ES2709359T3

ES2709359T3 - Un extracto de Indigo naturalis y un procedimiento para preparar el mismo

Info

Publication number: ES2709359T3
Application number: ES16717299T
Authority: ES
Inventors: Isabelle Cardinaud; Laurent Chantalat; Philippe Andres; Yin-Ku Lin; Jean-Thomas Pierson; Antoine Bily; Bronec Loïc Le
Original assignee: Galderma SA
Current assignee: Galderma SA
Priority date: 2015-04-09
Filing date: 2016-04-08
Publication date: 2019-04-16
Anticipated expiration: 2036-04-08
Also published as: DK3209313T3; AU2016245203B2; TWI732754B; RS58304B1; AU2016245203A1; MX2017012595A; WO2016162484A1; US20190224264A1; SI3209313T1; PT3209313T; US10251926B2; BR112017021191A2; EP3209313A1; JP6820273B2; US9861673B2; HRP20190088T1; LT3209313T; PL3209313T3; CN107427545A; CA2981624A1

Abstract

Un procedimiento para preparar un extracto refinado a partir de Indigo naturalis, que comprende las etapas de: a) extraer Indigo naturalis con etanol a reflujo entre 2 y 8 horas, b) filtrar la mezcla a una temperatura no inferior a 65ºC para obtener unas aguas de filtrado, c) concentrar las aguas de filtrado, para obtener un extracto en bruto, dicho extracto en bruto se filtra opcionalmente (con adición de agua) para retirar completamente el disolvente y los últimos componentes aún presentes en el disolvente, y se seca, d) (i) lavar el extracto en bruto con hexano a una temperatura no inferior a 50ºC entre 15 y 60 min, (ii) filtrar a temperatura ambiente la mezcla obtenida en la etapa d) (i) para obtener un producto, opcionalmente enjuagarla con etanol y agua (iii) lavar el producto obtenido en la etapa d) (ii) con etanol a reflujo, y e) filtrar a temperatura ambiente la mezcla de lavado obtenida en la etapa d), y secar el producto resultante a una temperatura inferior a 80ºC para obtener un extracto que es opcionalmente micronizado.

Description

DESCRIPCION

Un extracto de Indigo naturalis y un procedimiento para preparar el mismo

Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un procedimiento para preparar un extracto de una o mas materias primas botanicas, tales como Indigo naturalis y su extracto. La presente invencion tambien se refiere a una composicion que comprende el extracto, as ^como el uso de la composicion en aplicaciones medicas o cosmeticas

Antecedentes

Los tratamientos convencionales para la soriasis se disenan generalmente conforme a la edad, genero, ocupacion y capacidad cognitiva de un paciente, los tipos y distribucion de lesiones, la(s) respuesta(s) del paciente a metodo(s) terapeutico(s) previo(s), y otras anamnesis del paciente. Los metodos terapeuticos principales para la soriasis incluyen un tratamiento topico, tratamiento sistemico, inyeccion de compuestos biologicos y fototerapia. Las composiciones para el tratamiento topico incluyen, por ejemplo, corticoesteroides, antralina (disponible como Margiton®), alquitran de hulla (disponible como Polytar®), calcitriol (disponible como Silkis®), tazaroteno (disponible como Tazorac®), acido salidlico, y estas composiciones son adecuadas para tratar a los pacientes de soriasis con smtomas leves. Las preparaciones por via oral de, por ejemplo, metotrexato (MTX), ciclosporina, y retinoides se usan comunmente para terapia sistemica, y son adecuados para tratar pacientes de soriasis con smtomas de medios a graves. Los compuestos biologicos incluyen alefacept (disponible como Amevive®), efalizumab (disponible como Raptiva®), etanercept (disponible como Enbrel®) y adalimumab (disponible como Humira®), y son adecuados para inyectar a los pacientes de soriasis con smtomas de medios a graves. La fototerapia, por ejemplo, la fototerapia con ultravioleta B (UVB), la fotoquimioterapia tal como psolareno mas ultravioleta A (PUVA), es adecuada para tratar pacientes de soriasis con smtomas graves.

Sin embargo, son deseables metodos terapeuticos adicionales.

Compendio

La materia objeto de la presente invencion es como se define en las reivindicaciones 1-13.

El Indigo naturalis, por ejemplo, Qingdai, es un polvo de color azul oscuro preparado a partir de hojas de plantas que llevan mdigo o de plantas que producen mdigo. Dichas plantas se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en Indigofera tinctoria L., Baphicacanthus cusia (Nees) Bremek (sin. Strobilanthes cusia (Nees), Persicaria tinctoria (Aiton) Spach. (sin. Polygonum tinctorum Aiton, P. tinctorium Lour.) e Isatis tinctoria L. (sin. Isatis indigotica Fort.).

Uno de los inconvenientes que se encuentran con el uso de Indigo naturalis o Qingdai es el color oscuro que produce sobre la piel, y deja manchas en la ropa. Qingdai es el nombre corriente para Indigo naturalis. Se extrae a partir de plantas que llevan mdigo o plantas que producen mdigo con una disolucion acuosa de NaOH o KOH, y corresponde a una mezcla de aproximadamente 5-15% de compuestos organicos que incluyen alcaloides, entre los que estan presentes el mdigo y la indirubina, y 85-95% de compuestos inorganicos, tales como carbonato calcico e hidroxido calcico.

Otro inconveniente puede ser que tradicionalmente, solamente el mdigo y la indirubina estan controlados en el producto Indigo naturalis.

De este modo, permanece una necesidad no satisfecha de desarrollar un extracto a partir de Indigo naturalis o a partir de plantas que llevan mdigo o de plantas que producen mdigo en un farmaco comercializable, para obtener un extracto menos coloreado que el Indigo naturalis, y para caracterizar y controlar la mayor parte de los componentes de tal extracto. Mas espedficamente, sena ventajoso proporcionar un extracto menos coloreado manteniendo o aumentando su eficacia para el tratamiento o mitigacion de enfermedades o trastornos de la piel, tales como la soriasis.

La presente invencion resuelve este problema proporcionando un extracto refinado facil de manejar que retiene los componentes activos de Indigo naturalis o Qingdai, para asegurar una eficacia y seguridad clmicas.

La presente invencion, en parte, se ocupa de un procedimiento para obtener un extracto a partir de Indigo naturalis, por ejemplo a partir de Qingdai, que a su vez contiene, por ejemplo, indirubina e mdigo para tratamiento o mitigacion de enfermedades o trastornos de la piel, tales como la soriasis.

En la presente memoria se describe un procedimiento para preparar un extracto a partir de una o mas materias primas botanicas, tales como Indigo naturalis. El procedimiento comprende las siguientes etapas:

a) una etapa de extraccion: extraccion de Indigo naturalis con un primer disolvente polar o moderadamente polar, para obtener una mezcla de extraccion;

b) una etapa de filtracion: filtracion de la mezcla de extraccion para obtener unas aguas de filtrado;

c) una etapa de concentracion: concentracion del filtrado para obtener un extracto en bruto;

d) una etapa de lavado: lavado del extracto en bruto con un disolvente apolar, y opcionalmente un segundo disolvente polar, para obtener una mezcla de lavado, y

e) una etapa de filtracion: filtrado de la mezcla de lavado para obtener un extracto refinado opcionalmente despues de una etapa de secado, por ejemplo, conforme a un metodo convencional de secado.

El procedimiento conforme a la invencion permite obtener un extracto refinado; tal extracto refinado es como se define mas adelante. En la siguiente descripcion, la expresion “materia prima botanica” hace referencia a Indigo naturalis (por ejemplo, el Qingdai disponible comercialmente).

En algunas realizaciones de la descripcion, el disolvente usado en la etapa de extraccion a) puede incluir dimetilformamida (DMF), acetato de etilo, etanol (que incluye etanol acuoso tal como, por ejemplo, etanol al 85%), dimetilsulfoxido (DMSO), diclorometano (DCM), tetrahidrofurano (THF), dimetilacetamida (DMA), acetona, 2-butanona, acetonitrilo, acetato de isopropilo, 2-metil-tetrahidrofurano (MeTHF), metil terc-butil eter, agua, metanol, cloroformo, terpeno (limoneno, p-cimeno, etc.), o una de sus combinaciones. Preferiblemente, el disolvente puede ser acetato de etilo, MeTHF, etanol o etanol acuoso.

Ademas, la etapa de extraccion a) puede llevarse a cabo con una relacion entre la materia prima botanica y el disolvente (es decir, los gramos del material que ha de extraerse frente a los ml de disolvente) en un intervalo de 1:5 a 1:150 (g/ml), por ejemplo, en un intervalo de 1:5 a 1:100, por ejemplo, 1:6, 1:15, 1:20, 1:30, 1:50, 1:100.

En una realizacion particular, el disolvente usado en la etapa de extraccion a) es un disolvente organico. Mas preferiblemente, el disolvente se selecciona del grupo que consiste en dimetilformamida, acetato de etilo, etanol, dimetilsulfoxido, diclorometano, tetrahidrofurano, dimetilacetamida, acetona, 2-butanona, acetonitrilo, acetato de isopropilo, 2-metil-tetrahidrofurano, metil terc-butil eter, metanol, cloroformo, terpeno y una de sus combinaciones.

En algunas realizaciones, la etapa de extraccion a) puede repetirse hasta que haya menos de 0,10% de contenido de indirubina (% p/p) en la materia prima botanica restante filtrada en la etapa de filtracion b), determinado mediante el metodo de HPLC descrito en el ejemplo 8A.

En algunas otras realizaciones, la etapa de extraccion a) se lleva a cabo mediante calentamiento, por ejemplo hasta reflujo.

La etapa de extraccion a) se sigue por una etapa de filtracion b), y luego una etapa de concentracion c) para concentrar las aguas de filtrado, para proporcionar un extracto en bruto. La etapa de filtracion b) puede llevarse a cabo en caliente.

En algunas realizaciones, la etapa de lavado d) puede repetirse hasta que la cantidad de indirubina (% p/p) en el extracto refinado es al menos 55% (p/p), determinado mediante el metodo de HPLC descrito en el ejemplo 8A.

En algunas realizaciones, el disolvente usado en la etapa de lavado d) se selecciona del grupo que comprende agua, un alcano con de 5 a 8 atomos de carbono, un alcohol con de 2 a 6 atomos de carbono y una de sus combinaciones. Por ejemplo, el disolvente incluye hexano, heptano, etanol, agua o una de sus combinaciones. Por ejemplo, en la etapa de lavado d), se usan hexano o heptano, y etanol acuoso, en secuencia o simultaneamente en el caso de que se usen dos o mas disolventes.

Conforme a la invencion, el disolvente apolar usado en la etapa d) es hexano.

Conforme a otra realizacion espedfica de la descripcion, la etapa d) se lleva a cabo con un disolvente apolar y un segundo disolvente polar. Conforme a la invencion, el segundo disolvente polar es etanol. Mas preferiblemente, el disolvente apolar usado en la etapa d) es hexano, y el segundo disolvente polar es etanol.

En algunas otras realizaciones, un extracto en bruto obtenido de la etapa de concentracion c) se somete al siguiente procedimiento durante al menos un ciclo, hasta obtener un extracto refinado: el extracto en bruto se lava con un disolvente (etapa d)), y se filtra (etapa e)), para proporcionar un extracto refinado, seguido opcionalmente de una etapa de secado. Conforme a una realizacion espedfica, la etapa de lavado d) y la etapa de filtracion e) se llevan a cabo mediante un solo ciclo, para obtener el extracto refinado. Cuando se aplica mas de un ciclo, se puede usar el mismo o diferentes disolventes para lavado. Ademas, el extracto en bruto puede lavarse con un disolvente a reflujo, la mezcla se puede enfriar a temperatura ambiente, y luego se filtra para proporcionar un extracto refinado, seguido opcionalmente de una etapa de secado.

En una realizacion preferida, se llevan a cabo dos ciclos. Particularmente, el extracto en bruto obtenido mediante la etapa de concentracion c) se lava en un disolvente apolar, preferiblemente hexano (etapa d), y se filtra (etapa e), seguido opcionalmente de una etapa de secado. El extracto de hexano se lava luego con un disolvente polar organico, preferiblemente etanol (etapa d), y luego se filtra (etapa e) para obtener un extracto refinado, seguido opcionalmente de una etapa de secado.

Opcionalmente, se lleva a cabo una etapa de micronizacion despues de la etapa e), proporcionando por lo tanto un extracto refinado con un tamano de partfculas entre 25 y 35 |im, preferiblemente de aproximadamente 30 |im.

En otra realizacion preferida, cuando el extracto refinado se microniza en la ultima etapa, 99% de las partmulas obtenidas es inferior o igual a 30 |im.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona un extracto refinado a partir de Indigo naturalis.

La presente invencion proporciona tambien un extracto refinado que contiene indirubina como componente en una cantidad de al menos 55% (p/p) del extracto refinado. En algunas realizaciones, la indirubina esta presente en una cantidad de al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80% o 85% (p/p) del extracto refinado. Por ejemplo, la indirubina puede estar en una cantidad de 55-90% (p/p) del extracto refinado, por ejemplo, 55-60%, 55-65%, 55-70%, 55-75%, 55-80%, 55-85%, 55-90%, 60-65%, 60-70%, 60-75%, 60-80%, 60-85%, 60-90%, 65-70%, 65-75%, 65-80%, 65-85%, 65-90%, 70-75%, 70-80%, 70-85%, 70-90%, 75-80%, 75-85%, 75-90%, 80-85%, 80-90%, o 85-90% (p/p) del extracto refinado.

Preferiblemente, la presente invencion proporciona un extracto refinado que contiene indirubina como componente en una cantidad de al menos 65% (p/p) del extracto refinado.

Preferiblemente, la indirubina esta en una cantidad de 65-90% (p/p) del extracto refinado.

En algunas realizaciones, el extracto refinado contiene indigo como componente. El indigo puede estar en una unidad de 0-15% (p/p) del extracto refinado, por ejemplo, 0,1-15%, 0,5-15%, 1-15%, 2-15%, o 3-15% (p/p) del extracto refinado.

En algunas otras realizaciones, el extracto refinado contiene ademas triptantrina como componente. La triptantrina puede estar en una cantidad de 0,01-5% o preferiblemente 0,1-5% (p/p) del extracto refinado, por ejemplo, 0,01-1%, 0,05-1%, 0,1-1%, 0,1-5%, 0,5-1%, o 0,5-5% (p/p) del extracto refinado.

En algunas realizaciones mas, el extracto refinado contiene ademas qingdainona como componente. La qingdainona puede estar en una cantidad de 0,1-5% (p/p) del extracto refinado, por ejemplo, 0,1-1%, 0,1-5%, 0,5-1%, o 0,5-5% (p/p) del extracto refinado.

En algunas otras realizaciones mas, en el extracto refinado, que comprende dos o mas de los descritos anteriormente, representa al menos 60% (p/p) del extracto refinado, por ejemplo, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% (p/p), y preferiblemente al menos 90% (p/p). Los componentes caracterizados, que comprenden dos o mas de los descritos anteriormente, estan en una cantidad de 60-99% (p/p) del extracto refinado, por ejemplo, 60-95%, 65-95%, 70-95%, 80-95%, 85-95%, 90-95%, 60-99%, 65-99%, 70-99%, 80-99%, 85-99% o 90-99% (p/p), y preferiblemente en una cantidad de 90-99% (p/p).

En otro aspecto mas, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende un extracto refinado como se ha descrito anteriormente, y un vehmulo farmaceuticamente aceptable. La composicion esta en la forma para una administracion topica u oral.

En otro aspecto mas, la presente invencion proporciona una composicion cosmetica que comprende un extracto refinado como se ha descrito anteriormente, y un vehmulo cosmeticamente aceptable. La composicion esta en una forma para administracion topica.

En aun otro aspecto, la presente descripcion proporciona un uso del extracto refinado en la preparacion de una composicion farmaceutica o cosmetica para inhibir la proliferacion o diferenciacion de queratinocitos, inhibir la infiltracion de las celulas mononucleares en la dermis y epidermis, inhibir la alteracion vascular que da como resultado vasos sangumeos hiperplasicos, o inhibir el aumento de moleculas de adhesion sobre celulas endoteliales. El uso comprende administrar la composicion recien descrita a un sujeto (por ejemplo, ser humano) que la necesite.

En aun otro aspecto, la presente invencion proporciona una composicion descrita anteriormente para el tratamiento o mitigacion de una enfermedad o trastorno de la piel, seleccionada del grupo que consiste en soriasis, trastornos inflamatorios de la piel, onicomicosis, cancer de piel, enfermedades inducidas por una queratinizacion anomala, envejecimiento de la piel, dermatosis pustulosa y linfoma cutaneo de linfocitos T (CTCL).

En otro aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para inhibir la proliferacion o diferenciacion de queratinocitos, inhibir la infiltracion de las celulas mononucleares en la dermis y epidermis, inhibir la alteracion vascular que da como resultado vasos sangumeos hiperplasicos, o inhibir el aumento de moleculas de adhesion sobre celulas endoteliales, que comprende una etapa de poner en contacto el extracto refinado de la presente invencion con una celula que lo necesite. Este metodo puede aplicarse in vitro o in vivo.

En aun otro aspecto mas, la presente descripcion proporciona un metodo para el tratamiento de una enfermedad o trastorno de la piel que comprende administrar una cantidad eficaz del extracto refinado conforme a la presente invencion a sujetos que lo necesiten. La enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en soriasis, trastornos inflamatorios de la piel, onicomicosis, cancer de piel, enfermedades inducidas por una queratinizacion anomala, envejecimiento de la piel, dermatosis pustulosa y CTCL.

En algunas realizaciones, los trastornos inflamatorios de la piel pueden ser dermatitis atopica, eccema o piel sobreinfectada. El envejecimiento de la piel puede ser rejuvenecimiento de la piel, regeneracion de tejidos para cicatrices o envejecimiento de la piel. La queratinizacion anomala puede ser acne, ictiosis o queratodermia palmoplantar. El cancer de piel puede ser cancer de piel precancerosa, por ejemplo, queratosis actmica (AK), enfermedad de Bowen; cancer de piel, por ejemplo, SCC, BCC, NMSC; melanoma y cancer de piel inducido por VPH.

Descripcion de los dibujos

Las caractensticas y ventajas anteriores y otras de la presente invencion seran evidentes con referencia a la siguente descripcion detallada y los dibujos que la acompanan.

Figura 1: cromatogramas de HPLC ilustrativos de mdigo (A) e indirubina (B).

Figura 2: cromatogramas de HPLC ilustrativos de triptantrina (A), Qingdai (B) y un extracto refinado del ejemplo 2 (C). Figura 3: grupo y dosis para evaluacion in vivo de extractos de Qingdai en un modelo de soriasis inducido por IL-22. Se disenaron cinco estudios y se resumieron en el estudio 1-5, respectivamente. En el estudio 1, se usaron 100 ng y 500 ng de IL-22 en 20 |il de disolucion salina, i.d., para induccion. En el estudio 2-5, se usaron 500 ng de IL-22 en 20 |il de disolucion salina, i.d., para induccion.

Figura 4: las figuras ilustran las inflamaciones de las orejas despues de inyeccion intradermica de IL-22. En los estudios, las orejas de los ratones se inyectaron intradermicamente, y se midio el grosor de las orejas en los dfas entre inyecciones.

Figura 5: las figuras ilustran los efectos de los extractos de Qingdai en la inflamacion de las orejas despues de inyeccion intradermica de IL-22.

Descripcion detallada

Como se usa en la presente invencion, la indirubina, indigo, triptantrina y qingdainonatienen las formulas mencionadas en la bibliograffa, y mas particularmente, las siguientes estructuras.

Un “disolvente polar” hace referencia a un disolvente que tiene una alta constante dielectrica y un alto momento dipolar; y ejemplos incluyen agua, alcoholes, por ejemplo, alcoholes de 2 a 6 atomos de carbono (tales como etanol), acetonitrilo, dimetilformamida (DMF), y dimetilsulfoxido (DMSO).

Un “disolvente moderadamente polar” hace referencia a un disolvente con una constante dielectrica moderadamente alta; y ejemplos incluyen acetato de etilo, diclorometano (DCM), tetrahidrofurano (THF), dimetilacetamida (DMA), acetona, 2-butanona, acetato de isopropilo, 1,4-dioxano, 2-metiltetrahidrofurano (MeTHF), metil ferc-butil eter (MTBE).

Un “disolvente apolar” hace referencia a un disolvente con una baja constante dielectrica; y ejemplos incluyen eter dietflico, eter de petroleo (EP), tolueno y alcanos de 5 a 8 atomos de carbono, por ejemplo, heptano, hexano, pentano o ciclohexano.

Una “temperatura ambiente” hace referencia a 18°C-35°C.

La expresion “soriasis” o “enfermedad de soriasis” hace referencia a todos los tipos de soriasis bien conocidos por los expertos en la tecnica. Incluye soriasis en placas cronica, soriasis en gotas, soriasis eritrodermica, soriasis pustulosa, soriasis inversa (tambien conocida como soriasis flexural), soriasis ungueal, artritis psoriasica.

La expresion “extracto refinado” hace referencia a un extracto solido, semisolido u oleoso, preferiblemente un extracto solido, que contiene menos de 10% (p/p) de agua y/o disolventes usados en el procedimiento para preparar dicho extracto refinado. Un extracto refinado esta caracterizado mas preferiblemente mediante un aumento en la cantidad de ingredientes activos, que incluyen alcaloides entre los que estan presentes el indigo, indirubina, triptantrina y/o qingdainona, preferiblemente enriquecido en indirubina, comparado con Qingdai o Indigo nafuralis. Mas espedficamente, el extracto refinado conforme a la invencion comprende al menos 60%, o mas preferiblemente mas de 70% (p/p) de ingredientes activos, que incluyen indigo, indirubina, triptantrina y/o qingdainona.

La expresion “extracto en bruto”, como se usa en la presente invencion, hace referencia a un extracto solido, semisolido u oleoso, preferiblemente un extracto solido o semisolido, que contiene menos de 15% (p/p) (por ejemplo, 5-15%, 5 10%) de agua y/o disolventes usados en el procedimiento para preparar el extracto refinado. El extracto refinado esta menos enriquecido en indirubina que el extracto refinado cuando se compara con Qingdai o Indigo nafuralis. El extracto en bruto se obtiene mediante la etapa de concentracion c) conforme a la invencion. La etapa de concentracion se lleva a cabo mas particularmente enviando las aguas de filtrado a un concentrador (por ejemplo, a presion reducida), para retirar el agua y/o disolventes usados en el procedimiento, y concentrando por lo tanto los ingredientes activos presentes en el extracto, que incluyen indigo, indirubina, triptantrina y/o qingdainona.

“Un ciclo”, como se usa en la presente invencion, hace referencia a las dos etapas de la etapa de lavado d) y la etapa de filtracion e), que se llevan a cabo secuencialmente una vez. “Dos ciclos”, como se usa en la presente invencion, hace referencia a las dos etapas de la etapa de lavado d) y etapa de filtracion e), que se llevan a cabo secuencialmente dos veces.

La expresion “una cantidad eficaz” hace referencia a un nivel de dosis del extracto refinado que proporciona un beneficio terapeutico (por ejemplo, mejora, mitigacion o cura de las enfermedades, trastornos o smtomas) a un paciente en promedio.

La presente invencion proporciona un procedimiento para preparar un extracto refinado a partir de Indigo nafuralis.

El Indigo nafuralis se obtiene de hojas y tallos, preferiblemente de hojas, de Indigofera fincforia L., Baphicacanfhus cusia (Nees) Bremek (sin. Sfrobilanfhes cusia (Nees), Persicaria fincforia (Aifon) Spach. (sin. Polygonum fincforium Aifon, P. fincforium Lour.) e Isafis fincforia L. (sin. Isafis indigofica Forf.). Preferably, Indigo nafuralis se obtiene de hojas y tallos de Persicaria fincforia y/o Baphicacanfhus cusia.

Mientras que Indigo nafuralis esta disponible comercialmente (ejemplos de Indigo nafuralis disponible comercialmente (planta/proveedor): Baphicacanfhus cusia/Delong; Indigofera fincforia/KMA exports o Sam Vegetable Colours PVT Ltd; Isafis fincforia/Andrea Primavera o Bleu de Lectoure; Polygonum fincforium/ColeurGarance o EARL 4 saisons), puede producirse a partir de las hojas y tallos de una o mas de las plantas anteriores mediante metodos comunmente conocidos en la tecnica. Estos metodos pueden resumirse como sigue: se anaden tallos y hojas recien recolectados de Persicaria fincforia y/o Baphicacanfhus cusia a una piscina al aire libre, el agua se anade a la piscina para cubrir los tallos/hojas. Despues de un empapado durante unos pocos dfas (26-30°C), los tallos/hojas se habran descompuesto. Luego, se anade soda con agitacion. Cuando el color de la mezcla empapada cambia de verde a violeta oscuro, el precipitado se recoge, se lava (usualmente con agua durante 2-3 veces), y luego se seca para proporcionar polvo de Indigo nafuralis.

Puede prepararse un extracto refinado mediante un procedimiento como se describe en la presente memoria, que comprende las siguientes etapas que consisten en: a) (i) anadir un disolvente de extraccion, un disolvente polar o moderadamente polar (tal como un alcohol o acetato de etilo), a un polvo de Indigo nafuralis para proporcionar una mezcla; (ii) calentar y agitar la mezcla durante un periodo de tiempo (por ejemplo, 30 min, 1 hora, 2 horas); b) (iii) filtrar la mezcla calentada mientras esta caliente para retirar los subproductos insolubles para proporcionar unas aguas de filtrado; c) (iv) concentrar las aguas de filtrado para proporcionar un extracto en bruto; d) (v) anadir un disolvente de lavado (por ejemplo, agua, o un disolvente apolar, o un disolvente polar o una de sus mezclas) al extracto en bruto para proporcionar una mezcla de lavado; (vi) calentar y agitar la mezcla de lavado durante un periodo de tiempo (por ejemplo, 30 min, 1 hora, 2 horas); e) (vii) filtrar la mezcla de lavado, por ejemplo, a temperature ambiente (por ejemplo, 18°C-35°C) para recoger un extracto refinado; (viii) repetir opcionalmente las etapas de (v) a (vii) hasta que la cantidad de indirubina (% p/p) en el residuo (es decir, el extracto) es mas de 55% (p/p), preferiblemente mas de 65% (p/p), como se determina por el metodo de HPLC descrito en el ejemplo 8A, (ix) secar opcionalmente el extracto refinado conforme a un metodo convencional (por ejemplo, secado al aire, liofilizacion). El disolvente de lavado de las etapas (v) y (viii) puede ser el mismo o diferente.

Conforme a la invencion, se prepara un extracto refinado mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

a) extraer Indigo naturalis con etanol a reflujo entre 2 y 8 horas,

b) filtrar la mezcla a una temperatura no inferior a 65°C para obtener unas aguas de filtrado,

c) concentrar las aguas de filtrado, para obtener un extracto en bruto, dicho extracto en bruto se filtra opcionalmente (con adicion de agua) para retirar completamente el disolvente y los ultimos componentes aun presentes en el disolvente, y se seca,

d) (i) lavar el extracto en bruto con hexano a una temperatura no inferior a 50°C entre 15 y 60 min, (ii) filtrar a temperatura ambiente la mezcla obtenida en la etapa d) (i) para obtener un producto, opcionalmente enjuagarla con etanol y agua

(iii) lavar el producto obtenido en la etapa d) (ii) con etanol a reflujo, y

e) filtrar a temperatura ambiente la mezcla de lavado obtenida en la etapa d), y secar el producto resultante a una temperatura inferior a 80°C para obtener un extracto que es opcionalmente micronizado.

En otra realizacion preferida, cuando el extracto refinado se microniza en la ultima etapa, el tamano de partfculas es aproximadamente 99% en el intervalo de 25 a 35 |im, preferiblemente de aproximadamente 30 |im.

Como es usa en la presente invencion, “aproximadamente” o “alrededor de” se entendera por una persona de habilidad normal en la tecnica, y variara hasta cierto grado en el contexto en el que se use. Si hay usos de la “expresion” que no estan claros para la persona de habilidad normal en la tecnica dado el contexto en el que se usa, “aproximadamente” o “alrededor de” significaran hasta mas o menos 20%, preferiblemente 10% de la expresion en particular.

Los contenidos de ingredientes tales como indigo, indirubina, triptantrina y qingdainona pueden ser cuantificados mediante metodos de HPLC como se describe en el ejemplo 8.

El procedimiento recien descrito hace posible obtener un extracto refinado que es facil de manejary puede formularse ademas en composiciones farmaceuticas o cosmeticas. Ademas, el procedimiento proporciona un extracto con una indirubina enriquecida. Al menos 60% (p/p) del componente del extracto refinado obtenido de este modo esta caracterizado; preferiblemente al menos 90% (p/p), entre ellos uno o mas se seleccionan de la lista que consiste en indigo, indirubina, triptantrina y qingdainona. Aunque el extracto refinado obtenido a partir del procedimiento esta en forma solida, una preparacion de una forma lfquida para el extracto refinado puede prepararse basada en las necesidades de manejo o formulacion, mediante una simple disolucion o solubilizacion del extracto refinado solido.

En este caso, puede prepararse una forma lfquida para el extracto refinado mediante un procedimiento como se describe en la presente memoria, que comprende las etapas siguientes que consisten en: a) (i) anadir un disolvente de extraccion, un disolvente polar o moderadamente polar (tal como un alcohol o acetato de etilo), a un polvo de Indigo naturalis para proporcionar una mezcla; (ii) calentar y agitar la mezcla durante un periodo de tiempo (por ejemplo, 30 min, 1 hora, 2 horas); b) (iii) filtrar la mezcla calentada mientras esta caliente para retirar los subproductos insolubles para proporcionar unas aguas de filtrado; c) (iv) concentrar las aguas de filtrado para proporcionar un extracto en bruto; d) (v) anadir un disolvente de lavado (por ejemplo, agua, o un disolvente apolar, o un disolvente polar o una de sus mezclas) al extracto en bruto para proporcionar una mezcla de lavado; (vi) calentar y agitar la mezcla de lavado durante un periodo de tiempo (por ejemplo, 30 min, 1 hora, 2 horas); e) (vii) filtrar la mezcla de lavado, por ejemplo, a temperatura ambiente (por ejemplo, 18°C-35°C) para recoger un extracto refinado; (viii) repetir opcionalmente las etapas de (v) a (vii) hasta que la cantidad de indirubina (% p/p) en el residuo (es decir, el extracto) es mas de 55% (p/p), preferiblemente mas de 65% (p/p), como se determina por el metodo de HPLC descrito en el ejemplo 8A, (ix) solubilizar el extracto refinado obtenido de este modo en un disolvente o vehuculo farmaceuticamente aceptable. Los disolventes de lavado de las etapas (v) y (viii) pueden ser los mismos o diferentes.

La presente invencion proporciona tambien un extracto obtenible mediante el procedimiento descrito anteriormente a partir de extracto de Indigo naturalis, dicho extracto obtenible incluye indirubina como componente en una cantidad de al menos 55% (p/p) del extracto refinado, preferiblemente al menos 65% (p/p). El extracto refinado esta en forma solida y puede prepararse mediante el procedimiento descrito anteriormente o cualquier otro procedimiento adecuado. El extracto refinado puede incluir ademas indigo, triptantrina y/o qingdainona, que pueden coextraerse junto con la indirubina. En particular, el extracto que contiene multiples ingredientes puede proporcionar un efecto sinergico.

La presente invencion proporciona ademas una composicion farmaceutica que comprende el extracto refinado. La composicion farmaceutica puede formularse en una forma farmaceutica adecuada para administracion topica u oral, usando tecnologfa bien conocida por los expertos en la tecnica. La composicion farmaceutica puede comprender adicionalmente un vehmulo farmaceuticamente aceptable, tal como los empleados ampliamente en la tecnica de fabricacion de farmacos. Por ejemplo, el vehmulo farmaceuticamente aceptable puede incluir uno o mas de los siguientes agentes: disolventes, emulsionantes, agentes de suspension, de descomposicion, agentes aglutinantes, excipientes, agentes estabilizantes, agentes quelantes, diluyentes, agentes gelificantes, conservantes, lubricantes, agentes de retardo de la absorcion, liposomas, y similares. Preferiblemente, los disolventes se seleccionan del grupo que consiste en agua, glicerol, etanol, propilenglicol, butilenglicol, dipropilenglicol, diglicoles etoxilados o propoxilados, polioles dclicos, vaselina, un aceite vegetal y cualquier mezcla de estos disolventes. Preferiblemente, la composicion farmaceutica se formula en una formulacion topica que puede aplicarse directamente en la piel, por ejemplo, una piel con soriasis. La formulacion topica adecuada para la composicion farmaceutica puede ser una emulsion, un gel, una pomada, una crema, un parche, un linimento, un aerosol, un pulverizador, una locion, un suero, una pasta, una espuma, o unas gotas. En una realizacion de la presente invencion, la composicion farmaceutica se formula en una preparacion externa mezclando el extracto refinado conforme a la presente invencion con una base tal como las bien conocidas y usadas comunmente en la tecnica.

En algunas realizaciones, la dosificacion y la frecuencia de administracion de la composicion de la composicion farmaceutica conforme a la presente invencion puede variar dependiendo de los siguientes factores: la gravedad de la enfermedad que ha de tratarse, la via de administracion, y el peso, edad, estado ffsico y respuesta del sujeto que ha de tratarse. En mas realizaciones o realizaciones adicionales, la cantidad del extracto refinado esta en el intervalo de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal/dfa, por ejemplo, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 500, 300 o 100 mg/kg de peso corporal/dfa.

La presente invencion proporciona tambien una composicion cosmetica que comprende el extracto refinado. La composicion cosmetica puede estar presente en una forma adaptada para una aplicacion topica que comprende un vehmulo o medio cosmetica o dermatologicamente aceptable. “Cosmetica o dermatologicamente aceptable” quiere decir medios que son adecuados para un uso en el que se ponen en contacto con la piel o apendices de piel humana sin plantear un riesgo de toxicidad, intolerancia, inestabilidad, reaccion alergica, etc. En la composicion cosmetica, el extracto refinado puede solubilizarse previamente en uno o mas disolventes cosmetica o dermatologicamente aceptables, tales como agua, glicerol, etanol, propilenglicol, butilenglicol, dipropilenglicol, diglicoles etoxilados o propoxilados, polioles dclicos, vaselina, un aceite vegetal o cualquier mezcla de estos disolventes.

El extracto refinado y las composiciones anteriores pueden usarse en el tratamiento o mitigacion de una enfermedad o trastorno. Por tratamiento se quiere decir al menos una mitigacion de los smtomas asociados con el proceso patologico que aflige al sujeto, en el que la mitigacion se usa en un amplio sentido para hacer referencia a al menos una reduccion de la magnitud de un parametro, por ejemplo, smtoma, asociado al proceso patologico que se esta tratando, tal como dermatitis, soriasis y similares. Como tal, el tratamiento incluye tambien situaciones en las que el proceso patologico, o al menos smtomas asociados a el, se inhiben completamente, por ejemplo, se impide que se produzcan, o se detienen, por ejemplo, se terminan, de modo que el huesped no experimenta mas el proceso patologico, o al menos los smtomas que caracterizan el proceso patologico. Como tal, el tratamiento incluye tanto la curacion como el tratamiento de una enfermedad. Por consiguiente, el extracto y las composiciones anteriores pueden usarse en el tratamiento o mitigacion de una enfermedad o trastorno seleccionados del grupo que consiste en soriasis, trastornos inflamatorios de la piel, onicomicosis, cancer de piel, enfermedades inducidas por queratinizacion anomala, envejecimiento de la piel y dermatosis pustulosa.

La presente descripcion proporciona ademas un metodo para inhibir la proliferacion o diferenciacion de queratinocitos, inhibir la infiltracion de las celulas mononucleares en la dermis y epidermis, inhibir la alteracion vascular que da como resultado vasos sangumeos hiperplasicos, o inhibir el aumento de moleculas de adhesion sobre celulas endoteliales, que comprende administrar el extracto y composiciones anteriores a un sujeto que lo necesite.

La eficacia del extracto refinado y las composiciones pueden evaluarse mediante modelos in vitro, con respecto a sus actividades de inhibir la proliferacion o diferenciacion, o inflamacion. Por ejemplo, los ensayos in vitro pueden llevarse a cabo en la senalizacion de citocinas, rutas que implican STAT-3/STAT-1, MAPK, NFkB.

La eficacia del extracto refinado y las composiciones pueden evaluarse mas mediante modelos in vivo con respecto a sus actividades de tratar enfermedades o trastornos. Por ejemplo, pueden ensayarse ratones modificados geneticamente, que incluyen los modelos transgenicos o con genes inactivados.

Las nuevas caractensticas de la aplicacion se describen particularmente en las reivindicaciones adjuntas. Un mejor conocimiento de las caractensticas y ventajas de la presente solicitud se obtendra por referencia a la siguiente descripcion detallada, que describe realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la solicitud.

Aunque se han mostrado y descrito en la presente memoria las realizaciones preferidas de la presente solicitud, tales realizaciones se proporcionan solo como ejemplo. Debe entenderse que diversas alternativas a las realizaciones de la solicitud descrita en la presente memoria pueden emplearse al poner en practica la solicitud. Los expertos en la tecnica apreciaran que son posibles numerosas variaciones, cambios y sustituciones, sin apartarse de la solicitud. Se desea que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de los aspectos de la solicitud, y que de este modo se cubran los metodos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes.

El porcentaje, en la presente memoria, se expresa mediante peso relativo al peso del extracto o el producto especificado, a menos que se especifique de otra manera.

Se describiran mas aspectos y ventajas de la invencion en la siguiente seccion experimental ilustrativa

Ejemplos

1. Preparacion de extractos refinados de Indigo naturalis y metodos analfticos para analisis

Ejemplo 1: preparacion de un extracto refinado de Indigo naturalis

Qingdai, como se usa en la siguiente preparacion, se obtiene de Delong Pharmaceutical (indigo al 2,62% e indirubina al 0,284% (metodo de HPLC representado en el ejemplo (8A) y triptantrina al 0,0046% (metodo de HPLC representado en el ejemplo 8B)).

Se suspendieron 500 g de Qingdai en 10 l de acetato de etilo. La mezcla se agito a reflujo durante dos horas, y luego se filtro a 75°C. Las aguas de filtrado se concentraron a presion reducida, para proporcionar un solido oscuro. El extracto en bruto se agito en 250 ml de hexano y se calento a reflujo durante una hora. Despues de enfriar a temperatura ambiente, la suspension se filtro para proporcionar un residuo oscuro (un extracto en bruto).

0,50 g del residuo oscuro se sometieron a reflujo en 25 ml de hexano, otra vez durante una hora, y se enfrio a temperatura ambiente, seguido de filtracion, para proporcionar un extracto refinado como un solido rojo oscuro, 452 mg. HPLC: 62,9% de indirubina, 12,9% de indigo y 0,53% de triptantrina.

Ejemplo 2: preparacion de un extracto refinado de Indigo naturalis

500 g de Qingdai, como se usa en el ejemplo 1, se suspendieron en 10 l de alcohol (etanol). La mezcla se agito a reflujo durante dos horas, y luego se filtro a 75°C. Las aguas de filtrado se concentraron a presion reducida para proporcionar un solido oscuro, que se agito en 260 ml de hexano y se calento a reflujo durante una hora. Tras enfriar a temperatura ambiente, la suspension se filtro para proporcionar un residuo oscuro.

0,80 g del residuo oscuro se sometieron a reflujo en 24 ml de alcohol (etanol) durante una hora mas, y luego se enfrio a temperatura ambiente, seguido de filtracion, para proporcionar un extracto refinado como un solido rojo oscuro (538 mg). Hp LC: 83,6% de indirubina, 6,35% de indigo y 0,75% de triptantrina.

Ejemplo 3: preparacion de un extracto refinado de Indigo naturalis

500 g de Qingdai, como se usa en el ejemplo 1, se suspendieron en 10 l de acetato de etilo. La mezcla se agito a reflujo durante dos horas, y luego se filtro mientras estaba caliente. Las aguas de filtrado se concentraron a presion reducida para proporcionar un solido oscuro. El extracto en bruto se agito en 250 ml de hexano y se calento a reflujo durante una hora. Despues de enfriar a temperatura ambiente, la suspension se filtro para proporcionar un residuo oscuro.

0,75 g del residuo oscuro se sometieron a reflujo en 22,5 ml de etanol durante una hora, y se enfrio a temperatura ambiente, seguido de filtracion, para proporcionar un extracto refinado como un solido rojo oscuro (538 mg). HPLC: 77,9% de indirubina, 15,9% de indigo y 0,56% de triptantrina.

Ejemplo 4: preparacion de un extracto refinado de Indigo naturalis

500 g de Qingdai, como se usa en el ejemplo 1, se suspendieron en 2,1 l de DMF. La mezcla se agito a 50°C durante 40 min. Tras enfriar a 20°C, la suspension se filtro. Las aguas de filtrado se concentraron a presion reducida para proporcionar un solido oscuro, que se agito en 130 ml de hexano y se calento a reflujo durante una hora. Tras enfriar a 20°C, la suspension se filtro para proporcionar un residuo oscuro.

1,56 g del residuo oscuro se lavaron con 46,8 ml de etanol, y se calento a reflujo durante una hora, y luego se enfrio a 20°C, seguido de filtracion, para proporcionar un extracto refinado (766 mg). HPLC: 66,3% de indirubina, 9,76% de indigo.

Ejemplo 5: preparacion de un extracto refinado de Indigo naturalis

500 g de Qingdai, como se usa en el ejemplo 1, se suspendieron en 3 l de DMF. La mezcla se agito a 30°C durante 1 hora, y luego se filtro. Las aguas de filtrado se concentraron a presion reducida para proporcionar un solido oscuro, que se agito en 230 ml de hexano y se calento a reflujo durante una hora. Tras enfriar a 20°C, la suspension se filtro para proporcionar un residuo oscuro.

1,96 g del residuo oscuro se lavaron con 59 ml de etanol al 85% (etanol acuoso al 85%), y se calento a reflujo durante una hora, seguido de filtracion en caliente, para proporcionar un extracto refinado (1,02 g). HPLC: 69,4% de indirubina, 18,7% de indigo y 0,62% de triptantrina.

Ejemplo 6: preparacion de un extracto refinado de Indigo naturalis

100g de Qingdai se extrajeron con 2 l de etanol al 92% (etanol acuoso al 92%) durante 2 horas en condiciones de reflujo. Tras finalizar, la mezcla se filtro en caliente sobre un filtro AF6 (Buchner), para obtener una disolucion rojiazul oscura como aguas de filtrado. Estas aguas de filtrado se redujeron hasta sequedad a vado, para proporcionar 2,4 g de un residuo seco. Este residuo se lavo con 120 ml de hexano durante 1 h a reflujo. Tras finalizar, la mezcla se enfrio a temperatura ambiente durante 2 h, y luego se filtro a vado para proporcionar 312,9 mg de un extracto refinado rojo oscuro.

280 mg de este extracto refinado se lavaron con 15 ml de etanol al 92% (etanol acuoso al 92%) durante 1 h a reflujo. Tras finalizar, la disolucion se enfrio a temperatura ambiente, y luego se filtro para proporcionar 159 mg de un extracto refinado de color rojo borgona oscuro despues de secar en estufa (80°C) durante 1 h 30 min. (0,18% g). HPLC: 82,31% de indirubina, 8,99% de indigo y 0,81% de triptantrina.

Ejemplo 7: etapa de micronizacion

La etapa de micronizacion de extracto refinado de Indigo naturalis obtenido en los ejemplos anteriores se lleva a cabo con el siguiente equipo:

- micronizador: molino en espiral a chorros Diameter 200

- alimentador: este equipo se usa para la dosificacion de polvo para alimentar el micronizador. La dosificacion se hace gracias a dos tornillos. Este sistema permite una regularidad del flujo.

La micronizacion consiste en proyectar granos de polvo con chorros de aire. El contacto de los granos permite su explosion.

Los siguientes parametros de micronizacion se registran durante la micronizacion:

- presion de anillo: 6 bar

- presion del inyector: 3 bar

- flujo de la alimentacion de polvo: 25 kg/h

El micronizador permite un cercamiento cilmdrico - agujeros alrededor del cercamiento para la inyeccion de aire. El polvo se introduce en el micronizador, los granos se impulsan gracias al chorro de aire. Cuando los granos tienen el tamano bueno, se concentran en el centro del micronizador y se aspiran. Para evitar cualquier contaminacion por partfculas extranas o piezas rotas del micronizador, se lleva a cabo una criba adicional (tamiz: 700 |im).

La etapa se realiza manualmente despues de la micronizacion y antes del envasado.

Se llevo a cabo un analisis granulometrico del producto homogeneo obtenido conforme al metodo de distribucion de tamano de partfculas (PSD) [especificaciones analfticas: D99 < 30 |im].

Ejemplo 8: metodos analfticos para analisis

A - Metodo de HPLC de fase inversa

Se establecio un nuevo metodo de HPLC de fase inversa para cuantificar simultaneamente el indigo y la indirubina, basado en la European Pharmacopoeia (Pharmeuropa vol. 20, n1 1, enero 2008, pags. 118-119), Chinese Pharmacopoeia (2010 Edition, pag. 185) y bibliograffa (Chen LW, Liao W, Yang M, Jia DY, He P, Chen SM, Fu CM. Determination of indigo and indirubin in Indigo Naturalis by HPLC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, 23(6), 714-715; Liu ZY, Su ZT, Gao YN, Yang M. Simultaneously determination of indigo and indirubin in Indigo Naturalis by HPLC, China Pharmacist 2010, 13(3), 324-326).

El sistema cromatografico (Agilent 1200 series) consistio en un desgasificador G1322A , una bomba G1211A, un automuestreador G1367B, un horno para columna G1316A y un detector DAD G1315B. Otros aparatos inclrnan un dispositivo ultrasonico SK7200H (China) y un sistema de purificacion de agua Milli-Q (EE.UU.).

Se recogieron seis lotes de Qingdai de tres vendedores en China. Se compro Indigo estandar en Tokyo Chemical Industry Co. (Japan, > 98%). La triptantrina se compro en Accela Co. (China, 97%). La indirubina se sintetizo y recristalizo en Hutchison Medipharma (HMP) (> 99% en HPLC).

Se usaron en los experimentos una membrana organica para filtro (0,45 |im, China), dimetilformamida (DMF, calidad analttica), metanol (calidad de HPLC), acido formico (AF, calidad de HPLC), trietilamina (TEA, calidad analftica) y agua ultrapura purificada con un sistema de purificacion de agua Milli-Q.

Pretratamiento de disolucion de DMF: 500 ml de DMF se borbotearon con N²seco durante media hora, luego se anadieron 0,5 ml de TEA y se mezclo para proporcionar una disolucion de DMF (que contema TEA al 0,1%, sin oxfgeno). Esta disolucion de DMF se uso en la preparacion de la muestra.

Se suspendieron 50 mg de Qingdai en 50 ml de disolucion de DMF. Despues de una extraccion con ultrasonidos durante 10 min, la suspension se filtro a traves de un filtro de jeringa de 0,45 |im, para generar la disolucion de ensayo de Qingdai.

Se suspendieron 20 mg de extracto refinado (obtenido del ejemplo 2) en 200 ml de disolucion de DMF. Despues de una extraccion con ultrasonidos, la suspension se filtro a traves de un filtro de jeringa de 0,45 |im, para generar la disolucion de ensayo del extracto.

La separacion se llevo a cabo en una columna Waters Symmetry C18 (5 |im, 3,9 x 150 mm). La fase movil fue de metanol al 65% (que contema 0,05% de AF). El caudal fue de 1,0 ml/min durante 15 min, y la temperatura de la columna fue 25°C. El volumen de inyeccion fue de 4 |il. La longitud de onda de deteccion fue 289 nm, para que el indigo y la indirubina pudieran analizarse simultaneamente. El indigo y la indirubina pudieron analizarse simultaneamente en una inyeccion. Cromatogramas tfpicos de HPLC del indigo e indirubina se muestran en la figura 1.

B - Metodo analftico de HPLC para cuantificar triptantrina:

Se establecio tambien un nuevo metodo analftico de HPLC para cuantificar la triptantrina. Se ajustana la concentracion de la muestra en consecuencia debido a la baja concentracion de triptantrina, tanto en Qingdai como en su producto enriquecido, el extracto refinado. Los analisis se llevaron a cabo a 25°C en una columna Waters Symmetry C18 (5 |im, 3,9 x 150 mm). La fase movil fue de metanol (que contema 0,05% de AF, eluyente B) y agua (que contema 0,05% de AF, eluyente A). El perfil de elucion con gradiente fue como sigue: 50% de B, isocratico (12 min), de 50% a 100% de B (1 min), 100% de B, isocratico (6 min) y de 100% a 50% de B (1 min). El caudal fue de 1,0 ml/min, y la temperatura de la columna fue 25°C. El volumen de inyeccion fue de 10 |il. La longitud de onda de deteccion fue 254 nm.

400 g de Qingdai se suspendieron en 20 ml de disolucion de DMF. Despues de una extraccion ultrasonica durante 20 min, la suspension se filtro a traves de un filtro de jeringa de 0,45 |il para proporcionar la disolucion de ensayo de Qingdai.

15 mg de extracto refinado (obtenido del ejemplo 2) se suspendieron en 20 ml de una disolucion de DMF. Despues de una extraccion ultrasonica, la suspension se filtro a traves de un filtro de jeringa de 0,45 |il para proporcionar la disolucion de ensayo de extracto refinado.

Cromatogramas tfpicos de HPLC de triptantrina, Qingdai y un extracto refinado se muestran en la figura 2.

Ejemplo 9: estabilidad a largo plazo de un extracto refinado de Indigo naturalis

Un extracto refinado de Indigo naturalis preparado conforme al ejemplo 6, se sometio a condiciones de estabilidad. La caracterizacion por HPLC del extracto preparado es como sigue: 80,16% de indirubina, 10,95% de indigo y 0,64% de triptantrina.

Las condiciones de conservacion usadas durante el estudio de estabilidad son 25°C ± 2°C y 60% de HR ± 5% de HR en una camara climatica (Piardi CC1400).

Conforme a la GUIDELINE ON QUALITY OF HERBAL MEDICINAL PRODUCTS (CPMP/QWP/2819/00, rev. 01), las caractensticas de calidad tienen que cumplir con los ftmites [ftmites: contenido de indirubina (% de extracto seco) = 65,0-85,0; contenido de indigo (% de extracto seco) = 5,0-15,0; contenido de triptantrina (% de extracto seco) < 5,0.

Las variaciones en el contenido de los marcadores no tienen que superar ± 10% de los valores de la prueba inicial.

Los resultados se muestran en la tabla 1 siguiente.

Tabla 1:

La huella de HPLC a 1 mes, 2 meses y 3 meses cumple con la huella del cromatograma en el T0. De este modo, las caractensticas cualitativas cumplen con los ftmites. La variacion de contenido de indigo, indirubina y triptantrina no excede el intervalo aceptable de ± 10% de los valores de la prueba inicial.

De este modo, un extracto refinado de Indigo naturalis preparado conforme a la invencion es estable al menos 6 meses a 25°C y 60% de HR.

2. Evaluacion in vitro de extractos refinados de Indigo naturnlis en ensayos bioqmmicos y celulares

Ejemplo 10: ensayos in vitro y resultados

A. Reactivos generales:

DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Cat. N° D2650

Cinasa de Janus 1 (JAK1), Life technologies™, Cat. N° PV4774

Cinasa de Janus 1 (JAK2), Life technologies™, Cat. N° PV4210

Cinasa de Janus 1 (JAK3), Life technologies™, Cat. N° PV3855

CDK1, Life technologies™, Cat. N° PV3292

CDK2, Life technologies™, Cat. N° PV3267

CDK5, Life technologies™, Cat. N° PV3000

Kit para ensayo de cinasas Z'-LYTE® - Tyrosine 6 Peptide, Life technologies™, Cat. N° PV4122

Kit para ensayo de cinasas Z'-LYTE® - Ser/Thr 12 Peptide, Life technologies™, Cat. N° PV3673

Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), Life technologies™, Cat. N° C11965

RMPI-1640, Life technologies™, Cat. N° A10491

Suero bovino fetal (FBS), Life technologies™, Cat. N° 10099141

Medio EpiLife®, Life technologies™, Cat. N° M-EPI-500-CA

HKGS, Life technologies™, Cat. N° S-001-5

IL-2 recombinada humana, Peprotech Inc, Cat. N° 200-02

IL-6 recombinada humana, Peprotech Inc, Cat. N° 200-06

IL-3 recombinada humana, Peprotech Inc, Cat. N° 200-03

GM-CSF recombinada humana, Peprotech Inc, Cat. N° 300-03

IL-22 recombinada humana, Peprotech Inc, Cat. N° 200-22

TNFa recombinado humano, R&D, Cat. N° 210-TA-010

Lipopolisacarido (LPS), Calbiochem, Cat. N° 437650

Anti-CD3 humano, de calidad funcional purificado (aCD3) (clon: OKT3) eBioscience, Cat. N° 16-0037-85

Anti-CD28 humano, de calidad funcional purificado (aCD28) (clon: CD28.2) eBioscience, Cat. N° 16-02897-85 Anticuerpo phospo-STAT3 (Y705) (conejo-anti-humano), Cell Signalling Technology, Cat. N° 9145

Anticuerpo phospo-STAT5 (Y694) (conejo-anti-humano), Cell Signalling Technology, Cat. N° 9359

Anticuerpo de actina (raton-anti-humano), Sigma-Aldrich, Cat. No. A1978

IgG Alexa 488 de cabra anti-conejo, Life technologies™, Cat. N° A11034

IROYE 800CW de cabra anti-conejo, Li-COR Bioscience, Cat. N° 926-32211

IROYE 800CW de cabra anti-conejo, Li-COR Bioscience, Cat. N° 926-32210

Kit ELISA de IFNy humano, R&D, Cat. N° DY285

Kit ELISA de TNFa humano, R&D, Cat. N° DY210

Kit ELISA de IL-1 p humano, R&D, Cat. N° DY201

Kit ELISA de IL-6 humano, R&D, Cat. N° DY206

Thiazolyl Blue Tetrazolium Blue (MTT), Sigma-Aldrich, Cat. N° M2128

CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (ensayo de viabilidad celular luminiscente), Promega, Cat. N° G7572 CytoTox-ONE™ Homogeneous Membrane Integrity Assay (ensayo de integridad de membrana homogeneo), Promega, Cat. N° G7891

Ensayo de luciferasa, Promega, Cat. N° E4550

iBlot® Transfer Stack (pila de transferencia), Regular (nitrocelulosa), Life technologies™, Cat. N° IB3010-01 loduro de propidio, Sigma-Aldrich, Cat. N° P4170

Ribonucleasa A, Sigma-Aldrich, Cat. N° R6513

Tampon 1X PBS (1 l): NaCl, 8,0 g; KCl, 0,2 g; Na2HPO4.12 H²O, 3,58 g; KH²PO⁴, 0,24 g, disuelto en 1 l de H²O dd Milli-Q, pH ajustado a 7,4

Tampon de carga 1 x SDS: Tris-HCl/pH 8,850 mM, 2% de SDS, 10% de glicerol, 0,1% de azul de bromofenol, DTT 100 mM.

B. Celulas y lmeas celulares

HepG2, una lmea celular de carcinoma hepatocelular humano, adquirido en Shanghai Institutes for Biological Sciences (SIBS) (Shanghai, China, Cat. N° TCHu 72), se cultivo en DMEM que contiene FBS al 10%.

TF1, una lmea celular de eritroleucemia humana, adquirida en American Tissue Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, Cat. N° CRL-2003™), se cultivaron en RMPI-1640 que contiene FBS al 10% y 2 ng/ml de GM-Cs F a 37°C con CO²al 5%.

PBMC: se recogieron muestras de sangre de humanos de donantes adultos sanos en tubos heparinizados. Cada experimento independiente uso sangre de un unico donante sano. Se aislaron las celulas mononucleares (PMBC) usando el reactivo Ficoll-Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Suecia, Cat. N° 17-1440-02) conforme al protocolo recomendado por el fabricante, y se cultivaron en RMPI-1640 que contema FBS al 10%, a 37°C con CO²al 5%.

Linfocitos T primarios: se aislaron celulas mononucleares (PBMC) usando el reactivo Ficoll-Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Suecia, Cat. N° 17-1440-02) conforme al protocolo recomendado por el fabricante. Luego, las celulas se activaron usando anti-CD3 (1 |ig/ml) y anti-CD28 (5 |ig/ml) durante 3 dfas, y se desarrollaron en RMPI-1640 que contema FBS al 10% y 10 ng/ml de IL-2 a 37°C con CO²al 5% cada 2-3 dfas, durante 2 semanas, antes de llevar a cabo los experimentos.

HaCaT, una lmea de queratinocitos epidermicos humanos de The Second Military Medical University (SMMU), China, se cultivo en DMEM que contema FBS al 10%.

HEKa, queratinocitos epidermicos humanos aislados de piel de adulto, adquiridos en Life technologies™ (Carlsbad, CA, EE.UU., Cat. N° C-005-5C) y cultivados en medio EpiLife® que contema HKGS a 37°C con CO²al 5%.

La lmea celular 293/NFkB-Luc se adquirio en Panomics (Fremont, CA, Cat. N° RC0014). Se obtuvo por cotransfeccion con pNFkB-Luc y pHyg en celulas embrionarias de rinon humano 293, seguido de seleccion con higromicina. Las celulas se cultivaron en DMEM que contema FBS al 10% y 100 |ig/ml de higromicina B (Life technologies™, Cat. N° 10687-010).

C. Ensayo de cinasa

Se llevaron a cabo ensayos de cinasa JAK 1/2/3 in vitro usando JAK1/2/3 recombinados humanos y un kit para ensayo de cinasas Z'-LYTE® - Tyrosine 6 Peptide. Se llevaron a cabo ensayos de cinasa CDK 1/2/5 in vitro usando CDK 1/2/5 recombinados humanos y un kit para ensayo de cinasas Z'-LYTE® - Ser/Thr 12 Peptide. Todas las reacciones (20 |il) se iniciaron anadiendo 2,5 |il de control positivo (CP-690550 para el ensayo de cinasa JAK y estaurosporina para el ensayo de cinasa CDK) o los artmulos de ensayo (es decir, muestras) en una disolucion de DMSO al 4%, 5 |il de mezcla de sustrato cinasa/peptido o disolucion de phospho-peptido, 2,5 |il de disolucion de ATP (100 |iM) o 1,33 x tampon de cinasa. La placa de ensayo de 384 pocillos (Corning, Cat. N° 3575) se mezclo y se incubo a temperatura ambiente durante 1 hora. Se anadieron luego 5 |il de la disolucion de desarrollo a cada pocillo, se mezclo y se incubo a temperatura ambiente durante 1 hora mas. Las reacciones de cinasas se detuvieron luego anadiendo 5 |il de reactivo de detencion, seguido del registro de la fluorescencia a 450 nm y 520 nm, usando un lector de placas Perkin-Elmer Victor III (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA).

D. Ensayo Acumen

Para la fosforilacion de STAT3 inducida por IL-6, se sembraron HepG2 en placas de 96 pocillos, con 5,4103 por pocillo en medio DMEM sin suero a 37°C, CO²al 5%, durante la noche. Despues de incubar con CP-690550 o artmulos de ensayo durante 30 minutos, las celulas se estimularon anadiendo 100 ng/ml de IL-6 recombinada humana (1:10) a cada pocillo durante 15 minutos.

Para la fosforilacion de STAT5 inducida por IL-3, se sembraron TF-1 en placas de 96 pocillos, con 1 x 104 celulas por pocillo a 37°C, CO²al 5% durante 3 horas. Despues de incubacion con CP-690550 o artmulos de ensayo durante 30 minutos, las celulas se estimularon anadiendo 100 ng/ml de IL-3 recombinada human (1:10) a cada pocillo durante 30 minutos.

Las celulas HepG2 o TF1 se fijaron luego en paraformaldelmdo al 2% durante 45 minutos a temperatura ambiente, y se incubaron en metanol enfriado con hielo durante 30 minutos. Despues de lavar con PBS, las celulas se incubaron con anticuerpo anti-phospo-STAT3 (Y705) o anti-phospho-STAT5 (Y694) respectivamente, a 4°C durante la noche. Se anadio anticuerpo secundario IgG Alexa 488 de cabra anti-conejo durante 90 minutos antes de los lavados con PBS. Las celulas se contaron despues de incubacion en PBS que contema ioduro de propidio 7,5 |iM y 100 |ig/ml de ribonucleasa A durante 60 minutos en la oscuridad. Se leyo la placa en un instrumento Acumen X3 (TPP Labtech, Hertfordshire SG8, UK).

E. Inmunotransferencia

Se sembraron HEKa en placas de 6 pocillos, con 2 x 105 celulas/pocillo a 37°C, CO²al 5%, durante la noche. Despues de incubacion con el artmulo de ensayo durante 30 minutos, las celulas se estimularon con 100 ng/ml de IL-22 durante 30 minutos.

Despues del tratamiento, las muestras se recogieron en tampon de carga 1 x SDS. Las muestras de protema se hirvieron durante 15 m y se recogieron por centrifugacion a 14000 g durante 10 min a 4°C. Los sobrenadantes se usaron o almacenaron inmediatamente a -80°C. Para el analisis de inmunotransferencia, las muestras se separaron sobre un gel de electroforesis con gradiente de Tris-HCl al 10% (Bio-Rad Laboratories). Los geles se transfirieron sobre un iBlot® Transfer Stack, Regular (nitrocelulosa), que se bloqueo en 5% de leche desnatada seca, y se exploro usando anticuerpo anti-phospo-STAT3 (Y705) o anticuerpo anti-actina a 4°C durante la noche, respectivamente. La membrana se incubo luego con anticuerpo secundario IDRye 800CW apropiado, seguido de deteccion usando el sistema de imagen infrarroja Odyssey (Li-COR Bioscience, Lincoln, NE, EE.UU).

F. Ensayos de indicadores

Para ensayos de genes indicadores, se sembraron 293/NFkB-Luc en una placa de 96 pocillos, con 4 x 104 celulas por pocillo, durante la noche. Despues de incubacion con Andrographolide (LGT) o artmulos de ensayo durante 30 minutos, las celulas se estimularon anadiendo 100 ng/ml de TNFa (1:10) a cada pocillo durante 6 horas. Se prepararon lisados de celulas retirando los medios y anadiendo tampon para lisis. Se anadio un volumen de 5 x de reactivo para ensayo de luciferasa a cada pocillo antes de la lectura de la placa. Se registro la luminiscencia usando un lector de placas Perkin-Elmer Victor III (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, EE.UU.).

G. Ensayo ELISA

Se sembraron linfocitos T primarios en placas de 96 pocillos, con 8 x 104 celulas/pocillo. Se anadieron artmulos de ensayo en los cultivos, y se incubaron a 37°C, con CO²al 5%. Despues de 30 minutos, la suspension celular de cada pocillo se transfirio a otra placa de 96 pocillos revestida con CD3 (1 |ig/ml) y CD28 (5 |il/ml), y se incubo a 37°C, con CO²al 5%, durante 22 horas. Se retiraron los medios y se almaceno a -80°C hasta el ensayo. Se determinaron las concentraciones de IFNy usando un kit ELISA comercial (R&D Systems), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se sembraron PBMC en placas de 96 pocillos, con 3 x 104 celulas/pocillo. Se anadieron luego artmulos de ensayo en los cultivos, y se incubaron a 37°C, con CO²al 5%. Despues de 30 minutos, se anadio 1 |j/ml de LPS (1:10) al cultivo. Para la cuantificacion de los niveles de protema, las placas se incubaron durante 18 horas. Se retiraron los medios y se almaceno a -80°C hasta el ensayo. Se determinaron las concentraciones de TNFa, IL-1 p y IL-6 usando kits ELISA comerciales (R&D Systems), siguiendo las instrucciones del fabricante.

H. Ensayo del MTT

Se sembraron HaCaT en placas de 96 pocillos, con 4 x 104 celulas/pocillo, durante la noche. Se anadieron luego estaurosporina o artmulos de ensayo en el cultivo y se incubaron a 37°C, con CO²al 5%, durante 72 horas. Despues de la retirada de los medios, las celulas de las placas de 96 pocillos se expusieron a 100 |il de MTT (0,5 mg/ml) en DMEM que contema FBS al 10% por pocillo, y se incubaron durante 3 horas a 37°C, CO²al 5%. Posteriormente, los sobrenadantes se retiraron, y se anadieron 150 |il de DMSO a cada pocillo. La placa se incubo en la oscuridad durante 10 minutos, y se registro inmediatamente la absorbancia a 492 nm, usando un lector de microplacas Multiskan MK3 (Thermo Life Sciences, HK, China).

I. Ensayo de viabilidad celular

Se uso el kit CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay para investigar la viabilidad celular. Se sembraron HEKa en una placa de paredes opacas de 96 pocillos, con 1 x 104 celulas/pocillo, durante la noche. Se anadieron luego ditranol o artfculos de ensayo al cultivo, y se incubo a 37°C, con CO²al 5%, durante 48 horas. Las celulas se lisaron con reactivo CellTiter-Glo®, igual al volumen de los medios de cultivo celular presentes en cada pocillo, y los contenidos se mezclaron durante 2 minutos para inducir la lisis celular. Se incubo la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar la senal de luminiscencia. La luminiscencia se registro usando un lector de placas Perkin-Elmer Victor III (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, EE.UU).

J. Ensayo de liberacion de LDH

Se uso un kit de ensayo de liberacion de lactato-deshidrogenasa (LDH) para investigar la citotoxicidad. Se sembraron HEKa en placas de paredes opacas de 96 pocillos, con 4 x 104 celulas/pocillo, durante la noche. Se anadieron luego ditranol o artfculos de ensayo al cultivo, y se incubo a 37°C, con CO²al 5%, durante 24 horas. Se prepararon sobrenadantes y lisados celulares. Se anadio un volumen de 1 x de reactivo CytoTox-ONE™ igual al volumen de sobrenadantes o lisados celulares a cada pocillo, seguido de mezclado durante 30 segundos e incubacion a 25°C durante 10 minutos. Se anadio una disolucion para detencion igual a un volumen de 50% de los sobrenadantes o lisados celulares a cada pocillo para detener la reaccion, y se registro la fluorescencia con una longitud de onda de excitacion de 560 nm y una longitud de onda de emision de 590 nm, usando un SpectraMax M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CAL, EE.UU.).

K. Activacion de NFkB inducida por TNFa

Las citocinas y quimiocinas proinflamatorias juegan papeles importantes en la patogenia de la soriasis. NFkB es claramente uno de los reguladores mas importantes de la expresion de los genes de citocinas y quimiocinas proinflamatorias. Por lo tanto, se investigo la potencia inhibidora de Qingdai y sus extractos refinados sobre la activacion de NFkB dependiente de TNFa en HEK 293/NFkB-Luc. Como se muestra en la tabla 1, TNFa estimularon la expresion de luciferasa dependiente de NFkB, y el pretratamiento de celulas con glucosido de Tripterygium bloqueo la activacion de NFkB de un modo dependiente de la concentracion. El extracto refinado de Indigo naturalis tuvo actividades de microgramos/g sobre la activacion de NFkB dependiente de TNFa en las condiciones experimentales (vease la tabla 1).

L. Determinaciones de CI⁵⁰

Todos los valores de CI⁵⁰se determinaron usando un programa informatico XLfit™ (version 2.0) de ID Business Solutions (Guildford, UK). El fondo se definio en cultivos con celulas tratadas con DMSO solamente, y se resto para los calculos de CI⁵⁰.

M. Resultados

Algunos resultados de ensayos in vitro de extractos refinados de Indigo naturalis se muestran en la tabla 2 siguiente, en la que Indigo naturalis A se obtiene de Delong Pharmaceutical: (indigo, 2,62%; indirubina, 0,284%; triptantrina, 0,0046%).

Tabla 23

( )_________________

**Indigo naturalis A: Indigo naturalis de Delong Pharmaceutical: indigo, 2,62%; indirubina, 0,284%; triptantrina, 0,0046%

3. Evaluacion in vivo de extractos refinados de Indigo naturalis en modelos animales

Ejemplo 11: ensayos in vivo y resultados

A. Materiales y metodos

Animales

Ratones BABL/c, machos, 19~22 g de peso, adquiridos en Shanghai SLC AnimalCenter.

Temperatura ambiente: 24 ± 1 °C

Humedad relativa ambiente: 40-70%

Ciclo de luz: luz fluorescente durante 12 horas de luz (8:00-20:00) y 12 horas de oscuridad

Alojamiento del animal: 4 ratones/jaula

Alimentacion: libre acceso al alimento (irradiado, Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd., China)

Agua: libre acceso a agua corriente de suministro local (filtrada en primer lugar por una maquina de agua ultrapura Molanimal del suministro de agua municipal)

Instrumentos

Termociclador Peltier MJ Research PTC-200 (Alpha Unit™ Block Assembly para sistemas de PTC DNA Engine™) Applied Biosystems 7500 realtime PCR System

Calibre micrometro Digimatic: Mitutoyo, Japon, precision: 0,001 mm

Reactivos

IL-22 recombinado de raton (rmIL-22), Novoprotein (sinobio), Cat. C047, Lot. 0375351

Kit High capacity cDNA Reverse Transcription, Applied Biosystems, Part n°: 4368813, Lot: 0909069

Thermo Scientific ABsolute SYBR Green Rox Mix, Thermo Scientific, Cat: AB-1163/A, Lot: 0911/16

Control positivo

Protopic® (tacrolimus, FK506), pomada al 0,1%, Astellas Toyama Co., Ltd. Toyama Plant, H20100079, Lot: 028680. Regimen de administracion

Se administraron por via topica diferentes concentraciones de las muestras de ensayo, vehfculo, o 0,1% de pomada FK506, al 1%, una hora despues de la induccion de modelo, y luego se dieron diariamente desde el dfa 1 hasta el dfa 11, dos veces al dfa. El primer dfa de administracion de un artfculo de ensayo se contemplo como el dfa 0.

Via de administracion

Aplicacion topica, b.i.d.

Establecimiento de modelos de raton de soriasis inducida por IL-22

Se administro una inyeccion intradermica de 20 |il de PBS, solo o que contema 1000500 ng de IL-22 recombinado de raton (eBioscience), en las orejas de ratones anestesiados, usando una aguja de 0,30 mm de diametro (30 G), cada dos dfas, durante 11 dfas. Se midieron los grosores de las orejas antes de la inyeccion el dfa 0 y a partir de a h los dfas sin inyecciones. Las medidas en las orejas se tomaron en el centro de las orejas, usando un calibre micrometro Digimatic (Mitutoyo).

Veinticuatro horas despues del ultimo tratamiento con IL-22, los ratones fueron sacrificados, y se recogieron las orejas para un analisis mas extenso.

Examen histologico

Se recogieron orejas en la necropsia, se fijaron en formol al 10% tamponado con fosfato, se incluyeron en parafina, se seccionaron, y se tineron con hematoxilina/eosina (H&E). Las secciones microscopicas se clasificaron mediante el numero y gravedad de las lesiones.

Metodos estadfsticos

Los resultados de grosores de orejas se expresaron como media ± S.E.M. El AUC (area bajo la curva) de la hinchazon de las orejas se calculo mediante los datos de grosor de las orejas desde el dfa 0 hasta el dfa 11, y se analizaron mediante metodos ANOVA de medidas repetidas con el paquete informatico JMP®. Los datos de la protema citocina y de expresion de genes se evaluaron con un ANOVA de un factor, y seguido de una prueba t de Student para un analisis a posteriori (post-hoc). (El nivel de significacion se fijo a p < 0,05).

Grupo y dosis

Vease la figura 3.

Resultados

Algunos resultados de los ensayos in vivo de algunos extractos refinados de Indigo naturalis se muestran en la tabla 3.

Tabla 3

j ( )

Indigo naturalis B: Indigo naturalis de Qingfeng Pharmaceutical: indigo, 2,02%; indirubina, 0,216%; triptantrina 0,0032%

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para preparar un extracto refinado a partir de Indigo naturalis, que comprende las etapas de:

a) extraer Indigo naturalis con etanol a reflujo entre 2 y 8 horas,

d) (i) lavar el extracto en bruto con hexano a una temperatura no inferior a 50°C entre 15 y 60 min,

(ii) filtrar a temperatura ambiente la mezcla obtenida en la etapa d) (i) para obtener un producto, opcionalmente enjuagarla con etanol y agua

(iii) lavar el producto obtenido en la etapa d) (ii) con etanol a reflujo, y

2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que se lleva a cabo una etapa de micronizacion despues de la etapa e), proporcionando por lo tanto un extracto refinado con un tamano de partfculas entre 25 y 35 |im, preferiblemente de alrededor de 30 |im.

3. Un extracto refinado obtenible mediante el procedimiento de la reivindicacion 1 o 2.

4. El extracto refinado de la reivindicacion 3, que comprende indirubina como componente, y opcionalmente uno o mas de indigo, triptantrina y qingdainona.

5. El extracto refinado de la reivindicacion 3, que comprende indirubina como componente en una cantidad de al menos 65% (p/p) del extracto refinado, preferiblemente 65-90% (p/p) del extracto refinado.

6. El extracto refinado de las reivindicaciones 4 o 5, que comprende ademas indigo como componente, preferiblemente en una cantidad de 0,1-15% (p/p) del extracto refinado.

7. El extracto refinado de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, que comprende ademas triptantrina como componente, preferiblemente en una cantidad de 0,1-5% (p/p) del extracto refinado.

8. El extracto refinado de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, que comprende ademas qingdainona como componente, preferiblemente en una cantidad de 0,1-5% (p/p) del extracto refinado.

9. El extracto refinado de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que dos o mas de los componentes de indirubina, indigo, triptantrina y qingdainona, estan en una cantidad de 90%-99% (p/p) del extracto refinado.

10. Una composicion farmaceutica que comprende el extracto refinado de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.

11. Un extracto refinado de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno, seleccionada del grupo que consiste en soriasis, trastornos inflamatorios de la piel, onicomicosis, cancer de piel, enfermedades inducidas por una queratinizacion anomala, envejecimiento de la piel, dermatosis pustulosa y CTCL.

12. El extracto refinado para uso de la reivindicacion 11, en el que el tratamiento de una enfermedad o trastorno es el tratamiento de soriasis.

13. El extracto refinado para uso de la reivindicacion 12, en el que la soriasis es soriasis en placas cronica, soriasis en gotas, soriasis eritrodermica, soriasis pustulosa, soriasis inversa, soriasis ungueal y/o artritis psoriasica.