CN107118283B - 巴戟天糖聚物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药及保健食品技术领域，具体涉及巴戟天糖聚物及其制备方法，及其在制备防治骨质疏松和/或风湿病的药物或保健食品或功能食品中的应用。本发明以巴戟天为原料，通过水提醇沉和碱提醇沉相结合、Sevag法脱蛋白、DEAE纤维素柱层析、Sephacryl柱层析等获得糖聚物纯品。本发明巴戟天糖聚物在抗骨质疏松症方面具有显著效果，另外，本发明得到的糖聚物纯品，在体外促进骨形成实验中显示其具有促进成骨细胞增殖、分化、矿化和上调成骨相关基因表达量的作用，表明其具有促进骨形成活性，这些可为将来在保健品、医药等领域中的应用提供依据。

Description

巴戟天糖聚物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药及保健食品技术领域，具体涉及巴戟天糖聚物及其制备方法，及其在制备防治骨质疏松和/或风湿病的药品或保健品或食品中的应用。

背景技术

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种以骨量低下、骨微结构损坏、骨强度降低，从而导致骨的脆性增加，易发生骨折的全身性代谢性骨病。骨质疏松症是老年人中常见的一种慢性骨病，随着人口的老龄化日益严重，骨质疏松症已严重危害老年人健康。绝经后女性常发骨质疏松症的原因主要是其卵巢分泌雌激素减少，进而导致一系列反应所致，成为该病最大的受害人群，约占总患病人数70％以上。目前防治骨质疏松症的药物主要是骨吸收抑制剂、骨形成促进剂和矿化药物，这些药物均属替代治疗，在长期使用过程中，具有毒副作用大，靶向性低，依从性差，费用高等缺点。因此，寻到高效、低毒的药物对骨质疏松症的治疗有十分重要的意义。中药在治疗骨质疏松症方面历史悠久，具有全身调理、毒副作用小、价格低廉等优势，越来越受到人们的关注。而在众多中药中，补肾壮骨类中药由于良好的疗效一直受到人们的青睐。

巴戟天(Morinda officinalis How.)系茜草科巴戟天属植物巴戟天的干燥根，是我国著名的“四大南药”之一。具有补肾阳、强筋骨、祛风湿之功效，被誉为“补肾阳之要药”。现代研究表明，巴戟天中含有多种有效成分，如糖聚物、蒽醌、环烯醚萜、有机酸等，具有抗氧化、利尿、保护肝肾等作用。巴戟天糖聚物作为巴戟天的主要活性成分之一，已被报道具有抗骨质疏松、免疫调节、保护肝肾等多种药理活性，所以提取、分离、纯化巴戟天糖聚物，并研究其在预防和/或治疗骨质疏松症、风湿病等方面的作用就显得尤为重要。

中国专利申请(CN101874840A)公开了巴戟天属植物总多糖提取物及其制备方法和在治疗鼾症的药物中的用途。该总多糖提取物中巴戟天多糖的重量百分比为50％～90％。其制备方法为：将巴戟天属植物(包括根、茎、叶和果实)烘干后粉碎至10～100目，用水加热回流提取，提取液上弱碱阴离子交换树脂柱，收集穿流液和水洗脱液，浓缩除去约80％的水后，加入3～4倍体积的乙醇，静置，沉析出多糖，经过滤、干燥后得到巴戟天植物总多糖提取物产品。制备得到的产品用于治疗鼾症(也称睡眠呼吸暂停综合征(SAS))具有疗效快而显著、无毒副作用、价格低廉、使用方便等优点。

目前，国内外对巴戟天的研究主要集中在其总多糖提取物的抗氧化、免疫调节、抗骨质疏松等方面的活性研究，但对分级醇沉及不同提取方法得到的巴戟天糖聚物在抗骨质疏松作用方面的研究未见报道，同时关于巴戟天中分离纯化得到的精糖聚物的体外促成骨活性研究也鲜有报道。为了进一步开发巴戟天这一传统的补肾壮骨中药，本发明以巴戟天为原料，采用水提醇沉法得到粗糖聚物，对提取的粗糖聚物进行脱蛋白，然后利用离子交换层析和凝胶分子筛柱层析方法纯化巴戟天糖聚物，首次制备出三种巴戟天糖聚物纯品，并且对三种组分糖聚物的理化性质、分子量、单糖组成等进行了系统的分离鉴定，并成功得出三个组分的结构特征。本发明得到的糖聚物样品在预防和/或治疗骨质疏松症、风湿病等方面有显著效果，同时，体外促进骨形成活性研究表明纯化得到的精糖聚物能显著促进成骨细胞增殖、分化、矿化及成骨相关基因表达量，这些可为将来在食品、保健品、药品等领域中的应用提供依据。

发明内容

为解决上述问题，本发明以巴戟天为原料，采用水提醇沉法得到粗糖聚物，对提取的粗糖聚物进行脱蛋白，然后利用离子交换层析和凝胶分子筛柱层析方法纯化巴戟天糖聚物，首次制备出三种巴戟天糖聚物纯品。本发明还提供了巴戟天糖聚物的制备方法及其在制备防治骨质疏松和/或风湿病的药品或保健品或食品中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种巴戟天糖聚物，所述巴戟天糖聚物由葡萄糖和果糖组成，主链为(2→1)-β-D-Fruf，末端为葡萄糖，结构式为；

其中n为1～30。

优选地，所述巴戟天精糖聚物结构式中n为1～6时，为巴戟天寡糖MOP-1。

优选地，所述巴戟天糖聚物结构式中n为14～30时，为巴戟天多糖MOP-2。

优选地，所述巴戟天糖聚物结构式中n为7～13时，为巴戟天多糖MOP-3。

所述巴戟天粗糖聚物的制备方法，包括以下操作步骤：

S1.干燥：将巴戟天根晾干；

S2.水提：将干燥后的巴戟天进行水提，分别收集提取液和残渣；

S3.分级醇沉：将提取液浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为a，静置10～38h，收集沉淀，得粗糖聚物MO1和上清液I；将上清液I再次进行减压浓缩，加入乙醇使乙醇体积浓度为b，静置10～38h，收集沉淀，得粗糖聚物MO2和上清液II；将上清液II再次进行减压浓缩，加入乙醇使乙醇体积浓度为c，静置10～38h，收集沉淀，得粗糖聚物MO3；其中5％≤a＜b＜c＜100％；

S4.碱提：将水提后的残渣浸泡于0.1～1M NaOH溶液中，静置1～4h，上清液用HCl进行中和，使上清液的pH为6～8，离心取上清，浓缩上清，加入乙醇使乙醇体积浓度为50～90％，静置1～4h，收集沉淀，即得碱提粗糖聚物MO4；

S5.纯化：利用Sevag法分别对上述MO1、MO2、MO3和MO4粗糖聚物进行除蛋白，除蛋白后粗糖聚物进行透析、冻干；

S6.将纯化后的粗糖再经离子交换柱层析，用蒸馏水和NaCl溶液进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收集糖部分，浓缩，冷冻干燥；然后用水溶解，离心，取上清液进行分子筛凝胶柱层析，用水进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收集糖部分，浓缩，冷冻干燥，即得。

优选地，所述步骤S2中水提用5～15倍体积、温度为60～100℃的水对切好的巴戟天进行提取，提取时间1～4h。

优选地，所述步骤S3中乙醇体积浓度分别为5％≤a＜60％，60％＜b＜80％，80％＜c＜100％。

优选地，所述步骤S5透析袋的截留分子量为1000Da。

优选地，所述步骤S6所用离子交换柱为DEAE离子交换柱；分子筛凝层析选用Sephacryl分子筛色谱柱。

所述巴戟天糖聚物在制备防治骨质疏松和/或风湿病的药品或保健品或食品中的应用。

本发明的有益效果是：

1.与传统水煮法提取糖聚物相比，本发明采用水提醇沉法和碱提法的结合，乙醇浓度由低到高进行分级醇沉，对巴戟天糖聚物进行初步分离，同时高浓度乙醇能将极性大、水溶性好的糖聚物与极性小、水溶性差的糖聚物分离，使所提取的糖聚物组合物含有更高含量的糖聚物。本制备工艺简单，操作方便，且可以大规模生产。

2.本发明提取方法在比较温和的条件下进行，完整的保存了糖聚物的组分，并且筛选出了含量高、活性强的糖聚物有效部位。

3.本发明对制备出的三种糖聚物结构进行了鉴定，明确了各糖聚物组分的理化性质及结构，为探究其药理活性机制提供结构依据。

4.本发明提供了巴戟天中具有抗骨质疏松活性的成分的制备方法及其在抗骨质疏松方面的活性，为巴戟天糖聚物在医药、保健品等领域的应用提供依据。

附图说明

图1为MOP-1的离子色谱图；

图2为MOP-1的红外图谱；

图3为MOP-1的¹³C NMR图谱；

图4为MOP-1的¹H NMR图谱；

图5为MOP-1的HSQC图谱；

图6为MOP-1的HMBC图谱；

图7为MOP-2的离子色谱图；

图8为MOP-2的红外图谱；

图9为MOP-2的¹³C NMR图谱；

图10为MOP-2的¹H NMR图谱；

图11为MOP-2的HSQC图谱；

图12为MOP-2的HMBC图谱；

图13为MOP-3的离子色谱图；

图14为MOP-3的红外图谱；

图15为MOP-3的¹³C NMR图谱；

图16为MOP-3的¹H NMR图谱；

图17为MOP-3的HSQC图谱；

图18为MOP-3的HMBC图谱；

图19为巴戟天糖聚物对去卵巢大鼠体重的影响；

图20为巴戟天糖聚物对去卵巢大鼠子宫系数的影响；

图21为巴戟天糖聚物对去卵巢大鼠股骨骨密度的影响；

图22为巴戟天糖聚物对去卵巢大鼠股骨骨矿物量的影响；

图23为巴戟天糖聚物对大鼠尿液生化指标的影响；

图24各组大鼠股骨干骺端Micro-CT三维重建图；

图25各组大鼠椎骨Micro-CT三维重建图；

图26 MOP-2对MC3T3-E1细胞增殖的影响；

图27 MOP-2对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响；

图28 MOP-2对MC3T3-E1细胞成骨矿化的影响；

图29 MOP-2对MC3T3-E1细胞成骨基因表达量的影响；

具体实施方式

下面将结合说明书附图和实施例进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

实施例1巴戟天糖聚物MOP-1及其制备方法

巴戟天糖聚物MOP-1，经完全酸水解、甲基化分析、红外光谱检测及核磁分析，如图1～6所示，其糖聚物是由葡萄糖和果糖组成，主链为(2→1)-β-D-Fruf，末端为葡萄糖，结构为：

其中n为1～6。

所述巴戟天糖聚物MOP-1的制备方法为：

S1.干燥：将一定重量的巴戟天根晾干；

S2.水提：将干燥后的巴戟天，用10倍体积量、温度为90℃水提取，收集提取液，残渣晾干。

S3.醇沉：提取液于60℃减压浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为50％，静置24h后，离心，收集沉淀，得粗糖聚物MO1和上清液I；上清液I于60℃减压浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为70％，静置24h后，离心，收集沉淀，得粗糖聚物MO2和上清液II；上清液II于60℃减压浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为90％，室温静置24h后，离心，收集沉淀，得粗糖聚物MO3；

S4.碱提：将水提后的残渣浸泡于0.1～1M NaOH溶液中，静置1～4h，上清液用HCl进行中和，使上清液的pH为6～8，离心取上清，浓缩上清，加入乙醇使乙醇体积浓度为50～90％，静置1～4h，收集沉淀，即得碱提粗糖聚物MO4；

S5.纯化：利用Sevag法对得到的粗糖聚物MO2进行除蛋白，除蛋白后粗糖聚物用透析袋，截留分子量为1000Da，进行透析、冻干；

S6.离子交换柱层析：取100mg上述纯化后的粗糖聚物MO2，溶于5mL的去离子水中，上样于DEAE-Cellulose 52柱，在不同盐浓度的洗脱条件下出现两个峰，其中峰一为水(0MNaCl)洗脱部分，峰二为0.1M NaCl洗脱部分(洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集糖部分)，分别将所得洗脱液浓缩、冷冻干燥后，得到两种糖聚物：峰一糖聚物、峰二糖聚物；

分子筛凝胶层析：将上述冻干后的峰一糖聚物样品，用水进行溶解、离心，取上清液，上Sephacryl S-100 HR柱，用水进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，出现一个单一对称峰，收集主峰，浓缩、冷冻干燥后，得巴戟天糖聚物MOP-1。

实施例2巴戟天糖聚物MOP-2及其制备方法

巴戟天糖聚物MOP-2，经完全酸水解、甲基化分析、红外光谱检测及核磁分析，如图7～12所示，其单糖是由葡萄糖和果糖组成，主链为(2→1)-β-D-Fruf，末端为葡萄糖的果聚糖，结构为：

其中n为14～30。

所述巴戟天糖聚物MOP-2的制备方法为：

S1.干燥：将一定重量的巴戟天根晾干；

S2.水提：将干燥后的巴戟天，用10倍体积量、温度为90℃水提取，收集提取液，残渣晾干。

S3.醇沉：提取液于60℃减压浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为50％，静置24h后，离心，收集沉淀，得粗糖聚物MO1和上清液I；上清液I于60℃减压浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为70％，静置24h后，离心，收集沉淀，得粗糖聚物MO2和上清液II；上清液II于60℃减压浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为90％，室温静置24h后，离心，收集沉淀，得粗糖聚物MO3；

S4.碱提：将水提后的残渣浸泡于0.1～1M NaOH溶液中，静置1～4h，上清液用HCl进行中和，使上清液的pH为6～8，离心取上清，浓缩上清，加入乙醇使乙醇体积浓度为50～90％，静置1～4h，收集沉淀，即得碱提粗糖聚物MO4；

S5.纯化：利用Sevag法对粗糖聚物MO2进行除蛋白，除蛋白后粗糖聚物用透析袋(截留分子量为1000Da)进行透析、冻干；

S6.离子交换柱层析：取100mg上述纯化后的粗糖聚合MO2，溶于5mL的去离子水中，上样于DEAE-Cellulose 52柱，在不同盐浓度的洗脱条件下出现两个峰，其中峰一为水(0MNaCl)洗脱部分，峰二为0.1M NaCl洗脱部分(洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集糖部分)，分别将所得洗脱液浓缩、冷冻干燥后，得到两种糖聚物：峰一糖聚物、峰二糖聚物；

分子筛凝胶层析：将上述冻干后的峰二糖聚物样品，用水进行溶解、离心，取上清液，上Sephacryl S-100HR柱，用水进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，出现一个单一对称峰，收集主峰，浓缩、冷冻干燥后，得巴戟天糖聚物MOP-2。

实施例3巴戟天糖聚物MOP-3及其制备方法

巴戟天糖聚物MOP-3，经完全酸水解、甲基化分析、红外光谱检测及核磁分析，如图13～18所示，其是由葡萄糖和果糖组成，主链为(2→1)-β-D-Fruf，末端为葡萄糖，结构为：

其中n为7～13。

所述巴戟天糖聚物MOP-3的制备方法为：

S1.干燥：将一定重量的巴戟天根晾干；

S2.水提：将干燥后的巴戟天，用10倍体积量、温度为90℃水提取，收集提取液，残渣晾干。

S3.醇沉：提取液于60℃减压浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为50％，静置24h后，离心，收集沉淀，得粗糖聚物MO1和上清液I；上清液I于60℃减压浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为70％，静置24h后，离心，收集沉淀，得粗糖聚物MO2和上清液II；上清液II于60℃减压浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为90％，室温静置24h后，离心，收集沉淀，得粗糖聚物MO3；

S4.碱提：将水提后的残渣浸泡于0.1～1M NaOH溶液中，静置1～4h，上清液用HCl进行中和，使上清液的pH为6～8，离心取上清，浓缩上清，加入乙醇使乙醇体积浓度为50～90％，静置1～4h，收集沉淀，即得碱提粗糖聚物MO4；

S5.纯化：利用Sevag法对粗糖聚物MO3进行除蛋白，除蛋白后粗糖聚物用透析袋截留分子量为1000Da进行透析、冻干，即得巴戟天糖聚物MO3；

S6.离子交换柱层析：取100mg上述纯化后的粗糖聚合MO3，溶于5mL的去离子水中，上样于DEAE-Cellulose 52柱，在不同盐浓度的洗脱条件下出现两个峰，其中峰一为水(0MNaCl)洗脱部分，峰二为0.1M NaCl洗脱部分(洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集糖部分)，分别将所得洗脱液浓缩、冷冻干燥后，得到两种糖聚物峰一糖聚物、峰二糖聚物；

分子筛凝胶层析：将上述冻干后的峰一糖聚物样品，用水进行溶解、离心，取上清液，上Sephacryl S-100HR柱，用水进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，出现一个单一对称峰，收集主峰，浓缩、冷冻干燥后，得巴戟天糖聚物MOP-3。

试验例1巴戟天糖聚物的结构分析

(1)单糖组成分析

对实施例2制备得到的巴戟天糖聚物MOP-2进行单糖组分分析。由完全酸水解产物离子色谱HPAEC-PAD图谱(图7)可知，MOP-2单糖组成为葡萄糖和果糖。

(2)红外光谱检测

对实施例2制备得到的巴戟天糖聚物MOP-2进行红外光谱检测。MOP-2的红外光谱检测结果如图8所示，从中可以看出，MOP-2含有糖聚物的特征吸收峰为：3385.67cm^-1为O-H伸缩振动，2929.16cm^-1为C-H伸缩振动。936.74cm^-1和823.64cm^-1为呋喃环的特征吸收峰；870.11cm^-1处有吸收峰，说明MOP-2为主要由β型糖残基组成。

(3)甲基化分析

对实施例2制备得到的巴戟天糖聚物MOP-2进行甲基化分析。样品经甲基化，水解、还原，乙酰化后GC-MS分析，结果表明MOP-2含有α-D-Glcp-(1→和→1)-β-D-Fruf-(2→糖残基。

(4)糖聚物的核磁共振分析

将均一糖聚物MOP-2样品置于核磁管中，用D₂O溶解后测谱，所得结果如图9～12所示。

根据上述图5～8的核磁图谱可知各个碳和氢的归属，如下表1所示。

表1 MOP-2中各糖残基的化学位移值

经上述完全酸水解、甲基化分析、红外光谱检测及核磁分析，结果显示MOP-2是一种由葡萄糖和果糖组成的果聚糖，从甲基化分析说明其含有α-D-Glcp-(1→和→1)-β-D-Fruf-(2→糖残基，不同糖残基之间的连接顺序由二维核磁HMBC谱图分析得出，由以上分析得出MOP-2的结构为：

其中n为14～30，

同理，分别对糖聚物MOP-1、MOP-3的结构进行上述同样的分析(单糖组成分析、红外光谱检测、甲基化分析、核磁共振分析)，并分别获得以下信息：

1)糖聚物MOP-1：是由葡萄糖和果糖组成，主链为(2→1)-β-D-Fruf，末端为葡萄糖的果寡糖，MOP-1的结构为：

其中n为1～6。核磁共振分析结果如图3～图6所示。

2)糖聚物MOP-3：单糖分析结果显示MOP-3是由葡萄糖和果糖组成，甲基化分析表明其含有α-D-Glcp-(1→和→1)-β-D-Fruf-(2→糖残基，结合完全酸水解、甲基化分析、红外光谱检测及核磁分析，结果显示MOP-3是主链为(2→1)-β-D-Fruf，末端为葡萄糖的果聚糖，MOP-3的结构为：

其中n为7～13。核磁共振分析结果如图15～图18所示。

以上均一糖聚物可能是巴戟天抗骨质疏松的活性成分，因而，均一糖聚物的结构鉴定将为后续探究巴戟天抗骨质疏松的机制提供有力依据。

试验例2巴戟天粗糖聚物的抗骨质疏松作用研究

1实验方法：

1.1实验设计与分组：3月龄雌性SD大鼠，SPF级(由广州中医药大学实验动物中心提供)，随机分为7组，各组动物数和给药方法见表2，其中阳性对照组E2为17β-雌二醇，实验组为按实施例1制备方法得到的巴戟天粗糖聚物。手术后每天灌胃给药，每周称重一次，按体重变化调整相应给药量，连续灌胃90天。

表2实验设计与分组

1.2大鼠去卵巢手术方法：

用戊巴比妥钠溶液(4％)对大鼠进行腹腔注射麻醉，腹位固定。在其最末肋骨下，腋中线与距脊柱外侧约1cm之交叉处，去毛暴露手术视野。先任取一侧进行手术，以聚维酮碘溶液消毒，切开皮肤、背部肌肉和肌膜，摘除卵巢。同法摘除另一侧卵巢。假手术组的处理方法同上，只是切除小块脂肪组织，不摘除卵巢。

1.3取材与保存

1)称重、麻醉；

2)取大鼠血液，离心后取血清。

3)取脾脏、肾脏、心脏、肝脏、大脑、肺、子宫等器官，称重。

4)取右侧胫骨、股骨和第五腰椎，置4％PBS多聚甲醛溶液中，24h后转移至70％的乙醇溶液中。冷冻保存。

5)取左侧股骨、胫骨和第三、四腰椎，分装后冰冻保存。

1.4骨密度测定

采用双能X线骨密度仪检测第四腰椎骨和左股骨的全骨密度、前端股骨骨密度、末端股骨骨密度和骨矿物含量。

1.5骨生物力学测试

将股骨和椎骨置于-20℃预解冻，而后常温解冻，用生理盐水复湿。采用Mini858Bionix材料测试系统分析左股骨(三点弯曲实验)的生物力学性能。仪器自动记录每个时刻点的载荷和桡度变化值，绘制载荷-桡度曲线，并获得相应的参数。

1.6骨代谢生化指标检测

收集大鼠晨尿，检测尿液中的肌酐(Cr)、羟脯氨酸(Hyp)、脱氧吡啶啉(DPD)的含量。取血清，检测I型胶原C端肽(CTX-I)、I型前胶原羧基端原肽(PINP)、骨钙素(OC)、骨特异性碱性磷酸酶(BAP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的含量。严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.7股骨及椎骨Micro CT测量及扫描

将股骨固定于样品固定器内进行扫描。扫描完成后，选取松质骨感兴趣区域进行三维重组，提取图像信息。获得重组图像后，利用Micro CT自带的软件定量分析，得到骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、结构模型指数(SMI)、骨小梁连接性密度(Conn.D)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)等参数。

2实验结果：

2.1巴戟天糖聚物对去卵巢雌性大鼠体重影响

巴戟天糖聚物对去卵巢雌性大鼠体重影响见图19，各组动物给药后与给药前比较，体重均明显增加。与Sham组比较，OVX大鼠去卵巢第五周后，体重明显增加，提示去卵巢使得大鼠体重明显增加。与OVX组相比，巴戟天糖聚物MO1、MO2、MO3和MO4给药组自第七周后，体重增加趋势得到有效控制，阳性组第九周后体重增加的趋势也出现明显抑制。说明给药组与阳性组E2均能抑制去卵巢大鼠体重的增加。

2.2巴戟天糖聚物对去卵巢雌性大鼠子宫系数的影响

巴戟天糖聚物对去卵巢雌性大鼠子宫系数的影响见图20，与Sham组比较，OVX大鼠去卵巢后子宫系数明显减小，提示去卵巢使得大鼠子宫严重萎缩。与OVX组相比，MO1、MO2、MO3、MO4给药组并未明显增加去卵巢大鼠的子宫重量，说明巴戟天给药组对大鼠子宫刺激作用较弱，没有类雌激素样的副作用。

2.3巴戟天糖聚物对去卵巢雌性大鼠脏器系数的影响

巴戟天糖聚物对去卵巢雌性大鼠脏器系数影响的结果表明，与Sham组比较，OVX大鼠去卵巢后心脏、肝脏、肾脏、脾、肺、脑等器官的脏器系数均明显减小，表明去卵巢使大鼠各脏器发生萎缩，重量明显减轻。与OVX组相比，MO1、MO2、MO3、MO4给药组并未引起各脏器系数的明显改变，说明巴戟天糖聚物并未对各脏器产生明显的毒副作用。

2.4巴戟天糖聚物对去卵巢雌性大鼠股骨骨密度的影响

巴戟天糖聚物对去卵巢雌性大鼠股骨骨密度(BMD)的影响见图21，与Sham组比较，OVX去卵巢大鼠的股骨骨密度出现明显减小，提示去卵巢大鼠成功复制原发性骨质疏松症。与OVX组相比，MO1、MO2、MO3、MO4给药组与阳性组E2能明显增加去卵巢大鼠股骨(见图21)的骨密度。说明给药组与阳性组能够有效预防和/或治疗大鼠的骨质疏松症状。

2.5巴戟天糖聚物对去卵巢雌性大鼠股骨骨矿物量的影响

巴戟天糖聚物对去卵巢雌性大鼠股骨骨矿物量(BMC)的影响见图22，与Sham组比较，OVX组大鼠股骨骨矿物量出现明显减小，提示去卵巢大鼠成功复制原发性骨质疏松症。与OVX组相比，MO1、MO2、MO3、MO4给药组与阳性组E2均能明显增加去卵巢大鼠股骨骨矿物量(见图22)，上述结果说明各巴戟天糖聚物给药组均有一定防治和/治疗骨质疏松症的作用。

2.6巴戟天糖聚物对去股骨及腰椎骨生物力学的影响

巴戟天糖聚物对股骨和椎骨生物力学影响的结果表明，与Sham组比较，OVX组大鼠股骨生物力学相关参数均出现明显的减小，提示去卵巢后大鼠生物力学性能下降，骨脆性增加，产生了骨质疏松症状；与OVX组相比，给药组均能一定程度上有效改善去卵巢大鼠生物力学性能，特别是MO1、MO2、MO3和阳性组在多项生物力学数据上有极显著性差异，效果更为突出。上述结果说明给药组均有一定防治骨质疏松症的作用。

2.7骨代谢生化指标

巴戟天糖聚物对大鼠尿液生化指标的影响见图23，与Sham组比较，OVX组大鼠尿液的羟脯氨酸(Hyp)、脱氧吡啶啉(DPD)出现明显的增加，表明去卵巢大鼠骨吸收作用显著增强，出现骨质疏松症状；与OVX组相比，给药组和阳性组均能一定程度上抑制大鼠的骨吸收，发挥抗骨质疏松作用。

巴戟天糖聚物对大鼠血清生化指标影响的结果表明，与Sham组比较，OVX组大鼠血清的各项生化指标均出现明显增加，表明OVX组的骨形成和骨吸收均有增加，但骨吸收率高于骨形成率，由此造成骨丢失，发生骨质疏松；与OVX组相比，给药组和阳性组各个指标均有明显下降，说明给药组可以改善骨转换之间的平衡，发挥预防和/或治疗骨质疏松作用。

2.8大鼠股骨及腰椎骨Micro-CT测量

巴戟天糖聚物对大鼠股骨及椎骨微观参数影响的结果表明，与Sham组比较，OVX大鼠股骨及椎骨的骨体积分数(BV/TV)、骨小梁连接性密度(Conn.D)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)均明显降低，而结构模型指数(SMI)、骨小梁分离度(Tb.Sp)明显增加，表明大鼠去卵巢后，股骨及椎骨产生了严重的结构退变，骨小梁结构由板状向杆状变化，出现骨质疏松症状；与OVX组相比，给药组和阳性组的股骨及椎骨的上述指标均得到了很好的逆转，发挥抗骨质疏松的作用。

2.9大鼠股骨及腰椎骨Micro-CT三维重建图

各组大鼠股骨及椎骨Micro-CT扫描三维重建图见图24、图25，通过扫描重建所得的三维图像，观察到骨结构形态以及骨小梁数量的变化情况。与Sham组比较，OVX组出现了骨小梁断裂、变短的情况，而且在中央出现了很大的间隙，表明摘除卵巢后大鼠出现了骨质疏松的症状；与OVX组相比，给药组和阳性组骨小梁数量和结构均有明显的修复，表明其有抗骨质疏松作用。

由各组大鼠股骨干骺端Micro-CT三维重建图的厚度分析图可知，与Sham组比较，OVX组骨小梁变薄；与OVX组相比，给药组和阳性组厚度增加，表明给药组对骨质疏松具有治疗作用。

由各组大鼠股骨干骺端Micro-CT三维重建图的分离度分析图可知，与Sham组比较，OVX组红色、黄色部分明显增加，说明骨小梁分离度增加；与OVX组相比，给药组和阳性组骨小梁分离度降低，表明给药组对骨质疏松具有治疗作用。

试验例3巴戟天精糖聚物MOP-2促进骨形成活性研究

1实验方法：

1.1MOP-2对MC3T3-E1细胞增殖的影响

处于对数生长期的MC3T3-E1细胞经胰蛋白酶消化，计数后调整细胞密度为2.5×10⁴/mL，每孔200μL种于96孔板中，37℃培养箱中培养24h。根据实验设计加入按实施例2制备方法得到的不同浓度的巴戟天精糖聚物MOP-2，培养48h后进行CCK8检测。

1.2 MOP-2对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响

处于对数生长期的MC3T3-E1细胞经胰蛋白酶消化，计数后调整细胞密度为15×10⁴/mL，每孔100μL种于24孔板中，37℃培养箱中培养72h。根据实验设计加入不同浓度的MOP-2，每组两个复孔。同时设置不含药物组为正常组，只给成骨诱导培养基的为对照组，E2为阳性对照组，每三天进行一次换液。药物分别作用3天，6天，9天后，用细胞裂解液裂解细胞并收集，进行碱性磷酸酶(ALP)活性检测。

1.3 MOP-2对MC3T3-E1细胞成骨矿化的影响

处于对数生长期的MC3T3-E1细胞经胰蛋白酶消化，计数后调整细胞密度为15×10⁴/mL，每孔200μL种于12孔板中，37℃培养箱中培养72h。根据实验设计加入不同浓度的MOP-2，每组两个复孔。同时设置不含药物组为正常组，只给成骨诱导培养基的为对照组，E2为阳性对照组，每三天进行一次换液。药物作用21天后，进行茜素红染色定量分析。

1.4 MOP-2对MC3T3-E1细胞成骨基因表达量的影响

处于对数生长期的MC3T3-E1细胞经胰蛋白酶消化，计数后调整细胞密度为15×10⁴/mL，每孔100μL种于24孔板中，37℃培养箱中培养72h。根据实验设计加入不同浓度的MOP-2，每组两个复孔。同时设置不含药物组为正常组，只给成骨诱导培养基的为对照组，E2为阳性对照组，每三天进行一次换液。药物分别作用3天，6天，9天后，提取RNA样品，将收集得到的RNA样品逆转录为cDNA，并进行实时荧光定量PCR检测成骨相关基因表达量的变化。实验中所用引物为Runt相关转录因子2(Runx2)，成骨细胞特异性转录因子(Osx)，骨钙素(Ocn)，骨桥蛋白(Opn)，骨唾液蛋白(Bsp)和氧基聚明胶(Opg)。

2实验结果

2.1 MOP-2对MC3T3-E1细胞增殖的影响

MOP-2对MC3T3-E1细胞增殖的影响见图26，各个浓度的MOP-2样品均能明显促进MC3T3-E1细胞增殖，且促增殖作用随着MOP-2浓度的增加先升高再降低，说明MOP-2具有促进成骨细胞MC3T3-E1增殖的能力。

2.2 MOP-2对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响

MOP-2对MC3T3-E1细胞分化的影响见图27，在加药培养的第3天，各浓度的ALP活性并未出现显著性变化，在第6天时，MOP-2的32.2μM和80.4μM组ALP活性显著升高；在加药培养第9天时，MOP-2各浓度均能显著提高ALP活性，并表现出浓度依赖性，以上结果说明MOP-2以浓度和时间依赖的方式促进成骨细胞MC3T3-E1分化。

2.3 MOP-2对成骨细胞MC3T3-E1矿化的影响

MOP-2对MC3T3-E1细胞矿化的影响见图28，MOP-2各组均能明显提高矿化钙沉积率，并显示出浓度依赖性，表明MOP-2可以促进成骨细胞矿化，与ALP活性检测结果一致。

2.4 MOP-2对MC3T3-E1细胞成骨基因表达量的影响

MOP-2对MC3T3-E1成骨基因表达量的影响见图29，MOP-2可以显著性上调成骨相关基因(Runx2，Osx，Ocn，Opn，Bsp和Opg)的表达，说明MOP-2通过促进成骨细胞分化和抑制破骨细胞分化来发挥其促进骨形成作用。

雌性大鼠的卵巢切除后，雌激素水平降低、骨代谢活跃、骨转换增强、骨矿物量丢失，是经典的模仿妇女绝经时高转换型骨质疏松症的模型。本实验研究表明，通过上述方法提取的巴戟天粗糖聚物均能显著增加去卵巢大鼠股骨与腰椎骨密度以及骨矿物量，明显改善骨生物力学性能，并能通过Micro-CT扫描观察到给药后骨结构形态的修复，从而发挥治疗骨质疏松症的作用。

此后对纯化得到的精糖聚物MOP-2的体外促进骨形成活性进行研究，结果表明MOP-2能够明显促进MC3T3-E1成骨细胞的增殖，显著提高ALP活性，促进成骨细胞分化、矿化，并显著性上调成骨相关基因的表达，说明MOP-2可以通过促进成骨细胞增殖、分化和矿化发挥促进骨形成的作用。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。对于本领域的普通技术人员来说，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、代替、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种巴戟天粗糖聚物的制备方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

S1.干燥：将巴戟天根晾干；

S2.水提：将干燥后的巴戟天进行水提，分别收集提取液和残渣，水提用10倍体积、温度为90℃的水对切好的巴戟天进行提取，提取时间1～4h；

S3.分级醇沉：将提取液浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为50％，静置24h，收集沉淀，得粗糖MO1和上清液I；将上清液I再次进行减压浓缩，加入乙醇使乙醇体积浓度为70％，静置24h，收集沉淀，得粗糖MO2和上清液II；将上清液II再次进行减压浓缩，加入乙醇使乙醇体积浓度为90％，静置24h，收集沉淀，得粗糖MO3；

S4.碱提：将水提后的残渣浸泡于0.1～1MNaOH溶液中，静置1～4h，上清液用HCl进行中和，使上清液的pH为6～8，离心取上清，浓缩上清，加入乙醇使乙醇体积浓度为50～90％，静置1～4h，收集沉淀，即得碱提粗糖MO4；

S5.纯化：利用Sevag法分别对上述MO1、MO2、MO3和MO4粗糖聚物进行除蛋白，除蛋白后粗糖聚物进行透析、冻干，透析袋的截留分子量为1000Da；

S6.将纯化后的粗糖聚物再经DEAE离子交换柱层析，用蒸馏水和NaCl溶液进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收集糖部分，浓缩，冷冻干燥；然后用水溶解，离心，取上清液进行Sephacryl分子筛凝胶柱层析，用水进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收集糖部分，浓缩，冷冻干燥，即得；

所述巴戟天糖聚物是由葡萄糖和果糖组成，主链为(2→1)-β-D-Fruf，末端为葡萄糖，结构式为

其中n为1～30，所述巴戟天糖聚物结构式中n为1～6时，为巴戟天寡糖MOP-1，所述巴戟天糖聚物结构式中n为14～30时，为巴戟天多糖MOP-2，所述巴戟天糖聚物结构式中n为7～13时，为巴戟天多糖MOP-3。

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