右后背部接种0.2mL，24小时后将小鼠随机分组，每组各10只，每日小鼠称重后，除当归酸性多糖乙酰化产物和羧甲基化产物灌胃给药外，其余组按体重腹腔注射给药1次，正常组和模型组给予生理盐水做对照。14天后小鼠称重，处死，取瘤块、胸腺、脾脏称重，按公式计算抑瘤率和脾脏指数、胸腺指数：

肿瘤抑瘤率/％＝(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％；

脏器指数＝脏器重量/体重

统计学处理：实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验进行分析。

结果：连续当归酸性多糖及衍生物给药14天后，各组动物的瘤重、抑瘤率、免疫脏器指数见表2。当归酸性多糖及衍生物均有不同程度的抗肿瘤作用，其中当归酸性多糖和多糖硫酸化物体内抗肿瘤作用最为显著，明显高于同剂量的当归总多糖。当归酸性多糖及衍生物对免疫系统也有不同程度的激活作用，多糖羧甲基化物的作用最为显著。

表2当归酸性多糖及衍生物对小鼠S-180肉瘤的抑制作用及对免疫器官的影响(n＝10)

*与模型组进行对比，存在显著性差异(P<0.05)。

试验例6：当归酸性多糖组分对急性辐射损伤的保护作用

实验动物：BALB/C小鼠，体重18～22g，雌雄不拘，由第四军医大学实验动物中心提供。

实验分组：小鼠随机分为8组，即正常组、辐射对照组、实施例1得到的当归酸性多糖(20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)组、实施例7得到的当归酸性多糖乙酰化产物(50mg/kg)组、实施例8得到的当归酸性多糖硫酸化产物(50mg/kg)组、实施例9得到的当归酸性多糖羧甲基化产物(50mg/kg)组。

实验方法：小鼠适应喂养3天后，随机分组，除当归酸性多糖乙酰化产物和羧甲基化产物灌胃给药外，其余组按体重腹腔注射每日给药1次，正常组和模型组给予生理盐水做对照。各组连续给药14天后，进行⁶⁰Co-γ射线源照射(正常对照组不照射)：总吸收剂量为3.0Gy，照射距离50cm，剂量率为1.0Gy/min。照后继续给药3或14天。

外周血白细胞计数：辐照前1天于给药后1小时剪尾尖采血，以自动血球分析仪测外周血白细胞数，各组分别于照射后第3天和第14天再测白细胞数。

体重测量：体重采用电子天平分别在实验开始、辐射前、辐射后第3天、第7天和第14天各测体重1次。

骨髓细胞DNA含量测定：小鼠一次性全身照射3Gy的⁶⁰Co-γ射线。照射后第3天，颈椎脱臼处死小鼠，剥离出股骨，用1mL注射器吸取Hank’s液，冲出股骨中的全部骨髓细胞，让细胞悬液通过4号针头注射器，使细胞在悬液中充分分散。用紫外分光光度计在260nm处测定DNA含量。

统计学处理：实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验进行分析。

结果：由表3可看出，正常对照组体重在实验过程中呈上升趋势。经⁶⁰Coγ照射后体重急速下降，小鼠在辐照前给予当归酸性多糖和多糖乙酰化物、多糖羧甲基化物，对辐照小鼠体重的恢复有明显的促进作用。外周血白细胞数、骨髓细胞DNA含量减少是一次性全身⁶⁰Coγ射线照射引起辐射损伤的表现，分别提示机体血液系统和造血系统受损情况。由表4可看出，小鼠辐照后第3天白细胞严重受损，数量急剧下降，后有逐步回升趋势。由表4可看出，高、中、低3个剂量组的当归酸性多糖和多糖衍生物白细胞数目也有所降低，但均高于辐射对照组，且在实验剂量范围内当归酸性多糖有明显量效关系，其中高剂量组效果最明显。提示当归酸性多糖和衍生物对辐射引发的血液系统损伤有防护作用，并能促进其恢复。如表5所示，照射后第3天，当归酸性多糖和衍生物组骨髓细胞DNA含量显著高于辐射对照组。以上表明，本发明当归酸性多糖及其衍生物对小鼠⁶⁰Coγ射线辐射损伤具有不同程度的保护作用。

表3 当归酸性多糖及衍生物对辐射小鼠体重的影响(n＝8)

*与模型组进行对比，存在显著性差异(P<0.05)。

表4当归酸性多糖及衍生物对辐射小鼠外周血白细胞的影响(n＝8)

*与模型组进行对比，存在显著性差异(P<0.05)。

表5当归酸性多糖及衍生物对辐射小鼠外周血淋巴细胞的影响(n＝8)

*与模型组进行对比，存在显著性差异(P<0.05)。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种当归酸性多糖组分的提取方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)脱脂：将当归根粉碎成粉，用有机溶剂回流、浸渍或渗漉提取进行脱脂处理，弃提取液，脱脂后的当归根渣备用；

(2)碱水提取：将所述脱脂后的当归根渣干燥后，用相当于其重量4～10倍的碱水70～100℃下回流1～5h提取2～3次，合并水提液，将其减压浓缩至相当于原体积1/4～1/30的提取浓缩液，4℃预冷2～24小时；

(3)沉淀析出：搅拌下向所述提取浓缩液加入1～5倍体积的甲醇、乙醇或丙酮，4～10℃静置4～24小时后，析出沉淀，1000～6000g离心3～20分钟，沉淀备用；

(4)除蛋白：将离心后的沉淀采用Sevag法、反复冻融法或等电点沉淀法一种或多种方法合用除蛋白直至紫外检测无280nm的蛋白吸收峰，离心除去沉淀，保留水相；

(5)小分子杂质的去除：用截流分子量2000-8000Da的透析膜对所述水相进行水透析除去小分子杂质，收集透析袋内溶液，将其减压浓缩至相当于原体积1/2～1/50的浓缩液，备用；

(6)分级：将步骤(5)所述浓缩液8000～10000g离心后，上DEAE-sephadex A-25或DEAE-纤维素柱，用水洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；再用0.5mol/L的氯化钠水溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集氯化钠水溶液洗脱液，将其减压浓缩至相当于原体积1/2～1/50的洗脱浓缩液；

(7)纯化：将所述洗脱浓缩液8000～10000g离心后，上SephadexG-200、Sephadex G-100、Sephadex G-75、Sephacryl S-400或SephroseCL-6B凝胶柱，用水洗脱，收集分子量50kD以上组分的洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，即得当归酸性多糖组分。

2.根据权利要求1所述的当归酸性多糖组分的提取方法，其特征在于：步骤(1)中所述有机溶剂为甲醇、50～100％乙醇、乙醚或石油醚。

3.根据权利要求1或2所述的当归酸性多糖组分的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中用相当于当归根重量2～8倍的80-100％乙醇在80～100℃加热回流提取1～2小时，共提取2次进行脱脂处理。

4.根据权利要求1-3任一项所述的当归酸性多糖组分的提取方法，其特征在于：步骤(2)中所述碱水为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、氨水中的一种或两种的混合水溶液，优选为0.8～1.2mol/L的氢氧化钠或氢氧化钾。

5.根据权利要求1所述的当归酸性多糖组分的提取方法，其特征在于：

包括如下步骤：

(1)脱脂：将当归根粉碎成粉，用相当于当归根重量2～8倍的80-100％乙醇在80～100℃加热回流提取1～2小时，共提取2次进行脱脂处理，弃提取液，脱脂后的当归根渣备用；

(2)碱水提取：将所述脱脂后的当归根渣干燥后，用相当于其重量4～8倍的0.8～1.2mol/L的氢氧化钠水溶液80～100℃下回流1～3小时提取2～3次，合并水提液，将其减压浓缩至相当于原体积1/4～1/20的提取浓缩液，4℃预冷2～24小时；

(3)沉淀析出：搅拌下向所述提取浓缩液加入2～3倍体积的乙醇，4℃静置4～24小时后，析出沉淀，3000～6000g离心10～20分钟，沉淀备用；

(4)除蛋白：将离心后的沉淀采用反复冻融法和Sevag法除蛋白直至紫外检测无280nm的蛋白吸收峰，离心除去沉淀，保留水相；

(5)小分子杂质的去除：用截流分子量6000-8000Da的透析膜对所述水相进行水透析除去小分子杂质，收集透析袋内溶液，将其减压浓缩至相当于原体积1/2～1/20的浓缩液，备用；

(6)分级：将步骤(5)所述浓缩液8000～10000g离心后，上DEAE-sephadex A-25柱，用水洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；再用0.5mol/L的氯化钠水溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集氯化钠水溶液洗脱液，将其减压浓缩至相当于原体积1/5～1/20的洗脱浓缩液；

(7)纯化：将所述洗脱浓缩液8000～10000g离心后，上SephadexG-100凝胶柱，用水洗脱，收集分子量50kD以上组分的洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，即得当归酸性多糖组分。

6.权利要求1-5任一项所述方法提取得到的当归酸性多糖组分。

7.一种当归酸性多糖组分衍生物，其特征在于：将权利要求6所述的当归酸性多糖组分通过乙酰化、硫酸化和/或羧甲基化制备所得。

8.权利要求6所述的当归酸性多糖组分及权利要求7所述的当归酸性多糖组分衍生物在制备抗癌症药物、免疫增强药物、抗辐射药物或功能保健品中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的癌症包括食管癌，肺癌，胃癌，肝癌，结、直肠癌，鼻咽癌，脑肿瘤，甲状腺癌，乳腺癌，骨癌，宫颈癌，白血病及黑色素瘤。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述药物或功能保健品为口服剂型、舌下或口含给药剂型、静脉、皮下、透皮或肌内给药剂型。