CN101732697B - 一种复方骨肽冻干制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域，更具体地，本发明公开了一种复方骨肽冻干制剂，其中骨肽和蝎肽的质量比为3∶1、辅料为氯化钠，本发明还公开了上述复方骨肽冻干制剂的制备方法。本发明公开的复方骨肽制剂具有治愈率高，稳定性好的优点。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，更具体地，本发明公开了一种冻干的复方制剂。
背景技术
普通骨肽注射液是通过提取新鲜骨得到骨肽而制备得到的可以调节代谢，促进骨生长。目前国内生产骨肽的工艺路线主要参照张天民教书主审及林元藻教授主编《生化制药学》335-336页及李良等主编《最新生化药物制备技术》392-393页中公开的方法制备得到。由于全蝎具有熄风镇惊、通络止痛的功效，用于风湿完痹。全蝎与骨肽配伍，其优势互补，为了加强抗炎镇痛效果，目前在骨肽中加入了蝎肽做成复方制剂，用于调节骨代谢、刺激成骨细胞增值，促进新骨形成，以及调节钙、磷代谢，增加骨钙沉积，防治骨质疏松的作用。蝎肽工艺路线按中国药典2000版一部附录XA醇浸法制备.
上市品的骨肽制剂也是用健康猪四肢骨与全蝎经提取的无菌水溶液经冷冻干燥制成的无菌冻干品。每支含多肽类物质应不低于30mg，含总氮量应不低于6mg，含生物大分子，分子量超过11000道尔顿不得超过2.5％。其中骨肽和蝎肽的比例为2∶1-5∶1之间，经过临床验证其治愈率约为70％
虽然上述骨肽的复方制剂在一定程度上起到了刺激成骨细胞增值，促进新骨形成，以及调节钙、磷代谢，增加骨钙沉积，防治骨质疏松的作用，但还存在不稳定且治愈率不高的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的申请人进行了大量试验，得到了一种稳定的治愈率高的复方骨肽冻干制剂。
更具体的，本发明公开了一种复方骨肽冻干制剂，其中骨肽和蝎肽的质量比为3∶1，辅料为氯化钠，其中骨肽和蝎肽分别按以下方法制备得到：
骨肽：
A：骨肽的提取、去脂、浓缩：取健康新鲜或冷冻猪的四肢骨，洗净、打碎称重后，加两倍量蒸馏水，在1.5kg/cm3热压下抽提1.5小时，用双层纱布过滤，骨渣再加上述量蒸馏水，热压1.5小时，过滤；合并两次滤液，立即置于0-5℃冷室中，静置36小时，除去脂肪层，加热使冻状物融成液体，70℃以下真空浓缩至滤液总体积的1/5左右。
B：沉淀、浓缩：取浓缩液，加入95％乙醇至终浓度为70％(体积比)静置沉淀36小时，滤除杂蛋白，得澄清液；再于60℃以下真空浓缩至总体积的1/4左右，除去乙醇，将除去乙醇的浓缩液，至无醇味，加入0.3％苯酚，补加蒸馏水至总体积。
C：酸性、碱性沉淀：酸性沉淀：在搅拌下滴加6mol/L盐酸于上述溶液中，调PH4.0，常压加热100℃保持45分钟，离心，除去酸性蛋白，然后滤液消毒1小时，放冰箱过夜(0～5℃)；碱性沉淀：酸性沉淀放冰箱过夜后，次日取出，过滤，滤液在搅拌下加入50％氢氧化钠溶液，调pH8.5，100℃加热1小时，于冷室静置。次日离心，除去沉淀，得滤液。
D：中性沉淀：C步骤得到的滤液次日离心，除去沉淀，滤液用6mol/L盐酸调pH到7.0～7.2，常压消毒1小时，冷室放置过夜。
E：吸附：将D步骤得到的溶液再次过滤，滤液加入0.5％(重量/体积)活性炭，100℃搅拌加热30分钟，离心，得滤液，调pH7.0～7.2，100℃加热1小时，同时补水，测含量(取骨肽中间体溶液适量，稀释成浓度约5mg/ml，加入双缩脲试液(取硫酸铜1.50g和酒石酸钾钠6.0g，加水500ml使溶解，边搅边加入10％氢氧化钠溶液300ml，用水稀释至1000ml，混匀)4ml，混匀，室温放置30min，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV A)，在540nm的波长处测定吸收度；另精密称取酪蛋白适量，加0.05mol/l氢氧化钠试液制成每1ml中约含7mg的对照品溶液，精密量取2ml，加入双缩脲试液4ml，混匀，室温放置30min，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV A)，在540nm的波长处测定吸收度，测定吸收度，计算含量。应控制在30-33mg/ml。)，放冰箱备用。蝎肽的提取：
a：取全蝎，按中国药典200版附录XA测定浸出物，合格后投料。
b：全蝎肽的提取：粉碎，第一次加四倍量的95％乙醇，第二次加3倍量的95％乙醇，第三次加2倍量的95％乙醇，在沸水浴中回流三次，每次30分钟，合并提取液。
c：真空浓缩，回收乙醇：加提取液等量的蒸馏水，100℃浓缩，至无醇味，得浓缩液，测pH。
d：浓缩液用1mol/ml盐酸调pH4.0，100℃灭菌0.5hr，同时补水至总体积，冷却后过滤。
e：脱脂：将上述滤液用纸浆或滤纸过滤，除去油层，取滤液。
f：调pH：将上述滤液用1mol/mlNaOH调pH6.8，
g：除热原：将上述溶液，加入0.5％活性炭，搅拌加热100℃煮沸2hr(除热原)，并用蒸馏水补充所需含量，过滤到滤液，冰箱放置备用。(多肽的含量测定同骨肽，应控制多肽含量在15mg/ml以上。)
取上述骨肽和蝎肽加入0.9％氯化钠注射液制备成每毫升含48毫克多肽(骨肽/蝎肽含量比为3∶1)、3mg氯化钠的供试品溶液，调pH7.0-7.2，加总体积的0.1％的针用活性炭，煮沸5-10min，用蒸镏水补到每毫升含15毫克多肽，然后脱炭，0.22μm微孔簿膜过滤，无菌灌装，灌2ml多肽(30毫克)(含2mg氯化钠)在7ml瓶内、压半塞进行冻干，冻干时间不低于96hr，搁板最高温度50℃，瓶内最低温度不低于30℃，冷冻时最低温度-47℃(共凝点-30℃)，即得成品。
本发明的发明人利用不同比例的骨肽和蝎肽(骨肽含量/蝎肽分别为1∶1，2∶1，4∶1，5∶1)加入0.9％氯化钠注射液制备成每毫升含48毫克多肽、3mg氯化钠的供试品溶液，按与上述步骤相同的方法灌装2ml 30毫克多肽到7ml瓶内按与上述冻干相同的步骤得到对照品进行如下试验：
1.配比合理性试验
取三个不同批次的本发明的产品和对照品，每批取体重250-300g豚鼠100只(30mg/天)，均为腿部骨折分别对其连续7天的治疗，试验结果如下表1所示(各数据均为三个不同批次试验结果的平均值)
表1 试验疗效检测结果
试验结果表明：多肽含量中骨肽含量/蟹肽含量的比值为3∶1时疗效最为显著，利用市售产品进行上述试验，治愈率约为70％
另外再取三个不同批次的不同配比骨肽样品按与上述制备方法相同的方法得到对照品进行试验，每批取体重250-300g豚鼠100只，用同样的试验方法验证骨肽含量和蟹肽含量配比最合理试验，试验结果见表2
表2 试验疗效检测结果
试验结果表明：多肽含量中骨肽含量/蟹肽含量的比值越小时时疗效越不明显。
2.稳定性试验
(1)考察方法
将样品值于40℃±2℃在恒温培养箱中放置12个月，分别于0，1，2，3，6月取样，考察其鉴别、蛋白检查、性状、色泽、多肽含量(骨肽含量/蟹肽含量＝3∶1)、总氮量及pH的变化。
(2)考察项目见表3
表3 40℃±2℃加速试验检测结果
注：鉴别1为茚三酮反应，鉴别2为双缩脲反应
结果从上表中可以看出，本品多肽含量、总氮量RSD％小于5％，鉴别、蛋白检查、性状、色泽、多肽含量、总氮量及pH前后无明显变化。
结论根据6个月加速实验考察结果表明，药品前后变化不明显，说明该药品较稳定。
利用已上市售产品进行同样的试验，结果见表4.
结果表4 40℃±2℃加速试验检测结果
结果从上表中可以看出，本品多肽含量、总氮量虽RSD％都小于5％，但鉴别、蛋白检查、性状、色泽、多肽含量、总氮量及pH前后和本发明产品相比均有小幅变化，说明本发明的产品更稳定。
综上所述：本品多肽的含量中骨肽/蟹肽＝3∶1时最为合理。6个月加速实验考察结果表明，此配比时药品也较稳定，达到了本发明的目的。
具体实施方式
以下实施例试验例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。
实施例1复方骨肽冻干制剂的制备
骨肽的制备：
A：骨肽的提取、去脂、浓缩：取健康新鲜或冷冻猪的四肢骨，洗净、打碎称重后，加两倍量蒸馏水，在1.5kg/cm3热压下抽提1.5小时，用双层纱布过滤，骨渣再加上述量蒸馏水，热压1.5小时，过滤；合并两次滤液，立即置于0-5℃冷室中，静置36小时，除去脂肪层，加热使冻状物融成液体，70℃以下真空浓缩至滤液总体积的1/5左右。
B：沉淀、浓缩：取浓缩液，加入95％乙醇至终浓度为70％(体积比)静置沉淀36小时，滤除杂蛋白，得澄清液；再于60℃以下真空浓缩至总体积的1/4左右，除去乙醇，将除去乙醇的浓缩液，至无醇味，加入0.3％苯酚，补加蒸馏水至总体积。
C：酸性、碱性沉淀：酸性沉淀：在搅拌下滴加6mol/L盐酸于上述溶液中，调PH4.0，常压加热100℃保持45分钟，离心，除去酸性蛋白，然后滤液消毒1小时，放冰箱过夜(0～5℃)；碱性沉淀：酸性沉淀放冰箱过夜后，次日取出，过滤，滤液在搅拌下加入50％氢氧化钠溶液，调pH8.5，100℃加热1小时，于冷室静置。次日离心，除去沉淀，得滤液。
D：中性沉淀：C步骤得到的滤液次日离心，除去沉淀，滤液用6mol/L盐酸调pH到7.0～7.2，常压消毒1小时，冷室放置过夜。
E：吸附：将D步骤得到的溶液再次过滤，滤液加入0.5％(重量/体积)活性炭，100℃搅拌加热30分钟，离心，得滤液，调pH7.0～7.2，100℃加热1小时，同时补水，测含量(取骨肽中间体溶液适量，稀释成浓度约5mg/ml，加入双缩脲试液(取硫酸铜1.50g和酒石酸钾钠6.0g，加水500ml使溶解，边搅边加入10％氢氧化钠溶液300ml，用水稀释至1000ml，混匀)4ml，混匀，室温放置30min，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV A)，在540nm的波长处测定吸收度；另精密称取酪蛋白适量，加0.05mol/l氢氧化钠试液制成每1ml中约含7mg的对照品溶液，精密量取2ml，加入双缩脲试液4ml，混匀，室温放置30min，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV A)，在540nm的波长处测定吸收度，测定吸收度，计算含量。应控制在30-33mg/ml。)，放冰箱备用。
蝎肽的提取：
a：取全蝎，按中国药典200版附录XA测定浸出物，合格后投料。
b：全蝎肽的提取：粉碎，第一次加四倍量的95％乙醇，第二次加3倍量的95％乙醇，第三次加2倍量的95％乙醇，在沸水浴中回流三次，每次30分钟，合并提取液。
c：真空浓缩，回收乙醇：加提取液等量的蒸馏水，100℃浓缩，至无醇味，得浓缩液，测pH。
d：浓缩液用1mol/ml盐酸调pH4.0，100℃灭菌0.5hr，同时补水至总体积，冷却后过滤。
e：脱脂：将上述滤液用纸浆或滤纸过滤，除去油层，取滤液。
f：调pH：将上述滤液用1mol/mlNaOH调pH6.8，
g：除热原：将上述溶液，加入0.5％活性炭，搅拌加热100℃煮沸2hr(除热原)，并用蒸馏水补充所需含量，过滤到滤液，冰箱放置备用。(多肽的含量测定同骨肽，应控制多肽含量在15mg/ml以上。)
取上述骨肽和蝎肽加入0.9％氯化钠注射液制备成每毫升含48毫克多肽(骨肽/蝎肽含量比为3∶1)、3mg氯化钠的供试品溶液，调pH7.0-7.2，加总体积的0.1％的针用活性炭，煮沸5-10min，用蒸镏水补到每毫升含15毫克多肽，然后脱炭，0.22μm微孔簿膜过滤，无菌灌装，灌2ml多肽(30毫克)(含2mg氯化钠)在7ml瓶内、压半塞进行冻干，冻干时间不低于96hr，搁板最高温度50℃，瓶内最低温度不低于30℃，冷冻时最低温度-47℃(共凝点-30℃)，即得成品。
对照品只是改变骨肽和蝎肽的比例按与上述方法相同的方法制备。
实验例1：配比合理性试验
取三个不同批次的本发明的产品和对照品，每批取体重250-300g豚鼠100只(30mg/天)，均为腿部骨折分别对其连续7天的治疗，试验结果如下表1所示(各数据均为三个不同批次试验结果的平均值)
表1 试验疗效检测结果
试验结果表明：多肽含量中骨肽含量/蟹肽含量的比值为3∶1时疗效最为显著，利用市售产品进行上述试验，治愈率约为70％
另外再取三个不同批次的不同配比骨肽样品按与上述制备方法相同的方法得到对照品进行试验，每批取体重250-300g豚鼠100只，用同样的试验方法验证骨肽含量和蟹肽含量配比最合理试验，试验结果见表2
表2 试验疗效检测结果
试验结果表明：多肽含量中骨肽含量/蟹肽含量的比值越小时时疗效越不明显。
试验例2稳定性试验
(1)考察方法
将样品值于40℃±2℃在恒温培养箱中放置12个月，分别于0，1，2，3，6月取样，考察其鉴别、蛋白检查、性状、色泽、多肽含量(骨肽含量/蟹肽含量＝3∶1)、总氮量及pH的变化。
(2)考察项目见表3
表3 40℃±2℃加速试验检测结果
注：鉴别1为茚三酮反应，鉴别2为双缩脲反应
结果从上表中可以看出，本品多肽含量、总氮量RSD％小于5％，鉴别、蛋白检查、性状、色泽、多肽含量、总氮量及pH前后无明显变化。
结论根据6个月加速实验考察结果表明，药品前后变化不明显，说明该药品较稳定。
利用已上市售产品进行同样的试验，结果表4.
表4 40℃±2℃加速试验检测结果
结果从上表中可以看出，本品多肽含量、总氮量虽RSD％都小于5％，但鉴别、蛋白检查、性状、色泽、多肽含量、总氮量及pH前后和本发明产品相比均有小幅变化，说明本发明的产品更稳定。
Claims (3)
1.一种复方骨肽冻干制剂，包含骨肽和蝎肽，其中骨肽和蝎肽的质量比为3∶1，辅料为氯化钠；骨肽和蝎肽分别按以下方法制备得到：
骨肽：
A：骨肽的提取、去脂、浓缩：取健康新鲜或冷冻猪的四肢骨，热压下抽提后过滤，骨渣抽提，过滤；合并两次滤液，立即置于冷室中静置，除去脂肪层，加热使冻状物融成液体，真空浓缩；
B：沉淀、浓缩：取浓缩液，加入95％乙醇至终浓度为体积比70％，静置沉淀，滤除杂蛋白，得澄清液；再真空浓缩至总体积的1/4左右，除去乙醇，加入0.3％苯酚，补加蒸馏水至总体积；
C：酸性、碱性沉淀：酸性沉淀：在搅拌下滴加盐酸，调PH，常压加热，离心除去酸性蛋白，然后滤液消毒1小时，放冰箱过夜；碱性沉淀：酸性沉淀产物放冰箱过夜后，次日取出，过滤，滤液在搅拌下加入碱溶液调pH8.5，加热后于冷室静置；次日离心，除去沉淀，得滤液；
D：中性沉淀：C步骤得到的滤液次日离心，除去沉淀，滤液用盐酸调pH到7.0～7.2，常压消毒1小时，冷室放置过夜；
E：吸附：将D步骤得到的溶液再次过滤，滤液加入活性炭，搅拌加热，离心，得滤液，调pH7.0～7.2，加热，同时补水，将骨肽含量控制在30-33mg/ml，放冰箱备用；
蝎肽的提取：
a：取全蝎，按中国药典2000版附录XA测定浸出物，合格后投料；
b：全蝎肽的提取：粉碎，三次提取，分别在沸水浴中回流三次，合并提取液；
c：真空浓缩，回收乙醇：加提取液等量的蒸馏水，真空浓缩；
d：浓缩液用盐酸调pH后加热灭菌，同时补水至总体积，冷却后过滤；
e：脱脂：将上述滤液用纸浆或滤纸过滤，除去油层，取滤液；
f：调pH：将上述滤液用碱调pH6.8；
g：除热原：将上述溶液，加入活性炭，搅拌加热煮沸2hr，并用蒸馏水补充所需含量，过滤到滤液，冰箱放置备用；
取上述骨肽和蝎肽加入0.9％氯化钠注射液制备成每毫升含48毫克多肽、其中骨肽/蝎肽含量比为3∶1，3mg氯化钠的供试品溶液；调pH7.0-7.2，加总体积的0.1％的针用活性炭，煮沸5-10min，用蒸镏水补到每毫升含15毫克多肽，然后脱炭，0.22μm微孔簿膜过滤，无菌灌装，灌2ml 30毫克含2mg氯化钠的多肽在7ml瓶内、压半塞进行冻干，冻干时间不低于96hr，搁板最高温度50℃，瓶内最低温度不低于30℃，冷冻时最低温度-47℃，其中共凝点-30℃，即得成品。
2.权利要求1所述的复方骨肽冻干制剂，其中骨肽的具体制备步骤为：
A：骨肽的提取、去脂、浓缩：取健康新鲜或冷冻猪的四肢骨，洗净、打碎称重后，加两倍量蒸馏水，在1.5kg/cm3热压下抽提1.5小时，用双层纱布过滤，骨渣再加上述量蒸馏水，热压1.5小时，过滤；合并两次滤液，立即置于0-5℃冷室中，静置36小时，除去脂肪层，加热使冻状物融成液体，70℃以下真空浓缩至滤液总体积的1/5左右；
B：沉淀、浓缩：取浓缩液，加入95％乙醇至终浓度为体积比70％，静置沉淀36小时，滤除杂蛋白，得澄清液；再于60℃以下真空浓缩至总体积的1/4左右，除去乙醇，将除去乙醇的浓缩液，至无醇味，加入0.3％苯酚，补加蒸馏水至总体积；
C：酸性、碱性沉淀：酸性沉淀：在搅拌下滴加6mol/L盐酸于上述溶液中，调PH4.0，常压加热100℃保持45分钟，离心，除去酸性蛋白，然后滤液消毒1小时，放冰箱过夜0～5℃；碱性沉淀：酸性沉淀放冰箱过夜后，次日取出，过滤，滤液在搅拌下加入50％氢氧化钠溶液，调pH8.5，100℃加热1小时，于冷室静置；次日离心，除去沉淀，得滤液；
D：中性沉淀：C步骤得到的滤液次日离心，除去沉淀，滤液用6mol/L盐酸调pH到7.0～7.2，常压消毒1小时，冷室放置过夜；
E：吸附：将D步骤得到的溶液再次过滤，滤液加入0.5％重量/体积活性炭，100℃搅拌加热30分钟，离心，得滤液，调pH7.0～7.2，100℃加热1小时，同时补水，测含量。
3.权利要求1所述的复方骨肽冻干制剂，其中蝎肽的具体制备步骤为：
a：取全蝎，按中国药典2000版附录XA测定浸出物，合格后投料；
b：全蝎肽的提取：粉碎，第一次加四倍量的95％乙醇，第二次加3倍量的95％乙醇，第三次加2倍量的95％乙醇，在沸水浴中回流三次，每次30分钟，合并提取液；
c：真空浓缩，回收乙醇：加提取液等量的蒸馏水，100℃浓缩，至无醇味，得浓缩液，测pH；
d：浓缩液用1mol/ml盐酸调pH4.0，100℃灭菌0.5hr，同时补水至总体积，冷却后过滤；
e：脱脂：将上述滤液用纸浆或滤纸过滤，除去油层，取滤液；
f：调pH：将上述滤液用1mol/mlNaOH调pH6.8；
g：除热原：将上述溶液，加入0.5％活性炭，搅拌加热100℃煮沸2hr，并用 蒸馏水补充所需含量，过滤到滤液，冰箱放置备用。
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