JP5452827B2

JP5452827B2 - 皮膚賦活用組成物

Info

Publication number: JP5452827B2
Application number: JP2000331318A
Authority: JP
Inventors: 智宮田; 正紀宇田; 隆男石田
Original assignee: Fancl Corp
Current assignee: Fancl Corp
Priority date: 2000-10-30
Filing date: 2000-10-30
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2020-10-30
Also published as: JP2002138047A

Description

発明が属する技術分野

本発明は、皮膚基底膜に存在する細胞外マトリックスタンパク質の一種であるラミニン５の産生を亢進させる活性を有するある特定の植物を有効成分として配合する皮膚賦活用組成物に関する。

ラミニン５（別名カリニン、エピリグリン、ナイセイン）は皮膚の基底膜に存在するラミニン分子種の一種として同定され、α３鎖、β３鎖、γ２鎖の３本のサブユニットで構成される分子量３８０〜４９０ｋDaの糖タンパク質である（Carter, W. G., et al., Cell., 65, 599-610, 1991., Rousselle, P., et al., J. Cell Biol., 114, 567-576, 1991., Verrando, P., et al., Biochem. Biophys. Acta, 942, 45-56, 1988.）。ラミニン５遺伝子は表皮・真皮間の剥離と水泡形成を特徴とする重篤な遺伝的疾患である結合型表皮水泡症（Herlitz's junctional epidermolysis bullosa）の原因遺伝子であることから、ラミニン５は正常な皮膚構造の維持に必要不可欠なタンパク質であることが明らかになった（Aberdam, D., et al., Nat. Genet., 6, 299-304, 1994., Pulkkinen, L., et al., Genomics, 24, 357-360, 1994, Kivirikko, S., et al., Hum. Mol. Genet., 4, 959-962, 1995.）。また、老化した皮膚では基底膜が偏平化していることから、基底膜の構造変化が皮膚老化を引き起こす可能性が示唆されていた（Lavker R., et al., Dermatol. Clin., 4, 379-389, 1986.）。

上記のような事から、ラミニン５自体やラミニン５の産生亢進活性を持つ大豆由来の調製物を有効成分として配合する事により、皮膚賦活効果などを有する皮膚外用剤や皮膚賦活用組成物が開発されている（特開平10-147515、特開平11-343226）。

発明が解決しようとする課題

しかしながら、ラミニン５は非常に高分子の糖タンパク質であることから、安定性、皮膚浸透性などに問題があり、それ自体を有効成分として配合する皮膚外用剤は、必ずしも十分な皮膚賦活用効果を期待できない。一方、従来使用されているラミニン５の産生を亢進させる組成物も活性がそれほど高いとは言い難く、必ずしも十分な皮膚賦活効果を期待できない。

課題を解決するための手段

本発明者は、種々の植物について、ラミニン５の産生を亢進させる活性を検討した。その結果、リュウガン（Euphoria longan （Lour.）Steud.）、タイセイ（I. Indigotica Fort.）、ホソバタイセイ（Isatis tinctoria L.）、リュウキュウアイ（Storobilanthes flaccidifolius Nees）、ナルコユリ（Polygonatum folcatum A. Gray）、カギクルマバナルコユリ（Polygonatum sibiricum Redoute ex Redoute）がラミニン５の産生を亢進させることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、リュウガン、ホソバタイセイおよびナルコユリから選ばれる１種または２種以上の植物又は植物抽出物を有効成分として含む皮膚賦活用組成物、リュウガン、ホソバタイセイ、およびナルコユリから選ばれる１種または２種以上の植物又は植物抽出物を含むラミニン５産生亢進組成物、リュウガン、ホソバタイセイ、およびナルコユリから選ばれる１種または２種以上の植物又は植物抽出物を含む光老化防止用組成物に関する。

本発明における植物は、リュウガン（Euphoria Iongan （Lour.）Steud.）、タイセイ（I. Indigotica Fort.）、ホソバタイセイ（Isatis tinctoria L.）、リュウキュウアイ（Storobilanthes flaccidifolius Nees）、ナルコユリ（Polygonatum folcatum A. Gray）、カギクルマバナルコユリ（Polygonatum sibiricum Redoute ex Redoute）が使用可能である。

本発明におけるリュウガン（Euphoria longan （Lour.）Steud.）とは、むくろじ科ユーフォリア属の植物である。仮種皮の部分は竜眼肉（リュウガンニク）と呼ばれ、鎮静、滋養強壮に処方され、物忘れや不眠症にも効果的で、神経の興奮を静める効力があるといわれている。

本発明におけるタイセイ（I. Indigotica Fort.）、ホソバタイセイ（Isatistinctoria L.）とは、いずれもあぶらな科タイセイ属の植物である。根の部分は板藍根（バンランコン）と呼ばれ、種々の病原菌に対する抑制作用を有し、消炎、解熱、解毒、止血薬として用いられている。

本発明におけるリュウキュウアイ（Storobilanthes flaccidifolius Nees）は、きつねのまご科イセハナビ属の植物である。この植物の根、根茎も板藍根（バンランコン）と呼ばれ、タイセイ（I. Indigotica Fort.）、ホソバタイセイ（Isatis tinctoria L.）の根と同様の薬効を有する。また、葉の部分にも抗菌、解毒、解熱、消炎、止血作用があることが知られている。

本発明におけるナルコユリ（Polygonatum folcatum A. Gray）、カギクルマバナルコユリ（Polygonatum sibiricum Redoute ex Redoute）はいずれもゆり科アマドコロ属の植物である。根茎の部分は黄精（オウセイ）と呼ばれ、種々の菌に対する抑制作用、アドレナリンによる高血糖に対する抑制作用、血圧降下作用があり、滋養強壮、糖尿病、動脈硬化症などの薬として用いられる。

本発明における植物は、葉、茎、芽、花、木質部、木皮部（樹皮）などの地上部、根、塊茎などの地下部、種子、樹脂などのすべての部位が使用可能である。

本発明における植物は、それら自体を乾燥させた乾燥物、その粉砕物、それら自体を圧搾抽出することにより得られる搾汁、水またはアルコール、エーテル、アセトンなどの有機溶媒による粗抽出物および粗抽出物を分配、カラムクロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどで段階的に精製して得られた抽出物画分などのすべてを含む。これらは単独で用いても良く、２種以上混合して用いても良い。

本発明の植物の有効配合量は、植物の調製法、製剤の形態などにより、適宜選択、決定され、特に限定されないが、例えば、本発明の植物の乾燥粉砕物からアルコール、エーテル、アセトンなどの有機溶媒により抽出された抽出物を調製物として使用する場合は、その乾燥含量として総組成物重量当たり０．００１〜３０重量％が適当である。

本発明の組成物は、ローション剤、乳液剤、クリーム剤、抽出製剤、散剤、造粒製剤、カプセル剤、錠剤、軟膏剤、硬軟剤、懸濁剤、シロップ剤、ハップ剤、坐剤、注射剤、エアゾール剤などの製剤として、製剤上の常套手段を用いて製剤化することができる。投与方法として、経口投与、注射、吸入、経皮投与、経粘膜投与などをすることができ、毒性は低い。また、必要に応じて、賦形剤、安定化剤、乳化剤、結合剤、保存剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、粘度調製剤、湿潤剤、着色剤、等張化剤、香料などの添加剤を適宜配合できる。

次に、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

調製植物の抽出；
リュウガン（Euphoria longan （Lour.）Steud.）の仮種皮の部分（リュウガンニク）、ホソバタイセイ（Isatis tinctoria L.）の根の部分（バンランコン）、ナルコユリ（Polygonatum folcatum A. Gray）の根茎の部分（オウセイ）を細切し、その各１ｋｇに９９．５％エタノール３Ｌを加え、室温で一晩浸漬した。これを濾過し、各抽出液を得た。各抽出液を濃縮したところ、その蒸発残分はそれぞれ７５ｇ、１１０ｇ、１３５ｇであった。

試験結果１表皮角化細胞によるラミニン５産生能の測定試験；
ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）によるラミニン５産生能の測定
表皮角化細胞および培地は、旭テクノグラス株式会社から販売されている胎児由来正常ヒト表皮角化細胞およびＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅＧｒｏｗｔｈＭｅｄｉｕｍＢｕｌｌｅｔＫｉｔを用いた。この培地（ＫＧＭ）は、表皮角化細胞基礎培地にヒト上皮細胞増殖因子（０．１ｎｇ／ｍｌ）、インシュリン（５．０μｇ／ｍｌ）、ハイドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、アンフォテリシンＢ（５０μｇ／ｍｌ）、牛脳下垂体抽出液（２ｍｌ）を添加したものである。細胞はＫＧＭで３７℃−５％ＣＯ_２インキュベーターにて培養した。本実験には継代数が３〜５代の細胞を使用した。

細胞をＫＧＭで培養後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を処理し、接着細胞を培養ディッシュから剥がした後、トリプシン中和溶液を用いてトリプシンを中和した。遠心分離により細胞を集めた後、２×１０^５／ｍｌとなるようにＫＧＭにて再懸濁した。この細胞懸濁液を１００μｌ／ウェルで９６穴プレートに播種し、２４時間培養後、各植物抽出物を１００μｇ／ｍｌで添加したＫＧＭで２４時間培養した。培養後、細胞培養上清を回収し、８００ｒｐｍ、５分間遠心して浮遊細胞を除去後、１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心して細胞片を除去し、ＥＬＩＳＡ用サンプルとして用いた。

９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートにリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で１／８に希釈した細胞培養上清液を３７℃で２時間吸着させた。細胞培養上清液を除去後、ブロッキング溶液｛１％の牛血清アルブミン（BSA）を含むＰＢＳ｝に浸し、３７℃で１時間ブロッキングした。洗浄液｛０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（和光純薬）を含むＰＢＳ｝にて洗浄後、一次抗体溶液｛洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したラミニンγ２鎖に対するモノクローナル抗体（クローンＤ4Ｂ５）（Mizushima, H., et al., Horm Res., 50, 7-14, 1998.）｝を５０μｌ／ウェルずつ添加し、３７℃で２時間反応させた。洗浄後、二次抗体｛洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したビオチン化抗マウスイムノグロブリンＧ（VECTOR LABORATORIES）｝を５０μｌ／ウェルずつ添加し、室温で１時間反応させた。洗浄後、酵素溶液｛洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したアルカリフォスファターゼアビジンＤ（VECTOR LABORATORIES）｝を５０μｌ／ウェルずつ添加し、室温で１時間反応させた。洗浄後、基質液｛１ｍｇ／ｍｌのｐ−ｎｉｔ−ｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ICN Biomedicals, Inc.）を含む０．７５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１０．３）｝を１００μｌ／ウェルずつ添加し、３７℃で３０分間反応後、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。

ＥＬＩＳＡによるラミニン５産生能の測定結果を表１に示す。各植物抽出物を処理した時のラミニン５産生率について、無処理対照を１００％として表した。バンランコン、リュウガンニク、オウセイを処理した場合は、無処理対照に比べてラミニン５産生率がそれぞれ１７６、１８９、１６８％に亢進した。尚、ラミニン５の産生を亢進することが知られているＰＨＯＲＢＯＬ１２−ＭＹＲＩＳＴＡＴＥ１３−ＡＣＥＴＡＴＥ（ＰＭＡ）(Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏ．)を１００ｎｇ／ｍｌで処理した場合は、無処理対照に比べてラミニン５産生率が１７３％であった。

（２）ウエスタンブロッティングによるラミニン５産生能の測定
細胞をＫＧＭで培養後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を処理し、接着細胞を培養ディッシュから剥がした後、トリプシン中和溶液を用いてトリプシンを中和した。遠心分離により細胞を集めた後、２×１０^５／ｍｌとなるようにＫＧＭにて再懸濁した。この細胞懸濁液をφ９０ｍｍディッシュに播種し、８０％飽和状態まで培養後、各植物抽出物を１００μｇ／ｍｌで添加したＫＧＭで２４時間培養した。培養後、細胞培養上清を回収し、８００ｒｐｍ、５分間遠心して浮遊細胞を除去後、１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心して細胞片を除去した。８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加して４℃で一晩攪拌した。２００００ｒｐｍ、３０分間遠心してタンパク質を沈降させ、上清を除去後、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解した。２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ７．５）で４℃で一晩透析後、２０倍濃縮になるように２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加え、ウエスタンブロッティング用サンプルとして用いた。

サンプル中のタンパク質を非還元条件でＳＤＳ-ＰＡＧＥで分離後、ニトロセルロース膜に転写した。転写後のニトロセルロース膜をブロッキング溶液（５％のスキムミルクを含むＰＢＳ）に浸し、室温で１時間ブロッキングした。洗浄液｛０．１％のＢＳＡおよび０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳ｝で洗浄後、一次抗体溶液｛洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したラミニンγ２鎖に対するモノクローナル抗体（クローンＤ4Ｂ５）｝に浸し、室温で一晩反応させた。洗浄後、二次抗体溶液（洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したビオチン化抗マウスイムノグロブリンＧ）に浸し、室温で１時間反応させた。洗浄後、酵素溶液（洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したアルカリフォスファターゼアビジンＤ）に浸し、室温で１時間反応させた。洗浄後、基質液｛ＢＣＩＰ／ＮＢＴｓｕｂｓｔｒａｔｅｋｉｔ（VECTOR LABORATORIES）｝に浸し、室温で１５分間反応させた。

ウエスタンブロッティングによる各植物抽出物のラミニン５産生能の測定結果を図１に示す。バンランコン、リュウガンニク、オウセイを処理した場合は、無処理対照に比べてラミニン５産生率が有意に亢進した。尚、ポジティブコントロールとしてＰＭＡを１００ｎｇ／ｍｌで処理した場合の結果も同時に示した。

実験結果２光老化に対する効果の測定試験；
（１）ヒト表皮角化細胞の光老化に対する効果の測定試験；
ヒト表皮角化細胞をＫＧＭで培養後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を処理し、接着細胞を培養ディッシュから剥がした後、トリプシン中和溶液を用いてトリプシンを中和した。遠心分離により細胞を集めた後、２×１０^５／ｍｌとなるようにＫＧＭにて再懸濁した。この細胞懸濁液に１００μｇ／ｍｌのリュウガンニク抽出物および５μｇ／ｍｌのラミニン５中和抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ，ｃｌｏｎｅＰ３Ｈ９−２）をそれぞれ単独または組み合せて処理した。本実験では、リュウガンニク抽出物の光老化に対する抑制効果が、ラミニン５の産生亢進に起因するかについて調べるために、ラミニン５中和抗体を用いた。この細胞懸濁液を１ｍｌ／ウェルで２４穴プレートに播種し、２４時間培養後、プレートに蓋をしない状態でＵＶＢを０または７０ｍＪ／ｃｍ^２で照射した。２４時間培養後、ＰＢＳ（−）で洗浄し浮遊細胞を除去した後、５％グルタルアルデヒド水溶液にて室温、１５分間処理し、細胞を固定した。水道水にて洗浄後、蛍光染色液｛５μｇ／ｍｌのＨｏｃｈｓｔ３３３４２(Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏ．)および０．００１％のポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬）を含む水溶液｝にて室温、暗所にて１．５時間処理した。水道水にて洗浄後、蛍光プレートリーダーにて蛍光強度を測定した。

結果を図２に示す。本実験での細胞生存率は、リュウガンニク抽出物およびラミニン５中和抗体を無処理で、ＵＶＢを非照射の場合を１００％として表した。ＵＶＢ非照射の場合は、リュウガンニク抽出物およびラミニン５中和抗体を単独または組み合わせて処理したいずれの場合でも、無処理の場合と同程度の細胞生存率であった。一方、ＵＶＢを７０ｍＪ／ｃｍ^２で照射した場合は、無処理の時の細胞生存率が約５０%まで低下したのに対して、リュウガンニク抽出物を処理した場合は約７０％であった。リュウガンニク抽出物およびラミニン５中和抗体を組み合せて処理した場合の細胞生存率は、約５０％で無処理と同程度であった。従って、リュウガンニク抽出物の光老化に対する抑制効果はラミニン５の産生亢進に起因するものであると考えられる。また、ラミニン５中和抗体を単独で処理した場合の細胞生存率は約５０％で無処理と同程度であり、抗体による細胞生存率の低下は見られなかった。
（２）ヒト皮膚三次元モデルの光老化に対する効果の測定試験；
ヒト皮膚三次元モデルは、東洋紡績（株）のＴＥＳＴＳＫＩＮ（ＬＳＥ−ｈｉｇｈ）を用いプロトコールに従って培養した。６０μｌのリュウガンニク抽出物（１００μｇ／ｍｌ）を含む培地をアッセイリング内の組織上に添加し、２４時間培養した。培養後、プレートに蓋をしない状態でＵＶＢを０、２４０、３６０および４６０ｍＪ／ｃｍ^２で照射し、２４時間培養した。培養後、組織培養液を回収し、１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心して組織片を除去した。

この組織培養液を用いて、細胞膜に傷害を受けた細胞から遊離される乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を測定することにより、細胞毒性を測定した。ＬＤＨ活性の測定は、ＬＤＨ−細胞毒性テスト（和光純薬）を用いて行った。１／８に希釈した組織培養液を５０μｌずつ９６穴の反応プレートに分注後、発色液を５０μｌずつ分注し、室温で２０分間反応させた。反応後、反応停止液を１００μｌずつ分注し、反応を停止させた後、マイクロプレートリーダーにより５６０ｎｍの吸光度を測定した。

結果を図３に示す。本実験での細胞毒性率は、リュウガンニク抽出物を無処理で、ＵＶＢを非照射の場合を１００％として表した。ＵＶＢを非照射の場合は、リュウガンニク抽出物の処理の有無に関わらず、ほぼ同程度の細胞毒性率であった。一方、ＵＶＢを照射した場合は、リュウガンニク抽出物を無処理の場合でも処理した場合でも、ＵＶＢ照射量の増加に伴い細胞毒性率は増加するが、無処理に比べてリュウガンニク抽出物を処理した場合は、細胞毒性率が有意に低下した。

処方例１クリームの製造；
（組成）（配合量）
（Ａ）ステアリルアルコール６．０％
ステアリン酸２．０％
水添ラノリン４．０％
スクワラン９．０％
オクチルドデカノール１０．０％
ＰＯＥ（２５）セチルアルコールエーテル３．０％
モノステアリン酸グリセリン２．０％
リュウガン抽出液０．１％
防腐剤適量
香料適量
（Ｂ）１，３ブチレングリコール６．０％
ＰＥＧ１５００４．０％
精製水残余
（製法）Ａ、Ｂをそれぞれ７０℃に加熱調節する。ＡをＢに加えて、ホモミキサーにて乳化粒子を均一にして、脱気、濾過、冷却する。

処方例２錠剤の製造；
（組成）（配合量）
リュウガン抽出液２０．０％
乳糖６５．０％
コーンスターチ１４．０％
グァーガム１．０％
（製法）常法に従い、上記組成の錠剤を製造した。

発明の効果

本発明によると、皮膚基底膜の構造維持を促し、正常な皮膚の構造維持や機能向上に有用な組成物が提供される。また、UVなどにより障害を受けた皮膚に対して、正常な皮膚の構造維持や機能向上を促し、障害を予防、防止および緩和することができる組成物が提供される。

各植物油出物を処理した場合のヒト表皮角化細胞によるラミニン５産生能をウエスタンブロッティングにより測定した結果を示す。 UVB照射時のヒト表皮角化細胞の細胞生存率に対するリュウガンニク抽出物の効果を測定した結果を示す。 UVB照射時のヒト皮膚三次元モデルの細胞毒性率に対するリュウガンニク抽出物の効果を測定した結果を示す。

Claims

リュウガンの仮種皮または、ホソバタイセイの根からのエタノール抽出の蒸発残留物を
有効成分として含む皮膚賦活用組成物。
リュウガンの仮種皮、ホソバタイセイの根またはナルコユリの根茎からのエタノール抽
出の蒸発残留物を有効成分として含むラミニン５産生亢進組成物。
リュウガンの仮種皮またはホソバタイセイの根からのエタノール抽出の蒸発残留物を有
効成分として含む光老化防止用組成物。
皮膚外用である請求項１、２、３のいずれかに記載の組成物。