TWI468169B - 青黛之經油萃取的產物及其製備方法與用途 - Google Patents

Description

青黛之經油萃取的產物及其製備方法與用途

本發明是有關於一種青黛之經油萃取的產物暨其製備方法。本發明亦有關於使用該青黛之經油萃取的產物來治療乾癬(特別是皮膚乾癬以及指甲乾癬)。

乾癬(psoriasis)[亦被稱為銀屑病(Yin Xie Bing)]是一種與遺傳有關聯之慢性發炎性皮膚病(chronic inflammatory skin disease)，它會侵犯全身的皮膚，其中較常見的部位包括：頭皮、四肢的外側、手肘以及膝蓋等。乾癬患者通常在皮膚上會出現紅色(redness)且邊界明顯的丘疹(papular)或斑塊(plaque)，並且皮膚病灶的表面會覆蓋有銀白色的鱗屑(silvery-white scale)，而部分患者甚至會同時併發關節炎等病狀。

目前臨床上，乾癬可依照患者的皮膚病狀而被區分為下面4種常見的類型：(1)慢性斑塊性乾癬(chronic plaque psoriasis)[亦被稱為尋常性乾癬(vulgaris psoriasis)]，它是所有乾癬類型當中最為常見者，大約有80%~90%的乾癬患者都是屬於此種類型；(2)點滴狀乾癬(guttate psoriasis)，其特徵在於病患的皮膚上會帶有多數小的呈粉紅色或紅色的淚滴狀病灶(teardrop-shaped lesions)，通常發生於7歲至10歲的兒童身上，並且大多數的患者在發病前的1至2週內曾遭受到一鏈 球菌感染(streptococcal infection)；(3)紅皮性乾癬(erythrodermic psoriasis)，其特徵在於患者的全身或超過90%的體表面積上的皮膚會出現紅斑(erythema)或剝落(exfoliation)的現象，而嚴重者可能會全身搔癢(itching)，並且伴隨有發燒(fever)以及不適(malaise)，甚至引起全身性的急性膿疱性乾癬(generalized acute pustular psoriasis)；以及(4)膿疱性乾癬(pustular psoriasis)，其可分為全身性膿疱性乾癬(generalized pustular psoriasis)與局部膿疱性乾癬(localized pustular psoriasis)[例如，掌蹠膿疱症(pustulosis palmaris et plantaris)以及稽留性肢端皮膚炎(acrodermatitis perstans)]

此外，大約有10%的乾癬患者會併發乾癬性關節炎(psoriatic arthritis)，它是一種會影響患者的韌帶(ligaments)、腱(tendons)、筋膜(fascia)以及脊椎或周邊關節(spinal or peripheral joints)的CD8 T細胞驅動的自體免疫發炎(CD8 T cell-driven autoimmune inflammation)；而有高達90%的乾癬患者曾經患有指甲乾癬(nail psoriasis)。

由於乾癬的病理狀況與症狀相當複雜，至今對於它的發病機制(pathogenesis)仍不清楚，已有研究顯示：遺傳(inheritance)在乾癬的發病機制上扮演一個重要的角色，而外傷(trauma)、感染(infection)、壓力(stress)、內分泌因素(endocrine factors)、代謝因素(metabolism factors)、氣候以及藥物等都可能誘發或者加重乾癬的發病。乾癬患者一旦發病，此病將會終其一生反覆地發作而無法根除。

現今西方醫學大多是依照乾癬患者的年齡、性別、職業、智力、病灶的形態與分布情形、對於先前所採用之療法的反應以及其它相關病史等來採用最適當的治療方式，而主要的治療方式包括：(1)局部性療法(topical therapy)：例如，皮質類固醇(corticosteroids)、蒽三酚(anthralin)(商品名稱為Margiton^® )、煤焦油(coal tar)(商品名稱為Polytar^® )、促鈣三醇(calcitriol)(商品名稱為 Silkis^® )、他紮羅汀(tazarotene)(商品名稱為Tazorac^® )以及水楊酸(salicylic acid)等，它們適用於具有輕微病況的乾癬患者；(2)全身性療法(systemic therapy)：例如，胺甲碟呤(methotrexate,MTX)、環孢素(cyclosporin)以及類視色素(retinoids)等口服製劑(oral preparations)，它們適用於具有中度至嚴重病況的乾癬患者；(3)生物製劑(biologics)的注射：例如，阿法賽特(alefacept)(商品名稱為Amevive^® )、依法利珠單抗(efalizumab)(商品名稱為Raptiva^® )、依那西普(etanercept)(商品名稱為Enbrel^® )以及阿達木單抗(Adalimumab)(商品名稱為Humira^® )，它們亦適用於具有中度至嚴重病況的乾癬患者；以及(4)光療法(phototherapy)：例如，紫外線B光療法[ultraviolet B(UVB)phototherapy]、光化學療法(photochemotherapy)[諸如，補骨脂素加紫外線A(psoralen plus ultraviolet A,PUVA)]等，它們適用於具有嚴重病況的乾癬患者。

然而，長期使用上述的治療方式可能會導致患者產生嚴重的副作用(side effect)或藥物耐受性(drug tolerance)，進而降低順從性(compliance)。有鑑於此，已有許多研究人員嘗試從傳統中藥(traditional Chinese medicines,TCM)中來尋找可用以治療乾癬的活性組分(active components)。

青黛[英文名稱為：indigo naturalis或natural indigo；漢語拼音為：qing dai；中文俗名為：靛花(dian hua)、青蛤粉(qing ge fen)、青缸花(qing gang hua)、藍露(lan lou)、淀花(dian hua)以及靛沫花(dian mo hua)等]是一種從靛藍-生成植物(indigo-producing plant)[諸如，爵床科植物馬藍(Baphicacanthus cusia (Nees)Bremek.)、蓼科植物蓼藍(Polygonum tinctorium Lour.)以及十字花科植物菘藍(Isatis indigotica Fort.)等]的葉子中所萃取出之呈深藍色的植物色素。青黛在傳統中醫 學的臨床使用上具有清熱涼血(clearing the heat and cooling the blood)的功用，而在現代醫學的臨床使用上則常被用來治療慢性骨髓白血病(chronic myeloid leukemia)、乾癬、腮腺炎(mumps)、各種潰瘍[例如消化性潰瘍(peptic ulcer)、口腔潰瘍(oral ulcer)等]、肝炎(hepatitis)、帶狀疱疹(herpes zoster)以及外耳道炎(otitis external)等。

已知從得自於不同的靛藍-生成植物的青黛中可以分離出各種活性成分，其中較常見的有靛藍(indigo)、靛玉紅(indirubin)以及異靛藍(isoindigo)等。有研究發現，靛玉紅具有抗腫瘤(anti-tumor)、抗發炎(anti-inflammation)以及免疫調節(immunomodulation)等功效，並且被認為具有發展成為一供用於治療阿茲海默症(Alzheimer’s disease)的藥物的潛力(G.Eisenbrandet al. (2000),J.Cancer Res.Clin.Oncol .,130：627-635；T.Kunikataet al. (2000),European Journal of Pharmacology ,410：93-100；N.K.Maket al. (2004),Biochemical Pharmacology ,67：167-174；S.Leclercet al. (2001),The Journal of biological Chemistry ,276：251-260)。

已有文獻報導，青黛的水溶性(water solubility)較差，因此目前最常使用有機溶劑來萃取青黛，俾以獲得各種活性成分。在Q.S.Zhanget al. (2006),J Guangxi Normal University：Natural Science Edition ,24：58-60中，Q.S.Zhang等人主要是分別以75%乙醇、氯仿(chloroform)、乙酸乙酯(ethyl acetate)以及丙酮(acetone)來萃取青黛，藉此而得到4種不同的有機萃取物，繼而比較該等有機萃取物中所含有的靛玉紅的含量。經由實驗結果顯示：當使用乙酸乙酯來進行青黛的萃取時，所得到的靛玉紅的含量最高，其次分別是使用丙酮、氯仿以及75%乙醇。

有研究發現，青黛之經有機溶劑萃取的產物(organic solvent-extracted product of indigo naturalis)具有顯著的抗發炎(anti- inflammation)或抗乾癬(anti-psoriasis)的活性。例如，在Y.K.Linet al. (2009),Journal of Dermatological Science ,54：168-174中，Y.K.Lin等人將青黛粉末以一為1：10(w/v)的比例溶於二甲亞碸(dimethylsulfoxide,DMSO)中，繼而藉由過濾來滅菌而得到一青黛之經DMSO萃取的產物。該青黛之經DMSO萃取的產物被證實會減少經培養的正常人類表皮角質細胞(normal human epidermal keratinocyte,NHEK)的細胞數目，並且會促使該NHEK細胞的細胞週期是停滯在G0/G1期(G0/G1 phase)。此外，該青黛之經DMSO萃取的產物中所含有的2種主要活性成分(亦即靛.藍以及靛玉紅)亦被證實能引起角質細胞的細胞週期停滯，而其中僅有靛玉紅可以調控增生細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)以及套膜蛋白(involucrin)的表現。因此，Y.K.Lin等人認為：該青黛之經DMSO萃取的產物主要是以靛玉紅作為活性成分來調控角質細胞的增生(proliferation)以及分化(differentiation)，藉此達到抗乾癬的效用。

雖然青黛之經有機溶劑萃取的產物具有抗乾癬的效用，但是在臨床使用上需要進一步將有機溶劑去除後才能被製成一可供人類個體使用的藥物。因此，申請人嘗試利用各種不同的植物油來進行青黛的萃取，而由此所得到的青黛之經油萃取的產物(oil-extracted product of indigo naturalis)在經由臨床試驗後被證實可以有效地治療乾癬(特別是皮膚乾癬以及指甲乾癬)。

發明概要

於是，在第一個方面，本發明提供一種青黛之經油萃取的產物，它是藉由在加熱的條件下以一油來萃取青黛而被製得。

在第二個方面，本發明提供一種用以製備一青黛之經油萃取的產物的方法，其包括：在加熱的條件下以一油來萃取青黛。

依據本發明的青黛之經油萃取的產物經由臨床試驗而被證實對於人類個體的乾癬(特別是皮膚乾癬與指甲乾癬)具有顯著的治療效用。因此，在第三個方面，本發明提供一種用於治療乾癬的藥學組成物，其包含有一如上所述的青黛之經油萃取的產物。

在第四個方面，本發明提供一種用於治療一具有或被懷疑具有乾癬的個體的方法，其包括對該個體投藥以一如上所述的青黛之經油萃取的產物。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。

發明的詳細說明

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

為了本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：術語“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及術語“包括(comprises)”具有一對應的意義。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。

如本文中所用的，術語“乾癬(psoriasis)”意欲涵蓋熟習此項技藝者所詳知的所有類型的乾癬，包括慢性斑塊性乾癬(chronic plaque psoriasis)[亦被稱為尋常性乾癬(vulgaris psoriasis)]、點滴狀乾癬(guttate psoriasis)、紅皮性乾癬(erythrodermic psoriasis)、膿疱性乾癬(pustular psoriasis)、反轉型乾癬(inverse psoriasis)[亦被稱為屈側乾癬 (flexural psoriasis)]、指甲乾癬(nail psoriasis)以及乾癬性關節炎(psoriatic arthritis)等。

傳統上通常是使用有機溶劑來萃取青黛中的各種活性成分，已有研究發現，青黛之經有機溶劑萃取的產物(organic solvent-extracted product of indigo naturalis)能藉由調控角質細胞的增生以及分化來達到抗乾癬的效用。但是，在青黛之經有機溶劑萃取的產物當中所含有的有機溶劑在臨床應用上可能會對人體產生非所欲的副作用(side effect)，同時亦會增加藥物製程的成本。因此，為了開發出在使用上更為安全與便利的抗乾癬藥物，申請人嘗試以各種不同的植物油以及各種萃取操作條件來進行青黛的萃取。

於是，本發明提供一種青黛之經油萃取的產物(oil-extracted product of indigo naturalis)，它是藉由在加熱的條件下以一油來萃取青黛而被製得。

依據本發明，該青黛之經油萃取的產物包含有靛玉紅(indirubin)作為一活性成分。

本發明亦提供一種用以製備一青黛之經油萃取的產物的方法，其包括：在加熱的條件下以一油來萃取青黛。

依據本發明，適用於萃取青黛的油是選自於由下列所構成的群組：動物油(animal oils)、植物油(vegetable oils)、礦物油(mineral oils)以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該青黛的萃取是藉由使用一植物油而被進行。

依據本發明，該植物油可以是，但不限於：棉籽油(cottonseed oil)、橄欖油(olive oil)、芝麻油(sesame oil)、葵花籽油(sunflower seed oil)、花生油(peanut oil)、小麥胚芽油(wheat germ oil)、大豆油(soybean oil)、荷荷巴油(jojoba oil)、月見草油(evening primrose oil)、椰子油(coconut oil)、麻油(sesame oil)、棕櫚油(palm oil)、甜杏仁 油(sweet almond oil)、蘆薈油(aloe oil)、杏核桃仁油(apricot kernel oil)、酪梨油(avocado oil)、琉璃苣油(borage oil)、大麻籽油(hemp seed oil)、夏威夷果仁油(macadamia nut oil)、玫瑰果油(rose hip oil)、胡桃油(pecan oil)、榛果油(hazelunt oil)、山茶花油(sasanqua oil)、米糠油(rice bran oil)、乳油木果油(shea butter)、玉米油(corn oil)、苦茶油(camellia oil)、葡萄籽油(grape seed oil)、芥花油(canola oil)以及蓖麻油(castor oil)。在本發明的一個較佳具體例中，該植物油是橄欖油。

依據本發明，該青黛與該橄欖油的萃取比例是落在1：10(w/v)至1：40(w/v)的範圍內。在本發明的一個較佳具體例中，該青黛與該橄欖油的萃取比例是1：10(w/v)。

依據本發明，該青黛是在一範圍落在100℃至155℃內的溫度下被進行萃取。在本發明的一個較佳具體例中，該青黛是在一為145℃的溫度下被進行萃取。

依據本發明，該青黛在被加熱萃取(heat-extracted)之後可進一步被進行一過濾處理。

依據本發明，該青黛之經油萃取的產物可以藉由該過濾處理來移除靛藍(indigo)以及雜質等。該過濾處理可以採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行。例如，該過濾處理可以藉由使用紗布(cheese cloth)，或者具有一選定的孔徑大小之濾紙(filter paper)或濾膜(filter membrane)而被進行。在本發明的一個較佳具體例中，該過濾處理是藉由使用一具有一孔徑為6μm的濾紙而被進行。

依據本發明的青黛之經油萃取的產物已經由臨床試驗而被證實：對於病患的乾癬病灶(特別是皮膚乾癬病灶以及指甲乾癬病灶)具有顯著的治療效用，並且不會對病患的皮膚產生嚴重的刺激性反應。基於上述，該青黛之經油萃取的產物被預期具有可用於治療乾癬的高潛 力。於是，本發明提供一種用於治療乾癬的藥學組成物，其包含有一如上所述的青黛之經油萃取的產物。

依據本發明，該藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)、局部地(topically)或口服地(orally)投藥的劑型(dosage form)，這包括，但不限於：無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、外部製劑(external preparations)、栓劑(suppositoriums)以及類似之物。

依據本發明的藥學組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。

在本發明的一個較佳具體例中，該藥學組成物被製造成可直接地施用於乾癬病灶上的外部製劑。

依據本發明，該外部製劑可以是，但不限於：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(embrocation)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)以及滴劑(drop)。

依據本發明，該外部製劑是藉由將本發明的青黛之經油萃取的產物與一熟習此項技藝者所詳知的基底(base)相混合而被製備。

依據本發明，該基底可包含有一或多種選自於下列的添加劑(additives)：碳氫化合物(hydrocarbons)[諸如石油膠(petroleum jelly)以 及白凡士林(white petrolatum)]、蠟(waxs)[諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、界面活性劑(surfactants)、吸收增強劑(absorption enhancers)、安定劑(stabilizing agents)、膠凝劑(gelling agents)、活性劑(active agents)、氣味吸收劑(odor absorbers)以及香料(fragrances)等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術人士的專業素養與例行技術範疇內。

在本發明的一個較佳具體例中，該藥學組成物被製造成一軟膏的劑型。在本發明的另一個較佳具體例中，該藥學組成被製造成一滴劑的劑型。

本發明亦提供一種用以治療一具有或被懷疑具有乾癬的個體的方法，其包括對該個體投藥以一如上所述的青黛之經油萃取的產物。

依據本發明，該青黛之經油萃取的產物之投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被治療的疾病之嚴重性，投藥途徑，以及要被治療的個體之體重、年齡、身體狀況與反應。一般而言，依據本發明的藥學組成物的每日投藥劑量通常是0.01mg/Kg體重至1mg/Kg體重，呈單一劑量或是分成數個劑量的形式，且可被口服地投藥或非經腸道地投藥。

依據本發明，該青黛之經油萃取的產物可被單獨地投藥，或是與其他藥物一起組合使用。適合與本發明的青黛之經油萃取的產物一起組合使用的藥物包括，但不限於：皮質類固醇(corticosteroids)、蒽三酚(anthralin)(商品名稱為Margiton^® )、煤焦油(coal tar)(商品名稱為Polytar^® )、促鈣三醇(calcitriol)(商品名稱為Silkis^® )、他紮羅汀(tazarotene)(商品名稱為Tazorac^® )、水楊酸(salicylic acid)、胺甲碟呤(methotrexate,MTX)、環孢素(cyclosporin)、類視色素(retinoids)、阿法賽特(alefacept)(商品名稱為Amevive^® )、依法利珠單抗(efalizumab)( 商品名稱為Raptiva^® )、依那西普(etanercept)(商品名稱為Enbrel^® )以及阿達木單抗(Adalimumab)。

圖1顯示一供用於評估鱗屑、紅斑與厚度的嚴重程度的比對標準圖片；圖2A至2D分別顯示被分別地施用以本發明的粗製軟膏以及精製軟膏的病灶位置隨著時間所測得的鱗屑、紅斑以及厚度的個別平均計分值以及這3個項目的總平均計分值；圖3顯示被分別地施用以本發明的粗製軟膏以及精製軟膏的病灶位置隨著時間所測得的平均病灶面積相對於基準值的百分比值；以及圖4顯示被分別地施用以本發明的粗製軟膏以及精製軟膏的病灶位置隨著時間所測得的病灶外觀的改善百分比值。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。

實施例 實驗材料：

1.在下面實施例中所使用的青黛粉末是購自於光盛貿易有限公司(Guang Sheng Trading,Taipei,Taiwan)。

2.在下面實施例中所使用的各種植物油(vegetable oils)是購自於Sigma,USA。

一般實驗方法：

1.藉由高效能液相層析(high performance liquid chromatography,HPLC)來定量分析(quantitative analysis)在青黛之經油萃取的產物 (oil-extracted product of indigo naturalis)中的靛玉紅(indirubin)：已知靛玉紅為青黛的主要活性成分之一，因此申請人選用靛玉紅作為指標成分(indicator component)來評估不同的操作條件對於青黛之經油萃取的產物的萃取效用(extraction efficiency)。

將下面實施例中所獲得的青黛之經油萃取的產物拿來進行高效能液相層析(HPLC)，而配於氯仿中的靛玉紅(0.1mg/mL)(購自於Alexis,Lausen,Switzerland)被拿來作為對照標準品(control standard)並進行相同的HPLC分析。HPLC定量分析是使用安捷倫1100系列液相層析系統(Agilent 1100 series liquid chromatography system)(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)來進行，而HPLC的各項操作條件被顯示於下面的表1中。

實施例1. 不同的萃取條件對於青黛之經油萃取的產物(oil-extracted product of indigo naturalis)的靛玉紅含量的影響 實驗方法： A、不同的植物油對於青黛之經油萃取的產物的靛玉紅含量的影響：

首先，對7種植物油[包括棉籽油(cottonseed oil)、橄欖油(olive oil)、芝麻油(sesame oil)、葵花籽油(sunflower seed oil)、花生油(peanut oil)、小麥胚芽油(wheat germ oil)以及大豆油(soybean oil)]各取2mL並分別與0.1g青黛粉末相混合，繼而將所形成的混合物置於110℃下加熱歷時30分鐘，藉此而得到7種青黛之經油萃取的粗產物(oil-extracted crude product of indigo naturalis)(它們皆呈藍紫色)。之後，將該7種青黛之經油萃取的粗產物以注射過濾器(syringe filter)(Millipore,France)來過濾並收取濾液(filtrate)，藉此而分別得到7種青黛之經油萃取的產物(它們皆呈紫紅色)。另外，為供比較，2種習知的有機溶劑(包括乙酸乙酯與乙醇)分別被拿來進行相同的萃取步驟，藉此而得到2種青黛之經有機溶劑萃取的產物(organic solvent-extracted product of indigo naturalis)。

之後，對所獲得的7種青黛之經油萃取的產物以及2種青黛之經有機溶劑萃取的產物各取100μL並分別以氯仿予以稀釋10倍，繼而依照上面“一般實驗方法”的第1項「藉由高效能液相層析來定量分析在青黛之經油萃取的產物中的靛玉紅」當中所述的方法來量測靛玉紅的含量。

結果：

表2顯示藉由使用不同的萃取溶劑而被獲得之青黛的萃取產物的靛玉紅定量分析結果。從表2可見，當使用植物油來萃取青黛時所得到的靛玉紅含量是介於使用乙酸乙酯以及乙醇所具者之間。此外，在這些植物油當中，以芝麻油來進行青黛的萃取時所得到的靛玉紅含量是最高的，其次是橄欖油。然而，芝麻油所含有的成分較為複雜並且氣味較重，同時有報導指出芝麻油可能會引起個體的過敏反應。因此，申請人認為：青黛之經橄欖油萃取的產物在臨床應用上是較佳且安 全的。

B、加熱溫度對於青黛之經橄欖油萃取的產物的靛玉紅含量的影響：

首先，將1g的青黛粉末與10mL的橄欖油相混合，繼而將所形成的混合物分別置於100℃、110℃、125℃、145℃以及155℃下加熱歷時30分鐘，然後以注射過濾器予以過濾並收取濾液，藉此而分別得到5種青黛之經橄欖油萃取的產物。之後，對該5種青黛之經橄欖油萃取的產物各取100μL並分別以氯仿予以稀釋10倍，繼而依照上面“一般實驗方法”的第1項「藉由高效能液相層析來定量分析在青黛之經油萃取的產物中的靛玉紅」當中所述的方法來量測靛玉紅的含量。

結果：

表3顯示在不同的加熱溫度下所獲得的青黛之經橄欖油萃取的產物的靛玉紅定量分析結果。從表3可見，在各個加熱溫度下皆可萃取 出靛玉紅，特別地，在145℃下來進行青黛的萃取時所得到的靛玉紅含量是最高的。

C、篩選青黛與橄欖油的較佳萃取比例(extraction ratio)：

首先，將1g、0.5g以及0.25g的青黛粉末分別與10mL的橄欖油相混合，藉此而使得青黛與橄欖油的萃取比例分別為1：10(w/v)、1：20(w/v)以及1：40(w/v)。之後，將所形成的混合物置於145℃下加熱歷時30分鐘，然後以注射過濾器予以過濾並收取濾液，藉此而分別得到3種青黛之經橄欖油萃取的產物。之後，對該3種青黛之經橄欖油萃取的產物各取100μL並分別以氯仿予以稀釋10倍，繼而依照上面“一般實驗方法”的第1項「藉由高效能液相層析來定量分析在青黛之經油萃取的產物中的靛玉紅」當中所述的方法來量測靛玉紅的含量。

結果：

表4顯示以不同的青黛與橄欖油的萃取比例來進行萃取時所獲得的青黛之經橄欖油萃取的產物的靛玉紅定量分析結果。從表4可見，以各種萃取比例來進行青黛的萃取時所得到的靛玉紅含量差異不大。然而，以萃取比例為1：20(w/v)與1：40(w/v)來進行青黛的萃取，當青黛的用量為固定時，增加橄欖油的用量並不會增加在青黛之經橄欖油萃取的產物中的靛玉紅含量，但是會使得該青黛之經橄欖油萃取的 產物的濃度相對變低。因此，申請人認為：以一為1：10(w/v)之青黛與橄欖油的萃取比例來進行萃取時可以得到一含有一較高濃度的靛玉紅的青黛之經橄欖油萃取的產物。

綜合上面第A至C項的實驗結果，申請人將較佳的萃取操作條件彙整於下面的表5中。

實施例2. 本發明的青黛之經橄欖油萃取的產物的大規模製備(large scale preparation)

首先，依據上面表5中所示的萃取操作條件，將90g青黛粉末與900mL的橄欖油置於一不銹鋼鍋中並予以混合，繼而將所形成的混合物置於145℃下加熱歷時30分鐘，藉此而得到一呈藍紫色的青黛之經橄欖油萃取的粗產物。此外，將另一個依據上述所獲得的青黛之經橄欖油萃取的粗產物以一孔徑為6μm的濾紙來進行過濾並收取濾液，藉此而得到一呈紫紅色的青黛之經橄欖油萃取的產物。依據上述所得到的青黛之經橄欖油萃取的粗產物與由之所分離出的青黛之經橄欖油萃取的產物被拿來進行下面的臨床實驗。

另外，為瞭解本發明的青黛之經橄欖油萃取的產物的主要成份分佈，申請人將上面所得到的青黛之經橄欖油萃取的產物拿來進行高效能液相層析，而依據Y.K.Linet al. (2009)(同上述)當中所揭示之方法而得到的青黛之經DMSO萃取的產物被拿來進行相同的HPLC分析以供比較。HPLC分析是使用安捷倫1100系列液相層析系統，而HPLC的各項操作條件是如上面表1中所示者。經由所得到的HPLC洗提圖形(HPLC elution profile)發現：依據本發明所得到的青黛之經橄欖油萃取的產物與依據Y.K.Lin等人所揭示的方法而得到的青黛之經DMSO萃取的產物具有不同的洗提波峰，這表示這兩種萃取物所含有的成份是不相同的(數據未顯示)。

實施例3. 本發明的青黛軟膏(indigo naturalis ointment)在改善人類皮膚乾癬上的效用以及安全性與便利性的評估

為瞭解依據本發明的青黛之經橄欖油萃取的粗產物與由之所分離出的青黛之經橄欖油萃取的產物對於患有皮膚乾癬的人類個體的治療效用(therapeutic effect)以及在使用上的安全性與便利性，下面的臨床試驗(clinical trial)被進行。

實驗材料、個體以及方法： A.青黛之粗製軟膏(crude ointment)與精製軟膏(refined ointment)的製備：

對在上面實施例2中所獲得的青黛之經橄欖油萃取的粗產物以及青黛之經橄欖油萃取的產物各取900mL，繼而對這兩種產物皆加入90g黃蠟(yellow wax)以及90g石油膠(petroleum jelly)，藉此而分別得到一青黛粗製軟膏(indigo naturalis crude ointment)以及一青黛精製軟膏(indigo naturalis refined ointment)備用。

B.實驗個體的篩選與臨床資訊(clinical information)：

參與本臨床試驗的實驗對象是來自於長庚紀念醫院(Chang Gung Memorial Hospital)之中醫門診(Chinese medicine outpatient department)的人類個體，他們必須符合如下面表6中所示之納入標準(inclusion criteria)的每一者，並且不具有該表6中所示之排除標準(exclusion criteria)的任一者。此外，本試驗有經由長庚紀念醫院人體試驗倫理委員會(Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital)的審查而被核准，並且針對所有參與試驗的個體都有取得他們的告知同意書(informed consent)。

本試驗共計有38位病患參加，有關這些病患的臨床資訊[諸如，性別、年齡、病程(duration)、乾癬面積暨嚴重性指數(psoriasis area and severity index,PASI)以及乾癬病灶的體表面積(body surface area,BSA)]被顯示在下面的表7中。

C.人體臨床試驗：

首先，從每位病患的身體部位(排除頭部與頸部)中任選兩處在病症程度上是相似的病灶位置並分別進行拍照與病灶面積的量測，繼而分別施用以上面第A項當中所製得之青黛的粗製軟膏以及精製軟膏(劑量為：每100平方公分的面積施用以1g的軟膏，每天一次)，試驗時間總共歷時8週。在施用軟膏之後的第2、4、6以及8週結束之時，對所有病患的經粗製軟膏治療與經精製軟膏治療的部位分別進行拍照與量測，並依據下面第D項以及第E項當中所述的方法來進行評估。

在整個試驗過程中，總計有35位病患完成所有試驗，而有3位病患僅完成部分試驗，其中1位病患在試驗開始之後的第5週因為被治療的部位有出現搔癢(itching)的情形而退出，另外2位病患在試驗開始之後的第4週以及第6週分別因為工作因素以及搬家無法回診而退出。

D.治療效用的評估： 1.鱗屑(scaling)、紅斑(erythema)以及厚度(thickness)的嚴重性評估：

在施用軟膏之前(亦即在第0週之時)以及在施用軟膏之後的第2、4、6以及8週結束之時，對各個病患的經粗製軟膏治療與經精製軟膏治療的部位進行拍照所得到的照片分別被皮膚科醫師拿來與一比對標準圖片(參見圖1)進行比對，比對項目包括鱗屑、紅斑以及厚度的嚴重性，並以下列5種計分(score)來作為區別的依據：計分0，表示正常；計分1，表示輕微；計分2，表示中度；計分3，表示嚴重；以及計分4，表示非常嚴重。由此可得到經粗製軟膏治療與經精製軟膏治療的部位在不同測試時間點的鱗屑、紅斑以及厚度的個別平均計分值以及這3個項目的總平均計分值。

所得到的實驗數據是以平均值±標準偏差(S.D.)來表示。所有數據是藉由雙因子變異數分析(two-way analysis of variance,two-way ANOVA)來作分析，俾以評估經相同的軟膏治療的部位在各個測試時間點之間的差異性，以及在相同的測試時間點之下經粗製軟膏治療與經精製軟膏治療的部位之間的差異性。若所得到的統計比對結果是p <0.05，代表有統計學顯著性(statistical significance)。

2.病灶面積的變化：

在施用軟膏之前(亦即在第0週之時)以及在施用軟膏之後的第2、4、6以及8週結束之時，對各個病患的經粗製軟膏治療與經精製軟膏治療的部位分別進行病灶面積(以平方公分來表示)的量測，而這兩處治療部位的病灶面積隨著時間的變化是以在不同測試時間點所量測出的平均病灶面積相對於基準值(baseline value)的百分比值來表示，其中基準值是在施用軟膏之前(亦即在第0週之時)所測得的平均病灶面積。有關平均病灶面積相對於基準值的百分比值是參照下面的公式(1)而被計算出：公式(1)：A=(B/C)×100

其中：A=平均病灶面積相對於基準值的百分比值(%)

B=在第0週之時以及在第2、4、6以及8週結束之時所分別測得的平均病灶面積(cm² )

C=在第0週之時所測得的平均病灶面積(cm² )

所得到的實驗數據是以平均值±標準偏差(S.D.)來表示，並參照上面第1點當中所述的方式來進行統計分析。

3.病灶外觀的改善百分比值(improvement percentage of lesion appearance)：

將在上面第1點中於各個測試時間點所測得的鱗屑、紅斑以及厚度這3個項目的總平均計分值以及在上面第2點中於各個測試時間點所測得的平均病灶面積相對於基準值的百分比值相乘，藉此可得到經粗製軟膏治療與經精製軟膏治療的部位在不同測試時間點的面積暨嚴重性計分值(area and severity score)。而這兩處治療部位在不同測試時間點之病灶外觀的改善百分比值是藉由將所得到的面積暨嚴重性計分值代入下面的公式(2)而被計算出：公式(2)：D=[(E-F)/E]×100

其中：D=病灶外觀的改善百分比值(%)

E=在第0週之時所測得的面積暨嚴重性計分值

F=在第2、4、6以及8週結束之時所分別測得的面積暨嚴重性計分值

所得到的實驗數據是以平均值±標準偏差(S.D.)來表示，並參照上面第1點當中所述的方式來進行統計分析。

4.病灶外觀的整體改善的評估：

由皮膚科醫師以目測的方式來比較35位已完成整個試驗的病患在第8週結束與第0週(亦即在施用軟膏之前)之時所分別拍攝到的照片 ，藉此可評估經粗製軟膏治療與經精製軟膏治療的部位之病灶外觀的整體改善情形，並以下列6種計分來作為區別的依據：計分0，表示病灶惡化；計分1，表示沒有改善；計分2，表示輕微改善；計分3，表示中度改善；計分4，表示病灶幾近消失；以及計分5，表示病灶消失。另外，該等病患亦自行目視觀察這兩處治療部位之病灶外觀的整體改善情形，並參照上述的方式來進行計分。

之後，將經由皮膚科醫師評估與病患自行評估所得到的6種計分值所對應的病患人數分別進行統計，並計算出各個計分值所具有的病患人數相對於總病患人數的百分比值。所得到的實驗數據是以百分比來表示，並藉由麥內瑪檢定(McNemar test)來作分析，俾以瞭解醫師所評估的結果與病患自行評估的結果之間的相關性。

E.安全性(safety)與便利性(convenience)的評估：

有關安全性評估是在施用軟膏之後的第2、4、6以及8週結束之時，由研究人員詢問並紀錄病患是否有出現任何皮膚刺激性反應(skin irritation reaction)[包括搔癢(itching)、刺激(irritation)以及紅斑(erythema)]，並以下列4種計分來作為區別的依據：計分0，表示無；計分1，表示輕微；計分2，表示中度；以及計分3，表示嚴重。而便利性評估是在整個試驗結束之後，由參與試驗的每位病患針對該粗製軟膏以及精製軟膏在使用上的便利性來進行比較。

結果： A.依據本發明之青黛的粗製軟膏以及精製軟膏的治療效用的評估：

圖2A至2D分別顯示被分別地施用以本發明的粗製軟膏以及精製軟膏的病灶位置隨著時間所測得的鱗屑、紅斑以及厚度的個別平均計分值以及這3個項目的總平均計分值。從圖2A至2D可見，與在第0週之時(亦即在施用軟膏之前)所測得的計分結果相較之下，分別被治療以粗製軟膏以及精製軟膏的病灶位置所測得的鱗屑、紅斑、厚度的個 別平均計分值以及這3個項目的總平均計分值皆會隨著時間而有顯著的降低，但是這兩處治療部位在相同的時間點之下所測得的各個計分值幾乎沒有差異。

圖3以及圖4分別顯示被分別地施用以本發明的粗製軟膏以及精製軟膏的病灶位置隨著時間所測得的平均病灶面積相對於基準值的百分比值以及病灶外觀的改善百分比值。從圖3以及圖4可見，分別被治療以粗製軟膏以及精製軟膏的病灶位置的面積皆會隨著時間而顯著地變小，而病灶外觀的改善百分比值則會隨著時間而有顯著的增加，但是這兩處治療部位在相同的時間點之下所測得的面積百分比值以及改善百分比值幾乎沒有差異。上面的實驗結果顯示：依據本發明之青黛的粗製軟膏以及精製軟膏皆可以顯著地改善病患的皮膚乾癬病灶。

另外，在整個試驗結束之後，皮膚科醫師與每位病患有就病灶外觀的整體改善情形來進行評估，所得到的結果被顯示於下面的表8中。從表8可見，皮膚科醫師與參與試驗的病患大多認為依據本發明之青黛的粗製軟膏以及精製軟膏能有效地改善乾癬病灶，並且這2種軟膏具有相似的治療效果。

B.依據本發明之青黛的粗製軟膏以及精製軟膏的安全性與便利性評估：

表9顯示在施用軟膏之後的第2、4、6以及8週結束之時，有產生皮膚刺激性反應的病患人數暨其計分結果。從表9可見，在整個試驗過程中，僅有少數病患在被施用以本發明的粗製軟膏以及精製軟膏之後會產生短暫且輕微的搔癢、刺激或紅斑的現象，但是這並不會影響他們接受後續的治療。特別地，該粗製軟膏要比該精製軟膏具有更高的總計分值，這表示本發明的青黛之經橄欖油萃取的粗產物可以經由過濾處理來去除雜質與色素，進而減少病患在使用時可能產生的皮膚刺激性反應。

另外，總共有35位病患完成整個試驗並針對這2種軟膏的使用便利性作一比較，其中有31位病患(88.6%)認為該精製軟膏在使用上是優於該粗製軟膏，有3位病患(8.6%)認為這2種軟膏之間並沒有差別， 僅有1位病患(2.9%)認為該粗製軟膏是較佳的。申請人據此而認為：將青黛之經橄欖油萃取的粗產物進行過濾之後所得到的青黛之經橄欖油萃取的產物，由於所含有的雜質較少並且顏色較淡，因此較不會對病患的皮膚造成刺激性或者在衣物上產生嚴重的染色，進而增加病患在使用時的便利性以及意願。

實施例4. 本發明的青黛滴劑(indigo naturalis drop)在改善人類指甲乾癬(nail psoriasis)上的效用以及安全性的評估

為瞭解依據本發明的青黛之經橄欖油萃取的產物對於人類的指甲乾癬的治療效用以及在使用上的安全性，下面的臨床試驗被進行。

實驗材料、個體以及方法： A.青黛滴劑與橄欖油滴劑的製備：

將上面實施例2中所獲得的青黛之經橄欖油萃取的產物直接分裝至滴瓶(dropping bottles)中並將之使用作為下面臨床試驗中的青黛滴劑。另外，將橄欖油分裝至滴瓶中並將之使用作為下面臨床試驗中的橄欖油滴劑。

B.實驗個體的篩選與臨床資訊：

參與本臨床試驗的實驗對象是來自於長庚紀念醫院之中醫門診的人類個體，他們必須符合如下面表10中所示之納入標準的每一者，並且不具有該表10中所示之排除標準的任一者。此外，本試驗有經由長庚紀念醫院人體試驗倫理委員會的審查而被核准，並且針對所有參與試驗的個體都有取得他們的告知同意書。

本試驗共計有31位病患參加，有關這些病患的臨床資訊(諸如，性別、年齡、病程、PASI以及乾癬病灶的BSA等)被顯示在下面的表11中。

C.人體臨床試驗：

首先，將每位病患的左、右手以隨機的方式區分為實驗組以及對照組並針對指甲乾癬的病灶位置進行拍照，繼而將上面第A項當中所製得的青黛滴劑施用在實驗組指甲的指甲板(nail plate)、指甲皺襞 (nail fold)以及下甲床(hyponychium)上(劑量為：每個指甲施用以0.05至0.1mL的滴劑，每天2次，每次歷時至少30分鐘)，試驗時間總共歷時24週。另外，對照組指甲的臨床試驗是參照上述方法來進行，不同之處在於：在試驗開始之後至第12週結束之時的試驗期間，指甲是被施用以在上面第A項當中所製得的橄欖油滴劑，而在第13週開始至第24週結束之時的試驗期間，則是以青黛滴劑來進行治療。在施用滴劑之後的第4、8、12、16、20以及24週結束之時，對所有病患的對照組與實驗組的指甲進行拍照，並依據下面第D項以及第E項當中所述的方法來進行評估。

在整個試驗過程中，總計有27位病患完成所有試驗，而有4位病患僅完成部分試驗，他們分別是在第8、16、20以及24週退出試驗。

D.治療效用的評估： 1.指甲乾癬嚴重性指數(nail psoriasis severity index,NAPSI)的評估：

在施用滴劑之前(亦即在第0週之時)以及在施用滴劑之後的第4、8、12、16、20以及24週結束之時，對各個病患的對照組以及實驗組的指甲進行拍照所得到的照片分別被用來進行NAPSI評估，而有關NAPSI評估是參照Rich P.and Scher R.K.(2003),J.Am.Acad.Dermatol ,49：206-212當中所述的方法來進行。簡言之，將對照組以及實驗組的指甲分別以一假想水平線(imaginary horizontal line)與一假想垂直線(imaginary longitudinal line)予以區分成四等分(quadrant)，繼而依據下列步驟針對該四等分的指甲乾癬[包括指甲基質乾癬(nail matrix psoriasis)以及甲床乾癬(nail bed psoriasis)]的各項臨床特徵(clinical features)(參見表12)來進行計分：

(a)指甲基質乾癬的臨床特徵的評估：在該指甲的四等分中，針對指甲基質乾癬的每一項臨床特徵來進行評估，並以下列5種計 分來作為區別的依據：計分0，表示四等分皆未表現出任何臨床特徵；計分1，表示在四等分中有一等分表現出臨床特徵中的任一者；計分2，表示在四等分中有二等分表現出臨床特徵中的任一者；計分3，表示在四等分中有三等分表現出臨床特徵中的任一者；以及計分4，表示四等分皆有表現出臨床特徵中的任一者。據此，每個指甲可獲得一關於指甲基質乾癬的臨床特徵的計分值(0~4)。

(b)甲床乾癬的臨床特徵的評估：在該指甲的四等分中，針對甲床乾癬的每一項臨床特徵來進行評估，並參照上面第(a)點中所述的方式來進行計分。據此，每個指甲可獲得一關於甲床乾癬的臨床特徵的計分值(0~4)。

(c)令上述兩點所測得的計分值相加，藉此而得到各個指甲的總計分值(0~8)。

(d)將實驗組與對照組的各個指甲(n=5)所測得的總計分值進行加總，藉此而分別得到實驗組與對照組的NAPSI總計分值(0~40)。

依據上述方式可分別得到所有病患之實驗組與對照組的指甲在不同測試時間點的NAPSI總平均計分值。

另外，在施用滴劑之前(亦即在第0週之時)，對所有病患的指甲所表現出的各項臨床特徵(參見表12)分別進行統計，藉此可得知在實驗組以及對照組的指甲中分別對應於該8項臨床特徵的數目。然後，分別針對實驗組以及對照組的指甲所具有的臨床特徵來進行NAPSI的評估，並以下列5種計分來作為區別的依據：計分0，表示該指甲的四等分皆未表現出該項臨床特徵；計分1，表示在該指甲的四等分中有一等分表現出該項臨床特徵；計分2，表示在該指甲的四等分中有二等分表現出該項臨床特徵；計分3，表示在該指甲的四等分中有三等分表現出該項臨床特徵；以及計分4，表示該指甲的四等分皆有表現出該項臨床特徵。據此，實驗組以及對照組的指甲會分別針對它們所具有的臨床特徵而得到一NAPSI平均計分值(0~4)。

在施用滴劑之後的第12週結束之時，參照上述的方式來分別對實驗組以及對照組的指甲進行計分。據此，實驗組以及對照組的指甲會分別針對它們所具有的臨床特徵而得到一NAPSI平均計分值(0~4)。之後，將實驗組以及對照組的指甲在第0週之時與第12週結束之時所分別測得的NAPSI平均計分值拿來進行比較，藉此可瞭解病患的實驗組以及對照組的指甲所表現出的各項臨床特徵在施用以本發明的青黛滴劑之後的改善情形。

所得到的實驗數據是以平均值±標準偏差(S.D.)來表示。所有數據是藉由混合效果模式(mixed effect model)，繼之以邦弗朗尼檢定(Bonferroni test)來作統計分析，俾以評估實驗組或對照組內在各個測試時間點之間的差異性，以及在相同的測試時間點之下實驗組與對照組之間的差異性。若所得到的統計比對結果是p <0.05，代表有統計學顯著性。

2.經改良的標靶NAPSI(modified target NAPSI)的評估：

從各個病患的實驗組與對照組指甲中分別選擇一個在病症程度 上是最嚴重的標靶指甲(target nail)，繼而將該標靶指甲在施用滴劑之前(亦即在第0週之時)以及施用滴劑之後的第4、8、12、16、20以及24週結束之時所分別拍攝到的照片拿來進行經改良的標靶NAPSI評估，而有關經改良的標靶NAPSI評估是參照Parrish C.A.et al. (2005),J.Am.Acad.Dermatol ,53：745-746當中所述的方法來進行。簡言之，將各個病患之實驗組以及對照組的標靶指甲分別以一假想水平線與一假想垂直線予以區分成四等分，繼而依據下列步驟針對該四等分的指甲乾癬的8項臨床特徵(參見表12)暨其嚴重性來進行計分：

(a)指甲乾癬的臨床特徵的評估：在該標靶指甲的四等分中，針對在上面表12中所示之每一項臨床特徵來分別進行評估，並以下列5種計分來作為區別的依據：計分0，表示四等分皆未表現出該項臨床特徵；計分1，表示在四等分中有一等分表現出該項臨床特徵；計分2，表示在四等分中有二等分表現出該項臨床特徵；計分3，表示在四等分中有三等分表現出該項臨床特徵；以及計分4，表示四等分皆有表現出該項臨床特徵。據此，該標靶指甲會針對各項臨床特徵而分別得到一計分值(0~4)。

(b)指甲乾癬的嚴重性的評估：針對該標靶指甲所出現的每一項臨床特徵的嚴重性來進行評估，並以下列4種計分來作為區別的依據：計分0，表示正常；計分1，表示輕微；計分2，表示中度；以及計分3，表示嚴重。據此，該標靶指甲會針對各項臨床特徵的嚴重性而分別得到一計分值(0~3)。

(c)令上述兩點所測得的計分值相乘，藉此而得到該8項臨床特徵的個別總計分值(0~12)。

(d)將該標靶指甲所分別測得的該8項臨床特徵的總計分值進行加總，藉此而得到經改良的標靶NAPSI總計分值(0~96)。

依據上述方式可分別得到所有病患的實驗組以及對照組的標靶指甲在不同測試時間點的經改良的標靶NAPSI總平均計分值。

所得到的實驗數據是以平均值±標準偏差(S.D.)來表示，並參照上面第1點當中所述的方式來進行統計分析。

3.病灶外觀的改善百分比值：

有關經青黛滴劑治療與經橄欖油滴劑治療之指甲的病灶外觀的改善百分比值是藉由將實驗組與對照組在施用滴劑之前(亦即在第0週之時)以及在施用滴劑之後的第12與24週結束之時所分別測得的NAPSI總平均計分值或經改良的標靶NAPSI總平均計分值代入下面的公式(3)而被計算出：公式(3)：G=(H-I/H)×100

其中：G=病灶外觀的改善百分比值(%)

H=在第0週之時所測得的NAPSI總平均計分值或經改良的標靶NAPSI總平均計分值

I=在第12與24週結束之時所分別測得的NAPSI總平均計分值或經改良的標靶NAPSI總平均計分值

所得到的實驗數據是以平均值來表示，並參照上面第1點當中所述的方式來進行統計分析。

4.病灶外觀的整體改善的評估：

由皮膚科醫師以目測的方式將各個病患在施用滴劑之後的第12以及24週結束之時所拍攝到的照片分別拿來與在第0週之時所拍攝到的照片進行比較，藉此可評估實驗組與對照組指甲之病灶外觀的整體改善情形，並以下列6種計分來作為區別的依據：計分0，表示病灶惡化；計分1，表示沒有改善；計分2，表示輕微改善；計分3，表示中度改善；計分4，表示病灶幾近消失；以及計分5，表示病灶消失。另外，該等病患亦自行目視觀察實驗組與對照組的指甲之病灶外觀的整體改善情形，並參照上述的方式來進行計分。

之後，將經由皮膚科醫師評估與病患自行評估所得到的6種計分值所對應的病患人數分別進行統計，並計算出各個計分值所具有的病 患人數相對於總病患人數的百分比值。所得到的實驗數據是以百分比來表示。

E.安全性的評估：

有關安全性評估是在施用滴劑之後的第4、8、12、16、20以及24週結束之時，由研究人員詢問並且紀錄病患是否有出現任何皮膚刺激性反應(包括搔癢、刺激以及紅斑)，並以下列4種計分來作為區別的依據：計分0，表示無；計分1，表示輕微；計分2，表示中度；以及計分3，表示嚴重。

結果： A.依據本發明的青黛滴劑之治療效用的評估：

表13分別顯示實驗組以及對照組的指甲隨著時間所測得的NAPSI總平均計分值、經改良的標靶NAPSI總平均計分值以及病灶外觀的改善百分比值。從表13可見，與在第0週之時(亦即在施用滴劑之前)所測得的計分結果相較之下，在第4、8以及12週結束之時，實驗組指甲所測得的NAPSI總平均計分值與經改良的標靶NAPSI總平均計分值皆會隨著時間而有顯著地降低。但是，對照組所測得的各個計分值並沒有隨著時間而有明顯的變化。特別地，在第8以及12週結束之時，實驗組指甲所測得的各個計分值皆顯著地低於對照組指甲所具者，而在第12週結束之時，實驗組指甲之病灶外觀的改善百分比值則是顯著地高於對照組指甲所具者。

另外，在第16、20以及24週結束之時，實驗組以及對照組的指甲所測得的各個計分值皆會隨著時間而有顯著地降低，而在第24週結束之時，實驗組以及對照組的指甲所測得的病灶外觀的改善百分比值亦皆有顯著的增加，並且這兩組所測得的數據並無太大的差異存在。特別地，對照組指甲在第24週結束之時所測得的改善百分比值是顯著地高於在第12週結束之時所具者。上面的實驗結果顯示：依據本發明的青黛滴劑可以有效地改善指甲乾癬病灶。

此外，在施用滴劑之前(亦即在第0週之時)以及在施用滴劑之後的第12週結束之時，將30位病患的實驗組以及對照組指甲拿來分別針對指甲乾癬的8項臨床特徵進行NAPSI的評估，所得到的結果被顯示於下面的表14中。從表14可見，在指甲基質乾癬的各項臨床特徵中，以指甲凹陷的發生率為最高，其次為甲板碎裂；而在甲床乾癬的各項臨床特徵中，以甲床分離的發生率為最高，其次為甲床變色，再者為甲下過度角化症。此外，與在第0週之時所測得的數據相較之下，在第12週結束之時，實驗組指甲針對8項臨床特徵所分別測得的計分值皆有降低的情形。特別地，在第12週結束之時，實驗組指甲在甲床分離、甲床變色以及指甲凹陷的改善程度上是顯著地高於對照組所具者。這個實驗結果顯示：依據本發明的青黛滴劑對於病患的指甲乾癬的臨床特徵(特別是甲床分離、甲床變色以及指甲凹陷)具有改善的效用。

a：表示有表現出特定的臨床特徵的指甲數目；b：表示針對特定的臨床特徵進行NAPSI評估後所測得的平均計分值；以及**：當實驗組在第12週結束之時所測得的計分值與對照組所具者相比較，p <0.01。

另外，在施用滴劑之後的第12以及24週結束之時，皮膚科醫師與每位病患有分別就病灶外觀的整體改善情形來進行評估，所得到的結果被顯示於下面的表15中。從表15可見，在第12週結束之時，皮膚科醫師與參與試驗的病患大多認為實驗組指甲的病灶外觀相較於對照組有顯著地改善；而在第24週結束之時，皮膚科醫師與病患則認為實驗組以及對照組指甲的病灶外觀皆有顯著地獲得改善。特別地，對照組指甲在第24週結束之時所測得的病灶的整體改善情形是顯著地優於在第12週結束之時所具者。

B.依據本發明的青黛滴劑之安全性的評估：

在整個試驗過程中，所有被施用以本發明的青黛滴劑的指甲都沒有產生任何的皮膚刺激性反應(數據未顯示)。申請人據此而認為：本發明的青黛之經橄欖油萃取的產物具有發展成為一種抗指甲乾癬之藥物的高潛力，並且可供病患長期的使用而不會產生非所欲的副作用。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

Claims (23)

1. 一種青黛之經油萃取的產物，其係由包含以下步驟之方法所製得：在溫度範圍落在100℃至155℃內的加熱條件下以橄欖油來萃取青黛，其中該青黛與該橄欖油的萃取比例係落在1：10(w/v)至1：40(w/v)的範圍內，藉此獲得青黛之經油萃取的粗產物；且將該青黛之經油萃取的粗產物進行過濾處理，藉此移除靛藍(indigo blus)。
2. 如請求項1的青黛之經油萃取的產物，其中該青黛與該橄欖油的萃取比例係1：10(w/v)。
3. 如請求項1或2的青黛之經油萃取的產物，其包含作為活性成分的靛玉紅(indirubin)。
4. 一種藥學組成物，其包含有如請求項1至3中任一項的青黛之經油萃取的產物，且係調配成供非經腸道投藥或供口服投藥的劑型，其每日投藥劑量是0.01mg/Kg體重至1mg/Kg體重，呈單一或多個劑量的形式。
5. 一種藥學組成物，其包含有如請求項1至3中任一項的青黛之經油萃取的產物，且係調配成供局部投藥的劑型。
6. 如請求項5的藥學組成物，其中該劑型係選自乳劑、凝膠、軟膏、乳霜、貼片、擦劑、氣溶膠、噴霧劑、乳液、乳漿(serum)、糊劑、泡沫或滴劑。
7. 如請求項5或6的藥學組成物，其中該劑型係軟膏。
8. 如請求項7的藥學組成物，其中該軟膏包含以下賦形劑：蠟，及 石油膠。
9. 如請求項5或6的藥學組成物，其中該劑型係滴劑。
10. 一種藥學組成物，其包含青黛之經油萃取的產物，該產物係藉由包含以下步驟之方法所製得：在溫度範圍落在100℃至155℃內的加熱條件下以油來萃取青黛，藉此獲得青黛之經油萃取的粗產物；且將該青黛之經油萃取的粗產物進行過濾處理，藉此移除靛藍；其中該藥學組成物係調配成供局部投藥的劑型。
11. 如請求項10的藥學組成物，其中該劑型係選自乳劑、凝膠、軟膏、乳霜、貼片、擦劑、氣溶膠、噴霧、乳液、乳漿、糊劑、泡沫或滴劑。
12. 如請求項10或11的藥學組成物，其中該劑型係軟膏。
13. 如請求項12的藥學組成物，其中該軟膏包含以下賦形劑：蠟，及石油膠。
14. 如請求項10或11的藥學組成物，其中該劑型係滴劑。
15. 一種藥學組成物，其包含藉由包含以下步驟的方法所製得的青黛之經油萃取產物：在溫度範圍落在100℃至155℃內的加熱條件下以油來萃取青黛，藉此獲得青黛之經油萃取的粗產物；且將該青黛之經油萃取的粗產物進行過濾處理，藉此移除靛藍；其中每日投藥劑量是0.01mg/Kg體重至1mg/Kg體重，呈單一或多個劑量的形式。
16. 如請求項15的藥學組成物，其係呈供非經腸道投藥或供口服投藥的劑型。
17. 一種如請求項4至9中任一項的藥學組成物的製備方法，其包含 將如請求項1至3中任一項的青黛之經油萃取的產物與一或多種選自以下的添加劑混合：碳氫化合物、蠟、保存劑、抗氧化劑、界面活性劑、吸收增強劑、安定劑、膠凝劑、活性劑、氣味吸收劑或香料。
18. 一種如請求項10至16中任一項的藥學組成物的製備方法，其包含將青黛之經油萃取的產物與一或多種選自以下的添加劑混合：碳氫化合物、蠟、保存劑、抗氧化劑、界面活性劑、吸收增強劑、安定劑、膠凝劑、活性劑、氣味吸收劑或香料；其中該青黛之經油萃取的產物係藉由包含以下步驟的方法所製得：在溫度範圍落在100℃至155℃內的加熱條件下以油來萃取青黛，藉此獲得青黛之經油萃取的粗產物；且將該青黛之經油萃取的粗產物進行過濾處理，藉此移除靛藍。
19. 如請求項17或18的方法，其中該碳氫化合物係選自石油膠、白凡士林或其組合。
20. 如請求項17或18的方法，其中該蠟係選自石蠟、黃蠟或其組合。
21. 一種製劑，其包含如請求項4至16中任一項之藥學組成物與選自由以下藥劑所組成之群之組合：皮質類固醇、蒽三酚(anthralin)、煤焦油(coal tar)、促鈣三醇(calcitriol)、他紮羅汀(tazarotene)、水楊酸(salicylic acid)、胺甲碟呤(methotrexate,MTX)、環孢素(cyclosporin)、類視色素(retinoids)、阿法賽特(alefacept)、依法利珠單抗(efalizumab)、依那西普(etanercept)以及阿達木單抗(Adalimumab)。
22. 一種如請求項1至3中任一項的青黛之經油萃取產物的用途，其係製造用於治療乾癬之藥劑，其與選自由以下藥劑所組成之群之組合使用：皮質類固醇、蒽三酚、煤焦油、促鈣三醇、他紮羅汀、水楊酸、胺甲碟呤、環孢素、類視色素、阿法賽特、依 法利珠單抗、依那西普以及阿達木單抗。
23. 一種青黛之經油萃取產物的用途，其係製造用於治療乾癬之藥劑，其與選自由以下藥劑所組成之群之組合使用：皮質類固醇、蒽三酚、煤焦油、促鈣三醇、他紮羅汀、水楊酸、胺甲碟呤、環孢素、類視色素、阿法賽特、依法利珠單抗、依那西普以及阿達木單抗；其中該青黛之經油萃取產物係藉由包含以下步驟的方法所製得：在溫度範圍落在100℃至155℃內的加熱條件下以油來萃取青黛，藉此獲得青黛之經油萃取的粗產物；且將該青黛之經油萃取的粗產物進行過濾處理，藉此移除靛藍。