CN101235097A - 一种从当归中提取多糖的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从当归中提取多糖的方法及应用。干燥当归用粉碎机粉成粉末，置入提取罐中，加入石油醚回流脱脂，向脱脂后的残渣中加入蒸馏水提取，醇沉、离心得沉淀，除去蛋白、酸解、凝胶色谱分离、冷冻干燥得到活性当归多糖。本发明还公开了一种活性当归多糖在制备治疗或预防骨关节炎药物中的应用。本发明有效成分明确、疗效确定、无毒副作用，方法易于实施。
Description
技术领域
本发明涉及医用医药技术领域，更具体涉及一种从当归中提取活性当归多糖的方法，同时还涉及从当归中提取的活性当归多糖在抗骨关节炎药物中的用途。
背景技术
关节软骨组织主要是由软骨细胞和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)组成，ECM的主要成分是II型胶原、蛋白多糖聚集体和水。正常关节软骨基质的降解和修复处于一种持续性的动态平衡状态，这一状态是由软骨细胞分泌软骨基质成分而得以维持的。虽然原发性骨关节炎中关节软骨进行性破坏和丧失机制尚不清楚，但已认识到骨关节炎是以关节软骨的代谢紊乱和降解为主要特征。按其病理过程可以划分为三个相互交叉的阶段：①软骨基质的改变，如胶原分子框架破坏、蛋白多糖降解等；②软骨细胞对组织损害作出反应，如细胞增殖、基质合成等代偿性修复；③软骨细胞合成代谢衰退及软骨组织的进行性丢失。骨关节炎是一种以局灶性关节软骨退行性变、骨丢失、关节边缘骨赘形成及关节畸形和软骨下骨质致密(硬化)为特征的慢性关节疾病，又称骨关节病、退行性骨关节病。随着老龄化社会的来临、人类平均寿命的延长，骨关节炎的患病率也逐渐升高，并已成为影响老年人生活质量的主要疾病之一。统计表明，我国50岁以上人群中50％患有骨关节炎，且随着年龄的增加，其患病率呈直线上升趋势。随着现代人活动频率、强度的增加以及生活方式、饮食结构和习惯的改变，骨关节炎发病正逐年增加并趋于年轻化。长期以来，临床上一般用镇痛药和非甾体类消炎药缓解症状。
目前临床上常用的药物有透明质酸制剂、氨基葡萄糖制剂以及糖皮质激素，一般通过口服或关节内注射治疗，但它们不能阻止骨关节炎最主要的病理进展，即受累关节软骨的进行性破坏。一旦病情发生，出现障碍和疼痛加重，只能靠关节镜局部冲洗甚至进行关节置换术，但前者治疗有限，而人工关节置换存在的关键是假体的寿命、松动及感染等问题。故只有研制开发能够促进软骨修复、改善和重建骨关节结构的新型药物，才能从根本上解决骨关节炎的治疗问题。
当归：为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根。现代药理证明：当归具有抑制血小板聚集、抗血栓、改善贫血及心肌缺血作用；此外还有扩张血管、促进免疫功能、降血脂、保肝、抗炎等作用。在临床上，当归主要用于血虚萎黄、眩晕心悸，月经不调，经闭痛经，虚寒腹痛，痈疽疮疡，风湿痹痛等。
现有的当归制剂有当归挥发油、当归注射液等，工业上制备这些产品时，当归多糖一般作为残渣被丢弃。
多糖是一类由十个以上单糖通过糖苷键连接而成的高分子化合物，天然的多糖包括活性多糖和膳食纤维两大类，活性多糖专指具有某种特殊生物活性的多糖化合物。
目前没有单独应用当归治疗骨关节炎的相关报道，更没有应用当归中提取的多糖预防或治疗骨关节炎的相关报道。
发明内容
本发明目的在于提供了一种从当归中提取活性当归多糖的方法，提取了有效成分，方法易于实施。从当归中经过水提、95％醇沉、酸解和凝胶色谱分离等步骤后，分子量在5,000～100,000之间且半乳糖含量≥7.6％的多糖成分。它的提取过程也十分简便，通过水煮醇沉后即可得到纯度较高的多糖产品，经过常规的除蛋白等过程后所得产品的多糖含量通常可达99％以上。
本发明另一个目的在于提供了一种活性当归多糖，活性当归多糖在制备治疗或预防骨关节炎药物中的应用。本发明中的活性当归多糖既是：用一定的方法，从当归中提取的，具有预防或治疗骨关节炎作用的多糖成分。它对骨关节炎具有很好的预防和治疗作用。本发明人多年来一直致力于骨关节炎的临床治疗研究和植物活性成分的研究工作。长期的研究和大量的实验结果证实，与现有的主流疗法相比，活性当归多糖对骨关节炎的预防和治疗具有效果好、副作用小、价格便宜等优势。本发明中，活性当归多糖治疗骨关节炎的机制在于：①提高软骨基质主要成分蛋白多糖的含量；②促进软骨细胞增殖，抑制软骨细胞凋亡；③降解缓慢，可长时间在关节腔内发挥基质替代作用。其抗骨关节炎机制的一致性要求其必须有一致的活性结构，我们通过大量的实验得出，抗骨关节炎的当归多糖必须满足以下条件：①分子量在5,000～100,000之间；②半乳糖含量≥7.6％。
应用活性当归多糖抗骨关节炎既开发了当归的新用途，亦能在临床治疗方面给广大骨关节炎患者带来福音，这两点是本发明的新颖性和创造性之所在。在此基础之上发明者完成了本发明。
为了实现上述任务，本发明采用了以下技术措施：
A、将干燥的当归用粉碎机粉成80～100目的粉末；
B、置入提取罐中，加入3～7倍(W(g)/V(mL))石油醚(沸程为60～90℃)回流30～60min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；
C、向残渣中加入7～15(W(g)/V(mL))倍蒸馏水100℃常压下提取1～2h，水煮提取重复此步骤三次，合并三次提取液；
D、50～80℃减压浓缩提取液，使溶液体积(mL)为所用A步骤当归粉末重量(g)的5～7倍，得到浓缩液；
E、向D步骤浓缩液中加入浓缩液3倍体积的95％乙醇，静置过夜，以便充分沉淀；
F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用7～15(W(g)/V(mL))倍无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；
G、在pH为1～4的水溶液中水解24～48h，5000半透膜透析；
H、通过凝胶色谱柱分离，收集分子量在5,000～100,000的溶液，冷冻干燥即可得到精制的活性当归多糖。
发明人对活性当归多糖作为制备预防或治疗骨关节药物中的应用进行了系列实验验证：
1.当归多糖纯度及分子量的确定
用考马斯亮蓝法测定上述提取的当归多糖中残留的蛋白质含量，检测不到蛋白质残留，证明蛋白除得彻底。以葡萄糖或其它单糖(最好为所测多糖水解后含量最大的单糖)为参比，用经典的苯酚-硫酸法测多糖含量，多糖含量一般可达到99％以上，说明上述提取的当归多糖的纯度很高。
关于分子量说明：本发明中的当归多糖是一类天然多糖，属于高分子物质。高分子物质由结构一致或相近、分子量不同的大量高分子化合物组成。因此，高分子物质不同于小分子，高分子物质没有准确的分子量，只有平均分子量。平均分子量可用凝胶色谱仪测定。我们提取的活性当归多糖经过测定，其分子量范围一般在5,000～100,000之间。
2.多糖结构及活性的确定
作为分子量范围较宽的天然高分子物质，当归多糖的分子结构十分复杂，许多当归多糖的详细结构目前还不大清楚，但是我们对许多当归多糖的结构进行了较系统的研究工作。将精制的多糖用色谱系统进行分离，然用经过完全酸水解、高氯酸氧化、Smith降解、紫外光谱、红外光谱、液相质谱连用、核磁共振等多项技术，可以得出组成多糖的单糖类型、各单糖比例、单糖间的连接方法等信息。
关于活性确定方法的说明：通过大量的药理实验，我们证实当归抗骨关节炎的机制：①蛋白多糖是软骨基质的主要成分，也是骨关节发生时丢失最严重的成分，活性当归多糖在体外实验中显著提高了蛋白多糖的水平；②软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞，其数目的多少决定着骨关节的基质合成水平，实验中活性当归多糖显著促进了软骨细胞的增殖，抑制了软骨细胞凋亡；③活性当归多糖作为一种天然的植物多糖，具有降解缓慢的特点，而其在粘度等生物物理性质方面与软骨基质有相似之处，注射到关节腔后，可长时间保持在关节腔内，发挥基质替代作用。其抗骨关节炎机制的一致性要求其必须有一致的活性结构，我们通过大量的实验得出，抗骨关节炎的当归多糖必须满足以下条件：①分子量在5,000～100,000之间；②半乳糖含量≥7.6％。
发明人还根据国家《中药新药研究指导原则》，对活性当归多糖的安全性进行了探讨，试验结果证明活性当归多糖作为药用时，十分安全。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1.有效成分确切，纯度高达99％以上，分子量范围较小，仅为5,000～10,000；
2.产量高，成本较低，易于实施；
3.开发了当归的新用途，当归多糖这一通常情况下作为废物丢弃，本发明有变废为宝的效用；
4.实验证实，在浓度比现有的阳性对照药物低4个数量级情况下抗骨关节炎效果与之相当(见表1)；
5.现有技术均为化学药品，而本发明得到的产品，毒副作用极小，药效持续时间长，非常适合骨关节炎治疗。
具体实施方式
下面通过具体的实验实例来进一步阐述本发明中活性当归多糖在制备预防或骨关节炎药物中的应用，活性当归多糖在预防和治疗骨关节炎疾病中的有益效果，以及从当归中提取活性当归多糖的方法。
实施例1：从当归中提取活性当归多糖的方法
A、将干燥的当归用粉碎机粉成80～100目的粉末；
B、将粉末置入提取罐中，加入3倍(W(g)/V(mL))石油醚(沸程为60～90℃)回流30～60min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；
C、向残渣中加入7(W(g)/V(mL))倍蒸馏水100℃常压下提取1h，水煮提取重复此步骤三次，合并三次提取液；
D、50℃减压浓缩提取液，使溶液体积(mL)为所用A步骤当归粉末重量(g)的5倍，得到浓缩液；
E、向D步骤浓缩液中加入浓缩液3倍体积的95％乙醇，静置过夜，以便充分沉淀；
F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用7(W(g)/V(mL))倍无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；
G、在pH为1的水溶液中水解24h，5000半透膜透析；
H、通过凝胶色谱柱分离，收集分子量在5,000～100,000的溶液，冷冻干燥即可得到精制的活性当归多糖。
实施例2：从当归中提取活性当归多糖的方法
A、将干燥的当归用粉碎机粉成80～100目的粉末；
B、置入提取罐中，加入4倍(W(g)/V(mL))石油醚(沸程为60～90℃)回流35min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；
C、向残渣中加入8(W(g)/V(mL))倍蒸馏水100℃常压下提取1.5h，水煮提取重复此步骤三次，合并三次提取液；
D、55℃减压浓缩提取液，使溶液体积(mL)为所用A步骤当归粉末重量(g)的6倍，得到浓缩液；
E、向D步骤浓缩液中加入浓缩液3倍体积的95％乙醇，静置过夜，以便充分沉淀；
F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用8(W(g)/V(mL))倍无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；
G、在pH为2的水溶液中水解30h，5000半透膜透析；
H、通过凝胶色谱柱分离，收集分子量在5,000～100,000的溶液，冷冻干燥即可得到精制的活性当归多糖。
实施例3：从当归中提取活性当归多糖的方法
A、将干燥的当归用粉碎机粉成80～100目的粉末；
B、置入提取罐中，加入5倍(W(g)/V(mL))石油醚(沸程为60～90℃)回流40min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；
C、向残渣中加入8(W(g)/V(mL))倍蒸馏水100℃常压下提取2h，水煮提取重复此步骤三次，合并三次提取液；
D、60℃减压浓缩提取液，使溶液体积(mL)为所用A步骤当归粉末重量(g)的7倍，得到浓缩液；
E、向D步骤浓缩液中加入浓缩液3倍体积的95％乙醇，静置过夜，以便充分沉淀；
F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用9(W(g)/V(mL))倍无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；
G、在pH为3的水溶液中水解36h，5000半透膜透析；
H、通过凝胶色谱柱分离，收集分子量在5,000～100,000的溶液，冷冻干燥即可得到精制的活性当归多糖。
实施例4：从当归中提取活性当归多糖的方法
A、将干燥的当归用粉碎机粉成80～100目的粉末；
B、置入提取罐中，加入6倍(W(g)/V(mL))石油醚(沸程为60～90℃)回流45min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；
C、向残渣中加入10(W(g)/V(mL))倍蒸馏水100℃常压下提取1h，水煮提取重复此步骤三次，合并三次提取液；
D、65℃减压浓缩提取液，使溶液体积(mL)为所用A步骤当归粉末重量(g)的5倍，得到浓缩液；
E、向D步骤浓缩液中加入浓缩液3倍体积的95％乙醇，静置过夜，以便充分沉淀；
F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用10(W(g)/V(mL))倍无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；
G、在pH为4的水溶液中水解42h，5000半透膜透析；
H、通过凝胶色谱柱分离，收集分子量在5,000～100,000的溶液，冷冻干燥即可得到精制的活性当归多糖。
实施例5：从当归中提取活性当归多糖的方法
A、将干燥的当归用粉碎机粉成80～100目的粉末；
B、置入提取罐中，加入7倍(W(g)/V(mL))石油醚(沸程为60～90℃)回流50min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；
C、向残渣中加入11(W(g)/V(mL))倍蒸馏水100℃常压下提取1.5h，水煮提取重复此步骤三次，合并三次提取液；
D、70℃减压浓缩提取液，使溶液体积(mL)为所用A步骤当归粉末重量(g)的6倍，得到浓缩液；
E、向D步骤浓缩液中加入浓缩液3倍体积的95％乙醇，静置过夜，以便充分沉淀；
F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用11(W(g)/V(mL))倍无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；
G、在pH为1的水溶液中水解48h，5000半透膜透析；
H、通过凝胶色谱柱分离，收集分子量在5,000～100,000的溶液，冷冻干燥即可得到精制的活性当归多糖。
实施例6：从当归中提取活性当归多糖的方法
A、将干燥的当归用粉碎机粉成80～100目的粉末；
B、置入提取罐中，加入3倍(W(g)/V(mL))石油醚(沸程为60～90℃)回流55min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；
C、向残渣中加入12(W(g)/V(mL))倍蒸馏水100℃常压下提取2h，水煮提取重复此步骤三次，合并三次提取液；
D、75℃减压浓缩提取液，使溶液体积(mL)为所用A步骤当归粉末重量(g)的7倍，得到浓缩液；
E、向D步骤浓缩液中加入浓缩液3倍体积的95％乙醇，静置过夜，以便充分沉淀；
F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用12(W(g)/V(mL))倍无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；
G、在pH为2的水溶液中水解28h，5000半透膜透析；
H、通过凝胶色谱柱分离，收集分子量在5,000～100,000的溶液，冷冻干燥即可得到精制的活性当归多糖。
实施例7：从当归中提取活性当归多糖的方法
A、将干燥的当归用粉碎机粉成80～100目的粉末；
B、置入提取罐中，加入4倍(W(g)/V(mL))石油醚(沸程为60～90℃)回流60min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；
C、向残渣中加入13(W(g)/V(mL))倍蒸馏水100℃常压下提取1h，水煮提取重复此步骤三次，合并三次提取液；
D、80℃减压浓缩提取液，使溶液体积(mL)为所用A步骤当归粉末重量(g)的5倍，得到浓缩液；
E、向D步骤浓缩液中加入浓缩液3倍体积的95％乙醇，静置过夜，以便充分沉淀；
F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用13(W(g)/V(mL))倍无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；
G、在pH为3的水溶液中水解32h，5000半透膜透析；
H、通过凝胶色谱柱分离，收集分子量在5,000～100,000的溶液，冷冻干燥即可得到精制的活性当归多糖。
实施例8：从当归中提取活性当归多糖的方法
A、将干燥的当归用粉碎机粉成80～100目的粉末；
B、置入提取罐中，加入5倍(W(g)/V(mL))石油醚(沸程为60～90℃)回流30min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；
C、向残渣中加入14(W(g)/V(mL))倍蒸馏水100℃常压下提取1.5h，水煮提取重复此步骤三次，合并三次提取液；
D、72℃减压浓缩提取液，使溶液体积(mL)为所用A步骤当归粉末重量(g)的6倍，得到浓缩液；
E、向D步骤浓缩液中加入浓缩液3倍体积的95％乙醇，静置过夜，以便充分沉淀；
F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用14(W(g)/V(mL))倍无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；
G、在pH为4的水溶液中水解38h，5000半透膜透析；
H、通过凝胶色谱柱分离，收集分子量在5,000～100,000的溶液，冷冻干燥即可得到精制的活性当归多糖。
实施例9：从当归中提取活性当归多糖的方法
A、将干燥的当归用粉碎机粉成80～100目的粉末；
B、置入提取罐中，加入6倍(W(g)/V(mL))石油醚(沸程为60～90℃)回流30min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；
C、向残渣中加入15(W(g)/V(mL))倍蒸馏水100℃常压下提取1h，水煮提取重复此步骤三次，合并三次提取液；
D、78℃减压浓缩提取液，使溶液体积(mL)为所用A步骤当归粉末重量(g)的7倍，得到浓缩液；
E、向D步骤浓缩液中加入浓缩液3倍体积的95％乙醇，静置过夜，以便充分沉淀；
F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用15(W(g)/V(mL))倍无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；
G、在pH为4的水溶液中水解48h，5000半透膜透析；
H、通过凝胶色谱柱分离，收集分子量在5,000～100,000的溶液，冷冻干燥即可得到精制的活性当归多糖。
实施例10：活性当归多糖对大鼠退变软骨细胞糖胺多糖合成的影响及其作用机制
1.1细胞培养
刀片削取Wistar大鼠(SPF级)骨关节标本得到关节软骨片，剪成1mm3小块。用0.2％的II型胶原酶37℃水浴消化4～5h直至成絮状。用200目不锈钢筛网过滤离心，加入全培养液重悬，获得单个软骨细胞悬液。将细胞接种于培养瓶内单层培养。隔天换液。待细胞基本长满后传代培养。传至第三代时，调整细胞浓度为1×105/ml，接种于培养板内用于实验。
1.2实验分组处理
细胞接种24h后把培养孔分为空白对照组、IL-1β对照组、当归多糖不同浓度组、阳性对照组。每组4孔，分别更换相应的培养液：
①空白对照组：换DMEM培养液(含10％FBS)；
②模型对照组：换DMEM培养液(含10ng/ml的IL-1β及10％FBS)；
③当归多糖各实验组：换DMEM培养液(含10ng/ml的IL-1β及10％FBS)，5min后添加0.001、0.01、0.1μg/ml当归多糖；
④阳性对照组：换DMEM培养液(含10ng/ml的IL-1β，10％FBS及4.5mg/L硫酸氨基葡萄糖)。
放入孵箱中继续培养。各项检测均在48h后进行。
1.3指标检测
细胞内糖胺多糖含量检测
采用DMB染色法，使用24孔培养板培养细胞。
(1)标准曲线测定：分别取100μL不同质量浓度(5～100μg/ml)硫酸软骨素标准溶液，加入1ml DMB显色剂，混匀，反应15s后，于525nm波长处比色，测定吸光值，做出GAG含量标准曲线。
(2)测定管测定：弃去培养基，每孔中加入细胞裂解液200μL，显微镜下见细胞完全碎裂后，取100μL裂解液，加入1ml DMB显色剂(32mg/mL)，混匀，反应15s后，于525nm波长处比色，测定吸光值。将各试验组吸光值与标准曲线对比，求出蛋白多糖浓度。
1.4实验结果
1.4.1细胞内糖胺多糖的变化
细胞内糖胺多糖结果(表1)显示，IL-1模型对照组较空白对照组蛋白多糖含量明显降低(P＜0.01)，说明造模成功。与空白对照组相比，各当归多糖组均有上升趋势，中、高浓度组有明显差异。与模型对照组相比，当归多糖各浓度组均有明显的增加蛋白多糖含量作用，中、高浓度组使其水平基本恢复至正常水平，并表现为良好的量效关系。还可以看出当归多糖给药浓度在低于阳性对照硫酸氨基葡萄糖几个数量级的情况下药效作用与其相当。
表1当归多糖对大鼠退变软骨细胞糖胺多糖合成的影响
| 分组 | 浓度(μg/ml) | 无IL-1 | IL-1造模 | ||
| 空白对照组 | 当归多糖 | 模型对照组 | 当归多糖 | ||
| 空白对照组模型对照组低浓度组中浓度组高浓度组 | 0.0010.010.1 | 83±6 | 84±695±5**101±6** | 13±3** | 53±8**##79±7##91±8## |
| 硫酸氨基葡萄糖 | 4500 | 98±10** | 96±5## |
1.4.2细胞增殖的变化
表2结果显示，模型对照组较空白对照组明显降低(P＜0.01)，说明造模成功。无IL-1系列中，当归多糖中、高浓度组较空白对照组可明显增加测量值(P＜0.05，P＜0.01)，表现出一定的浓度相关性。在IL-1造模系列中，当归多糖各浓度组均有明显的促进软骨细胞增殖作用(P＜0.05，P＜0.01)，并表现为良好的量效关系。另外，可以看出当归多糖给药浓度在低于阳性对照硫酸氨基葡萄糖几个数量级的情况下药效作用与其相当。
表2当归多糖对大鼠退变软骨细胞增殖的影响(MTT试验)
| 分组 | 浓度(μg/ml) | 无IL-1 | IL-1造模 | ||
| 空白对照组 | 当归多糖 | 模型对照组 | 当归多糖组 | ||
| 空白对照组低浓度组中浓度组高浓度组硫酸氨基萄糖 | 0.0010.010.14500 | 0.034±0.006 | 0.038±0.0060.041±0.0030.043±0.003**0.45±0.003** | 0.020±0.002** | 0.025±0.004**#0.032±0.006##0.033±0.004##0.037±0.005## |
1.4.3蛋白多糖/细胞增殖的变化
为排除细胞增殖对蛋白多糖合成的影响，我们将蛋白多糖各数据分别除以相应组的MTT值(分为无IL-1和IL-1造模两类)得到的比值来反映当归多糖对蛋白多糖合成的直接影响。结果如表3显示，IL-1模型对照组较空白对照组蛋白多糖含量明显降低(P＜0.01)，与IL-1使细胞合成蛋白多糖的能力下降有关。在无IL-1系列中，当归多糖中、高浓度组较空白对照组其比值明显增加(P＜0.01)，而低浓度作用不明显，表现出一定的浓度相关性。在IL-1造模组中，当归多糖各浓度组的比值较模型对照组明显增加(P＜0.01)，甚至高于无IL-1处理的相应浓度的当归多糖组，并表现为良好的量效关系。说明当归多糖有增强软骨细胞蛋白多糖合成作用，且对受损状态下的软骨细胞蛋白多糖合成作用更强。
表3当归多糖对大鼠退变软骨细胞糖胺多糖合成/增殖的影响
| 分组 | 浓度(μg/ml) | 无IL-1 | IL-1造模 | ||
| 空白对照组 | 当归多糖 | 模型对照组 | 当归多糖组 | ||
| 空白对照组当归多糖组低浓度组中浓度组高浓度组 | 0.0010.010.1 | 2194±76 | 2268±2762355±81**2385±99** | 638±93** | 2184±92**##2775±393*##2804±218## |
1.5结论
综上所述，提取的活性当归多糖在较低浓度时对软骨细胞增殖、蛋白多糖合成均起促进作用。且当归多糖给药浓度在低于经典阳性对照硫酸氨基葡萄糖几个数量级的情况下药效作用与其相当。
实施例11：当归活性多糖安全性试验(急性毒性试验，最大耐受量试验)
从上述实施例10中，可以看出当归活性多糖对软骨细胞没有毒性作用、安全。本实施例在上述实验基础上，根据国家《中药新药研究指导原则》，对当归活性多糖进行了急性毒性实验。
2.1实验材料
昆明种小鼠，20只(SPF级)，雌雄各半，20±2g，由武汉大学A3实验动物中心提供，饲养温度为25±1℃，实验期间自由获得水和食物，光照、黑暗12h交替。
2.2实验方法
取昆明种小鼠40只，雌雄各半，分为二组，每组20只。禁食12h后，受试药组以浓度为84％、体积为30ml/kg灌胃，给药二次，时间分别为上午9时和下午5时。对照组给予等容量双蒸水灌胃。首次给药后24h小鼠开始进食。严密观察给药后小鼠的反应，并逐日观察小鼠的活动、步态、进食、二便等情况，记录死亡动物数，共观察7日。
2.3实验结果
给药后24h内小鼠精神稍差、卷缩一团，活动较给药前略减少，二便未出现明显异常。进食后小鼠活动恢复，步态自如，毛色有光泽。给药7日内体重无异常改变且未见动物死亡。
2.4结论
小鼠经口灌胃当归多糖的最大耐受量为5g/kg，提示当归多糖急性毒性极低，安全性高。
Claims (2)
1、一种从当归中提取多糖的方法，它包括下列步骤：
A、将干燥的当归用粉碎机粉成80～100目的粉末；
B、置入提取罐中，加入3～7倍W(g)/V(mL)石油醚60～90℃回流30～60min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；
C、向残渣中加入7～15W(g)/V(mL)倍蒸馏水100℃常压下提取1～2h，水煮提取重复此步骤三次，合并三次提取液；
D、50～80℃减压浓缩提取液，使溶液体积(mL)为所用A步骤当归粉末重量(g)的5～7倍，得到浓缩液；
E、向D步骤浓缩液中加入浓缩液3倍体积的95％乙醇，静置过夜，沉淀；
F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用7～15W(g)/V(mL)倍无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；
G、在pH为1～4的水溶液中水解24～48h，5000半透膜透析；
H、通过凝胶色谱柱分离，收集分子量在5,000～100,000的溶液，冷冻干燥得到活性当归多糖。
2.权利要求1所述的一种活性当归多糖在制备治疗或预防骨关节炎药物中的应用。
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