ES2693495T3

ES2693495T3 - Producto de indigo natural extraído con aceite y proceso de preparación y uso del mismo

Info

Publication number: ES2693495T3
Application number: ES15176576.5T
Authority: ES
Inventors: Yin-Ku Lin
Original assignee: Galderma SA
Current assignee: Galderma SA
Priority date: 2011-02-18
Filing date: 2011-10-21
Publication date: 2018-12-12
Anticipated expiration: 2031-10-21
Also published as: CY1116812T1; HUE025849T2; EP2489358B1; US20120213868A1; PT2974732T; EP2974732A1; EP2489358A1; HRP20181668T1; PL2974732T3; SMT201500294B; RS57924B1; PT2489358E; LT2974732T; CN102641313A; PL2489358T3; HUE040472T2; TWI438000B; ES2552062T3; CY1121164T1; TW201235047A

Abstract

Un producto de indigo natural extraído con aceite que es obtenible por un proceso que comprende extraer polvo de índigo natural con aceite de oliva con calentamiento a una temperatura que oscila entre 100 ºC y 155 ºC, y a una relación de índigo natural con respecto a aceite de oliva en un intervalo de 1:10 (p/v) a 1:40 (p/v); seguido de un tratamiento de refinado por filtración.

Description

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DESCRIPCION

Producto de indigo natural extraldo con aceite y proceso de preparacion y uso del mismo

La presente invencion se refiere a un producto de indigo natural extraldo con aceite y a un proceso para preparar el mismo. La presente invencion tambien se refiere a una composicion farmaceutica que comprende dicho producto extraldo con aceite.

La psoriasis es una enfermedad de la piel inflamatoria cronica que puede aparecer sobre la piel en cualquier area del cuerpo, en particular la cabeza, extremidades, codos, rodillas, etc. Frecuentemente se observan papulas rojas o placas que tienen bordes claros sobre las pieles de pacientes con psoriasis, y las superficies de las lesiones de la piel de los pacientes pueden cubrirse por escamas plateadas-blancas. Algunos pacientes con psoriasis pueden incluso desarrollar artritis u otros slntomas al mismo tiempo.

Segun los slntomas de la piel, la psoriasis se clasifica cllnicamente en los cuatro tipos siguientes: psoriasis en placas cronica, psoriasis en gotas, psoriasis eritrodermica y psoriasis pustular. La psoriasis en placas cronica, tambien conocida como psoriasis vulgar, es la mas comunmente observada de entre todos los tipos de psoriasis, y aproximadamente el 80 %-90 % de los pacientes con psoriasis pertenecen a este tipo. La psoriasis en gotas se

caracteriza por numerosas lesiones rosas pequenas o en forma de lagrima rojas sobre la piel de los pacientes y

normalmente se produce en ninos de la edad 7 a la edad 10, en los que se encuentra que la mayorla de los

pacientes ha sufrido una infeccion estreptococica una o dos semanas antes de la aparicion de la enfermedad. La

psoriasis eritrodermica se caracteriza por la aparicion de eritema o exfoliacion sobre toda la superficie del cuerpo o mas del 90 % de la superficie del cuerpo, y bajo afecciones mas graves, la aparicion de picor sobre todo el cuerpo, que puede ir adicionalmente acompanado de fiebre y malestar. Ademas, la psoriasis pustular aguda generalizada puede incluso inducirse en pacientes con psoriasis eritrodermica. La psoriasis pustular puede clasificarse adicionalmente en psoriasis pustular generalizada y psoriasis pustular localizada (por ejemplo, pustulosis palmoplantar y acrodermatitis persistente). Ademas, aproximadamente el 10 % de los pacientes con psoriasis tienen un complicacion de artritis psoriasica, que es un trastorno inflamatorio autoinmunitario conducido por linfocitos T CD8 que afecta a ligamentos, tendones, fascia y articulaciones espinales o perifericas, mientras que hasta el 90 % de los pacientes ha sufrido psoriasis ungueal.

Debido a las complicadas afecciones patologicas y slntomas implicados en ella, la patogenesis de la psoriasis tiene que ser todavla bien estudiada hasta la fecha. Algunos estudios han revelado que la herencia desempena una funcion importante en la patogenesis de la psoriasis, y el traumatismo, infeccion, estres, factores endocrinos, factores de metabolismo, tiempo y medicacion pueden inducir o agravar la psoriasis. Despues de la aparicion de la psoriasis, esta enfermedad puede volver a aparecer repetidamente durante la vida de los pacientes y no es posible erradicacion de la misma.

Los tratamientos convencionales para la psoriasis se disenan generalmente segun edad, sexo, ocupacion y capacidad cognitiva del paciente, los tipos y distribucion de lesiones, respuesta(s) del paciente a metodo(s) terapeutico(s) previo(s), y otras historias medicas del paciente. Los metodos terapeuticos primarios para la psoriasis incluyen terapia topica, terapia sistemica, inyeccion de productos biologicos y fototerapia. Las composiciones para la terapia topica incluyen, por ejemplo, corticosteroides, antralina (disponible como Margiton®), alquitran de hulla (disponible como Polytar®), calcitriol (disponible como Silkis®), tazaroteno (disponible como Tazorac®), acido salicllico, etc., y estas composiciones son adecuadas para tratar pacientes con psoriasis con slntomas leves. Las preparaciones orales de metotrexato (MTX), ciclosporina, retinoides, etc., se usan comunmente para la terapia sistemica y son adecuadas para tratar pacientes con psoriasis con slntomas de medios a graves. Los productos biologicos incluyen alefacept (disponible como Amevive®), efalizumab (disponible como Raptiva®), etanercept (disponible como Enbrel®) y adalimumab (disponible como Humira®), y son aptos para inyectar en pacientes con psoriasis con slntomas de medios a graves. La fototerapia, por ejemplo, fototerapia ultravioleta B (UVB), fotoquimioterapia tal como psoraleno mas ultravioleta A (PUVA), etc., es adecuada para tratar pacientes con psoriasis con slntomas graves.

Sin embargo, el uso a largo plazo de los tratamientos convencionales descritos anteriormente puede producir graves efectos secundarios o tolerancia a farmacos, reduciendo as! adicionalmente el cumplimiento del paciente. En vista de lo anterior, muchos investigadores han intentado explorar, a partir de las medicinas tradicionales chinas (MTC), componentes activos que puedan usarse para tratar la psoriasis.

El Indigo natural (tambien denominado Indigo natural; chino: Quing dai) es un pigmento vegetal azul oscuro extraldo de las hojas de una planta productora de Indigo, tal como Baphicacanthus cusia (Nees) Bremek., Polygonum tinctorium Lour., Isatis indigotica Fort., etc. El Indigo natural se conoce en MTC por tener efecto de eliminacion del calor y refrigerante de la sangre, y se ha usado cllnicamente para tratar leucemia mieloide cronica, psoriasis, paperas, diversas ulceras (por ejemplo, ulceras pepticas, ulceras bucales, etc.), hepatitis, herpes zoster y otitis externa.

Se sabe que diversos componentes activos pueden aislarse del Indigo natural preparado a partir de diferentes

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plantas productoras de Indigo, entre los que los componentes activos mas comunes son Indigo, indirrubina, isoindigo, etc. Se ha informado que la indirrubina tiene efectos antitumorales, antiinflamatorios e inmunomoduladores y ha sido considerada por tener potencial en el tratamiento de leucemia mielocitica cronica (G. Eisenbrand et al. (2000), J. Cancer Res. Clin. Oncol., 130:627-635; T. Kunikata et al. (2000), European Journal of Pharmacology, 410:93-100; N.K. Mak et al. (2004), Biochemical Pharmacology, 67:167-174; S. Leclerc et al. (2001), The Journal of Biological Chemistry, 276:251-260).

Se ha informado que el indigo natural tiene mala solubilidad en agua y, por tanto, no pocos investigadores han pretendido extraer los componentes activos contenidos en el usando disolventes organicos. Q.S. Zhang et al., usaron cuatro disolventes organicos diferentes, es decir, 75 % de etanol, cloroformo, acetato de etilo y acetona para extraer indigo natural con/sin un tratamiento preliminar con 36 % de HCl, y se determinaron y compararon los contenidos de indirrubina de los productos asi obtenidos. Los resultados experimentales obtenidos revelan que, independientemente de ser sometidos al tratamiento preliminar con 36 % de HCl(ac) o no, el producto extraido con acetato de etilo tiene un mayor contenido de indirrubina, seguido del producto extraido con acetona, el producto extraido con cloroformo y el producto extraido con 75 % de etanol. Ademas, el tratamiento preliminar con 36 % de HCl(ac) aumenta significativamente el contenido de indirrubina en cada producto extraido con disolvente organico (Q.S. Zhang et al. (2006), Journal Guangxi Normal University: Natural Science Edition, 24(3):58-60).

En estudios previos, los solicitantes desarrollaron una pomada de material compuesto de indigo natural formulada por 20 % (en peso) de polvo de indigo natural y 80 % de vehiculo (que contiene 25 % de vaselina, 30 % de cera amarilla y 45 % de aceite de oliva), e investigaron el uso de dicha pomada como tratamiento topico para la psoriasis. Los solicitantes encontraron que la administracion topica de dicha pomada fue eficaz en el tratamiento de psoriasis pediatrica, psoriasis recalcitrante y psoriasis en placas (Y. K. Lin et al. (2006a), Pediatric Dermatology, 23(5):507- 510; Y. K. Lin et al. (2006b), Clinical and Experimental Dermatology, 99-100; y Y K. Lin et al. (2007), Dermatology, 214:155-161).

En un estudio posterior, los solicitantes usaron una pomada de indigo natural formulada por polvo de indigo natural y el vehiculo descrito anteriormente a una relacion de 1:10 (en peso) para tratar pacientes ambulatorios con psoriasis en placas cronica y encontraron que la administracion topica de dicha pomada produjo reducciones significativas en las puntuaciones de descamacion, eritema e induracion, ademas del porcentaje de areas de placas (Y K. Lin et al. (2008), Arch Dermatology, 144(11):1457-1464).

Los solicitantes tambien investigaron el efecto antipsoriasico del indigo natural sobre la proliferacion y diferenciacion de queratinocitos, en los que una muestra de indigo natural, obtenida disolviendo polvo de indigo natural en sulfoxido de dimetilo (DMSO) en una proporcion de 1:10 (peso/volumen), seguido de esterilizacion por filtracion (tamano de poro 0,2 pm), y los dos principales componentes del indigo natural es decir, el azul de indigo (adquirido en Fluka, Bucks, Suiza) y la indirrubina (adquirida en Alexis, Lausen, Suiza), ambos disueltos en DMSO antes de la dilucion en medio de cultivo, se probaron en los bioensayos. Los resultados obtenidos revelan que los efectos antipsoriasicos del indigo natural estan mediados, al menos en parte, modulando la proliferacion y diferenciacion de los queratinocitos, siendo la indirrubina el principal componente activo (Y K. Lin et al. (2009a), Journal of Dermatological Science, 54:168-174).

Los solicitantes investigaron adicionalmente los efectos antiinflamatorios de dicha muestra de indigo natural y de azul de indigo e indirrubina, ademas de la triptatrina, en neutrofilos humanos, y encontraron que solo dicha muestra de indigo natural inhibia las respuestas proinflamatorias de neutrofilos humanos, incluyendo la explosion respiratoria y la desgranulacion, que estuvieron mediadas por el bloqueo de las vias de senalizacion de MAPK y Ca2+. Los resultados obtenidos confirman el concepto de desarrollar un extracto herbal completo de indigo natural, en vez del (de los) principal(es) componente(s) contenido(s) en el, para tratar la inflamacion neutrofila (Y K. Lin et al. (2009b), Journal of Ethnopharmacology, 125:51-58).

Aunque se han usado disolventes organicos para extraer indigo natural, los productos obtenidos de esta manera, pueden contener cantidades traza de dichos disolventes organicos que pueden producir efectos adversos en el organismo humano. La pomada de indigo natural que han desarrollado previamente los solicitantes, tiene los inconvenientes de olor desagradable y color azul oscuro que puede dejar manchas sobre las unas, la piel y la ropa, afectando asi en el cumplimiento del tratamiento por parte del paciente.

Por tanto, los solicitantes desarrollaron una nueva formulacion en la que el polvo de indigo natural se refina mediante una extraccion con aceite de oliva, de manera que se eliminan el principal componente del indigo natural, es decir, el azul de indigo, ademas de impurezas, tales como cal. Esta nueva formulacion reduce la alteracion que causa el color azul de las unas, la piel y la ropa y proporciona menos irritacion de la piel, facilitando de esta manera el uso del tratamiento de la psoriasis.

Por tanto, segun un primer aspecto, la presente invencion proporciona un producto de indigo natural extraido con aceite que es obtenible por un proceso que comprende extraer el polvo de indigo natural con un aceite con calentamiento a una temperatura que oscila de 100 °C a 155 °C, seguido de un tratamiento de refinado por filtracion. En un segundo aspecto, en el presente documento se desvela un proceso para preparar un producto de indigo

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natural extraldo con aceite que comprende someter el polvo de Indigo natural a un tratamiento de extraccion usando un aceite con calentamiento.

Se ha demostrado que el producto de indigo natural extraldo con aceite es eficaz para aliviar o mejorar enfermedades psoriasicas humanas, en particular psoriasis de la piel y psoriasis ungueal. Por tanto, en un tercer aspecto, la presente invention proporciona una composition farmaceutica que comprende un producto de indigo natural extraldo con aceite como se ha descrito anteriormente.

Los objetivos, las caracterlsticas y las ventajas anteriores, y otros de la presente invencion, seran evidentes con referencia a la siguiente description detallada y a las realizaciones preferidas tomadas conjuntamente con los dibujos adjuntos, en los que:

la Figura 1 muestra las huellas cromatograficas de un extracto en bruto de Indigo natural (panel superior) y un extracto refinado de Indigo natural (panel central) como se prepara en el Ejemplo 2, mas adelante, ademas de la huella cromatografica de un producto extraldo con DMSO de Indigo natural (panel inferior) para la comparacion de las mismas;

la Figura 2 muestra las fotos de referencia estandar usadas para clasificar los grados de gravedad de la psoriasis basandose en escamas, eritema e induration;

la Figura 3 muestra los efectos terapeuticos de una pomada en bruto de Indigo natural (formulada con un producto extraldo con aceite de oliva en bruto como se prepara en el Ejemplo 2, mas adelante) y una pomada refinada de Indigo natural (formulada con un producto extraldo con aceite de oliva refinado como se prepara en el Ejemplo 2, mas adelante) en el tratamiento de lesiones psoriasicas durante un periodo de 8 semanas, en la que los paneles A, B y C muestran las puntuaciones de escamas, eritema e induracion como se calculan en diferentes momentos de tiempo (semana 0, 2, 4, 6 y 8), respectivamente, y el panel D muestra las sumas de estas tres puntuaciones como se calculan en diferentes momentos de tiempo (semana 0, 2, 4, 6 y 8); y todas las puntuaciones calculadas se expresan como media ± DE;

la Figura 4 es un grafico que muestra los cambios en las areas de lesion con el tiempo producidas por las pomadas en bruto y refinadas de Indigo natural como se preparan en el Ejemplo 2, mas adelante, en el que se representaron los valores en porcentaje promedio de las areas de lesion con respecto a las areas de lesion con respecto al valor del nivel inicial como se calcula en diferentes momentos de tiempo (semana 0, 2, 4, 6 y 8), y los datos se expresaron como media ± DE; y

la Figura 5 es un grafico que muestra la mejora del aspecto externo de las lesiones psoriasicas tratadas con las pomadas en bruto y refinadas de Indigo natural como se preparan en el Ejemplo 2, mas adelante, en el que se representaron el porcentaje de las mejoras de las lesiones tratadas con respecto al nivel inicial como se calcula en diferentes momentos de tiempo (semana 0, 2, 4, 6 y 8), y los datos se expresaron como media ± DE.

Debe entenderse que, si se hace referencia a cualquier publication de la tecnica anterior, dicha referencia no constituye una admision de que la publicacion forme parte del conocimiento general comun en la tecnica, en Taiwan o en cualquier otro pals.

Con el fin de esta memoria descriptiva, se entendera claramente que la palabra “que comprende” significa “que incluye pero, no se limita a”, y que las palabras “comprende,” “contiene” y variantes de las mismas, tienen un significado correspondiente.

A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientlficos usados en el presente documento tienen el significado comunmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece la presente invencion. Un experto en la tecnica reconocera muchos metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento, que podrlan usarse en la practica de esta invencion. De hecho, esta invencion no esta de ninguna manera limitada a los metodos y materiales descritos. Para mayor claridad, en el presente documento se usan las siguientes definiciones.

Como se usa en el presente documento, el termino “psoriasis” o “enfermedad psoriasica” se refiere a todos los tipos de psoriasis muy conocidos para aquellos expertos en la materia. El termino “psoriasis” incluye, pero no se limita a, psoriasis en placas cronica, psoriasis en gotas, psoriasis eritrodermica, psoriasis pustular, psoriasis inversa (tambien conocida como psoriasis flexural), psoriasis ungueal, artritis psoriasica, etc.

Con el fin de desarrollar un farmaco antipsoriasico que sea seguro para uso a largo plazo, los solicitantes han intentado extraer componentes activos de Indigo natural usando diferentes aceites vegetales y diversas condiciones de operation para la extraccion.

Por consiguiente, la presente invencion proporciona un producto de indigo natural extraldo con aceite y un proceso para preparar el mismo. El producto de indigo natural extraldo con aceite segun la presente invencion se obtiene extrayendo polvo de Indigo natural con un aceite con calentamiento, a una temperatura que oscila de 100 °C a 155 °C y a una relation de Indigo natural con respecto a aceite de oliva en un intervalo de 1:10 (p/v) a 1:40 (p/v); seguido de un tratamiento de refinado por filtration.

Segun los resultados del analisis de HPLC, el producto de indigo natural extraldo con aceite como se obtiene

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despues del tratamiento de extraccion con aceite demostro que contenla indirrubina e Indigo y presentaba un color azul-violeta. Cuando el tratamiento de refinado se realizo adicionalmente, se encontro que el producto de indigo natural extraldo con aceite as! obtenido tenia un contenido de Indigo reducido y presentaba un color rojo purpura.

En el presente documento se desvela que un aceite adecuado para su uso en la extraccion del polvo de indigo natural esta seleccionado del grupo que consiste en aceites vegetales, aceites animales, aceites minerales, y combinaciones de los mismos.

En una realization que se desvela, el aceite es un aceite vegetal seleccionado del grupo que consiste en aceite de oliva, aceite de semilla de algodon, aceite de sesamo, aceite de semilla de girasol, aceite de cacahuete, aceite de germen de trigo, aceite de soja, aceite de jojoba, aceite de onagra, aceite de coco, aceite de palma, aceite de almendra dulce, aceite de aloe, aceite de hueso de albaricoque, aceite de aguacate, aceite de borraja, aceite de semilla de canamo, aceite de nuez de macadamia, aceite de rosa mosqueta, aceite de pecana, aceite de avellana, aceite de sasanqua, aceite de salvado de arroz, manteca de karite, aceite de maiz, aceite de camelia, aceite de pepitas de uva, aceite de canola, aceite de ricino, y combinaciones de los mismos. En una realizacion mas especifica, el aceite es un aceite vegetal, seleccionado del grupo que consiste en aceite de oliva, aceite de semilla de algodon, aceite de sesamo, aceite de semilla de girasol, aceite de cacahuete, aceite de germen de trigo, aceite de soja y combinaciones de los mismos.

En la presente invention el aceite es aceite de oliva

Segun la presente invencion, la extraccion con aceite del polvo de indigo natural, se realiza a una relation de Indigo natural con respecto a aceite de oliva en un intervalo de 1:10 (peso/volumen) a 1:40 (peso/volumen). En una realizacion preferida de la presente invencion, la relacion de 1:10 se usa en la extraccion del polvo de Indigo natural por aceite de oliva.

Segun la presente invencion, la extraccion con aceite del polvo de indigo natural se realiza a una temperatura que oscila de 100 °C a 155 °C. En una realizacion preferida de la presente invencion, la extraccion con aceite del polvo de indigo natural se realiza a 145 °C.

Segun la presente invencion, cuando el proceso para preparar el producto de indigo natural extraldo con aceite comprende ademas un tratamiento de filtration para refinar el producto obtenido del tratamiento de extraccion, el tratamiento de filtracion puede realizarse por tecnicas muy conocidas para y comunmente usadas por aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, el tratamiento de filtracion puede realizarse usando estopilla, o papel de filtro o membrana de filtro que tiene un tamano de poro predeterminado. En una realizacion preferida de la presente invencion, el tratamiento de filtracion se realiza usando un papel de filtro que tiene un tamano de poro de aproximadamente 6 pm. Con este tratamiento de filtracion se obtiene un producto extraldo con aceite refinado de indigo natural, en el que se eliminaran ampliamente el indigo e impurezas tales como la cal.

Los productos extraldos con aceite de Indigo natural segun la presente invencion han demostrado tener potentes efectos terapeuticos sobre las lesiones psoriasicas en sujetos humanos, en particular lesiones psoriasicas de la piel y lesiones psoriasicas de las unas, mientras que no causan respuestas adversas a la piel a dichos sujetos humanos. Por tanto, se espera que los productos extraldos con aceite de indigo natural segun la presente invencion sean utiles en el tratamiento de psoriasis. Por consiguiente, la presente invencion proporciona una composition farmaceutica que comprende los productos extraldos con aceite anteriormente dichos de indigo natural

La composicion farmaceutica segun la presente invencion se formula en una forma de dosificacion adecuada para administration topica o por via oral usando tecnologla muy conocida para aquellos expertos en la materia, que incluye, pero no se limita a, polvo esteril, comprimidos, trociscos, plldoras, capsulas, preparaciones externas, supositorios y similares.

La composicion farmaceutica segun la presente invencion puede comprender adicionalmente un vehlculo farmaceuticamente aceptable tal como aquellos ampliamente empleados en la materia de la fabrication de farmacos. Por ejemplo, el vehlculo farmaceuticamente aceptable puede incluir uno o mas de los siguientes agentes: disolventes, emulsionantes, agentes de suspension, descomponedores, aglutinantes, excipientes, agentes estabilizantes, agentes quelantes, diluyentes, gelificantes, conservantes, lubricantes, agentes que retrasan la absorcion, liposomas y similares.

Preferentemente, la composicion farmaceutica segun la presente invencion se formula en una preparation externa que puede aplicarse directamente a una lesion psoriasica. La preparacion externa adecuada para la composicion farmaceutica segun la presente invencion puede ser una emulsion, un gel, una pomada, una crema, un parche, un linimento, un aerosol, un espray, una locion, un suero, una pasta, una espuma, o una gota. En una realizacion preferida de la presente invencion, la composicion farmaceutica se formula en una preparacion externa mezclando el producto de indigo natural extraldo con aceite segun la presente invencion con una base tal como aquellas que son muy conocidas y se usan comunmente en la materia.

Por ejemplo, la base adecuada para producir la preparacion externa segun la presente invencion puede incluir uno o

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mas de los siguientes aditivos: hidrocarburos (por ejemplo, vaselina y vaselina filante), ceras (por ejemplo, parafina y cera amarilla), agentes conservantes, antioxidantes, tensioactivos, potenciadores de la absorcion, agentes estabilizantes, gelificantes, agentes activos, absorbentes de olores, o fragancias. La eleccion y cantidad de estos aditivos estan dentro de la experiencia de aquellos expertos en la materia.

En una realizacion preferida de la presente invencion, la composicion farmaceutica se formula en una pomada. En otra realizacion preferida de la presente invencion, la composicion farmaceutica se formula en una gota de aceite.

La dosificacion y la frecuencia de administracion de la composicion farmaceutica segun la presente invencion puede variar dependiendo de los siguientes factores: la gravedad de la enfermedad que va a tratarse, la via de administracion, y el peso, edad, condicion flsica y respuesta del sujeto que va a tratarse. Por ejemplo, la dosificacion diaria de la composicion farmaceutica segun la presente invencion, por ejemplo, una pomada, puede ser aproximadamente 30 g para una administracion a un cuerpo completo (1 g de la pomada segun la presente invencion puede contener 0,01-1 mg de indirrubina), y puede administrarse una vez al dla o dos veces al dla.

La composicion farmaceutica segun la presente invencion puede usarse sola o en combinacion con otras composiciones farmaceuticas, que incluyen, pero no se limitan a, corticosteroides, antralina, alquitran de hulla, calcitriol, tazaroteno, acido salicllico, MTX, ciclosporina, retinoides, alefacept, efalizumab, etanercept y adalimumab.

La presente invencion se describira adicionalmente a modo de los siguientes ejemplos. Sin embargo, debe entenderse que los siguientes ejemplos estan unicamente previstos con el fin de ilustracion y no deben interpretarse como limitantes de la invencion en practica.

Ejemplos

Materiales experimentales:

1. Se compro polvo de Indigo natural que se preparo a partir de la planta de Strobilanthes formosanus Moore (Acanthaceae) cultivada en las montanas cerca del distrito de Sansia, Ciudad de Nuevo Taipei, Taiwan, de Guang Sheng Trading (Taipei, Taiwan).

2. Todos los aceites vegetales usados en extraer el polvo de Indigo natural se adquirieron en Sigma (EE.UU.). Procedimientos experimentales generales:

1. Analisis cuantitativos de indirrubina en productos extraldos de Indigo natural por cromatografla llquida de alta resolution (HPLC):

Como se sabe que la indirrubina es uno de los principales componentes activos del Indigo natural en los siguientes ejemplos se uso como indicador para determinar las influencias de diferentes condiciones de operation tras la extraction, en particular extraction con aceite, de polvo de Indigo natural

Para determinar el contenido de indirrubina del mismo, un producto extraldo de Indigo natural como se prepara en los siguientes ejemplos se sometio a un analisis de HPLC usando un sistema de cromatografla de llquidos serie 1100 de Agilent (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE.UU.) bajo las condiciones de operacion mostradas en la Tabla 1, en el que se uso indirrubina (adquirida en Alexis, Lausen, Suiza; 0,1 mg/ml en cloroformo) como patron de control.

Tabla 1. Condiciones de operacion de HPLC para el analisis cuantitativo de indirrubina.

Columna: Agilent ZORBAX SIL

Longitud de onda de detection: UV-307 nm

Fase movil: Cloroformo/acetato de etilo (80:20, v/v)

Condiciones para la elucion en gradiente: Mantener el contenido de acetato de etilo al 20 % durante 0-12 minutos; aumentar el contenido de acetato de etilo del 20 % al 100 % durante 12-15 minutos; mantener el contenido de acetato de etilo al 100 % durante 15-25 minutos; y reducir el contenido de acetato de etilo del 100 % al 20 % durante 25-30 minutos.

Velocidad de flujo (ml/minuto): 1

Ejemplo 1. Influencias de las condiciones de extraccion sobre el contenido de indirrubina en los productos extraldos con aceite de Indigo natural

A. Influencias de los diferentes aceites de extraccion sobre el contenido de indirrubina en los productos extraldos con aceite de Indigo natural

En este experimento, los solicitantes probaron siete aceites vegetales, que incluyen, aceite de oliva, aceite de

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semilla de algodon, aceite de sesamo, aceite de semilla de girasol, aceite de cacahuete, aceite de germen de trigo y aceite de soja, para determinar su capacidad de extraccion de polvo de Indigo natural. De estos experimentos, el experimento con aceite de oliva es de acuerdo con la invencion. En resumen, de manera uniforme se mezclaron 2 ml de cada aceite con 0,1 g de polvo de Indigo natural y la mezcla resultante se calento a 110 °C durante 30 minutos. Los siete productos extraldos con aceite en bruto as! obtenidos, que presentaron todos un color azul- violeta, se filtraron utilizando un filtro de jeringa (Millipore, Francia), respectivamente, y los filtrados as! recogidos formaron los productos correspondiente extraldos con aceite refinados de color rojo purpura. Para la comparacion, se prepararon dos productos extraldos con disolvente organico realizando los mismos experimentos de extraccion usando dos disolventes organicos diferentes, concretamente acetato de etilo y etanol.

Cien gl de cada uno de los productos extraldos de Indigo natural, como se ha descrito anteriormente, se diluyeron 10 veces con cloroformo y a continuacion se sometieron a analisis de HPLC como se expone en la seccion titulada “1. Analisis cuantitativo de indirrubina en productos extraldos de Indigo natural por cromatografla llquida de alta resolution (HPLC),” de los Procedimientos experimentales generales, de manera que se determinara el contenido de indirrubina de los mismos.

Resultados:

La Tabla 2 muestra los contenidos de indirrubina en productos extraldos de Indigo natural como se preparan a parti r de diferentes disolventes de extraccion. Puede observarse de la Tabla 2 que los siete productos extraldos con aceite refinados de Indigo natural tienen cada uno un contenido de indirrubina entre aquellos de los productos extraldos con acetato de etilo y etanol de Indigo natural. Ademas, de entre los siete productos extraldos con aceite refinados de Indigo natural el producto extraldo con aceite de sesamo tiene el mayor contenido de indirrubina, seguido del producto extraldo con aceite de oliva. Sin embargo, el aceite de sesamo tiene una composition complicada de componentes, ademas de un olor fuerte y, segun algunos informes, puede inducir alergia en algunas personas. Por tanto, el solicitante supuso que el producto extraldo con aceite de oliva de Indigo natural podrla ser mas adecuado para uso cllnico en terminos de seguridad y entonces se uso este producto para realizar los posteriores experimentos de la presente invencion.

Tabla 2. Contenidos de indirrubina en productos extraldos de Indigo natural como se preparan a partir de diferentes

disolventes de extraccion.

Disolvente de extraccion: Contenido de indirrubina en producto extraldo de Indigo natural (mg/g)

Aceite vegetal: Aceite de oliva 1,78

Aceite de semilla de algodon: 1,30

Aceite de sesamo: 1,85

Aceite de semilla de girasol: 1,36

Aceite de cacahuete: 1,56

Aceite de germen de trigo: 1,26

Aceite de soja: 1,39

Disolvente organico: Acetato de etilo 2,37

Etanol: 1,19

B. La influencia de las temperaturas de calentamiento sobre el contenido de indirrubina en productos extraldos con aceite de oliva de Indigo natural.

Se mezclo uniformemente 1 g del polvo de Indigo natural con 10 ml de aceite de oliva, y la mezcla resultante se calento a una temperatura designada (100 °C, 110 °C, 125 °C, 145 °C y 155 °C) durante 30 minutos, seguido de pasar a traves de un filtro de jeringa. Los 100 gl del filtrado as! recogidos se diluyeron 10 veces con cloroformo y a continuacion se sometieron a analisis de HPLC como se expone en la seccion titulada “1. Analisis cuantitativo de indirrubina en productos extraldos de Indigo natural por cromatografla llquida de alta resolucion (HPLC),” de los Procedimientos experimentales generales, de manera que se determinara el contenido de indirrubina de los mismos.

Resultados:

La Tabla 3 muestra los contenidos de indirrubina en productos extraldos con aceite de oliva de Indigo natural como se preparan a diferentes temperaturas de calentamiento. Puede observarse de la Tabla 3 que la indirrubina puede extraerse de Indigo natural a diferentes temperaturas de calentamiento, obteniendose el mayor contenido de indirrubina a 145 °C. Los solicitantes usaron entonces 145 °C como temperatura de calentamiento en los posteriores experimentos.

Tabla 3. Contenidos de indirrubina en productos extraldos con aceite de oliva de Indigo natural como se preparan a

5

10

15

20

25

30

35

40

45

diferentes temperaturas de calentamiento.

Temperatura de calentamiento (°C): Contenido de indirrubina en producto extraido con aceite de oliva de Indigo natural (mg/g)

100: 3,22

110: 3,42

125: 4,18

145: 4,66

155: 4,3

C. Seleccion de la relacion de polvo de indigo natural con respecto a aceite de oliva

Se mezclo uniformemente el polvo de Indigo natural a una cantidad designada (1 g, 0,5 g y 0,25 g) con 10 ml de aceite de oliva de manera que se proporcionara una mezcla que tenia una relacion de Indigo natural con respecto a aceite de oliva a 1:10, 1:20 o 1:40 (peso/volumen). La mezcla se calento a 100 °C durante 30 minutos, seguido de pasar a traves de un filtro de jeringa. Los 100 jl del filtrado asi recogidos se diluyeron 10 veces con cloroformo y a continuacion se sometieron a analisis de HPLC como se expone en la seccion titulada “1. Analisis cuantitativo de indirrubina en productos extraidos de indigo natural por cromatografia liquida de alta resolution (HPLC)”, de los Procedimientos experimentales generales, de manera que se determinara el contenido de indirrubina de los mismos.

Resultados:

Los contenidos de indirrubina en productos extraidos con aceite de oliva de Indigo natural como se preparan a diferentes relaciones de Indigo natural con respecto a aceite de oliva (1:10, 1:20 y 1:40, peso/volumen) se muestran en la Tabla 4. Los solicitantes encontraron que no estaba presente diferencia significativa entre los contenidos de indirrubina de los tres productos extraidos con aceite de oliva de indigo natural as! obtenidos. Ademas, bajo una cantidad fija de polvo de Indigo natural un aumento de la cantidad de aceite de oliva usada dejo de aumentar significativamente el contenido de indirrubina en el producto extraldo con aceite de oliva de Indigo natural sino que produjo una dilution de los componentes activos contenidos en el producto extraido. Asi, para obtener economicamente un producto extraido con aceite de oliva de Indigo natural que tiene una concentration saturada de indirrubina, los solicitantes decidieron seleccionar la relacion de 1:10 en la extraction del polvo de Indigo natural por aceite de oliva.

Tabla 4. Contenidos de indirrubina en productos extraidos con aceite de oliva de indigo natural como se preparan a ___________diferentes relaciones de indigo natural con respecto a aceite de oliva.___________

Relacion de Indigo natural con respecto a aceite de oliva (peso/volumen): Contenido de indirrubina en producto extraido con aceite de oliva de indigo natural (mg/g)

1: 10 3,2

1: 20 3,44

1: 40 3,48

Basandose en los resultados experimentales obtenidos en las secciones A-C precedentes, se determinaron las condiciones de extraccion con aceite preferidas para Indigo natural y se exponen brevemente en la Tabla 5.

Tabla 5. Condiciones de operation preferidas para la extraccion con aceite de indigo natural

Disolvente de aceite: Aceite de oliva

Temperatura de calentamiento: 145 °C

Tiempo de extraccion: 30 minutos

Relacion de Indigo natural con respecto a aceite de oliva (peso/volumen): 1:10

Ejemplo 2. Preparacion a gran escala del producto extraido con aceite de oliva de indigo natural segun la presente invencion

Siguiendo las condiciones de operacion mostradas en la Tabla 5, se mezclaron 90 g del polvo de Indigo natural con 900 ml de aceite de oliva en un recipiente de acero inoxidable, seguido de calentamiento a 145 °C durante 30 minutos, de forma que se obtuvo un extracto en bruto de Indigo natural que tenia un color azul-violeta. Se repitio el mismo tratamiento de extraccion del polvo de Indigo natural para proporcionar un segundo extracto en bruto de Indigo natural que se filtro adicionalmente a traves de un papel de filtro que tenia un tamano de poro de 6 jm, proporcionando asi un extracto refinado de Indigo natural que tenia un color rojo purpura. Los extractos en bruto y refinados de Indigo natural as! obtenidos se usaron en los siguientes experimentos.

Para verificar la distribucion de los principales componentes de los mismos, tanto los extractos en bruto como

5

10

15

20

25

30

35

refinados de Indigo natural como se preparan anteriormente se sometieron a analisis de HPLC como se expone en la seccion titulada “1. Analisis cuantitativo de indirrubina en productos extraldos de Indigo natural por cromatografia liquida de alta resolucion (HPLC)”, de los Procedimientos experimentales generales. Para la comparacion, tambien se analizo un producto extraido con DMSO de indigo natural que se preparo como se ha descrito previamente (Y K. Lin et al. (2009a) y Y K. Lin et al. (2009b), arriba).

Con referencia a la Figura 1, puede observarse que tanto los extractos en bruto (panel superior) como refinados (panel central) de indigo natural tienen una huella cromatografica diferente de la del producto extraido con DMSO de indigo natural (panel inferior). Ademas, en comparacion con el extracto en bruto de indigo natural, el contenido de indigo en el extracto refinado de indigo natural se redujo significativamente.

Ejemplo 3. Evaluaciones del efecto terapeutico, seguridad y conveniencia de pomadas de indigo natural formuladas segun la presente invencion en el tratamiento de psoriasis de la piel humana

Con el fin de examinar el efecto terapeutico, la seguridad y la conveniencia de los extractos en bruto y refinados de indigo natural como se preparan en el Ejemplo 2 anterior en el tratamiento de psoriasis de la piel humana, se realizaron las siguientes pruebas.

A. Preparacion de pomadas de indigo natural en bruto y refinadas

Se mezclaron 900 ml de cada uno de los extractos en bruto y refinados de indigo natural como se preparan en el Ejemplo 2 anterior con 90 g de cera amarilla y 90 g de vaselina, de manera que se obtuvieron una pomada en bruto que contenia el extracto en bruto de indigo natural y una pomada refinada que contenia el extracto refinado de indigo natural respectivamente.

B. Cribado de sujetos de prueba e informacion clfnica de los mismos

Se inscribieron sujetos de prueba que participaban en las siguientes pruebas preclinicas del departamento ambulatorio de medicina china del Hospital Memorial Chang Gung, Taiwan. Se requirio que estos sujetos de prueba cumplieran todos los criterios de inclusion y de exclusion que se exponen brevemente en la Tabla 6. Las pruebas fueron autorizadas por el Comite de etica medica del Hospital Memorial Chang Gung, y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada uno de los sujetos de prueba.

Tabla 6. Criterios de inclusion y de exclusion usados para cribar sujetos de prueba.

: 1 El sujeto fue diagnosticado con psoriasis en placas por un dermatologo.

: 2 El sujeto tuvo un area de la lesion psoriasica total de no mas del 60 % del area superficial de piel total del cuerpo.

Criterios de: 3 El sujeto tuvo al menos dos lesiones con grados similares de gravedad en el cuerpo del mismo.

inclusion: 4 El sujeto tenia buena condicion de salud y no tenia anomalia en la funcion hepatica y renal, ademas de hematologia.

: 5 El sujeto era un hombre o una mujer de edad entre 20 y 75 anos.

: 6 Si el sujeto era una mujer en edad de procrear, acepto usar anticoncepcion durante la prueba.

: 1 El sujeto tenia una historia de alergia a al menos uno de los componentes de la composicion farmaceutica de prueba.

: 2 El sujeto habia recibido una fototerapia o una terapia usando un farmaco antipsoriasico sistemico (tal como retinoides, ciclosporina, MTX, etc.) en el plazo de 4 semanas antes de la prueba.

Criterios de exclusion: 3 El sujeto habia recibido una terapia usando un farmaco antipsoriasico local (tal como alquitran de hulla, corticosteroides, analogos de vitamina D3, etc.) en el plazo de 2 semanas antes del experimento.

4: El sujeto tenia una historia medica de psoriasis no en placas (es decir, pustular o eritrodermica) o psoriasis inducida por farmaco.

: 5 El sujeto tenia enfermedad mental, diabetes, enfermedad hepatica o renal, cancer o SIDA.

: 6 El sujeto femenino tenia que dar de mamar, estaba embarazada o se estaba preparando para el embarazo.

: 7 El sujeto no estuvo disponible para la evaluacion en los momentos de tiempo designados durante la prueba.

Un total de 38 sujetos de prueba participaron en la siguiente prueba preclinica, y la informacion clfnica de los

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

mismos, que incluye sexo, edad, duracion de la psoriasis, area de psoriasis e indice de gravedad (PASI) y el porcentaje de area superficial del cuerpo implicada en la psoriasis, se exponen brevemente en la Tabla 7.

Tabla 7. Information clinica de 38 sujetos de prueba inscritos en la prueba preclinica.

: Media ± DE Intervalo

Sexo: Masculino (total) 31 -

Femenino (total): 7 -

Edad (anos): 42,8 ± 12,7 23-63

Duracion de la psoriasis (ano): 12,2 ± 10,5 1-45

PASI: 11,5 ± 7,8 1,6-36,1

Porcentaje de area superficial del cuerpo implicada en la psoriasis ( %): 19,0 ± 14,7 2-60

C. Prueba pre-clinica

Antes del inicio de la prueba (es decir, en la semana 0), se seleccionaron dos lesiones con grado de gravedad similar del cuerpo (excluyendo la cabeza y el cuello) de cada uno de los 38 sujetos de prueba inscritos y despues se fotografiaron por separado y se sometieron a medicion del area de lesion, expresandose los datos obtenidos como cm2.

Las pomadas en bruto y refinadas de indigo natural como se preparan en la section A precedente se aplicaron a las dos lesiones seleccionadas de cada sujeto de prueba una vez al dfa a una dosis de 1 g/100 cm2 del area de lesion durante un periodo de ocho semanas, respectivamente. A finales de las semanas 2, 4, 6 y 8, las lesiones tratadas se fotografiaron por separado y se sometieron a medicion del area de lesion. Para determinar el efecto terapeutico, la seguridad y conveniencia de las dos pomadas probadas, las lesiones tratadas se evaluaron segun los metodos expuestos en las secciones D y E a continuation.

Durante el tiempo de prueba, tres sujetos de prueba masculinos dejaron de completar el tratamiento con pomada, en los que el primero se retiro de la prueba en la semana 4 debido al trabajo, el segundo se retiro debido al desarrollo de una afeccion pruriginosa en las areas tratadas en la semana 5, y el tercero se retiro en la semana 6 debido a mudanza. Asf, solo 35 sujetos de prueba completaron satisfactoriamente la prueba preclinica.

D. Evaluacion del efecto terapeutico

1. Evaluacion de los grados de gravedad de la psoriasis basandose en escamas, eritema e induration:

Las fotos de las lesiones seleccionadas de los sujetos de prueba como se obtuvieron en la semana 0 (es decir, antes de la aplicacion de las pomadas de prueba de indigo natural) y a finales de las semanas 2, 4, 6 y 8 despues de empezar la aplicacion de las pomadas de prueba de indigo natural se compararon con las fotos de referencia estandar como se muestra en la Figura 2 por un dermatologo. Basandose en dichas fotos de referencia estandar, los grados de escamas, eritema e induracion se clasificaron con una puntuacion que oscilaba de 0 a 4, respectivamente, en la que 0 = normal, 1 = leves, 2 = moderadas, 3 = graves y 4 = muy graves. Entonces se determino el efecto terapeutico de una pomada de prueba basandose en las puntuaciones de escamas, eritema e induracion, respectivamente, calculadas en los momentos de tiempo designados (semana 0, 2, 4, 6 y 8), ademas de las sumas de dichas tres puntuaciones calculadas.

Los datos experimentales asf obtenidos para todas las lesiones seleccionadas de los sujetos de prueba se expresaron como media ± DE y se representaron frente al tiempo. Se uso la prueba de la t para datos emparejados o la prueba del orden con signo de Wilcoxon para comparar las puntuaciones de escamas, eritema e induracion entre las dos lesiones, cuando corresponda. Tambien se realizo la prueba de la t para datos emparejados, con objeto de comparar las puntuaciones de escamas, eritema e induracion entre los pre- y post-tratamientos. Se uso el modelo del efecto mixto para explicar la dependencia del tiempo de la medicion repetida y las diferencias entre las dos lesiones. La signification estadfstica se indico mediante el valor de p <0,05.

2. Evaluacion del cambio en el area de lesion:

Las areas de lesion de las lesiones seleccionadas de los sujetos de prueba como se miden en la semana 0 (es decir, antes de la aplicacion de las pomadas de prueba de indigo natural) y a finales de las semanas 2, 4, 6 y 8 despues de empezar la aplicacion de las pomadas de prueba de indigo natural se introdujeron en la siguiente ecuacion (1) para determinar los cambios en las areas de lesiones con el tiempo producidas por las pomadas de prueba.

C = (B/A)x100 (1)

en la que:

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15

20

25

30

35

40

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55

60

65

A = el valor de un area de lesion (expresada como cm2) medida en la semana 0 (es decir, el valor del nivel inicial).

B = el valor del area de lesion (expresada como cm2) medida en un momento de tiempo designado (semana 0, 2, 4, 6 y 8); y

C = el porcentaje del valor del area de lesion con respecto al valor del nivel inicial en el momento de tiempo designado.

Los datos experimentales asf obtenidos para todas las lesiones seleccionadas de los sujetos de prueba se expresaron como media ± DE y se representaron frente al tiempo y se analizaron estadfsticamente como se ha descrito anteriormente.

3. Evaluation de la mejora del aspecto externo de la lesion psoriasica:

Para determinar el efecto de mejora de cada pomada de prueba de indigo natural sobre el aspecto externo de la lesion psoriasica, el valor de la suma de las puntuaciones de escamas, eritema e induration como se ha calculado para una lesion seleccionada en un momento de tiempo designado (semana 0, 2, 4, 6 y 8) en la subsection 1 precedente se multiplico por el valor en porcentaje correspondiente del area de lesion con respecto al valor del nivel inicial en el momento de tiempo designado como se ha obtenido en la subseccion 2 precedente, de forma que se obtuvo una “puntuacion de area y gravedad” para dicha lesion seleccionada en el momento de tiempo designado. Las puntuaciones de area y gravedad asf calculadas para todas las lesiones seleccionadas de los sujetos de prueba se introdujeron posteriormente en la siguiente ecuacion (2):

F= [(D—E)/D]x100 (2)

en la que:

D = la puntuacion de area y gravedad calculada para una lesion seleccionada en la semana 0 (es decir, el valor del nivel inicial);

E = la puntuacion de area y gravedad calculada para la lesion seleccionada en un momento de tiempo designado (semana 2, 4, 6 y 8); y

F = el porcentaje de mejora de la lesion seleccionada con respecto al nivel inicial en el momento de tiempo designado.

4. Evaluacion global de la mejora de la lesion psoriasica:

Para evaluar la mejora global proporcionada por cada pomada de prueba de indigo natural las fotos de las lesiones seleccionadas que se han obtenido al final de la semana 8 para los 35 sujetos de prueba que completaron la prueba preclfnica se compararon visualmente por un dermatologo con las fotos correspondientes obtenidas en la semana 0. El grado de mejora, es decir, el cambio observado de la lesion mostrada en la foto obtenida al final de la semana 8 en comparacion con la mostrada en la foto correspondiente obtenida en la semana 0, se clasifico con una puntuacion que oscilaba de 0 a 5, en la que 0 = peor, 1 = sin cambio, 2 = ligeramente mejorada, 3 = moderadamente mejorada, 4 = casi desaparecida y 5 = desaparecida. Mientras tanto, se indico a cada uno de los sujetos de prueba que proporcionara una auto-evaluacion global observando visualmente las lesiones seleccionadas y clasificando las mismas basandose en el metodo de puntuacion anterior.

Segun la evaluacion global del dermatologo y las autoevaluaciones globales de los sujetos de prueba, se contaron los numeros de sujetos de prueba que tenfan las mismas puntuaciones de clasificacion, respectivamente, seguido del calculo de los porcentajes de dichos numeros de sujetos de prueba con respecto al numero total de sujetos de prueba. Los datos asf obtenidos se analizaron usando la prueba de McNemar de manera que se determinara la correlation entre los resultados experimentales del grupo que utiliza de pomada en bruto y los del grupo que utiliza pomada refinada.

E. Evaluacion de la seguridad y conveniencia

La evaluacion de la seguridad la realizo un investigador a finales de las semanas 2, 4, 6 y 8 despues de empezar la aplicacion de las pomadas de prueba de indigo natural. El investigador pregunto a los sujetos de prueba respecto a la aparicion de cualquier respuesta adversa de la piel (incluyendo picor, irritation y eritema), y los resultados se registraron segun las siguientes puntuaciones de clasificacion: 0 = nada, 1 = leves, 2 = moderadas y 3 = graves. La conveniencia de las pomadas en bruto y refinadas de indigo natural se evaluo segun la respuesta de cada uno de los sujetos de prueba al final de la prueba preclfnica.

Resultados:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

A. Evaluacion de los efectos terapeuticos de las pomadas en bruto y refinadas de indigo natural

La Figura 3 muestra los efectos terapeuticos de las pomadas en bruto y refinadas de Indigo natural como se preparan en el Ejemplo 2 anterior. Puede observarse de los resultados mostrados en los paneles A, B, C y D de la Figura 3 que las puntuaciones de escamas, eritema e induracion se redujeron significativamente con el tiempo debido al tratamiento con pomada, respectivamente, en comparacion con las puntuaciones correspondientes calculadas en la semana 0. Ademas, no se encontro que existiera diferencia significativa entre el grupo que utilizaba la pomada en bruto y el grupo que utilizaba la pomada refinada en el mismo momento.

La Figura 4 muestra los cambios en las area de lesion con el tiempo, producidos por las pomadas en bruto y refinadas de Indigo natural tal y como se preparan en el Ejemplo 2 anterior, y la Figura 5 muestra la mejora del aspecto externo de lesiones psoriasicas tratadas con las pomadas en bruto y refinadas de Indigo natural como se preparan en el Ejemplo 2 anterior. Puede observarse de la Figura 4 y Figura 5 que los valores en porcentaje promedio de las areas de lesion con respecto al valor del nivel inicial se redujeron significativamente con el tiempo debido al tratamiento con pomada, mientras que las mejoras en porcentaje de las lesiones tratadas con respecto al nivel inicial aumentaron significativamente con el tiempo debido al tratamiento con pomada, en comparacion con los datos correspondientes obtenidos en la semana 0. Ademas, no se encontro que existiera diferencia significativa entre el grupo que utilizaba la pomada en bruto y el grupo que utilizaba la pomada refinada en el mismo momento.

Los resultados experimentales anteriores revelan que tanto las pomadas en bruto como las refinadas de Indigo natural, segun la presente invencion, son eficaces para aliviar lesiones psoriasicas y que no hay diferencia significativa en la eficacia terapeutica.

Adicionalmente, un dermatologo evaluo las mejoras globales de las lesiones psoriasicas, como proporcionan las pomadas de prueba de Indigo natural, y los 35 sujetos de prueba, que completaron la prueba precllnica al final de la prueba as! como los resultados obtenidos, se resumen en la Tabla 8.

Tabla 8. Mejoras globales de lesiones psoriasicas evaluadas por un dermatologo y por los sujetos de prueba.

: Evaluacion de los sujetos de prueba Evaluacion del dermatologo

Pomada refinada: Pomada en bruto Pomada refinada Pomada en bruto

Desaparecidas (5a): 12b(34,3 %c) 8 (22,9 %) 19 (54,3 %) 18(51,4 %)

Casi desaparecidas (4): 11 (31,4 %) 13 (37,1 %) 3 (8,6 %) 3 (8,6 %)

Moderadamente mejoradas (3): 9 (25,7 %) 11 (31,4 %) 6 (17,1 %) 6 (17,1 %)

Ligeramente mejoradas (2): 1 (2,9 %) 1 (2,9 %) 3 (8,6 %) 3 (8,6 %)

Sin cambio (1): 1 (2,9 %) 1 (2,9 %) 1 (2,9 %) 2 (5,7 %)

Peor (0): 1 (2,9 %) 1 (2,9 %) 3 (8,6 %) 3 (8,6 %)

Correlacion: 0,70 0,83

a: Una puntuacion de clasificacion como se indica.

b: El numero de sujetos de prueba que tienen una puntuacion de clasificacion como se indica.

c: El porcentaje de dicho numero de sujetos de prueba con respecto al numero total de sujetos de prueba.

En la Tabla 8 puede observarse que no solo el dermatologo, sino tambien la mayorla de los sujetos de prueba, consideraron que las pomadas en bruto y las refinadas de Indigo natural, segun la presente invencion, eran eficaces para aliviar lesiones psoriasicas y que presentaban efectos terapeuticos similares.

B. Evaluacion de la seguridad y conveniencia de las pomadas en bruto y refinadas de indigo natural

La Tabla 9 muestra los resultados de la evaluacion de seguridad de las pomadas en bruto y refinadas de Indigo natural como se preparan en el Ejemplo 2 anterior. Puede observarse de la Tabla 9 que entre los sujetos de prueba que completaron la prueba, solo algunos de ellos experimentaron respuestas de la piel adversas temporales y leves, que incluyen picor, irritacion y eritema, que, sin embargo, no les detuvieron para completar la prueba. Particularmente, se encontro que la pomada en bruto de Indigo natural tenia una mayor puntuacion en comparacion con la pomada refinada de indigo natural que indica que el extracto de aceite de oliva en bruto de indigo natural podria refinarse por filtracion para eliminar cualquier posible impureza y pigmento no deseado contenido en su interior, reduciendose asi la incidencia de producirse una o mas respuestas adversas de la piel.

5

10

15

20

25

30

35

Tabla 9. Resultados de la evaluacion de seguridad de las pomadas en bruto y refinadas de indigo natural

: Respuesta adversa de la piel Puntuacion total

Picor: Irritacion Eritema

Pomada en bruto: Semana 2 1a*6b, 2*1 - 1*1,2*1 32

Semana 4: 1x5 1*1 1*2

Semana 6: 1*4 1*1 1*2

Semana 8: 1*5 - 1*1

Pomada refinada: Semana 2 1*5 1*1 - 17

Semana 4: 1*1 1*2 -

Semana 6: 1*4 1*2 1*1

Semana 8: 1*1 - -

a: Una puntuacion de clasificacion indicada para evaluar el grado de una respuesta adversa de la piel. b: El numero de sujetos de prueba que tienen la puntuacion de clasificacion que se indica.

Al final de la prueba precllnica, las ventajas de las pomadas en bruto y refinadas de Indigo natural se evaluaron segun las respuestas de los 35 sujetos de prueba que completaron la prueba, de entre los que 31 sujetos de prueba (88,6 %) respondieron que la pomada refinada de Indigo natural era mas facil de usar que la pomada en bruto de Indigo natural 3 sujetos de prueba (8,6 %) informaron que no hubo diferencia entre las pomadas en bruto y refinadas de Indigo natural y solo 1 sujeto de prueba (2,9 %) informo que la pomada en bruto de Indigo natural era mejor que la pomada refinada de Indigo natural Los solicitantes llegaron entonces a la conclusion de que serla menos probable que el producto extraldo con aceite de oliva refinado de Indigo natural que se obtuvo sometiendo el producto extraldo con aceite de oliva en bruto de Indigo natural a un tratamiento de refinado por filtracion y, por tanto, tuvo relativamente menos impurezas y un color relativamente claro, indujera reaccion (reacciones) adversa(s) de la piel o produjera un cambio de color de la piel o ropas, haciendo as! la pomada refinada de Indigo natural mas facil de usar y aumentando el cumplimiento del paciente en el uso de la misma.

Ejemplo 4. Evaluaciones del efecto terapeutico y la seguridad de gota de aceite de indigo natural en el tratamiento de psoriasis ungueal humana

Con el fin de examinar el efecto terapeutico y la seguridad del extracto refinado de Indigo natural como se prepara en el Ejemplo 2 anterior en el tratamiento de psoriasis ungueal humana, se realizaron las siguientes pruebas.

A. Preparacion de gota de aceite de indigo natural y gota de aceite de oliva

Se dispenso el extracto refinado de Indigo natural como se prepara en el Ejemplo 2 anterior en frascos cuentagotas para servir de la gota de aceite de Indigo natural probada a continuacion. Mientras tanto, se dispenso aceite de oliva en frascos cuentagotas para servir de la gota de aceite de oliva probada a continuacion.

B. Cribado de sujetos de prueba e informacion clfnica de los mismos

Se inscribieron sujetos de prueba que participaban en las siguientes pruebas precllnicas del departamento ambulatorio de medicina china del Hospital Memorial Chang Gung, Taiwan. Se requirio que estos sujetos de prueba cumplieran todos los criterios de inclusion y de exclusion expuestos brevemente en la Tabla 10. Las pruebas fueron autorizadas por el Comite de etica medica del Hospital Memorial Chang Gung, y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada uno de los sujetos de prueba.

Tabla 10. Criterios de inclusion y de exclusion usados para cribar sujetos de prueba.

Criterios de inclusion: 1 El sujeto fue diagnosticado por un dermatologo que tenia psoriasis ungueal, individualmente o en combinacion con psoriasis de la piel.

2: El sujeto tenia buena condicion de salud y no tenia anomalia en la funcion hepatica y renal, ademas de hematologia.

3: El sujeto era un hombre o una mujer de edad entre 20 y 65 anos.

4: Si el sujeto era una mujer en edad de procrear, acepto usar anticoncepcion durante la prueba.

Criterios de exclusion: 1 El sujeto tenia una historia de alergia a indigo natural

2: El sujeto habia recibido una terapia usando un farmaco antipsoriasico tal como retinoides, ciclosporina, MTX, etc., o una terapia de inyeccion de producto biologico.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

: 3 El sujeto femenino tenia que dar de mamar, estaba embarazada o se estaba preparando para el embarazo.

4: El sujeto no estuvo disponible para la evaluacion en los momentos de tiempo designados durante la prueba.

Un total de 31 sujetos de prueba participaron en la siguiente prueba precllnica, y la informacion cllnica de los mismos, que incluye sexo, edad, duracion de la psoriasis, PASI, etc., se expone brevemente en la Tabla 11.

Tabla 11. Informacion clinica de 31 sujetos de prueba inscritos en la prueba precllnica.

: Media ± DE Intervalo

Sexo: Masculino (total) 24 -

Femenino (total): 7 -

Edad (anos): 40,7 ± 12,6 21-65

Duracion de la psoriasis de la piel (ano): 9,4 ± 6,6 0-22

Duracion de la psoriasis ungueal (ano): 5,2 ± 5,5 0,5-21

Historia familiar de psoriasis: 7 -

Artritis psoriasica: 8 -

PASI: 9,0 ± 8,6 0-42,6

Porcentaje de area superficial del cuerpo implicada en la psoriasis ( %): 15,3 ± 19,9 0-99

Numero de dedos que tienen psoriasis ungueal: 9,4 ± 1,1 5-10

C. Prueba pre-cifnica

Las manos derecha e izquierda de cada uno de los sujetos de prueba se dividieron aleatoriamente en el grupo experimental y el grupo de control, y se fotografiaron las lesiones psoriasicas de las unas. Se les indico a los sujetos de prueba que aplicaran la gota de aceite de Indigo natural sobre la placa ungueal, pliegue ungueal e hiponiquio de las unas afectadas a una dosis de 0,05~0,1 ml por una dos veces al dla (por la manana y en el momento de acostarse), y tambien se les indico que no se lavaran las unas en el plazo de al menos 30 minutos despues de la aplicacion, ademas de evitar cualquier actividad que pudiera producir lesion a las unas. El tiempo de prueba para el grupo experimental duro durante un periodo de 24 semanas en conjunto.

Mientras tanto, las unas en el grupo de control se aplicaron con la gota de aceite de oliva de la misma forma que se ha descrito anteriormente para el grupo experimental durante un periodo de 12 semanas, y luego se aplicaron con la gota de aceite de Indigo natural durante otro periodo de 12 semanas.

A finales de las semanas 4, 8, 12, 16, 20 y 24 durante el tiempo de prueba, las unas en el grupo experimental y aquellas en el grupo de control de cada sujeto de prueba se fotografiaron por separado y luego se evaluaron segun los metodos expuestos en las secciones D y E a continuacion.

Durante el tiempo de prueba, 4 sujetos de prueba se retiraron de la prueba en la semana 8, 16, 20 y 24, respectivamente, por fallo en aplicar la gota de aceite como se ha habla indicado. Asl, solo 27 sujetos de prueba completaron satisfactoriamente la prueba precllnica.

D. Evaluacion dei efecto terapeutico

1. Evaluacion de la psoriasis ungueal por el Indice de gravedad de la psoriasis ungueal (NAPSI):

Las fotos de las unas en el grupo experimental y aquellas en el grupo de control como se obtuvieron en la semana 0 (es decir, antes de la aplicacion de la gota de aceite de prueba) y a finales de las semanas 4, 8, 12, 16, 20 y 24 despues de empezar la aplicacion de la gota de aceite de prueba se sometieron a una evaluacion de NAPSI segun las reglas establecidas en la Tabla 1 de P. Rich y R. K. Scher (2003), J. Am. Acad. Dermatol., 49(2):206-212, en la que las caracterlsticas cllnicas usadas en la evaluacion de NAPSI se exponen brevemente en la Tabla 12, de manera que se calculan las puntuaciones de NAPSI totales, ademas de las puntuaciones de NAPSI individuales de dichas caracterlsticas cllnicas, de las unas en el grupo experimental y aquellas en el grupo de control en los momentos de tiempo designados (semanas 0, 4, 8, 12, 16, 20 y 24). Las puntuaciones de NAPSI individuales como se han calculado basandose en las fotos de las unas obtenidas al final de la semana 12 se compararon con las calculadas basandose en las fotos de unas obtenidas en la semana 0, de manera que se determinara el (los) efecto(s) de mejora de la gota de aceite de Indigo natural sobre las caracterlsticas cllnicas de las unas de los sujetos de prueba.

5

10

15

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25

30

35

40

45

50

Los datos experimentales asf obtenidos se expresaron como media ± DE, y se analizaron estadfsticamente usando un modelo de efectos mixtos, seguido de la prueba de Bonferroni, de manera que se determinaran la(s) diferencia(s) entre diferentes momentos de tiempo para un grupo de prueba, y la(s) diferencia(s) entre el grupo experimental y el grupo de control en el mismo momento de tiempo. La significancia estadfstica se indico por p < 0,05.

Tabla 12. Caracteristicas clinicas usadas en la evaluacion de NAPSI de psoriasis ungueal.

: Caracteristicas clinicas

Psoriasis de la matriz de la una: Lesiones punteadas

Leuconiquia

Manchas rojas en la lunula

Desmoronamiento de la placa ungueal

Psoriasis del lecho de la una: Onicolisis

Hemorragias con astillamiento

Hiperqueratosis subungueal

Alteracion de color del lecho ungueal

2. Evaluacion de la psoriasis ungueal por un NAPSI objetivo modificado:

Para cada sujeto de prueba, una una objetivo que se considero que tenia la mayor gravedad de enfermedad se selecciono respectivamente de los cinco dedos mostrados en las fotos del grupo experimental y el grupo de control obtenidos en la semana 0, y dicha una objetivo se sometio entonces a una evaluacion de NAPSI objetivo modificado segun las reglas informadas en C.A. Parrish et al. (2005), J. Am. Acad. Dermatol., 53 (4):745-746, usando las caracteristicas clinicas brevemente expuestas en la Tabla 12, de manera que se calculara la puntuacion de NAPSI objetivo modificada total de dicha una objetivo en los momentos de tiempo designados (semanas 0, 4, 8, 12, 16, 20 y 24).

Los datos experimentales asf obtenidos se expresaron como media ± DE y se analizaron estadfsticamente como se ha descrito anteriormente para la evaluacion de NAPSI.

3. Evaluacion de la mejora de la psoriasis ungueal:

Para determinar el efecto de mejora de la gota de aceite de indigo natural sobre la psoriasis ungueal, las puntuaciones de NAPSI totales o las puntuaciones de NAPSI objetivo modificadas totales calculadas para cada sujeto de prueba se introdujeron en la siguiente ecuacion (3):

J= [(G—H)/G]x100 (3)

en la que:

G = la puntuacion de NAPSI total o la puntuacion de NAPSI objetivo modificada total calculadas para un grupo de prueba en la semana 0 (es decir, el valor del nivel inicial);

H = la puntuacion de NAPSI total o la puntuacion de NAPSI objetivo modificada total calculadas para el grupo de prueba en un momento de tiempo designado (semana 12 y 24); y J = el porcentaje de mejora de psoriasis ungueal con respecto al nivel inicial en el momento de tiempo designado.

4. Evaluacion global de la mejora de la psoriasis ungueal:

Para evaluar la mejora global proporcionada por la gota de aceite de indigo natural las fotos de unas que se habfan obtenido a finales de las semanas 12 y 24 para los sujetos de prueba se compararon visualmente por un dermatologo con las fotos correspondientes obtenidas en la semana 0, en las que el grado de mejora, es decir, el cambio observado de las unas mostradas en las fotos obtenidas al final de las semanas 12 o 24 en comparacion con las mostradas en las fotos correspondientes obtenidas en la semana 0, se clasifico con una puntuacion que oscilaba de 0 a 5, en la que 0 = peor, 1 = sin cambio, 2 = ligeramente mejorada, 3 = moderadamente mejorada, 4 = casi desaparecida y 5 = desaparecida. Mientras tanto, se indico a cada uno de los sujetos de prueba que proporcionara una auto-evaluacion global observando visualmente sus propias unas y clasificando las mismas basandose en el metodo de puntuacion anterior.

5

10

15

20

25

Segun la evaluacion global del dermatologo y las autoevaluaciones globales de los sujetos de prueba, se contaron los numeros de sujetos de prueba que tenian las mismas puntuaciones de clasificacion, respectivamente, seguido de calcular los porcentajes de dichos numeros de sujetos de prueba con respecto al numero total de sujetos de prueba.

E. Evaluacion de seguridad

La evaluacion de la seguridad se realizo por un investigador a finales de las semanas 4, 8, 12, 16, 20 y 24 despues de empezar la aplicacion de la gota de aceite de mdigo natural. El investigador pregunto a los sujetos de prueba respecto a la aparicion de cualquier respuesta adversa de la piel (incluyendo picor, irritacion y eritema), y los resultados se registraron segun las siguientes puntuaciones de clasificacion: 0 = nada, 1 = leves, 2 = moderadas y 3 = graves.

Resultados:

A. Evaluacion del efecto terapeutico de la gota de aceite de indigo natural

La Tabla 13 muestra los cambios de las puntuaciones de NAPSI totales, las puntuaciones de NAPSI objetivo modificadas totales y las mejoras en el porcentaje de la psoriasis ungueal de las unas en los grupos experimental y de control con el tiempo. Puede observarse de la Tabla 13 que durante el primer periodo de 12 semanas, la aplicacion de la gota de aceite de mdigo natural produjo una reduccion de las puntuaciones de NAPSI totales y las puntuaciones de NAPSI objetivo modificadas totales de las unas con el tiempo, y se encontro una mejora significativa de la psoriasis ungueal en el grupo experimental en comparacion con el grupo de control al final de la semana 12. Durante el segundo periodo de 12 semanas, las puntuaciones de NAPSI totales y las puntuaciones de NAPSI objetivo modificadas totales se redujeron con el tiempo en tanto los grupos experimentales como de control. Ademas, se encontro una mejora significativa de la psoriasis ungueal en tanto los grupos experimentales como de control al final de la semana 24.

Claims

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10

15

20

25

30

35

REIVINDICACIONES

1. Un producto de indigo natural extraldo con aceite que es obtenible por un proceso que comprende extraer polvo de Indigo natural con aceite de oliva con calentamiento a una temperatura que oscila entre 100 °C y 155 °C, y a una relacion de Indigo natural con respecto a aceite de oliva en un intervalo de 1:10 (p/v) a 1:40 (p/v); seguido de un tratamiento de refinado por filtracion.
2. El producto de Indigo natural extraldo con aceite segun la reivindicacion 1, en el que la relacion de Indigo natural con respecto a aceite de oliva es de 1:10 (p/v).
3. El producto de Indigo natural extraldo con aceite segun las reivindicaciones 1 o 2 que comprende indirrubina.
4. Una composicion farmaceutica que comprende un producto de Indigo natural extraldo con aceite segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que esta formulada en una forma de dosificacion para administracion topica u oral.
5. Una composicion farmaceutica segun la reivindicacion 4, en la que la forma de dosificacion para administracion topica se selecciona de una emulsion, un gel, una pomada, una crema, un parche, un linimento, un aerosol, un espray, una locion, un suero, una pasta, una espuma o una gota.
6. Una composicion farmaceutica segun la reivindicacion 5, en la que la forma de dosificacion es una pomada o una gota de aceite.
7. Una composicion farmaceutica segun la reivindicacion 6, en la que la pomada comprende uno o mas de los siguientes aditivos:

- Una cera, y

- Vaselina.
8. Un producto de Indigo natural extraldo con aceite como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en el tratamiento de la psoriasis.
9. Una composicion farmaceutica como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, para su uso en el tratamiento de la psoriasis.
10. Una composicion farmaceutica para uso de la reivindicacion 9 para un uso combinado con otra composicion farmaceutica que incluye un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: corticosteroides, antralina, alquitran de hulla, calcitriol, tazaroteno, acido salicllico, metotrexato (MTX), ciclosporina, retinoides, alefacept, efalizumab, etanercept y adalimumab.

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Minutos

0,030. ■

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FProducto de indigo natural extraido con raceite de oliva refinado

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5,00 iq.00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,OD 50,00 55,00

Minutos

Producto de indigo natural extraido con . DMSO

(2>

imagen2

FIG. 1

imagen3

Muy graves

Graves

Moderadas

Leves

Normales

imagen4

FIG. 2

CO

imagen5

imagen6

Tiempo (semana)

B

imagen7

imagen8

imagen9

Tiempo (semana)

D

imagen10

Tiempo (semana)

FIG. 3

imagen11

Pomada en bruto

-or- Pomada retmada

Ph c3

20

1 lempo (semana)

PIG 4

o -g
3 .9

i» ^ Ph II

5T >

p '3

o

3 ^

Pomada en bruto

Pomada refmada

-D-

Tiempo (semana)

FIG. 5