KR101920152B1 - 면역증진 효과가 있는 녹용약침 및 이의 조제방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 1) 녹용(Cervi Parvum Cornu) 절편을 열수 추출하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 얻은 1차 추출물을 90% 에탄올 수용액으로 2차 추출하는 단계; 3) 상기 단계 2)에서 얻은 2차 추출물을 70% 에탄올 수용액으로 3차 추출하는 단계; 및 4) 상기 단계 3)에서 얻은 3차 추출물을 극 미세여과하여 녹용 약침용 조성물을 수득하는 단계;를 포함하는 녹용 약침용 조성물 조제방법, 이를 통해 조제된 녹용 약침용 조성물 및 녹용 약침에 관한 것으로, 본 발명의 조제방법에 따르면, 총 4 번에 걸쳐 바이러스 불활화 과정을 거치게 되므로 안전하고 또한 유효성분이 다량 함유되어 있어 면역 증진 효과가 우수한 녹용 약침용 조성물 또는 녹용 약침을 조제할 수 있다.

Description

면역증진 효과가 있는 녹용약침 및 이의 조제방법{Cervi Parvum Cornu Acupuncture Enhancing Immunity and Method for Manufacturing thereof}
본 발명은 녹용 약침용 조성물 조제방법, 이로 조제된 녹용 약침용 조성물 및 이를 유효성분으로 포함하는 녹용 약침에 관한 것이다.
사슴의 뿔은 늦봄에 저절로 떨어지고 곧 그 자리에 새로운 뿔이 자라는데, 이 자라기 시작한 뿔을 녹용이라 지칭한다. 주로 그늘에서 말려 사용하며, 부드러운 세모로 덮여 있고 따뜻하고 혈관이 많이 들어 있으며 칼슘이 풍부하다. 일반적으로 한방에서는 녹용을 보정강장약으로 쓴다.
녹용을 부위별로 나누면 제일 끝부분에서부터 팁, 분골, 상대, 중대, 하대로 나눌 수 있다. 팁은 녹용의 가장 끝부분으로 녹용에서 극소량으로 얻을 수 있는 부위이고, 분골은 골질화가 되지 않아 가장 연한 부위로 절단면 테두리에 까맣고 굵에 기름띠(collagen)가 형성되어 있으며 대체로 복숭아 빛을 띠는데, 굵기에 관계 없이 치밀한 조직과 성장호르몬이 함유되어 있어 허약자나 병약자에게 효과적인 것으로 알려져 있다. 상대는 조직이 치밀하고 붉은 핏빛으로 연한 갈색을 띠며 조혈작용 및 심장과 위를 보호하는 효과가 있다고 알려져 있다. 중대는 절단면 가운데의 조직이 거칠고 나이테 같은 줄이 관찰되며 대체로 붉은 부위로, 장 보호, 강정 작용 및 부인병 개선 효과가 있으나, 상대보다는 그 약효가 미약하다. 마지막으로 하대는 사슴의 머리에 가장 가까운 부분으로, 큰 구멍이 다수 발견되며, 테두리 부분이 흰색을 띤다. 미네랄을 함유하고 있어 노인들의 뼈마디 보호에 효과적이라고 알려져 있다.
한편, 약침요법은 경혈에 물리적인 자극을 주던 침구요법 치료 형태에서 화학적인 자극을 경혈에 추가한 한의학 고유의 치료 행위로, 녹용 등의 순수 한약재에서 정제, 추출한 한약제제를 경혈 자리에 극소량으로 주입함으로써 침의 작용과 한약의 작용을 병행하여 치료를 보다 극대화하는 요법이다. 약침요법은 순수 한약재를 사용하기 때문에 중독성, 습관성, 내성 등이 없으며, 또한 각 장부와 연결된 경락과 경혈을 자극함으로써 약침의 기운이 내장의 병소에 직접 전달되어 최소량의 약물로서 최대의 효과를 볼 수 있는 장점이 있다. 즉, 의약 분야에서 사용되는 주사는 일정한 부위에 다량의 화학 약물을 주입하여 약물의 약효를 얻게 되는데 반해, 약침은 천연약물인 한약재를 침을 놓는 경혈 부위에 소량 주입함으로써 침의 지속적 자극 효과와 한약의 치료 효과를 함께 얻을 수 있다.
하지만, 약침은 사용되는 약재의 종류가 제한적이며, 약재의 종류 및 그 조제방법에 따라 발열, 피로, 오한, 두통, 어지러움, 시술 부위 또는 전신의 가려움증 등과 같은 부작용이 발생할 가능성이 있다. 또한, 약재의 종류에 따라 약침의 조제방법이 달라지며, 약재의 추출방식 및 약침의 조제방법이 표준화되지 않아 유효성분 함량의 균질성이 떨어져 약효가 달라지는 문제가 있다.
따라서, 부작용 없이 안전하게 적용될 수 있는 약침 조성물의 표준화된 조제공정의 개발 및 제약화를 위한 『의약품의 품질 허가, 신고, 심사 규정』에 따른 과학적인 데이터 확보가 시급한 실정이다.
한국공개특허 제10-2016-0146031호(2016.12.21 공개).
본 발명의 목적은 면역 증강 효과가 있는 녹용 약침 조성물의 조제방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 면역 증강 효과가 있는 녹용 약침 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 면역 증강 효과가 있는 녹용 약침 조성물을 포함하는 녹용 약침을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 녹용(Cervi Parvum Cornu) 절편을 열수 추출하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 얻은 1차 추출물을 90% 에탄올 수용액으로 2차 추출하는 단계; 3) 상기 단계 2)에서 얻은 2차 추출물을 70% 에탄올 수용액으로 3차 추출하는 단계; 및 4) 상기 단계 3)에서 얻은 3차 추출물을 극 미세여과하여 녹용 약침용 조성물을 수득하는 단계;를 포함하는 녹용 약침용 조성물 조제방법을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 조제방법으로 조제된 녹용 약침용 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 조제방법으로 조제된 녹용 약침용 조성물을 유효성분으로 포함하는 녹용 약침을 제공한다.
본 발명은 신규한 녹용 약침용 조성물 조제방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조제방법으로 녹용 약침용 조성물을 조제하는 경우, 4번의 바이러스 불활화 과정을 거치게 되므로 안전하며, 이미 시판되고 있는 제품보다 더 많은 아미노산을 함유하고 또한 강글리오사이드, 콘드로이친황산 등의 유효성분을 포함하고 있는 조성물을 조제할 수 있는 바, 면역 증진 효과가 우수한 녹용 약으로 활용될 수 있다.
도 1은 녹용의 종 감별 프라이머 제작을 위한 마록 및 매화록의 미토콘드리아 특이적 유전자 밴드를 확인한 결과이다.
도 2는 녹용 확인 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 3 및 도 4는 녹용의 순도 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 다양한 녹용 추출 방법을 모식적으로 도시한 것이다.
도 6은 추출 방법별 녹용 추출물의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 전탕 후 에탄올 추출 방법 시, 에탄올 농도 단계별 순도의 차이를 확인한 결과이다.
도 8은 90% 에탄올 및 70% 에탄올 추출로 얻은 녹용 추출물의 유효성분의 함량을 TLC로 확인한 결과이다.
도 9는 최종적으로 확립된 표준화된 녹용 약침용 조성물 및 녹용 약침의 조제 공정도를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 조제방법으로 조제된 시제품을 나타낸 것이다.
도 11은 녹용 약침 조성물의 HPLC에 따른 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 12는 상기 도 11의 실시예에 따른 HPLC의 재현성을 확인한 결과이다.
도 13은 녹용 약침용 조성물에서 강글리오사이드의 존재 여부를 확인한 결과이다.
도 14는 녹용 약침용 조성물의 콘드로이친황산 함량을 측정한 결과이다.
도 15는 알라닌 및 류신의 스탠다드 그래프를 나타낸 것이다.
도 16은 녹용 약침용 조성물의 아미노산 중 류신 및 알라닌의 함량을 측정한 결과이다.
도 17은 녹용 약침용 조성물의 전체 아미노산 구성 성분을 분석한 결과이다.
도 18은 녹용 약침 조성물의 무균 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 녹용 약침 조성물의 엔도톡신 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 녹용 약침 조성물을 투여한 수면박탈 마우스에서의 외현 변화를 나타낸 것이다.
도 21은 녹용 약침 조성물을 투여한 수면박탈 마우스의 체중 변화를 나타낸 것이다.
도 22는 녹용 약침 조성물을 투여한 수면박탈 마우스의 음식 섭취량 변화를 나타낸 것이다.
도 23은 녹용 약침 조성물을 투여한 수면박탈 마우스의 비장과 체중의 비율을 나타낸 것이다.
도 24는 녹용 약침 조성물을 투여한 수면박탈 마우스에서 사이토카인인 IL-2의 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 25는 녹용 약침 조성물을 투여한 수면박탈 마우스에서 사이토카인인 IFN-γ의 발현량 변화를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
약침은 높은 사용빈도에도 불구하고 조제 및 품질관리 기준 미비로 안전성, 유효성 문제 대두 등으로 인한 의약품 안전사고 발생 우려가 생겨나고 있는 바, 이에, 본 발명의 발명자들은 약침 안전성 및 유효성 확보를 통한 관련법 및 제도에 필요한 조제공정을 표준화하고자 하였고, 또한 동물성 약제, 특히 녹용 및 고급한약재로 분류되는 동물성 약재는 끊임없이 진가품 논란이 계속되어 왔으므로, 표준화된 녹용약침을 조제하는 데 있어서 주원료가 되는 녹용의 기원을 명확하게 하고자 하여 약침의 원료를 표준화하고자 하였으며, 최종적으로 표준화된 조제공정에 맞게 조제된 약침의 약효를 표준화하기 위하여 연구하던 중 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 1) 녹용(Cervi Parvum Cornu) 절편을 열수 추출하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 얻은 1차 추출물을 90% 에탄올 수용액으로 2차 추출하는 단계; 3) 상기 단계 2)에서 얻은 2차 추출물을 70% 에탄올 수용액으로 3차 추출하는 단계; 및 4) 상기 단계 3)에서 얻은 3차 추출물을 극 미세여과하여 녹용 약침용 조성물을 수득하는 단계;를 포함하는 녹용 약침용 조성물 조제방법을 제공한다.
상기 단계 1)에서 녹용 절편은, 녹용 절편의 7배 부피만큼의 정제수에 침지될 수 있는 바, 상기 범위 내 함량의 녹용 절편을 사용할 때 녹용의 유효성분을 함께 충분히 추출할 수 있으므로 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 단계 1) 에서 열수 추출은 105℃의 열을 가하며 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 극 미세여과는 3차 추출물을 공극의 평균 직경이 0.45 ㎛ 및 0.2 ㎛ 인 여과 필터에 순차적으로 통과시킴으로써 두 번 수행될 수 있는 바, 이러한 여과 과정을 통해 바이러스 불활화(inactivation) 과정이 일어나므로 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
즉, 상기 단계 2) 내지 4)에서 1차 내지 3차 추출물 또는 녹용 약침용 조성물은 바이러스가 불활화(inactivation)된 추출물 또는 조성물일 수 있는 바, 본 발명에 따른 조제 공정에서는 총 4 번에 걸쳐 바이러스 불활화 과정이 수행되므로, 식품의약품안전처에서 요구하는 「동물유래의약품 바이러스 안전성 평가 가이드라인」요구에 맞춘 녹용 약침을 조제할 수 있으며, 따라서 동물에게 더욱 안전하게 투여될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 조제방법에 따르면 2번의 교반 과정을 거치는 바, 이러한 과정을 통해 녹용 약침 사용 시 부작용을 일으키는 콜라겐을 현저하게 제거할 수 있어 녹용 약침의 부작용을 방지할 수 있다.
상기 녹용 약침용 조성물은 콘드로이친황산(chondroitine sulfate)을 7.51 mg/g 함유할 수 있는 바, 항염증 작용, 연골조직 재생, 관절염 증상 완화 등의 다양한 생리활성을 지니고 있는 성분을 포함하므로 이로 조제된 녹용 약침용 조성물 내지는 녹용 약침은 면역 증진 효과 외에 상기와 같은 다양한 효과를 더 나타낼 수 있다.
또한, 상기 녹용 약침용 조성물은 알라닌을 17.90 mg/g, 및 류신을 15.81 mg/g 함유할 수 있는 바, 이는 시중에 판매되는 제품의 약 4배 내지 5배 되는 양으로, 우수한 생리활성 효과를 나타낼 수 있다.
따라서, 상기와 같은 유효성분의 함량이 녹용 약침 조제 후, 조제된 녹용 약침 조성물 또는 녹용 약침의 품질 기준으로 활용될 수 있을 것이다.
더욱이, 상기 녹용 약침용 조성물은 면역 증진 효과를 나타낼 수 있다.
더불어, 본 발명은 상기 조제방법으로 조제된 녹용 약침용 조성물 및 상기 녹용 약침용 조성물을 유효성분으로 포함하는 녹용 약침을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐이므로 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 녹용 종 감별
이하의 모든 실험에서는 약침의 비임상시험관리기준(GLP)을 위한 사전 실험으로서 신뢰성을 확보할 수 있도록 연구를 진행하였고, 사전 동물실험을 통해 불필요한 반복을 줄이면서 사람에게 안전한 사용을 도모할 수 있으므로, 동물의 종류, 성별 및 연령, 투여경로 및 투여량을 고려하여 실험을 진행하였다.
(1) 종 감별 마커 제작
표준화된 녹용 약침을 조제하기 위해서는, 주원료가 되는 녹용의 기원을 명확하게 할 필요가 있다. 이에, 마록, 매화록, 순록, 엘크의 미토콘드리아 유전자 염기서열을 이용하여 특이적으로 마록을 감별하는 종 감별 프라이머를 제작하여 종 감별을 수행하였다.
먼저, 종 감별 프라이머 제작을 위해 미국 생물정도 데이터베이스인 NCBI에 있는 마록, 매화록, 순록, 엘크 4종의 유전자 염기서열을 확보하여, 모계 유전인 미토콘드리아 유전자 염기 서열을 비교한 결과, 도 1(M: 사이즈 마커; Lane 1: 마록(805 bp); Lane 2: 매화록(600 bp); Lane 3: 순록(500 bp 이하); Lane 4: 엘크(400 bp 이하))에 나타난 밴드 패턴을 확인하였다. 이러한 결과를 토대로 마록과 매화록의 미토콘드리아 유전자 특이적 밴드를 마커 밴드(marker band)로 설정하였고, 이 밴드의 염기서열에 상보적으로 결합하는 종 감별 프라이머를 제작하였다.
(2) 녹용 확인 시험
다음으로, 대한민국약전 외 한약(생약) 규격집(KHP)에 나와 있는 대로, 감별하고자 하는 녹용 절편들을 옴니허브에서 구입하였다. 구체적으로, 마록(Cervus elaphus Linne)의 뿔로 추정되는 뉴질랜드산 1(시료번호: NY02ON190225), 뉴질랜드산 2(시료번호: NY02MG190223), 러시아산(시료번호: NY02MG190304) 및 중국산(시료번호: NY02MG190307) 녹용을 구입하여 종 감별 실험에 이용하였다.
먼저, 종 확인 시험을 수행하였다. 녹용 추출물에 닌히드린 시액 3방울을 넣고 흔들어 섞어 5분간 끓이면 남자색을 나타내며, 또한 10% 수산화나트륨 용액 2방울을 넣고 흔들어 섞은 다음 0.5% 황산동용액을 떨어뜨리면 남자색을 나타내는 원리를 이용하여, 각 녹용 시료들을 추출한 추출물을 두 그룹으로 나누어 한 그룹은 닌히드린 시액 3방울을 넣고 흔들어 섞어 5분간 끓였고, 또 나머지 한 그룹에서는 10% 수산화나트륨 용액 2방울을 넣고 흔들어 섞은 다음 0.5% 황산동 용액을 떨어뜨려 색 변화를 관찰하였다.
그 결과, 도 2의 a(닌히드린 시액 첨가) 및 b(황산동 용액 첨가)에 나타난 바와 같이, A 내지 D(A: NY02ON190225; B: NY02MG190223; C: NY02MG190304; D: NY02MG190307)의 모든 시료가 두 실험 모두에서 남자색을 띠는 것을 확인하였다.
(3) 순도 시험
상기에서 준비한 네 시료를 대상으로, 먼저 순록의 뿔인지 아닌지를 확인하였다. 즉, 유전자 분석을 수행하여, DNA 사이즈 마커의 200 bp에서 밴드가 나타나면 순록이 아니고, 200 bp 및 386 bp 에서 밴드가 모두 나타나는 경우 순록으로 확인한다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 뉴질랜드산 1, 뉴질랜드산 2 및 중국산의 경우 순록이 아닌 것으로 확인되었으나, 러시아산은 순록 마커인 386 bp에서 밴드가 확인되어 순록인 것으로 판명되었다.
다음으로, 녹용의 진품여부를 확인하기 위하여, 상기에서 수행한 방법과 동일하게 유전자 분석을 수행한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 뉴질랜드산 1 및 뉴질랜드산 2의 경우 마록의 마커 밴드와 동일하게 805 bp에서 밴드가 나타나 마록으로 확인되었고, 중국산 및 러시아산은 마록으로 볼 수 없었다. 이에, 하기 실험에서는 진품 녹용인 뉴질랜드산 1 녹용 절편을 사용하였다.
< 실시예 2> 조제공정의 표준화
(1) 추출방법 별 비교
녹용 약침은 녹용을 주원료로 하여 이를 학회, 원외탕전, 한방병원 등에서 다양한 공정을 통해 조제되고 있다. 이에, 본 발명에서는 도 5에 나타난 바와 같이, 에탄올 추출법(Method A), 전탕 후 에탄올 추출법(Method B), 교반법(Method C), 전탕 후 증류법(Method D)에 따른 추출물을 조제하고, 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography; HPLC)를 통한 함유물질 분석, 조제공정상 수득률 및 경제성을 검토하여 최종적으로 표준화가 가능한 조제공정을 개발하고자 하였다.
에탄올 추출법(Method A)은 90%에서 80% 에탄올을 순차적으로 이용하여 추출하는 방법으로서, 콜라겐이 완전히 제거되지 않아 여과과정이 복잡하고 어렵다는 단점이 있으며, 동결 건조 후 분말에 약간의 아교 성분이 남아있다. 전탕 후 에탄올 추출법(Method B)은 3시간 동안 전탕한 후 7배수의 에탄올을 첨가하여 90% 에탄올부터 70% 에탄올까지 순차적으로 추출하는 방법으로서, 전 과정을 교반하므로 불순물이 충분히 제거되어 여과가 용이하고, 콜라겐이 완벽하게 제거되어 순도가 높다는 장점이 있으나, 조제공정이 복잡하고 시간이 많이 소요되는 단점이 있다. 물 교반 추출법(Method C)은 녹용 절편의 20배의 3차 증류수 첨가 후 실온에서 교반, 원심분리하여 상등액을 동결건조한 후 약침을 조제하는 방법으로, 조제공정 자체는 간단하지만 녹용의 유효성분이 충분히 용출되지 않는다는 단점이 있다. 증류 추출법(Method D)은 녹용 절편을 60분간 불린 후 2시간 동안 전탕하여 다시 증류를 추출하는 방법에 관한 것으로, 조제공정은 간단하지만 물에 녹는 성분 외의 다른 물질이 충분히 용출되지 않는 단점이 있다.
이에, 상기 네 가지 추출법에 따라 녹용 절편을 추출하고, 각 추출물을 HPLC를 통해 분석한 결과가, 도 6에 나타난 바와 같았다.
또한, 원료 대비 최종 수득물의 수득률을 계산한 결과, Method A로 추출한 추출물의 수득률은 3.2%, Method B로 추출한 추출물의 수득률은 3.3% 내지 4.2%, Method C로 추출한 추출물의 수득률은 9.5%였고 Method D로 수득한 추출물의 수득률은 확인이 어려웠다.
상기 결과를 바탕으로, 전탕을 통해 수용성 물질을 충분히 추출하고, 에탄올 용매로부터 방향성 물질이나 중성지질 또는 아미노산을 포함한 단백성분이 충분히 용출될 것으로 예상되는 Method B를 선정하여, 보다 구체적인 조제공정을 확립하였다.
(2) 최적화 추출 공정 확립
먼저, 조제공정을 확립하기 위해 각각의 단계별 이물질 분리도를 확인하였다. 즉, 3시간 동안 전탕한 후, 순차적으로 90, 80, 70, 60, 50% 에탄올까지 각 단계별 순도를 상기에서 수행한 방법과 같이 HPLC를 통해 확인하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 단계별 순도의 차이가 없는 것을 확인하였는 바, 기존 90, 80, 70% 에탄올을 이용해 순차적으로 분리하던 방법을 90% 에탄올 다음 바로 70% 에탄올로 추출하는 것으로 공정순서를 간결화하였다.
다음으로, 상기 간결화한 공정으로 녹용을 추출하더라도 녹용의 유효성분이 충분히 추출될 수 있는지 확인하기 위하여, 90% 에탄올 추출 및 70% 에탄올 추출로 변경된 방법으로 녹용을 추출하여 시제품을 조제하였고, 동덕 제약에서 시판하는 녹용 추출물을 동일 농도로 점적하여 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography; TLC)로 비교분석하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 시제품은 동덕 제약의 시판제품과 유사한 패턴을 나타내었으며, 또한 시제품에서 유효성분의 함량이 더 높은 것을 확인할 수 있었다.
(3) 바이러스 클리어런스에 따른 최종 조제 공정 확립
동물 유래 원료를 함유하는 의약품(주사제에 한함)의 품목 허가 또는 원료 의약품의 등록(DMF) 신청 시에는 동물 유래 원료에 대하여 조제방법을 기재하고 바이러스 클리어런스를 입증하는 자료를 제출해야 한다. 여기서 바이러스 클리어런스(Virus clearance)란 바이러스의 제거(removal) 및 불활화(inactivation)를 의미하며, 바이러스 제거는 동물 유래 원료에 존재할 수 있는 바이러스 입자의 물리적 제거를, 바이러스 불활화는 화학적 또는 물리적 처리에 의한 바이러스의 감염력을 감소시키는 단계를 의미한다.
따라서, 상기 기준 및 상기에서 실험하여 얻은 결과를 바탕으로, 도 9에 나타난 바와 같은 조제공정을 확립하고 이에 따라 녹용 추출물 시제품을 조제하였다. 즉, 전탕 과정을 열수 추출로 진행하였는데, 먼저 뉴질랜드산 1 녹용 절편을 칭량하고, 칭량한 녹용 절편의 7배 부피만큼의 정제수(녹용 절편 100 g 당 정제수 700 mL)에 상기 녹용 절편을 침지하고 105℃에서 3시간 동안 가열하여 추출하여 1차로 바이러스를 불활화(inactivation)시켰다. 그리고 이렇게 준비된 추출물을 감압농축한 후, 90% 에탄올 수용액상에 넣고 3시간동안 교반하며 2차로 바이러스를 불활화시킨 90% 에탄올 추출물을 얻었다. 이후 섬유질을 거르기 위하여 여과 과정을 거친 후에, 70% 에탄올 수용액상에 상기 여과를 거친 추출물을 넣어 1시간 동안 교반하며 3차로 바이러스를 불활화시킨 70% 에탄올 추출물을 얻었고 이를 감압농축하였다. 이후 약침의 흡수 증대를 위해 3차 증류수를 이용하여 희석하였고, 24시간 저온 침강시킨 후에, 4차 바이러스 불활화를 위해, 각각 0.45 ㎛ 및 0.2 ㎛의 평균입경을 가진 공극을 포함하는 여과필터에 여과시켜 총 2번의 극 미세여과를 수행함으로써 최종적으로 총 4번의 바이러스 불활화 처리 및 총 2번의 교반을 통한 콜라겐 제거 과정을 거치도록 하였다. 마지막으로 상기 여과된 최종 추출물을 동결건조한 후 분말화하였고, 이 분말을 무균실에서 2 mg/mL의 농도로 주사제 용수로 희석 및 충전하여, 도 10에 나타난 바와 같은 녹용 약침 시제품을 얻었다.
<실시예 3> 녹용 약침 조성물 시제품의 품질 분석
녹용의 대표적인 물질로는 중성지질, 인지질, 강글리오사이드(ganglioside), 각종 아미노산 등이 있다. 이에, 상기 실시예 2에서 확립한 조제공정을 통해 조제된 녹용 약침의 함량 기준을 설정하였다. 각 실험에서 상기 실시예 2에서 조제한 시제품인 녹용 약침 조성물과 대조군으로 원료 녹용을 비교 분석하였다.
(1) HPLC 분석
상기 녹용 약침 시제품을 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 HPLC 분석을 위한 검액으로 사용하였다. 먼저 Waters ALLIANCE HPLC를 이용하였고, 칼럼의 규격은 YMC C18(5㎛, 4.6 X 150 mm)였으며, 유량 1.0 mL/min, 시료 주입량은 10 ㎕였다. 검출 파장은 UV 240 nm였으며, 이동상 조건은 하기 표 1에 나타난 바와 같았다.
시간 (분) 용매 A (%) 용매 B (%)
0 90 10
60 0 90
(용매 A : 0.1% 포름산 수용액(0.1% formic acid in H2O), 용매 B : 아세토니트릴(Acetonitrile))
그 결과, 본 발명에서 조제한 녹용 약침 조성물의 크로마토그램이 도 11에 나타난 바와 같았다. 즉, [1]이 Peak A, [2]가 Peak B, [3]이 Peak C였다.
이러한 결과의 재현성을 확인하기 위하여, 총 3개의 로트(Lot)를 검체로 하여, 각 로트 당 세 개의 유리병(vials)에서 시료를 취하여 3번 반복함으로써 총 27개의 실험 결과를 얻었고, 그 결과들을 표 2 및 도 12에 나타내었다.
Peak Peak area
Ave S.D. RSD(%)
Peak A [1] 304132.93 5476.81 1.80
Peak B [2] 946008.26 4753.22 0.50
Peak C [3] 621231.74 11653.12 1.88
즉, 각 피크(peak)의 상대표준편차(RDS(%))는 0.5 내지 1.88%로 확인되어, peak A 내지 C 모두 대체적으로 안정한 결과를 보였다. 따라서, 상기 peak A 내지 C가 조제된 녹용 약침의 주요 피크가 될 수 있을 것으로 판단된다.
(2) 강글리오사이드(Ganglioside) 존재 확인
녹용의 대표적인 유효성분인 강글리오사이드는 전체 녹용 중 6% 정도가 함유되어 있다. 이에, TLC를 통해 강글리오사이드 표준 시약과 비교하여 상기 녹용 약침 시제품의 강글리오사이드 성분 유무를 확인하였다. 구체적으로, 전개 용매로서 클로로포름:메탄올:2.5N Na4OH(64:24:4)를 사용하였고, UV 및 발색을 위한 황산 시약을 처리하여 강글리오사이드 스팟의 존재 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 강글리오사이드 표준 시약과 비교한 결과, Rf 0.25에서 표준 시약과 동일한 물질이 있는 것을 확인할 수 있었다.
(3) 콘트로이친황산(Chondroitine sulfate) 함량 확인
콘드로이친황산은 녹용에 고농도로 함유된 성분으로 강력한 항염증작용, 연골조직 재생, 관절염 증상 완화 등의 효과를 나타낸다. 먼저 콘드로이친의 기본 단위인 D-글루코론산을 카바졸과 반응시켜 붉은 화합물로 합성한 후 530 nm에서 흡광도를 확인하였다.
먼저, 카바졸 시액은 카바졸(Carbazol, C12H9N, 1급) 0.125 g에 무수에탄올 100 mL를 가해 용해한 후 냉암소에 보관하였다. 또한, 붕산나트륨황산 시액은 붕산나트륨(Sodium Borate) 1 g에 정밀분석용 황산을 가해 200 mL로 만들어 조제하였다. 또 표준용액을 조제하기 위하여, δ-글루쿠로노락톤 0.04 g을 정밀히 취한 후, 100 mL 부피플라스크에 넣고 증류수를 표선까지 채웠다. 이후 이 액 1mL를 정확히 취하여 20 mL 부피플라스크에 넣었고, 다시 증류수를 20 ㎍/mL가 되도록 표선까지 채웠다.
두 개의 비색관에 붕산나트륨황산 시액을 5 mL씩 정밀히 달아 취하고 위의 비색관을 얼음물로 충분히 냉각하였다. 이후, 상기에서 조제한 녹용 약침 조성물과 표준용액을 1 mL씩 취하여 상기 비색관에 주의하여 가한 후, 냉각하면서 혼합하여 시험용액을 조제하였다. 이후 100℃의 수욕 상에서 10분간 가열한 후 즉시 얼음물로 냉각시켰다. 다시 각 시험용액에 카바졸 시액을 0.2 mL 정확히 가하여 혼합하였고 수욕상에서 15분간 가열한 후 얼음물로 실온까지 냉각시켰다. 증류수 1 mL를 사용하여 상기와 동일하게 조작한 것을 대조군으로 설정하였고, 총 세 가지 시험 용액의 흡광도를 530 nm 파장에서 측정하였다.
이때, 콘드로이친황산의 함량 및 글루쿠론산(mg/g)의 함량은 하기 식 1에 개시된 바와 같이 계산하였다.
<식 1>
1. 콘드로이친황산 함량 = 글루쿠론산 Ｘ 2.593
2. 글루쿠론산(mg/g)
= 검액(녹용 약침 조성물)의 흡광도/표준물질의 흡광도 Ｘ 표준물질(mg)/시료 채취량(g) Ｘ 1/4 Ｘ 1.1023
(*2.593 : 콘드로이친황산 분자량 / 글루쿠론산 분자량
*1.1023 : 글루쿠론산 분자량 / δ-글루쿠로노락톤의 분자량)
그 결과, 하기 표 3 및 도 14에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 조제한 녹용약침 조성물에서 7.51 mg/g의 콘드로이친황산이 포함되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
평균
(3번 반복)		 글루쿠론산 (mg/g) 콘드로이친 황산 (mg/g)
STD
(δ-글루쿠로노락톤 함량)		 0.26
시제품 0.27 2.90 7.51
(4) 아미노산 분석
녹용에 존재하는 20여 종의 아미노산 중 류신(leucine)과 알라닌(alanine)을 대표적 아미노산으로 선정하여 LC/MS(liquid chromatography/mass spectrometry)를 이용해 함량을 확인하였다.
구체적으로, 도 15에 나타난 바와 같이, 알라닌과 류신을 스탠다드로 설정하여 함량을 분석하였다. 또한, LC/MS를 통해 동덕제약에서 시판 중인 녹용 및 상기에서 조제한 녹용 약침 조성물의 류신 및 알라닌의 함량을 측정하였다.
mg/g 알라닌 류신
녹용 약침 조성물 17.90 15.81
그 결과, 상기 표 4 및 도 16에 나타난 바와 같이, 알라닌과 류신의 함량이 각각 17.2 및 15.81 mg/g으로, 시판 녹용 중에 들어있는 알라닌(4.52 mg/g) 및 류신(3.61 mg/g)보다 4-5배 더 많이 포함되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 아미노산 분석기를 이용하여 녹용 약침의 성분을 분석한 결과, 하기 표 5 및 도 17에 나타난 바와 같이. 전반적으로 본 발명에 따른 녹용 약침 조성물에서 구성 아미노산 함량이 높은 것을 알 수 있었다.
　 Asp Thr Ser Glu Gly Ala
시판제품(대조군) 0.15 0.14 0.23 0.52 0.64 0.68
녹용약침 조성물 0.21 0.19 0.27 0.60 0.72 0.72
　 Cys Val Met Ile Leu Tyr
시판제품(대조군) 0.01 0.21 0.02 0.08 0.25 0.25
녹용약침 조성물 0.01 0.26 0.05 0.13 0.31 0.09
　 Phe Lys NH3 His Arg Pro
시판제품(대조군) 0.17 0.14 1.20 0.04 0.04 0.23
녹용약침 조성물 0.13 0.14 0.76 0.06 0.02 0.33
상기와 같은 결과를 고려하면, 본 발명에 따른 조제공정으로 조제한 녹용 약침의 품질이 우수하며, 추후 이러한 함량들을 기준으로 하여 품질 관리 기준을 마련할 수 있을 것으로 판단된다.
<실시예 4> 녹용약침 시제품의 안전성 평가
상기 실시예 2에서 조제한 녹용 약침의 안전성을 평가하기 위하여, 무균시험, 엔도톡신 및 중금속(총 중금속, 납, 비소) 시험을 수행하였다. 구체적으로, 무균시험 시에는 액상티오글리콜산배지 및 대두카제인소화배지를 사용한 직접법을 이용하였고, 엔도톡신 시험 시에는 Pierce　LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit를 사용하였으며(이때, Determination coefficient (R2) ≥ 0.9932임), 중금속 시험 시에는 총 중금속, 납 및 비소의 함량을 확인하였다. 이때 검사할 용액 및 비교액을 비교하여, 검액이 나타내는 색이 비교액이 나타내는 색보다 진하지 않는 경우에 적합하다는 판정을 내렸다.
그 결과, 하기 표 6 및 도 18 및 19에 개시된 바와 같이, 무균 시험 및 엔도톡신 시험에서는 로트 1, 2, 3 모두 세균과 엔도톡신이 검출되지 않아 적합하였고, 또한 중금속의 경우에도 비교액보다 적었고, 납과 비소의 양이 0으로 나타나 식용으로 사용할 수 있을 만큼 안전한 것을 확인하였다.
총 중금속(기준 30 ppm 이하) 비교액 이하
납(기준 5 ppm 이하) 0
비소(기준 3 ppm 이하) 0
<실시예 5> 녹용 약침의 면역 증강 효과 확인
(1) 면역억제유도 동물 모델 조제
일반적으로 동물모델에서 면역을 억제하는 방법으로는 스트레스, 면역 억제제 투여 및 유전자 조작 등이 있다. 이중 스트레스를 이용한 면역 억제는 트레드밀, 전동쳇바퀴 등을 이용한 강제 운동방법, 강제 부유법, 완전수면 박탈법, 렘수면 박탈법 등을 이용하여 과도한 스트레스를 부여함으로써 면역을 저하시키는 방법이다.
이 중 수면 박탈에 대한 첫 실험은 러시아의 과학자인 Maria Michailovna Manaseina(1843-1903)에 의해 처음 실시되었고, 강아지를 이용한 실험에서 수면 박탈이 건강에 치명적이라는 것을 확인하였다. 최근의 동물연구는 각성을 유지하는 방법에서 많은 발전이 있어왔는데, 쥐의 두개 내에 EEG, EMG 전극을 각각 심어놓고 물위에 흠이 파인 디스크판을 이용한 각성 기구를 고안하여 수면 박탈에 대한 영향을 기록하거나, 트레드밀을 이용해 강제 운동을 통한 각성, 수조의 부표를 띄워 정상수면을 억제하는 방법 등이 개발되었다.
생리적인 영향에 대한 일련의 연구결과에서는 모든 수면 박탈 쥐들은 결국 사망하였고, 수면박탈을 하는 동안 외모가 점차 쇠약해졌고 털이 부스스해지며, 음식의 섭취가 증가하였으나 체중은 지속적으로 감소하였다. 이후 Everson 등은 수면박탈 쥐의 혈액에 세균이 있음을 보고하면서, 수면박탈 쥐의 혈액에서 세균이 발견되는 원인은 수면박탈로 인한 면역능력이 저하된 결과라고 해석하였다. 즉, 수면박탈 동안 발생하는 저체온, 스트레스, 에너지 소모, 면역 기능 저하, 영양 결핍 등이 종합적으로 수면박탈에 의한 사망에 관여한다고 보고하였다.
본 발명에서는 위와 같은 기존의 연구 결과를 근거로 하여, 수면억제를 통하여 실험 동물의 면역을 억제한 후, 녹용약침을 중완혈(中脘穴)에 투여하여 면역기능의 증진효과를 확인하고자 하였다. 중완혈은 명치와 배꼽의 중간부위에 있는 혈 자리로, 기를 조절하고 면역기능을 강화하는 것으로 알려져 있다.
구체적으로, 렘 수면 박탈법을 7주령 SD 랫트에 적용하였고, 이를 위해 랫트 케이지에 높이 3 cm의 부표를 5개 설치한 후, 그 위에 그물망의 크기가 가로 x 세로 1 cm2 인 철망을 올린 후 그 아래에 물을 채워 철망이 살짝 잠기도록 하였다.
(2) 녹용 약침 투여
상기에서 렘 수면 박탈법을 적용한 랫트의 명치와 배꼽사이 정중앙에 있는 중완혈에 녹용약침을 1일 200 cc만큼 5일간 투여하였다. 렘 수면 박탈은 투여 기간 내내 진행하였으며, 녹용 약침 투여와 함께 체중과 사료 섭취량을 측정하고 외형변화를 관찰하였다. 또 5일간의 투여 후 희생하여 비장과 간의 무게를 측정하였고, 혈장 내의 사이토카인 분비량을 확인하였다.
(3) 실험 결과
실험 결과, 도 20 내지 22에 개시된 바와 같이, 정상 수면군과 수면 박탈군, 녹용 약침 투여군 총 3개의 군을 비교하였을 때 수면박탈이 진행되는 동안 전체적인 체중이 감소하는 반면 사료섭취량이 증가하였으나 녹용약침 투여군에서는 체중감소가 완화되는 효과가 있었으며 사료의 섭취량도 크게 증가하지 않았다. 녹용 약침을 투여한 경우, 털의 윤기나 털 빠짐 등이 적었고, 수면박탈군에 비해서 활동성도 양호하였다. 하기 표 7 및 도 23에 나타난 바와 같이, 각 군의 비장 무게를 비교하였을 때는 녹용약침 투여군이 수면박탈군에 비하여 비장무게의 감소가 완화된 것을 확인할 수 있었다.
비장/체중 (%)
정상수면 100.0 ± 10.31
수면박탈 75.9 ± 2.91
수면박탈+녹용약침 82.9 ± 1.64
또한, 도 24 및 25, 표 8 및 9에 개시된 바와 같이, 녹용약침 투여군에서는 혈장의 사이토카인 분비를 확인하였을 때는 면역증진과 관련된 사이토카인인 IL-2와 IFN-γ의 분비가 정상수면군과 비슷한 수준을 유지함을 확인할 수 있었다.
IL-2 분비량 (pg/mL)
정상수면 384.4 ± 36.31
수면박탈 329.0 ± 4.35
수면박탈+녹용약침 379.3 ± 4.43
IFN-γ 분비량 (pg/mL)
정상수면 49.1 ± 5.59
수면박탈 42.1 ± 5.77
수면박탈+녹용약침 59.7 ± 5.23
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (10)

1) 녹용(Cervi Parvum Cornu) 절편을 105℃의 열을 가하여 열수 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 얻은 1차 추출물을 90% 에탄올 수용액으로 2차 추출하는 단계;
3) 상기 단계 2)에서 얻은 2차 추출물을 70% 에탄올 수용액으로 3차 추출하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)에서 얻은 3차 추출물을 극 미세여과하여 녹용 약침용 조성물을 수득하는 단계;
를 포함하며, 상기 단계 2) 내지 4)에서 1차 내지 3차 추출물 또는 녹용 약침용 조성물은 바이러스가 불활화(inactivation)된 추출물 또는 조성물이고, 상기 녹용 약침용 조성물은 면역 증진 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 녹용 약침용 조성물 조제방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 1)에서 녹용 절편은, 녹용 절편의 7배 부피만큼의 정제수에 침지되는 것을 특징으로 하는 녹용 약침용 조성물 조제방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 극 미세여과는 3차 추출물을 공극의 평균 직경이 0.45 ㎛ 및 0.2 ㎛인 여과필터에 순차적으로 통과시킴으로써 두 번 수행되는 것을 특징으로 하는 녹용 약침용 조성물 조제방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 녹용 약침용 조성물은 콘드로이친황산(chondroitine sulfate)를 7.51 mg/g 함유하는 것을 특징으로 하는 녹용 약침용 조성물 조제방법.
제 1 항에 있어서, 상기 녹용 약침용 조성물은 알라닌을 17.90 mg/g, 및 류신을 15.81 mg/g 함유하는 것을 특징으로 하는 녹용 약침용 조성물 조제방법.
삭제
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