BR112017021190B1

BR112017021190B1 - Uso de uma composição farmacêutica que compreende um extrato de indigo naturalis

Info

Publication number: BR112017021190B1
Application number: BR112017021190-4A
Authority: BR
Inventors: Laurent Chantalat; Philippe Andres
Original assignee: Galderma Sa.
Priority date: 2015-04-09
Filing date: 2016-04-08
Publication date: 2021-12-21
Also published as: BR112017021190A2; JP6749935B2; US20190160128A1; JP2018510889A; US20200147163A1; AU2016245204B2; WO2016162485A1; EP3209314A1; US20170304381A1; US10555985B2; CN107466234A; US10232006B2; EP3209314B1; AU2016245204A1; CA2980667A1; TW201701893A; MX2017012596A; TWI737602B; US11116811B2; KR20170132880A

Abstract

composição farmacêutica e o uso da mesma. a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica, bem como ao uso da composição em aplicações médicas.

Description

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção se refere a uma composição farmacêutica, bem como ao uso da composição em aplicações médicas.

ANTECEDENTES

Os tratamentos convencionais para a psoríase geralmente são concebidos de acordo com a idade, sexo, ocupação e capacidade cognitiva de um paciente, os tipos e distribuição das lesões, resposta(s) do paciente a método(s) terapêutico(s) prévio(s) e outros históricos médicos do paciente. Os métodos terapêuticos primários para psoríase incluem terapia tópica, terapia sistêmica, injeção de biologias e fototerapia. As composições para terapia tópica incluem, por exemplo, corticosteroides, antralina (disponibilizado como Margiton®), alcatrão mineral (disponibilizado como Polytar®), calcitriol (disponibilizado como Silkis®), tazaroteno (disponibilizado como Tazorac®), ácido salicílico, e essas composições são adequadas para tratar pacientes com psoríase com sintomas leves. As preparações orais de, por exemplo, metotrexato (MTX), ciclosporina, e retinoides são comumente usadas para terapia sistêmica e são adequadas para tratar pacientes com psoríase com sintomas de médio a grave. As biologias incluem alefacept (disponibilizado como Amevive®), efalizumab (disponibilizado como Raptiva®), etanercept (disponibilizado como Enbrel®) e adalimumab (disponibilizado como Humira®), e os mesmos são adequados para injeção em pacientes com psoríase com sintomas de médio a grave. A fototerapia, por exemplo, fototerapia de luz ultravioleta B (UVB), fotoquimioterapia, tal como psoraleno mais luz ultravioleta A (PUVA), é adequada para tratar pacientes com psoríase com sintomas graves.

No entanto, métodos terapêuticos adicionais são desejáveis.

SUMÁRIO

A presente invenção, em parte, se refere a uma composição farmacêutica incluindo pelo menos 65 % (p/p) de um derivado de indirubina, com base no peso total de ingredientes ativos.

Os ingredientes ativos, de acordo com a presente invenção, se referem a ingredientes incluindo um ou mais derivados de indirubina, derivados de índigo, derivados de triptantrina, derivados de isatina e derivados qingdainona, ou a um extrato vegetal (por exemplo, um extrato de Indigo Naturalis ou um extrato refinado de Indigo Naturalis) contendo um ou mais dos derivados de indirubina, derivados de índigo, derivados de triptantrina, derivados de isatina e derivados de qingdainona.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica com pelo menos 65 % (p/p) de um derivado de indirubina, com base no peso total de ingredientes ativos (por exemplo, pelo menos 70 %, 75 %, 80 % ou 85 % (p/p) com base no peso total de ingredientes ativos), e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em algumas modalidades, a composição compreende 65-90 % (p/p) de um derivado de indirubina e 0-15 % de um derivado de índigo, com base no peso total de ingredientes ativos, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, o derivado de indirubina, incluindo um ou mais derivados de indirubina, pode estar em uma quantidade de 65-90 % (p/p), por exemplo, 65-70 %, 65-75 %, 65-80 %, 65-85 %, 65-90 %, 70-75 %, 70-80 %, 70-85 %, 70-90 %, 75-80 %, 75-85 %, 75-90 %, 80-85 %, 8090 %, ou 85-90 % (p/p), com base no peso total de ingredientes ativos. O derivado de índigo, incluindo um ou mais derivados de índigo, pode estar em uma quantidade de 015 %, por exemplo, 0,05-15 %, 0,1-15 %, 0,5-15 % (p/p), com base no peso total de ingredientes ativos.

Em alguns exemplos, um derivado de indirubina, incluindo um ou mais derivados de indirubina, pode estar em uma quantidade de 20-500 ppm com base na composição farmacêutica, por exemplo, 20-100 ppm, 20-200 ppm, 20-300 ppm, 20-400 ppm, 20-500 ppm, 50-100 ppm, 50-200 ppm, 50-300 ppm, 50-400 ppm, 50-500 ppm, 100-200 ppm, 100-300 ppm, 100-400 ppm, 100-500 ppm, 200-300 ppm, 200-400 ppm, 200-500 ppm, 300-400 ppm, 300500 ppm ou 400-500 ppm.

Em alguns outros exemplos, um derivado de índigo, incluindo um ou mais derivados de índigo, pode estar em uma quantidade de 0,1-40 ppm com base na composição farmacêutica, por exemplo, 0,1-5 ppm, 0,l-l0 ppm, 0,1-20 ppm, 0,1-30 ppm, 0,1-40 ppm, l-5 ppm, 1-10 ppm, l-20 ppm, l-30 ppm, l-40 ppm, 5-10 ppm, 5-20 ppm, 5-30 ppm, 5-40 ppm, 10-20 ppm, 10-30 ppm, 10-40 ppm, 20-30 ppm, 20-40 ppm ou 30-40 ppm.

Em algumas outras modalidades, a composição compreende adicionalmente um derivado de triptantrina. O derivado de triptantrina, incluindo um ou mais derivados de triptantrina, pode estar em uma quantidade de 0,01-5 % (p/p) com base no peso total de ingredientes ativos, por exemplo, 0,1-1 %, 0,15 %, 0,5-1 % ou 0,5-5 % (p/p), com base no peso total de ingredientes ativos.

Em alguns exemplos, um derivado de triptantrina, incluindo um ou mais derivados de triptantrina, pode estar em uma quantidade de 0,1-10 ppm com base na composição farmacêutica, por exemplo, 0,1-1 ppm, 0,1-5 ppm, 0,1-10 ppm, l-5 ppm, 1-10 ppm, ou 5-10 ppm.

Em outras modalidades, a composição compreende adicionalmente um derivado de qingdainona. O derivado de qingdainona, incluindo um ou mais derivados de qingdainona, pode estar em uma quantidade de 0,1-5 % (p/p), com base no peso total de ingredientes ativos, por exemplo, 0,1-1 %, 0,13 %, 0,5-1 %, ou 0,5-5 % (p/p) com nos ingredientes ativos.

Em alguns exemplos, um derivado de qingdainona, incluindo um ou mais derivados de qingdainona, pode estar em uma quantidade de 0,1-10 ppm com base na composição farmacêutica, por exemplo, 0,1-1 ppm, 0,1-5 ppm, 0,1-10 ppm, l-5 ppm, 1-10 ppm, ou 5-10 ppm.

Em algumas outras modalidades, a composição compreende adicionalmente um derivado de isatina como um componente. O derivado de isatina, incluindo um ou mais derivados de isatina, pode estar em uma quantidade de 0,1-5 % (p/p), com base nos ingredientes ativos.

Em alguns exemplos, um derivado de isatina, incluindo um ou mais derivados de isatina, pode estar em uma quantidade de 0,1-10 ppm com base na composição farmacêutica, por exemplo, 0,1-1 ppm, 0,1-5 ppm, 0,1-10 ppm, l-5 ppm, 1-10 ppm, ou 5-10 ppm.

Em uma modalidade adicional, a composição farmacêutica compreende: - de 0,002 % a 0,077 % (p/p) de um extrato refinado de Indigo Naturalis, e - um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o extrato refinado de Indigo Naturalis compreende de 65 % a 90 % (p/p) de indirubina e um ou mais dos derivados selecionados da lista que consiste em índigo, triptantrina e qingdainona nas seguintes quantidades: - índigo: 0,1 a 15 % (p/p) do extrato refinado, - triptantrina: 0,01 a 5 %, de preferência 0,1 a 5 % (p/p) do extrato refinado, e - qingdainona: 0,1 a 5 % (p/p) do extrato refinado.

Em uma modalidade particular, a composição da invenção está em uma forma para administração tópica ou administração oral.

Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição conforme descrita acima para uso no tratamento ou alívio de uma doença ou condição selecionada a partir do grupo que consiste em psoríase, condições inflamatórias da pele, onicomicose, câncer de pele, doenças induzidas pela queratinização anormal, envelhecimento da pele, dermatose pustulosa.

Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para inibir a proliferação ou diferenciação dos queratinócitos, inibir a infiltração de células mononucleares na derme e epiderme, inibir a alteração vascular resultando em vasos sanguíneos hiperelásticos, ou inibir a suprarregulação de moléculas de adesão em células do endotélio compreendendo o contato da composição descrita acima com uma célula necessitando desta. O método pode ser usado in vivo ou in vitro.

Ainda em outro aspecto, a presente invenção proporciona o uso de uma composição conforme descrita acima na preparação de um produto para o tratamento ou alívio de uma doença ou condição selecionada a partir do grupo que consiste em psoríase, condições inflamatórias da pele, onicomicose, câncer de pele, doenças induzidas pela queratinização anormal, envelhecimento da pele, dermatose pustulosa ou linfoma cutâneo de células T (LCCT).

Ainda em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para o tratamento de doenças ou condições da pele compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma composição conforme descrita acima a um indivíduo (por exemplo, seres humanos) que necessitem dela. A doença ou condição é selecionada a partir do grupo que consiste em psoríase, condições inflamatórias da pele, onicomicose, câncer de pele, doenças induzidas pela queratinização anormal, envelhecimento da pele, dermatose pustulosa e LCCT. Em algumas modalidades, as condições inflamatórias da pele podem ser dermatite atópica (DA), eczema ou pele superinfeccionada. O envelhecimento da pele pode ser rejuvenescimento da pele, regeneração tecidual de cicatrizes ou senescência da pele. A queratinização anormal pode ser acne, ictiose ou ceratodermia palmoplantar. O câncer de pele pode ser câncer de pele pré-canceroso, por exemplo, ceratose actínica (AK), doença de Bowen; câncer de pele, por exemplo, SCC, BCC, NMSC; melanoma e câncer de pele induzido por HPV. DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As características acima e outras características e as vantagens da presente invenção se tornarão aparentes com referência à seguinte descrição detalhada e desenhos anexos. Figura 1: Cromatogramas de HPLC ilustrativos de índigo (A) e indirubina (B).

Figura 2: Cromatogramas de HPLC ilustrativos de triptantrina (A), Qingdai (B) e um extrato refinado do exemplo 2 (C).

Figura 3: Grupo e dosagem para avaliação in vivo de extratos de Qingdai no modelo de psoríase induzida por IL-22. Cinco estudos foram concebidos e descritos nos estudos 1-5, respectivamente. No Estudo 1, l00 ng e 500 ng de IL-22 em 20 μl, i.d., foram usados para a indução. Nos Estudos 2-5, 500 ng de IL-22 em 20 μl de soro fisiológico, i.d., foram usados para a indução.

Figura 4: As figuras ilustram a inflamação da orelha após injeção intradérmica de IL-22. Nos estudos, orelhas de camundongos foram injetadas por via intradérmica e a espessura da orelha foi medida nos dias entre as injeções.

Figura 5: As figuras ilustram os efeitos dos extratos de Indigo Naturalis na inflamação da orelha após a injeção intradérmica de IL-22.

DESCRIÇÃO DETALHADA

O Indigo Naturalis, por exemplo, Qingdai, é um pó azul escuro preparado a partir de folhas de plantas portadoras de

Índigo ou plantas que produzem índigo. As ditas plantas são, de preferência, selecionadas a partir do grupo que consiste em Indigofera tinctoria L., Baphicacanthus cusia (Nees) Bremek (sin. Strobilanthes cusia (Nees), Persicaria tinctoria (Aitón) Spach. (sin. Polygonum tinctorium Aitón, P tinctorium Lour.) e Isatis tinctoria L. (sin. Isatis indigotica Fort.).

Qingdai é o nome atual para Indigo Naturalis. Ele é extraído de plantas que contêm índigo ou plantas produtoras de índigo com uma solução aquosa de NaOH ou KOH e corresponde a uma mistura de cerca de 5-15 % compostos orgânicos, incluindo alcaloides, entre os quais índigo e indirubina estão presentes, e 85-95 % de compostos inorgânicos como o carbonato de cálcio e hidróxido de cálcio.

Conforme usado neste documento, indirubina, índigo, triptantrina, isatina e qingdainona têm as seguintes estruturas.

Um derivado de indirubina, conforme usado neste documento, se refere à indirubina bem como a um derivado desta, por exemplo, representado pela fórmula I

em que, X é um heteroátomo selecionado dentre qualquer um de N, O e S; no caso de X=N, N está ligado a uma hidroxila ou a uma alquila substituída com hidroxila, halogênio ou NH2; R1 e R2 são um ou mais substituintes selecionados dentre hidrogênio, alquila, OH, halogênio, NH2, SO3H, NO2; e a alquila mencionada anteriormente é, por exemplo, uma alquila tendo de um a seis átomos de carbono.

Um derivado de índigo, conforme usado neste documento, se refere ao índigo bem como a um derivado deste, por exemplo, representado pela fórmula II

X, R1 e R2 são definidos como aqueles na Fórmula I.

Exemplos de derivados de índigo e derivados indirubina são conforme a seguir: - N-metilisoindigotina (meisoindigo); - N-acetil-indirubina; e - Compostos representados conforme a seguir: - Compostos representados conforme a seguir:

Um derivado de triptantrina, conforme usado neste documento, se refere à triptantrina bem como a um derivado desta. Um derivado de triptantrina se refere a um composto contendo um núcleo de triptantrina, ou seja, um anel quinazolina fundido a uma porção indol. Um exemplo de um derivado de triptantrina é a faitantrina A, B, C, D ou E; metilisatoide, ou orfiuroidina, tal como descrito em Ashli M. Tucker e Peter Grundt, The chemistry of tryptanthrin and its derivatives, ARKIVOC 2012 (i) 546-569.

Um derivado de isatina, conforme usado neste documento, se refere à isatina bem como a um derivado desta. Um derivado de isatina se refere a um composto obtido a partir de isatina, por exemplo, aqueles divulgados em Yun Mi Chung et al., Synthesis of ortho-Acetamidomandelic Acid Derivatives from Isatins, Bull. Korean Chem. Soc. 2002, Vol. 23, No. 10 1363; Ankur Patel et al., Synthesis and Antimicrobial Activity of Some New Isatin Derivatives, Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2006) 4: 249-254; ou Olcay Bekircan et al., Synthesis of Schiff and Mannich Bases of Isatin Derivatives with 4-Amino-4,5-Dihydro-lH-l,2,4-Triazole-5- Ones, Molecules 2008, 13, 2126-2135.

Um derivado de qingdainona se refere à própria qingdainona bem como um derivado desta. Um derivado de qingdainona se refere a um composto obtido a partir de qingdainona.

O termo “uma quantidade eficaz” se refere a uma dose da composição farmacêutica que produz um benefício terapêutico (por exemplo, melhora, alívio ou cura das doenças, distúrbios ou sintomas) a um paciente, em média.

Os ingredientes ativos descritos acima podem ser sintetizados quimicamente por métodos conhecidos de um técnico no assunto, ou extraídos de uma planta contendo índigo, por exemplo, um extrato de Indigo Naturalis.

Um processo de preparação de um extrato refinado de Qingdai é descrito abaixo.

Indigo Naturalis é obtido a partir de folhas e talos de plantas contendo índigo ou plantas produtoras de índigo, de preferência, selecionadas a partir do grupo que consiste em Indigofera tinctoria L., Baphicacanthus cusia (Nees) Bremek (sin. Strobilanthes cusia (Nees), Persicaria tinctoria (Aiton) Spach. (sin. Polygonum tinctorium Aiton, P. tinctorium Lour.) e Isatis tinctoria L. (sin. Isatis indigotica Fort.). Embora o Indigo Naturalis ou Qingdai estejam disponíveis comercialmente (exemplos de Indigo Naturalis disponíveis comercialmente (planta/fornecedor): Baphicacanthus cusia/Delong; KMA Indigoferatinctoria/KMA Exports ou SAM VEGETABLE COLOURS PVT LTD ou SICHUAN XIELI; Isatis tinctoria/ANDREA PRIMAVERA ou Bleu de Lectoure; Polygonum tinctorium/Couleur Garance ou EARL 4 Saisons), ele pode ser produzido a partir de folhas e/ou talos de uma ou mais das plantas acima por métodos comumente conhecidos no estado da técnica. Estes métodos podem ser resumidos conforme a seguir: folhas e talos recentemente colhidos de Persicaria Tinctoria e/ou Baphicacanthus cusia são adicionados a uma piscina ao ar livre, é adicionada a água à piscina suficiente para cobrir os talos/folhas. Após imersão durante alguns dias (26-30 °C), os talos/folhas ficarão podres. Em seguida é adicionado soda cáustica com agitação. Quando a cor da mistura muda de verde para violeta escuro, o precipitado é coletado, lavado (geralmente com água, 2-3 vezes) e depois seco para proporcionar pós de Indigo Naturalis.

Um extrato refinado pode ser preparado por um processo compreendendo: a) uma etapa de extração: extração de Indigo Naturalis, ou das folhas e/ou talos de uma ou mais plantas conforme selecionadas acima, com um primeiro solvente polar ou moderadamente polar, para obter uma mistura de extração; b) uma etapa de filtração: filtração da mistura de extração para obter um filtrado; c) uma etapa de concentração: concentração do filtrado para obter um extrato bruto; d) uma etapa de lavagem: lavagem do extrato bruto com um solvente apolar e, opcionalmente, um segundo solvente polar, para obter uma mistura de lavagem; e e) uma etapa de filtração: filtração da mistura de lavagem para obter um extrato refinado, opcionalmente após uma etapa de secagem, por exemplo, de acordo com um método convencional de secagem.

Em uma modalidade particular, um extrato bruto obtido a partir da etapa de concentração c) é submetido ao seguinte procedimento, durante pelo menos um ciclo, até a obtenção de um extrato refinado: o extrato bruto é lavado com um solvente (etapa (d)), e filtrado (etapa (e)) para produzir um extrato refinado, opcionalmente seguido por uma etapa de secagem. De acordo com uma modalidade específica, a etapa de lavagem d) e a etapa de filtração e) são realizadas durante apenas um ciclo, para obtenção do extrato refinado. Quando é empregado mais de um ciclo, podem ser usados os mesmos solventes ou solventes diferentes para a lavagem. Além disso, o extrato bruto pode ser lavado com um solvente sob refluxo, a mistura pode ser resfriada até a temperatura ambiente e, em seguida, filtrada para produzir um extrato refinado, opcionalmente seguido por uma etapa de secagem.

Em uma modalidade preferida, são realizados dois ciclos. Particularmente, o extrato bruto obtido na etapa de concentração c) é lavado com um solvente apolar, de preferência hexano (etapa d), e filtrado (etapa e), opcionalmente seguido por uma etapa de secagem. O extrato de hexano é, então, lavado com um solvente polar orgânico, de preferência etanol (etapa (d)), e filtrado (etapa (e)) para produzir um extrato refinado, opcionalmente seguido por uma etapa de secagem.

Opcionalmente, é realizada uma etapa de micronização após a etapa e), proporcionando assim um extrato refinado com um tamanho de partícula entre 25 e 35 μm, de preferência de cerca de 30 μm.

Em uma modalidade preferida, um extrato refinado pode ser preparado por um processo compreendendo as seguintes etapas que consistem em: a) (i) adição de um solvente de extração, um solvente polar ou moderadamente polar (como um álcool ou acetato de etila), ao pó de Indigo Naturalis para obter uma mistura; (ii) aquecimento e agitação da mistura durante um período de tempo (por exemplo, 30 min, 1 hora, 2 horas); b) (iii) filtração da mistura aquecida enquanto ainda está quente para remover subprodutos insolúveis, para obter um filtrado; c) (iv) concentração do filtrado para obter um extrato bruto; d) (v) adição de um solvente de lavagem (por exemplo, água, um solvente apolar e/ou um solvente polar ou uma mistura destes) ao extrato bruto para obter uma mistura de lavagem; (vi) aquecimento e agitação da mistura de lavagem durante um período de tempo (por exemplo, 30 min, 1 hora, 2 horas); e) (vii) filtração da mistura de lavagem, por exemplo, em temperatura ambiente (por exemplo, 18-35 °C) para coletar um extrato refinado; opcionalmente (viii) repetição das etapas (v) a (vii) até que a quantidade de indirubina (% p/p) no extrato refinado seja superior a 55 % (p/p), de preferência superior a 65 % (p/p), conforme medido pelo método de HPLC divulgado no Exemplo 8A e, opcionalmente, (ix) secagem do resíduo de acordo com um método convencional (por exemplo, secagem a ar, liofilização) para obter um extrato seco. O solvente de lavagem nas etapas (v) e (viii) pode ser igual ou diferente.

Em uma modalidade mais preferida, um extrato refinado é preparado por um processo compreendendo as etapas de: a) extração de Indigo Naturalis com etanol em refluxo entre 2 e 8 horas, b) filtração da mistura a uma temperatura não inferior a 65 °C para obter um filtrado, c) concentração do filtrado para obter um extrato bruto, o dito extrato bruto sendo opcionalmente filtrado (com adição de água) para remover completamente o solvente e os últimos componentes ainda presentes no solvente e seco, d)(i) lavagem do extrato bruto com hexano a uma temperatura não inferior a 50 °C entre 15 e 60 min, ii) filtração em temperatura ambiente da mistura obtida na etapa d) (i) para obter um produto, opcionalmente enxaguando tal produto com etanol e água, (iii) lavagem do produto obtido na etapa d) (ii) com etanol em refluxo, e e) filtração à temperatura ambiente da mistura de lavagem obtida na etapa d) e secagem do produto resultante a uma temperatura inferior a 80 °C, para obter um extrato que é opcionalmente micronizado.

Em outra modalidade preferida, quando o extrato refinado é micronizado na última etapa, o tamanho de partícula fica na faixa de 25 a 35 μm, de preferência cerca de 30 μm.

Em outra modalidade preferida, quando o extrato refinado é micronizado na última etapa, 99 % das partículas obtidas tem um tamanho menor ou igual a 30 μm.

Conforme usado neste documento, “cerca de” ou “em torno de” será entendido por um técnico no assunto e variará até certo ponto no contexto em que é usado. Se existirem usos do termo que não estão claros para um técnico no assunto no contexto em que são usados, os termos “cerca de” ou “em torno de” significarão até mais ou menos 20 %, de preferência 10 % do termo particular.

O termo “extrato refinado", conforme usado neste documento, se refere a um extrato sólido, semissólido ou oleoso, de preferência um extrato sólido, que contém menos de 10 % (p/p) de água e/ou solventes usados no processo de preparação do dito extrato refinado. Um extrato refinado é caracterizado, mais de preferência, por um aumento da quantidade de ingredientes ativos, incluindo alcaloides entre os quais estão presentes índigo, indirubina, triptantrina e/ou qingdainona, de preferência enriquecido em indirubina, em comparação com o Qingdai ou Indigo Naturalis. Mais especificamente, o extrato refinado de acordo com a invenção compreende pelo menos 60 %, ou mais de preferência mais de 65 % (p/p) de ingredientes ativos, incluindo índigo, indirubina, triptantrina e/ou qingdainona.

O termo “extrato bruto”, conforme usado neste documento, se refere a um extrato sólido, semissólido ou oleoso, de preferência um extrato sólido ou semissólido, que contém menos de 15 % (p/p) (por exemplo, 5-15 %, 5-10 %) de água e/ou solventes usados no processo de preparação do extrato refinado. O extrato bruto é menos enriquecido em indirubina do que o extrato refinado, em comparação com o Qingdai ou Indigo Naturalis. O extrato bruto é obtido pela etapa de concentração c) de acordo com a invenção. A etapa de concentração é mais particularmente realizada pelo envio do filtrado para um concentrador (por exemplo, a pressão reduzida), de modo a remover a água e/ou solventes usados no processo e, assim, concentrar os ingredientes ativos presentes no extrato, incluindo índigo, indirubina, triptantrina, isatina e/ou derivados de qingdainona.

“Um ciclo”, conforme usado neste documento, se refere às duas etapas da etapa de lavagem d) e etapa de filtração e) que são realizadas sequencialmente uma vez; “dois ciclos”, conforme usado neste documento, se refere às duas etapas da etapa de lavagem d) e etapa de filtração e) que são realizadas sequencialmente duas vezes.

O teor de ingredientes como índigo, indirubina, triptantrina e qingdainona pode ser quantificado por métodos de HPLC, conforme divulgado no Exemplo 8.

O extrato refinado de Qingdai mencionado acima ou um extrato refinado a partir de folhas e/ou talos de uma planta contendo índigo ou plantas produtoras de índigo, de preferência, selecionadas a partir do grupo que consiste em

Indigofera tinctoria L., Baphicacanthus cusia (Nees) Bremek (sin. Strobilanthes cusia (Nees), Persicaria tinctoria (Aiton) Spach. (sin. Polygonum tinctorium Aiton, P tinctorium Lour.) e Isatis tinctoria L. (sin. Isatis indigotica Fort.) inclui indirubina como um componente em uma quantidade de pelo menos 65 % (p/p) do extrato refinado. O extrato está em uma forma sólida e pode ser preparado pelo processo descrito acima ou qualquer outro processo adequado. O extrato pode incluir adicionalmente índigo, triptantrina, qingdainona e/ou quaisquer derivados destes compostos, que podem ser co- extraídos juntamente com a indirubina. Em particular, o extrato contendo vários ingredientes pode proporcionar um efeito sinérgico.

No extrato refinado obtido pelo processo acima, estão presentes um derivado de indirubina e pelo menos um ou mais derivados de índigo, triptantrina e qingdainona nas seguintes quantidades: - Derivado de índigo: de 0,1 % a 15 % (p/p) do extrato refinado, - Derivado de indirubina: de 65 % a 90 % (p/p) do extrato refinado, - Derivado de triptantrina: de 0,01 a 5 % (p/p), de preferência de 0,1 % a 5 % (p/p) do extrato refinado, - Derivado de qingdainona: de 0,1 % a 5 % (p/p) do extrato refinado.

E uma modalidade preferida, no extrato refinado obtido pelo processo acima, estão presentes indirubina e pelo menos um ou mais de índigo, triptantrina e qingdainona nas seguintes quantidades: - índigo: de 0,1 % a 15 % (p/p) do extrato refinado, - indirubina: de 65 % a 90 % (p/p) do extrato refinado, - triptantrina: de 0,01 a 5 % (p/p), de preferência de 0,1 - a 5 % (p/p) do extrato refinado, - qingdainona: de 0,1 % a 5 % (p/p) do extrato refinado.

A presente invenção proporciona ainda uma composição farmacêutica, que pode ser formulada em uma forma de dosagem adequada para administração oral ou tópica, usando tecnologia bem conhecida por um técnico no assunto. A composição farmacêutica pode compreender adicionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável como aqueles amplamente empregados no estado da técnica de fabricação de fármacos. Por exemplo, o veículo farmaceuticamente aceitável pode incluir um ou mais dos seguintes agentes: solventes tais como azeite de oliva, azeite de oliva refinado, óleo de semente de algodão, óleo de gergelim, óleo de semente de girassol, óleo de amendoim, óleo de germe de trigo, óleo de soja, óleo de jojoba, óleo de prímula, óleo de coco, óleo de palma, óleo de amêndoas doces, óleo de aloé, óleo de caroço de damasco, óleo de abacate, óleo de borragem, óleo de semente de cânhamo, óleo de macadâmia, óleo de rosa mosqueta, óleo de noz pecan, de óleo de avelã, óleo de sasanqua, óleo de farelo de arroz, manteiga de karité, óleo de camélia, óleo de semente de uva, óleo de canola, óleo de rícino e combinações destes, de preferência azeite de oliva refinado, emulsionantes, agentes de suspensão, agentes de decomposição, ligantes, excipientes, agentes estabilizantes, agentes quelantes, diluentes, gelificantes, agente espessante tal como cera de abelha e/ou vaselina, conservantes, lubrificantes, agentes de atraso da absorção, lipossomas, antioxidantes como butil-hidroxitolueno ou butil-hidroxianisol e semelhantes. De preferência, a composição farmacêutica é formulada em uma formulação de uso tópico que pode ser aplicada diretamente à pele, por exemplo, uma pele que sofre de psoríase. A formulação tópica adequada para a composição farmacêutica pode ser uma emulsão, um gel, uma pomada, um creme, um emplastro, um líquido para embrocação, um aerossol, um spray, uma loção, um soro, uma pasta, uma espuma ou uma gota. Em uma modalidade da presente invenção, a composição farmacêutica é formulada em uma preparação externa pela mistura do extrato de acordo com a presente invenção com uma base como aquelas bem conhecidas e de uso comum no estado da técnica.

Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica, conforme divulgada acima, pode compreender de 0,002 % e 0,077 % (p/p) de um extrato refinado de Indigo Naturalis e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o extrato refinado de Indigo Naturalis compreende de 65 % a 90 % (p/p) de derivado de indirubina e um ou mais derivados selecionados da lista que consiste em índigo, triptantrina e qingdainona com as seguintes quantidades: - derivado de índigo: 0,1 a 15 % (p/p) do extrato refinado, - derivado de triptantrina: 0,01 a 5 %, de preferência 0,1 a 5 % (p/p) do extrato refinado, e - derivado de qingdainona: 0,1 a 5 % (p/p) do extrato refinado.

Em algumas modalidades preferidas, uma composição farmacêutica, conforme divulgada acima, pode compreender de 0,002 % e 0,077 % (p/p) de um extrato refinado de Indigo Naturalis e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o extrato refinado de Indigo Naturalis compreende de 65 % a 90 % (p/p) de indirubina e um ou mais derivados selecionados da lista que consiste em índigo, triptantrina e qingdainona com as seguintes quantidades: - índigo: 0,1 a 15 % (p/p) do extrato refinado, - triptantrina: 0,01 a 5 %, de preferência 0,1 a 5 % (p/p) do extrato refinado, e - qingdainona: 0,1 a 5 % (p/p) do extrato refinado.

Em algumas modalidades, a dosagem e a frequência de administração da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção podem variar de acordo com os seguintes fatores: a gravidade da doença a ser tratada, a via de administração e o peso, idade, estado físico e a resposta do indivíduo a ser tratado. Em outras modalidades ou modalidades adicionais, a quantidade de ingredientes ativos na composição farmacêutica está na faixa de cerca de 0,001 a cerca de 1000 mg/kg de peso corporal/dia, por exemplo, cerca de 0,01 a cerca de 500, 300 ou 100 mg/kg de peso corporal/dia. I

As composições acima podem ser usadas no tratamento ou alívio de uma doença ou condição. Por tratamento, entende-se pelo menos um alívio dos sintomas associados à condição patológica que aflige o indivíduo, onde o alívio é usado em um sentido amplo para se referir a pelo menos uma redução na magnitude de um parâmetro, por exemplo, sintoma associado à condição patológica sendo tratada, como dermatite, psoríase e semelhantes. Como tal, o tratamento inclui também situações em que a condição patológica, ou pelo menos os sintomas associados a esta, são completamente inibidos, por exemplo, impedidos ou interrompidos, por exemplo, terminados, de modo que o hospedeiro já não sofre da condição patológica, ou pelo menos dos sintomas que caracterizam a condição patológica. Como tal, o tratamento inclui tanto a cura e o controle de uma condição de doença. Por conseguinte, as composições acima podem ser usadas no tratamento ou alívio de uma doença ou condição selecionada a partir do grupo que consiste em psoríase, condições inflamatórias da pele, onicomicose, câncer de pele, doenças induzidas pela queratinização anormal, envelhecimento da pele e dermatose pustulosa.

A presente invenção proporciona ainda um método para inibir a proliferação ou diferenciação dos queratinócitos, inibir a infiltração de células mononucleares na derme e epiderme, inibir a alteração vascular resultando em vasos sanguíneos hiperelásticos, ou inibir a suprarregulação de moléculas de adesão em células do endotélio compreendendo a administração das composições acima a um indivíduo necessitando desta.

A eficácia das composições pode ser avaliada por modelos in vitro com relação às suas atividades na inibição da proliferação ou diferenciação ou inflamação. Por exemplo, testes in vitro podem ser realizados nas vias envolvidas na sinalização de citocinas, STAT-3/STAT-1, MAPK, NFKB.

A eficácia das composições pode ser adicionalmente avaliada por modelos in vitro com relação às suas atividades no tratamento de doenças ou distúrbios. Por exemplo, camundongos geneticamente modificados, incluindo os modelos transgênicos e knockout, podem ser testados.

As características inovadoras do pedido de patente são apresentadas com particularidade nas reivindicações anexas. Um melhor entendimento dos recursos e das vantagens do presente pedido serão obtidos com referência à seguinte descrição detalhada que define as modalidades ilustrativas, nas quais os princípios do pedido são utilizados.

Embora as modalidades preferidas do presente pedido tenham sido mostradas e descritas no presente documento, tais modalidades são fornecidas a título de exemplo apenas. Deve ser entendido que podem ser empregadas várias alternativas às modalidades do pedido de patente descrito aqui, na prática do pedido. Técnicos no assunto compreenderão que inúmeras variações, alterações e substituições são possíveis sem se afastar do escopo do presente pedido. Pretende-se que as seguintes reivindicações definam o escopo dos aspectos do pedido e que os métodos e estruturas dentro do escopo dessas reivindicações e seus equivalentes sejam cobertos por tal.

Deve ser entendido que, se qualquer publicação do estado da técnica for referida no presente documento, essa referência não constitui uma admissão de que a publicação faz parte dos conhecimentos gerais comuns do estado da técnica. Todos os documentos, ou porções de documentos, citados no pedido incluindo, sem limitação, patentes, pedidos de patente, artigos, livros, manuais e tratados são expressamente incorporados por meio desse a título de referência em suas totalidades para qualquer propósito.

A porcentagem no presente documento é expressa em peso relativo ao peso do extrato ou do produto especificado, salvo caso especificação contrária.

Aspectos e vantagens adicionais da invenção serão revelados na seguinte seção experimental ilustrativa.

EXEMPLOS 1. Preparação de extratos refinados de Indigo Naturalis e métodos analíticos para análise

Exemplo 1: Preparação de um extrato refinado de Indigo Naturalis Qingdai, conforme usado na seguinte preparação, é obtido a partir da Delong Pharmaceutical (Índigo a 2,62 % e Indirubina a 0,284 % (método HPLC retratado no Exemplo 7A) e triptantrina a 0,0046 % (método HPLC retratado no Exemplo 8B)). 500 g de Qingdai foram suspensos em 10 l de acetato de etila. A mistura foi agitada em refluxo por duas horas, e, então, filtrada a 75 °C. O filtrado foi concentrado em pressão reduzida para render um sólido escuro. O extrato bruto foi agitado em 250 ml de hexano e aquecido sob refluxo durante uma hora. Após resfriamento até a temperatura ambiente, a suspensão foi filtrada para dar um resíduo escuro. 0,50 g do resíduo escuro foram novamente aquecidos sob refluxo em 25 ml de hexano durante uma hora e resfriados até a temperatura ambiente, seguido por filtração para dar um extrato refinado de 452 mg como um sólido vermelho escuro. HPLC: 62,9 % de indirubina, 12,9 % de índigo e 0,53 % de triptantrina.

Exemplo 2: Preparação de um extrato refinado de Indigo Naturalis 500 g de Qingdai, conforme usado no Exemplo 1, foram suspensos em 10 l de álcool (etanol). A mistura foi agitada em refluxo por 2 horas e, em seguida, filtrada a 75 °C. O filtrado foi concentrado em pressão reduzida para produzir um sólido escuro, o qual foi agitado em 260 ml de hexano e aquecido sob refluxo durante uma hora. Após resfriamento até a temperatura ambiente, a suspensão foi filtrada para dar um resíduo escuro. 0,80 g do resíduo escuro foram novamente aquecidos sob refluxo em 24 ml de álcool (etanol) durante uma hora adicional e, em seguida, resfriados até a temperatura ambiente, seguido por filtração para dar um extrato refinado de 538 mg como um sólido vermelho escuro. HPLC: 83,6 % de indirubina, 6,35 % de índigo e 0,75 % de triptantrina.

Exemplo 3: Preparação de um extrato refinado de Indigo Naturalis 500 g de Qingdai, conforme usado no Exemplo 1, foram suspensos em 10 l de acetato de etila. A mistura foi agitada em refluxo por duas horas, e, então, filtrada enquanto quente. O filtrado foi concentrado em pressão reduzida para produzir um sólido escuro. O extrato bruto foi agitado em 250 ml de hexano e aquecido sob refluxo durante uma hora. Após resfriamento até a temperatura ambiente, a suspensão foi filtrada para dar um resíduo escuro. 0,75 g do resíduo escuro foram aquecidos sob refluxo em 22,5 ml de etanol durante uma hora e resfriados até a temperatura ambiente, seguido por filtração para dar um extrato refinado de 538 mg como um sólido vermelho escuro. HPLC: 77,9 % de indirubina, 15,9 % de índigo e 0,56 % de triptantrina.

Exemplo 4: Preparação de um extrato refinado de Indigo Naturalis 500 g de Qingdai, conforme usado no Exemplo 1, foram suspensos em 2,1 l de DMF. A mistura foi agitada a 50 °C por 40 minutos. Após resfriamento até 20 °C, a suspensão foi filtrada. O filtrado foi concentrado em pressão reduzida para produzir um sólido escuro, o qual foi agitado em 130 ml de hexano e aquecido sob refluxo por uma hora. Após resfriamento até 20 °C, a suspensão foi filtrada para dar um resíduo escuro. 1,56 g do resíduo escuro foram lavados com 46,8 ml de etanol e aquecidos sob refluxo por uma hora e, em seguida, resfriados a 20 °C, seguido por filtração para produzir um extrato refinado (766 mg). HPLC: 66,3 % de indirubina, 9,76 % índigo.

Exemplo 5: Preparação de um extrato refinado de Indigo Naturalis 500 g de Qingdai, conforme usado no Exemplo 1, foram suspensos em 3 l de DMF. A mistura foi agitada a 30 °C por 1 hora, e, então, filtrada. O filtrado foi concentrado em pressão reduzida para produzir um sólido escuro, o qual foi agitado em 230 ml de hexano e aquecido sob refluxo por uma hora. Após resfriamento até 20 °C, a suspensão foi filtrada para dar um resíduo escuro. 1,96 g do resíduo escuro foram lavados com 59 ml de etanol a 85 % (solução aquosa de etanol a 85 %), e aquecido sob refluxo durante uma hora, seguido por filtração enquanto ainda estava quente para produzir um extrato refinado (1,02 g). HPLC: 69,4 % de indirubina, 18,7 % de índigo e 0,62 % de triptantrina.

Exemplo 6: Preparação de um extrato refinado de Indigo Naturalis 100 g de Qingdai foram extraídos com 2 l de etanol a 92 % (solução aquosa de etanol a 92 %) por 2 horas sob refluxo. Mediante a finalização, a mistura foi filtrada enquanto quente em filtro AF6 (Buchner) para obter uma solução de vermelho azulado escuro como um filtrado. Este filtrado foi reduzido à vácuo até a secura para dar 2,4 g de resíduo seco. Esse resíduo foi lavado com 120 ml de hexano por 1 h sob refluxo. Mediante a finalização, a mistura foi resfriada a temperatura ambiente por 2 h, então, filtrada sob vácuo para gerar 312,9mg de um extrato refinado vermelho escuro. 280 mg desse extrato refinado foram lavados com 15 ml de etanol a 92 % (etanol aquoso a 92 %) por 1 h sob refluxo. Mediante a finalização, a solução foi resfriada a temperatura ambiente, e, então, filtrada para gerar 159 mg de um extrato refinado vermelho escuro/grená após secagem em forno (80 °C) por 1 h e 30 min. (0,18 %); HPLC: 82,31 % de indirubina, 8,99 % de índigo e 0,81 % de triptantrina.

Exemplo 7: Etapa de micronização A etapa de micronização do extrato refinado de Indigo Naturalis obtido nos exemplos anteriores é realizada com os seguintes equipamentos: - Micronizador: moinho de jato espiral de diâmetro 200 - Alimentador: este equipamento é usado para a dosagem de pó que alimenta o moinho micronizador. A dosagem é feita por dois parafusos. Este sistema permite uma regularidade de fluxo.

A micronização consiste em projetar os grãos de pó com jato de ar. O contato dos grãos permite sua explosão.

Os seguintes parâmetros de micronização são registrados durante a micronização: - Pressão do anel: 6 bar - Pressão do injetor: 3 bar - Vazão de alimentação do pó: 25 kg/h

O moinho micronizador possui um compartimento cilíndrico - orifícios em torno do compartimento para a injeção de ar.

Em pó é introduzido no micronizador; os grãos são impulsionados pelo jato de ar. Quando os grãos tiverem tamanho bom, os mesmos são concentrados no centro do micronizador e são respirados. Para evitar qualquer contaminação por partículas estranhas ou pedaços quebrados do equipamento, é realizado um peneiramento adicional (peneira: 700 μm).

A etapa é feita manualmente após a micronização e antes do empacotamento.

Uma análise granulométrica do produto homogêneo obtido foi realizada de acordo com o método de distribuição de tamanho de partículas (PSD) [especificações analíticas: D99 < 30 μm].

Exemplo 8: Métodos analíticos para análise A - Método de HPLC de fase reversa: Foi estabelecido um novo método de HPLC de fase reversa para quantificar o índigo e indirubina simultaneamente, com base na Farmacopeia Europeia (Pharmeuropa Vol. 20, N° l de janeiro de 2008, P118-119.), Farmacopeia Chinesa (Edição 2010, P185) e documentos da literatura (Chen LW, Liao W, Yang M., Jia DY, He P, Chen SM, Fu CM. Determination of indigo and indirubin in Indigo Naturalis by HPLC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, 23(6), 714-715; Liu ZY, Su ZT, Gao YN, Yang M. Simultaneously determination of indigo and indirubin in Indigo Naturalis by HPLC. China Pharmacist 2010, 13(3), 324-326).

O sistema cromatográfico (Agilent Série 1200) consistiu em um desgaseificador G1322A, uma bomba G1211A, um amostrador automático G1367B, um forno de coluna G1316A e um detector G1315B DAD. Outros aparelhos incluíram um dispositivo ultrassônico SK 7200 H (China) e um sistema de purificação de água Milli-Q (EUA). Seis lotes de Qingdai foram coletados a partir de três fornecedores na China. O índigo padrão foi comprado da Tokyo Chemical Industry Co. (Japão, >98 %). A triptantrina foi comprada de Accela Co. (China, 97 %). A indirubina foi sintetizada e recristalizada na Hutchison Medipharma (HMP) (>99 % por HPLC).

Uma membrana de filtração orgânica (0,45 μm, China), dimetil formamida (DMF, grau analítico), metanol (grau para HPLC), ácido fórmico (FA, grau para HPLC), trietilamina (TEA, grau analítico) e água ultrapura purificada com o sistema de purificação de água Milli-Q foram usados nos experimentos. Pré-tratamento da solução de DMF: 500 ml de DMF foram soprados N2 seco durante meia hora, em seguida foram adicionados 0,5 ml de TEA e misturados para proporcionar uma solução de DMF (contendo 0,1 % de TEA, isento de oxigênio).

Esta solução de DMF foi usada na preparação da amostra. 50 mg de Qingdai foram suspensos em 50 ml de solução de DMF. Após a extração ultrassônica por 10 min, a suspensão foi filtrada através de um filtro de seringa de 0,45 μm para gerar a solução de teste de Qingdai. 20 mg de extrato seco de Indigo Naturalis (obtido a partir do Exemplo 2) foram suspensos em 200 ml de solução de DMF. Após a extração ultrassônica, a suspensão foi filtrada através de um filtro de seringa de 0,45 μm para gerar a solução de teste de Indigo Naturalis.

A separação foi realizada em uma coluna Waters Simmetry C18 (5 μm, 3,9x150 mm). A fase móvel foi metanol a 65 % (contendo 0,05 % de FA). A vazão foi de 1,0 ml/min por 15 min e a temperatura da coluna foi de 25 °C. O volume de injeção foi de 4 μl. O comprimento de onda de detecção foi 289 nm, de modo que o índigo e indirubina pudessem ser dosados simultaneamente. O índigo e a indirubina puderam ser analisados simultaneamente em uma injeção. Cromatogramas de HPLC típicos de índigo e indirubina são mostrados na Figura 1. B - Método analítico de HPLC para quantificar a triptantrina:

Um novo método de análise por HPLC para quantificar a triptantrina também foi estabelecido. A concentração da amostra é ajustada de acordo, devido à baixa concentração de triptantrina em ambos o Qingdai e em seu produto enriquecido, o extrato seco. As análises foram realizadas a 25 °C em uma coluna Waters Simmetry C18 (5 μm, 3,9x150 mm). A fase móvel foi metanol (contendo 0,05 % de FA, eluente B) e água (contendo 0,05 % de FA, eluente A). O perfil do gradiente de eluição foi o seguinte: 50 % B isocrático (12 min), 50 % para 100 % B (1 min), 100 % B isocrático (6 min) e 100 % para 50 % B (1 min). A vazão foi de 1,0 ml/min por 15 min e a temperatura da coluna foi de 25 °C. O volume de injeção foi de 10 μl. O comprimento de onda de detecção foi de 254 nm. 400 mg de Qingdai foram suspensos em 20 ml de solução de DMF. Após a extração ultrassônica por 20 min, a suspensão foi filtrada através de um filtro de seringa de 0,45 μm para gerar a solução de teste de Qingdai. 15 mg de extrato seco (obtido a partir do Exemplo 2) foram suspensos em 20 ml de solução de DMF. Após a extração ultrassônica, a suspensão foi filtrada através de um filtro de seringa de 0,45 μm para proporcionar a solução de teste de extrato seco.

Cromatogramas de HPLC típicos de triptantrina, Qingdai e extrato seco são mostrados na Figura 2.

2. Avaliação in vitro de extratos refinados de Indigo Naturalis em ensaios bioquímicos e celulares

Exemplo 9: Ensaios in vitro e resultados

A. Reagentes gerais:

DMSO, Sigma-Aldrich, St. Fouis, MO, N° de Cat. D2650 Janus quinase 1 (JAK1), Life Technologies™, N° de Cat. PV4774 Janus quinase 1 (JAK2), Life Technologies™, N° de Cat. PV4210 Janus quinase 1 (JAK3), Life Technologies™, N° de Cat. PV3855 CDK1, Life Technologies™, N° de Cat. PV3292 CDK2, Life Technologies™, N° de Cat. PV3267 CDK5, Life Technologies™, N° de Cat. PV3000 Kit de ensaio de quinase Z'-LYTE® - peptídeo tirosina 6, Life Technologies™, N° de Cat. PV4122 Kit de ensaio de quinase Z'-LYTE® - peptídeo Ser/Thr 12, Life Technologies™, N° de Cat. PV3673 Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), Life Technologies™, N° de Cat. Cl 1965 RMPI-1640, Life Technologies™, N° de Cat. A10491 Soro bovino fetal (SBF), Life Technologies™, N° de Cat. 10099141 Meio EpiLife ®, Life Technologies™, N° de Cat. M-EPI-500-CA HKGS, Life Technologies™, N° de Cat. S-001-5 IL-2 recombinante humano, Peprotech Inc, N° de Cat. 200-02 IL-6 recombinante humano, Peprotech Inc, N° de Cat. 200-06 IL-3 recombinante humano, Peprotech Inc, N° de Cat. 200-03 GM-CSF recombinante humano, Peprotech Inc, N° de Cat. 300-03 IL-22 recombinante humano, Peprotech Inc, N° de Cat. 200-22 TNFα recombinante humana, R&D, N° de Cat. 210-TA-010 Lipopolissacarídeo (LPS), Calbiochem, N° de Cat. 437650 Anti-Human CD3 Functional Grade® Purificado (aCD3) (Clone: OKT3) eBioscience, N° de Cat. 16-0037-85 Anti-Human CD28 Functional Grade® Purificado (aCD28) (Clone: CD28.2), eBioscience, N° de Cat. 16-02897-85 Anticorpo fosfo-STAT3 (Y705) (anti-humano de coelho), Cell Signaling Technology, N° de Cat. 9145 Anticorpo fospo-STAT5 (Y694) (anti-humano de coelho), Cell Signaling Technology, N° de Cat. 9359 Anticorpo actina (anti-humano de camundongo) Sigma-Aldrich, N° de Cat. A1978 IgGAlexa 488 anti-coelho de cabra, Life Technologies™, N° de Cat. A11034 IROYE 800CW anti-coelho de cabra, Li-COR Bioscience, N° de Cat. 926-32211 IROYE 800CW anti-camundongo de cabra, Li-COR Bioscience, N° de Cat. 926-32210 Kit ELISA IFNY humano, R&D, N° de Cat. DY285 Kit ELISA TNFα humano, R&D, N° de Cat. DY210 Kit ELISA IL-lβ humano, R&D, N° de Cat. DY201 Kit ELISA IL-6 humano, R&D, N° de Cat. N° DY201 Tiazolil Azul de Tetrazólio Azul (MTT), Sigma-Aldrich, N° de Cat. M2128 Ensaio de viabilidade celular por luminescência CellTiter- Glo®, Promega, N° de Cat. G7572 Ensaio de integridade de membrana homogênea CytoTox-ONE™, Promega, N° de Cat. G7891 Ensaio de luciferase, Promega, N° de Cat. E4550 Pilha de transferência iBlot®, Regular (nitrocelulose), Life Technologies™, N° de Cat. IB3010-01 lodeto de propídio, Sigma-Aldrich, N° de Cat. P4170 Ribonuclease A, Sigma-Aldrich, N° de Cat. R6513 Tampão lXPBS (1 l): 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 3,58 g de Na2HPO4-12H2O, 0,24 g de KH2PO4, dissolvidos em 1 l de ddH2O da MilliQ, pH ajustado para 7,4. Tampão de carregamento de lxSDS: 50 mM de Tris-HCl/pH 8,8, 2 % de SDS, 10 % de glicerol, 0,1 % de azul de bromofenol, 100 mM de DTT.

B. Célula e linhagens celulares

HepG2, uma linhagem celular de carcinoma hepatocelular humano, adquirida de Shanghai Institutes for Biological Sciences (SIBS) (Shanghai, China, N° de cat. TCHu 72), foi cultivada em DMEM contendo 10 % de SBF. TF1, uma linhagem celular de eritroleucemia humana, adquiridos de American Tissue Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, N° de cat. CRF-2003™), foi cultivada em RMPI- 1640 contendo 10 % de SBF e 2 ng/ml de GM-CSF a 37 °C com 5 % de CO2. PBMC: Amostras de sangue humano normal de doadores adultos saudáveis foram coletadas em tubos heparinizados. Cada experimento independente usou sangue a partir de um único doador saudável. Células mononucleares (PBMC) foram isoladas com reagente de Ficoll-Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Suécia, N° de cat. 17-1440-02) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante e cultivadas em RMPI-1640 contendo 10 % de SBF a 37 °C com 5 % de CO2. Células T primárias: Células mononucleares (PBMC) foram isoladas com reagente de Ficoll-Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Suécia, N° de cat. 17-1440-02) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. Em seguida as células foram ativadas usando anti-CD3 (1 μg/ml) e anti-CD28 (5 μg/ml) por 3 dias, e expandidas em RMPI-1640 contendo 10 % de SBF e l0 ng/mF de IL-2 a 37 °C com 5 % de CO2 a cada 2-3 dias por 2 semanas antes de realizar os experimentos.

HaCaT, uma linhagem de queratinócito epidérmico humano, foi uma espécie de presente do prof. YuYiZhi ((The Second Military Medical University (SMMU), China) e foi cultivada em meio DMEM contendo 10 % de SBF.

HEKa, queratinócitos epidérmicos humanos isolados da pele de adultos, adquirido da Life Technologies™ (Carlsbad, CA, EUA, N° de cat. C-005-5C) e cultivados em meio EpiLife ® contendo HKGS a 37 °C com 5 % de CO2.

A linhagem celular 293/NFkB-Luc foi adquirida da Panomics (Fremont, CA, N° de cat. RC0014). Ela foi obtida por co-transfecção com pNFKB-Luc e pHyg em células embrionárias de rim humano 293, seguido por seleção com higromicina. As células foram cultivadas em meio DMEM contendo 10 % de SBF e 100 μg/ml de higromicina B (Life Technologies™, N° de cat. 10687-010).

C. Ensaio de quinase

Ensaios de quinase JAK1/2/3 foram realizados in vitro usando JAK1/2/3 recombinante humano e o kit de ensaio Z'- LYTE® - peptídeo 6 tirosina. Ensaios de quinase CDK1/2/5 foram realizados in vitro usando CDK1/2/5 recombinante humano e o kit de ensaio Z'-LYTE® - peptídeo 12 Ser/Thr. Todas as reações (20 μl) foram iniciadas pela adição de 2,5 μl de controle positivo (CP-690550 para o ensaio de quinase JAK e estaurosporina para o ensaio de quinase CDK) ou os artigos de teste (isto é, as amostras) em solução de DMSO a 4 %, 5 μl da mistura de substrato quinase/peptídeo ou solução fosfo- peptídica, 2,5 μl de Solução de ATP (l00 μM) ou 1,33 x tampão de quinase. A placa de ensaio de 384 poços (Coming, N° de cat. 3575) foi misturada e incubada em temperatura ambiente por 1 hora. 5 μl da solução de desenvolvimento foi então adicionada a cada poço, misturada e incubada a temperatura ambiente durante outra 1 hora. As reações da quinase foram então interrompidas adicionando 5 μl de reagente de parada seguido pelo registro da fluorescência a 450 nm e 520 nm usando um leitor de placas Perkin-Elmer Victor III (Perkin- Elmer Life Sciences, Boston, MA).

D. Ensaio Acumen

Para a fosforilação de STAT3 induzida por IL-6, HepG2 foram semeadas em placas de 96 poços a 5,4 x l03células por poço em meio DMEM isento de soro a 37 °C, 5 % de CO2 durante a noite. Após a incubação com CP-690550 ou artigos de teste por 30 minutos, as células foram estimuladas pela adição de l00 ng/ml de IL-6 recombinante humano (1:10) em cada poço por 15 minutos.

Para a fosforilação de STAT5 induzida por IL-3, TF-1 foram semeadas em placas de 96 poços a 1 x l04células por poço a 37 °C, 5 % de CO2 por 3 horas. Após a incubação com CP-690550 ou artigos de teste por 30 minutos, as células foram estimuladas pela adição de l00 ng/ml de IL-3 recombinante humano (1:10) em cada poço por 30 minutos.

As células HepG2 ou TF1 foram então fixadas em paraformaldeído a 2 % por 45 minutos em temperatura ambiente e incubadas em metanol gelado por 30 minutos. Após lavagem com PBS, as células foram incubadas com anticorpo anti-fosfo- STAT3 (Y705) ou anti-fosfo-STAT5 (Y694), respectivamente, a 4 °C durante a noite. Anticorpo secundário IgG anti-coelho de cabra Alexa 488 foi adicionado por 90 minutos antes das lavagens com PBS. As células foram contadas após a incubação em PBS contendo 7,5 μM iodeto de propídio e 100 μg/ml de ribonuclease A por 60 minutos no escuro. A placa foi lida em um instrumento Acumen X3 (TPP Labtech. Hertfordshire SG8, Reino Unido).

E. Western blot

HEKa foram semeadas em placas de 6 poços a 2 x 105 células/poço a 37 °C, 5 % de CO2 durante a noite. Após a incubação com o artigo de teste por 30 minutos, as células foram estimuladas com l00 ng/ml de IL-22 por 30 minutos.

Após o tratamento, as amostras foram coletadas em tampão de carregamento lxSDS. Amostras de proteínas foram fervidas por 15 minutos e coletadas por centrifugação a 14.000 g por 10 min a 4 °C. Os sobrenadantes foram usados ou imediatamente armazenados a -80 °C. Para o ensaio de Western blot, as amostras foram separadas em um gel de eletroforese com gradiente de 10 % de Tris-HCL (Bio-Rad Laboratories). Os géis foram manchados em uma pilha de transferência iBlot®, regular (nitrocelulose) que foi bloqueada com 5 % de leite seco desnatado e investigados usando anticorpo anti-fosfo-STAT3 (Y705) ou anticorpo anti-actina a 4 °C durante a noite, respectivamente. A membrana foi então incubada com o anticorpo secundário IDRye 800CW apropriado, seguido por detecção usando o sistema de imagem por infravermelho Odyssey Infrared Imaging System (Li-COR Bioscience, Lincoln, NE, EUA).

F. Ensaios de Repórter

Para ensaios com genes repórter, células 293/NFKB-LUC foram semeadas em placa de 96 poços a 4 x 104células por poço durante a noite. Após a incubação com Andrografólido (LGT) ou artigos de teste por 30 minutos, as células foram estimuladas ao adicionar l00 ng/ml de TNFα (1:10) a cada poço por 6 horas. Lisados de células foram preparados pela remoção do meio e adição de tampão de lise. Reagente de Ensaio de Reagente de Luciferase de volume de 5x foi adicionado a cada poço antes da placa de leitura. A luminescência foi registrada usando um leitor de placas Perkin-Elmer Victor III (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, EUA).

G. Ensaio ELISA

Células T primárias foram semeadas em placas de 96 poços a 8 x 104células/poço. Artigos de teste foram adicionados às culturas e estas incubadas a 37 °C, 5 % de CO2. Após 30 minutos, a suspensão de células em cada poço foi transferida para outra placa de 96 poços revestida com um CD3 (1 μg/ml) e um CD28 (5 μg/ml) e incubada a 37 °C com 5 % de CO2 por 22 horas. O meio foi removido e armazenado a -80 °C até a realização do ensaio. As concentrações de IFNY foram determinadas usando um kit ELISA comercial (R & D Systems), de acordo com as instruções do fabricante.

Células PBMC foram semeadas em placas de 96 poços a 3 x 104células/poço. Artigos de teste foram então adicionados à cultura e incubados a 37 °C, 5 % de CO2. Após 30 minutos, foi adicionado 1 μg/ml de LPS (1:10) à cultura. Para quantificação dos níveis de proteína, as placas foram incubadas por 18 horas. O meio foi removido e armazenado a - 80 °C até a realização do ensaio. As concentrações de TNFα, IL-lβ e IL-6 foram determinadas usando um kit ELISA comercial (R & D Systems), de acordo com as instruções do fabricante.

H. Ensaio MTT

Células HaCat foram semeadas em placas de 96 poços a 4 x 104células/poço. Estausporina ou artigos de teste foram então adicionados à cultura e incubados a 37 °C, 5 % de CO2 por 72 horas. Após a remoção do meio, as células em placas de 96 poços foram expostas a 10 μL de MTT (0,5 mg/ml em meio DMEM contendo 10 % de SBF por poço) e incubadas por 3 horas a 37 °C, 5 % de CO2. Posteriormente, os sobrenadantes foram removidos e foram adicionados 150 μl de DMSO em cada poço. A placa foi incubada no escuro por 10 minutos e a absorvância a 492 nm foi registrada imediatamente usando um leitor de microplacas Multiskan MK3 (Thermo Life Sciences, HK, China).

I. Ensaio de Viabilidade Celular

Ensaio de viabilidade celular por luminescência CellTiter-Glo®. O kit foi usado para investigar a viabilidade celular. Células HEKa foram semeadas em placas de 96 poços a 4 x 104 células/poço. Ditranol ou artigos de teste foram então adicionados à cultura e incubados a 37 °C, 5 % de CO2 por 48 horas. As células foram lisadas com reagente CellTiter-Glo® igual ao volume de meio de cultura celular presente em cada poço e o conteúdo misturado por 2 minutos para induzir a lise celular. A placa foi incubada em temperatura ambiente por 10 minutos para estabilizar o sinal luminescente. A luminescência foi registrada usando o leitor de placas Perkin-Elmer Victor III (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, EUA).

J. Ensaio de Liberação de LDH

Foi usado o kit de ensaio de liberação da lactato desidrogenase (LDH) para investigar a citotoxicidade. Células HEKa foram semeadas em placas de 96 poços com paredes opacas a 4 x 104células/poço durante a noite. Ditranol ou artigos de teste foram então adicionados à cultura e incubados a 37 °C, 5 % de CO2 por 24 horas. Foram preparados sobrenadantes e lisados de células. Foram adicionados 1 x o volume de reagente CytoTox-ONE™ igual ao volume de sobrenadante ou lisados celulares em cada poço, seguido por mistura por 30 segundos e incubação a 25 °C por 10 minutos. Foi adicionada solução de parada igual a 50 % do volume dos sobrenadantes ou lisados celulares em cada poço para parar a reação, e a fluorescência foi registrada com um comprimento de onda de excitação de 560 nm e um comprimento de onda de emissão de 590 nm usando um SpectraMax M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CAL, EUA).

K. Ativação de NFKB induzida por TNFα hhmp 2.3.2.1, Tabela 22)

As citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias desempenham um papel importante na patogênese da psoríase. Claramente, NFKBé um dos mais importantes reguladores da expressão gênica da citocina e quimiocina pró-inflamatória. Portanto, a potência inibitória de Qingdai e seus extratos refinados sobre a ativação de NFkB dependente de TNFα foi investigada em HEK 293/NFkB-Luc. Conforme mostrado na Tabela 1, a expressão da luciferase dependente de NFkB estimulada por TNFα e o pré-tratamento de células com glicosídeo de tripterígio bloqueou a ativação de NFkB em uma forma dependente da concentração. Extrato refinado de Indigo Naturalis teve atividades em micrograma/g na ativação de NFkB dependente de TNFα na condição experimental. (Consultar a Tabela 1)

L. Determinações de IC50

Todos os valores de IC50 foram determinados usando o software Xlfit™ (Versão 2.0) de ID Business Solutions (Guildford, Reino Unido). O fundo genético foi definido em cultura com células tratadas somente com DMSO e foi subtraído para os cálculos de IC50.

M. Resultados

Alguns resultados de ensaios in vitro de alguns dos extratos refinados de Indigo Naturalis são mostrados na Tabela 1 abaixo, em que o Indigo Naturalis A é obtido de Delong Pharmaceutical: (Índigo 2,62 %, Indirubina 0,284 %; Triptantrina 0,0046 %). Tabela 1

Indigo Naturalis A**: Indigo Naturalis da Delong Pharmaceutical: Índigo 2,62 %, Indirubina 0,284 %; Triptantrina 0,0046 %

3. Avaliação in vivo de extratos refinados de Indigo Naturalis em modelos animais Exemplo 10: Ensaios in vivo e resultados A. Materiais e Métodos Animais

Camundongos BABL/c, machos, peso corporal 19~22 g, adquiridos de Shanghai SLC Animal Center. Temperatura ambiente: 24 ± 1 °C Umidade relativa do ambiente: 40-70 % Ciclo iluminação: Luz fluorescente por 12 horas de luz (8:00 -20:00 h) 12 horas de escuridão Hospedagem dos animais: 4 camundongos/gaiola Alimento: Livre acesso à comida (irradiados, Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd., China) Água: Livre acesso à água de torneira do abastecimento local (primeiro filtrada por um equipamento de água ultrapura Molanimal a partir do suprimento de água municipal) Instrumentos

Termociclador MJ Research PTC-200 Peltier (Alpha UnitTM Block Assembly para PTC DNA EngineTM systems)

Sistema de PCR em tempo real Applied Biosystems 7500 Paquímetro micrométrico Digimatic: Mitutoyo, Japão. Precisão: 0,001 mm Reagentes IL-22 de camundongo recombinante (rmIL-22), Novoprotein (sinobio), N° de cat. C047, Lote 0375351 Kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade, Applied Biosystems, N° de Ref.: 4368813, lote: 0909069 Mistura Thermo Scientific Absolut SYBR Green Rox, Thermo Scientific, N° de Ref.: AB-1163/A, lote: 0911/16 Controle positivo Protopic® (tacrolimus, FK506), pomada a 0,1, Astellas Toyama Co., Ltd., Toyama Plant, H20100079, lote: 028680. Regime de dosagem Diferentes concentrações das amostras de teste, veículo, ou 0,1 % de pomada FK506 foram administrados topicamente a 1 %, uma hora após a indução do modelo e depois administradas diariamente a partir do dia 1 ao dia 11, duas vezes ao dia. O primeiro dia de administração de um artigo de teste foi considerado como dia 0. Via de administração Aplicação tópica, BID.

Estabelecimento de modelo murino semelhante à psoríase induzida por IL-22

Foi administrada uma injeção intradérmica de 20 μl PBS, isoladamente ou contendo 100 ou 500 ng IL-22 recombinante de camundongo (eBiosience) em orelhas de camundongos anestesiados, usando uma agulha calibre 30, dia sim dia não, durante onze dias. As espessuras da orelha foram medidas antes da injeção no dia 0 e posteriormente nos dias sem injeções. A medições da orelha foram realizadas no centro das orelhas usando um paquímetro micrométrico Digimatic (Mitutoyo).

Vinte e quatro horas após o último tratamento com IL-22, os camundongos foram sacrificados e as orelhas foram coletadas para análise adicional.

Exame histológico

As orelhas foram coletadas na necropsia, fixadas em fosfato de formalina tamponado a 10 %, embebidas em parafina, seccionadas e coradas com hematoxilina/eosina (H&E). Seções microscópicas foram classificadas de acordo com o número e a gravidade das lesões. Métodos Estatísticos

Os resultados dos dados da espessura da orelha foram expressos como média ± SEM (erro padrão da média). A AUC do inchaço da orelha foi calculada pelos dados de espessura da orelha do dia 0 ao dia 11, e analisados por métodos ANOVA de medidas repetidas com o software JMP®. Dados de proteínas de citocinas e expressão gênica foram avaliados com um ANOVA one-way e seguido pelo teste t de Student para análise post- hoc. (Nível de significância foi estabelecido em p < 0,05). Grupo e dosagem Ver a Figura 3.

Resultados

Alguns resultados de ensaios in vivo de alguns extratos refinados de Indigo Naturalis são mostrados na Tabela 2. Tabela 2

*Indigo Naturalis B: Indigo Naturalis da Qingfeng Pharmaceutical: Índigo 2,02 %, Indirubina 0,216 %; Triptantrina 0,0032 %

4. Preparação de uma composição farmacêutica contendo um extrato refinado de Indigo Naturalis.

Exemplo 11: Formulação A (pomada de Indigo Naturalis)

* HPLC: 79,26 % de indirubina, 6,15 % de índigo e 0,62 % de triptantrina. Processo de fabricação: Etapa 1: Extrato refinado de Indigo Naturalis, azeite de oliva e BHT foram agitados e aquecidos a 90 °C durante pelo menos 20 minutos, de modo a obter uma preparação homogênea. Esta mistura constituiu a fase A. Etapa 2: Cera de abelha (branca) e petrolato branco foram adicionadas à Fase A a 90 °C e agitadas durante pelo menos 20 minutos até que a mistura ficasse homogênea. Etapa 3: A mistura homogênea da etapa 2 foi resfriada até 55 °C durante a agitação. Etapa 4: O conteúdo da etapa 3 foi mantido a 55 °C e o produto acabado foi preenchido na embalagem. Especificações iniciais (T=0):

Aspecto macroscópico: Pomada de cor fúcsia viscosa e homogênea Estabilidade física:

Estabilidade química:

A estabilidade química da pomada de Indigo Naturalis foi avaliada por dosagem química da indirubina.

A indirubina é quantificada na pomada de Indigo Naturalis usando cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (HPLC) e os resultados são expressos em mg/g de indirubina na pomada de Indigo Naturalis.

Os resultados mostram que a pomada de Indigo Naturalis é fisicamente e quimicamente estável por 3 meses em TA, 30 °C e 40 °C.

A estabilidade química é definida como um valor de ensaio de >90 % dos valores de T0.

A estabilidade física é definida como nenhuma alteração significativa a partir de observações iniciais.

Exemplo 12: Formulação B

Processo de fabricação:

Etapa 1: Extrato refinado de Indigo Naturalis foi adicionado ao triglicerídio caprílico/cáprico, aquecido a 90 °C e misturado durante pelo menos 20 minutos, de modo a obter uma preparação homogênea.

Etapa 2: Gliceril dibehenato (e) tribehenina (e) gliceril behenato, óleo de rícino hidrogenado e estearato de glicerila foram adicionados ao conteúdo da etapa 1. A mistura foi mantida a 90 °C e agitada durante pelo menos 10 minutos até ficar homogênea.

Etapa 3: O conteúdo da etapa 2 (Fase A) foi resfriado até 55 °C com agitação.

Etapa 4: A Fase B (PPG-15 éter estearílico) foi adicionada à Fase A a 55 °C enquanto era agitada durante pelo menos 10 minutes a 55 °C até ficar homogênea.

Etapa 5: O conteúdo da Etapa 4 foi resfriado com agitação até que a mistura atingisse a temperatura ambiente.

5. Absorção percutânea in vitro em formulações de pomada de acordo com exemplo 11 (Formulação A).

Este estudo compara a absorção da pele e a distribuição da indirubina formulada em duas pomadas diferentes contendo extrato refinado de Indigo Naturalis em pele humana ex vivo.

Uma pomada (pomada 1) é divulgada no exemplo 11 da presente invenção (Formulação A) e a outra pomada (pomada 2) foi preparada de acordo com o documento do estado da técnica US 2012/213868 com um extrato de Indigo Naturalis também preparado de acordo com o documento US 2012/213868 (Formulação C).

As duas formulações de pomada são ilustradas na tabela 3 a seguir. Tabela 3

Procedimentos experimentais

Estudos de absorção in vitro foram realizados usando amostras cortadas da espessura da pele humana (espessura variou entre 0,59 e 0,91 mm) montadas em células de difusão. Cada condição foi testada em quatro repetições de quatro doadores diferentes, totalizando 16 valores por condição.

Uma dose de 10 mg/cm2 de cada formulação foi aplicada na superfície da pele com uma área de aplicação de 2 cm2 e um compartimento receptor cheio com 3 ml de soro fisiológico com tampão de fosfato contendo 0,1 % (v/v) de Tween-80. O sistema de teste foi regulado por termostato com um banho de água circulante definido em 37 °C e o líquido receptor foi continuamente agitado a 350 rpm. A duração do tratamento foi de 24 horas em condições estáticas e luz inactínica.

As concentrações de indirubina foram medidas na epiderme incluindo o estrato córneo,derme, líquido receptor e amostras de excesso de formulação usando um método de LC- MS/MS. O limite de quantificação foi de 0,05 ng/ml em todas as matrizes.

Resultados

Os resultados da liberação da indirubina em compartimentos da pele são apresentados na Tabela 4 e mostraram que os balanços de massa de indirubina representaram 102 % e 105 % da dose de indirubina aplicada para a pomada 1 e para a pomada 2, respectivamente.

Qualquer que seja a formulação aplicada, a indirubina foi distribuída na epiderme (incluindo o estrato córneo), na derme e no líquido receptor. Tabela 4: Liberação de indirubina em um corte de espessura de pele humana após um período de tratamento de 24 horas (média aritmética e SEM; N = 16)

Total penetrado: Soma das quantidades recuperadas na epiderme + estrato córneo; derme e líquido receptor

Os valores entre parênteses correspondem aos valores de SEM. *Proporção das médias geométricas significa “grupo de teste em relação ao grupo de referência” com grupo teste sendo a pomada 1 e grupo de referência sendo a pomada 2.

Com a pomada 1, a indirubina representou 1,60 %, 0,93 % e 0,29 % da dose de indirubina aplicada na epiderme (estrato córneo incluído), derme e líquido receptor, respectivamente. O total penetrado de indirubina representou 2,82 % da dose de indirubina aplicada.

Com a pomada 2, a indirubina representou 1,51 %, 0,63 % e 0,18 % da dose de indirubina aplicada na epiderme (estrato córneo incluído), derme e líquido receptor, respectivamente. O total penetrado de indirubina representou 2,32 % da dose de indirubina aplicada.

Foram realizadas análises estatísticas usando a abordagem de bioequivalência e as proporções médias geométricas obtidas para o total penetrado são apresentadas na Tabela 4 acima. Ambas as proporções médias geométricas estão fora do intervalo de aceitação [80,00 % - 125,00 %] mostrando, portanto, uma maior absorção cutânea de indirubina para a pomada 1 em comparação com a pomada 2 (49 % mais de indirubina administrada pela pomada 1 com base na análise do total penetrado expresso em ng/cm2: (ver a Tabela 5 abaixo).

*Teste = Pomada 1 Referência = Pomada 2

Concluindo, os inventores demonstraram, surpreendentemente, que a indirubina foi distribuída na epiderme (estrato córneo incluído), derme e líquido receptor (ver a Tabela 4) e que a absorção cutânea da indirubina foi significativamente maior com uma formulação da invenção em comparação com a formulação de acordo com o documento US 2012/213868.

Claims

1. Uso de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para o tratamento ou alívio de uma doença ou condição selecionada a partir do grupo que consiste em psoríase, condições inflamatórias da pele, onicomicose, câncer de pele, doenças induzidas pela queratinização anormal, envelhecimento da pele, dermatose pustulosa, em que o composição farmacêutica compreende um extrato refinado de Indigo Naturalis e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o extrato refinado de Indigo Naturalis compreende: um derivado de índigo: 0,1-15 % (p/p) com base no peso total de ingredientes ativos, e um derivado de indirubina: 65-90 % (p/p) com base no peso total de ingredientes ativos.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição compreende adicionalmente um derivado de triptantrina em uma quantidade de 0,01-5 % (p/p), de preferência de 0,1-5 % (p/p) com base no peso total de ingredientes ativos.

3. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a composição compreende adicionalmente um derivado de qingdainona e/ou um derivado de isatina, cada um, em uma quantidade de 0,1-5 % (p/p) com base no peso total de ingredientes ativos.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a composição farmacêutica compreende: - de 0,002 % a 0,077 % (p/p) de um extrato refinado de Indigo Naturalis, e - um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o extrato refinado de Indigo Naturalis compreende adicionalmente: - triptantrina: 0,01 a 5 %, de preferência 0,1 a 5 % (p/p) do extrato refinado, e - qingdainona: 0,1 a 5 % (p/p) do extrato refinado.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a composição está na forma para administração tópica ou administração oral.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a dita doença inflamatória da pele é selecionada a partir do grupo que consiste em dermatite atópica (AD), eczema e pele superinfeccionada.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o dito envelhecimento da pele é selecionado a partir do grupo que consiste em rejuvenescimento da pele, regeneração tecidual de cicatrizes ou senescência da pele.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a dita doença induzida por queratinização é selecionada a partir do grupo que consiste em acne, ictiose ou ceratodermia palmoplantar.

9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o dito câncer de pele é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de pele pré-canceroso, ceratose actínica (AK), doença de Bowen, câncer de pele selecionado a partir do grupo que consiste em carcinoma de células escamosas (SCC), carcinoma basocelular (BCC), câncer de pele não melanoma (NMSC); melanoma e câncer de pele induzido por HPV.